Isolamento de ácidos nucleicos

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Isolamento de ácidos nucleicos
Prof. Eldio dos Santos, Prof.ª Thaíssa Queiróz Machado
Descrição
Isolamento dos ácidos nucleicos: coleta, transporte e armazenamento
de amostras; extração e quantificação de DNA e RNA; síntese de cDNA;
desenho experimental.
Propósito
Compreender as etapas para o isolamento dos ácidos nucleicos, a partir
do desenho experimental até a sua extração e quantificação é o primeiro
passo para obtenção de amostras de qualidade para a realização dos
métodos moleculares, garantindo, assim, resultados fidedignos.
Objetivos
Módulo 1
Introdução ao isolamento dos
ácidos nucleicos
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Descrever o desenho experimental e as fases pré-analíticas do
isolamento dos ácidos nucleicos.
Módulo 2
Extração e quanti�cação do
material genético
Descrever os procedimentos de extração e quantificação do DNA e
RNA e síntese do cDNA.
Introdução
A Biologia Molecular é responsável por estudar as moléculas que
realizam a manutenção da vida. São elas: DNA, RNA e proteínas,
que têm como função principal, considerando o dogma central da
Biologia, armazenar informações e enviar essas informações
para a síntese das proteínas que realizaram as funções celulares,
respectivamente.
Atualmente, os inúmeros avanços obtidos na área médica, na
ciência animal e vegetal, são resultado da elaboração de técnicas
moleculares que nos proporcionaram novas formas de estudar o
DNA e o RNA. Técnicas essas que estão em constante evolução.
No entanto, antes de analisar o material genético propriamente
dito, é necessário extrair esse material das células. Para isso, é
essencial que a coleta, o armazenamento, o transporte e o
processo extrativo sejam realizados de maneira satisfatória e que
tenhamos uma quantidade de material genético suficiente, de
qualidade, livre de contaminantes e íntegro para realizar a análise.
Você imagina como é feito o processo extrativo? Será que a
extração de DNA ou RNA empregam a mesma metodologia? E o
que é cDNA e qual sua importância?

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Vamos juntos, ao longo desta jornada, explorar todos esses
questionamentos, visitando a coleta, o transporte e
armazenamento do material para análise molecular (fase pré-
analítica). Após essa fase, vamos aprender sobre as técnicas de
extração de DNA e RNA, quantificação, análise da pureza e, por
fim, a síntese do cDNA. Além disso, estudaremos o desenho
experimental e entenderemos a sua aplicabilidade, etapas e
importância no desenvolvimento e conhecimento científico!
1 - Introdução ao isolamento dos ácidos
nucleicos
Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever o desenho
experimental e as fases pré-analíticas do isolamento dos ácidos
nucleicos.
Desenho experimental
O desenho experimental é um planejamento de um estudo realizado em
algumas etapas e é uma ramificação do método científico, que é a
ferramenta mais poderosa de todas para o avanço tecnológico da
humanidade e muda até mesmo a forma que pensamos nas coisas do
dia a dia.
Veja a aplicação deste método em uma atividade do nosso cotidiano:
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Leonardo tem o hábito de assistir ao telejornal todos os dias.
Enquanto assistia ao programa, viu que o prefeito da sua
cidade participou de uma pequena entrevista e fez algumas
afirmações sobre o funcionamento da prefeitura naquele
trimestre.
Primeiro, Leonardo deve parar, pensar sobre tal afirmação e
aplicar o método científico, observando o que foi falado e
questionar: “Será que é verdade o que o prefeito falou?"
Em seguida, ele estabelecerá hipóteses: “É verdade que tal
coisa aconteceu” ou “É mentira que tal coisa aconteceu”.
A próxima etapa é realizar um experimento, que nesse caso é a
busca de fontes confiáveis de notícia, com credibilidade, para
identificar se o que o político falou é verdade ou não, analisar o
discurso e, finalmente, Leonardo poderá tomar a sua conclusão
baseado no método científico.
Pronto! Agora ele pode validar a hipótese “É verdade” ou “É
mentira” ao invés de simplesmente aceitar a afirmação dita.
O método científico foi utilizado para produzir quase tudo que existe,
indo do aparelho em que você está lendo este texto até a cadeira em
que está sentado(a). Nós utilizamos esse método muitas vezes de
forma inconsciente, mas temos que ter em mente que ele existe e que
devemos pensar sempre de forma criteriosa.
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Método científico.
Resumindo, as etapas do método científico são: observação,
questionamento, hipótese, experimento, análise dos resultados e
conclusão. Agora que já entendemos o método científico, podemos falar
sobre desenho experimental. Ele é um conjunto de etapas que devem
ser realizadas para conduzir uma hipótese utilizando o método
científico, com objetivo de estabelecer um resultado confiável e
reprodutível. A reprodutibilidade é um dos pontos mais importantes da
ciência!
Observação
A partir da observação de algum evento – por exemplo, a existência do DNA
–, podemos nos perguntar (questionar): “Eu gostaria de purificar o DNA
para estudar melhor como ele é construído, tem alguma forma de fazer
isso?”.
Hipótese
A partir dessa pergunta, estabelecemos uma hipótese: “Se eu aplicar um
reagente específico e fizer um determinado procedimento, será que consigo
o DNA purificado?”.
Experimento
Depois vamos para a bancada, onde o experimento é feito, e a partir da
análise dos resultados, as conclusões são obtidas.
Exemplo
Suponha que sua equipe do laboratório desenvolveu uma nova técnica
de quantificação de DNA. Você deverá escrever sua metodologia passo
a passo, com detalhes dos tipos de solventes necessários, as
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concentrações, a pressão, a temperatura de incubação etc. Os dados
devem ser claros para que, quando outra pessoa ler essa metodologia
(por exemplo, alguém do outro lado do mundo, cinco anos depois), ela
consiga chegar no mesmo resultado, considerando que todas as
condições e manipulação foram realizadas conforme o descrito.
Vejamos as etapas do desenho experimental!
 De�nir a relação causa-efeito
Estabelecer o problema existente, os objetivos do
trabalho e as metas a serem cumpridas.
 Planejamento
Com o projeto estabelecido, preparar a
instrumentação e avaliar possíveis problemáticas
do experimento.
 Execução
Realizar as medições e técnicas planejadas.
 Análise e interpretação
Após a execução, analisar os dados coletados de
forma criteriosa e científica.
 Formular as conclusões
A partir da análise e interpretação dos resultados,
devemos concluir se a relação causa-efeito se
mostrou existente e responder aos objetivos do
t b lh d fi id t 1 f h d d
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A partir do desenho experimental, pretendemos dizer de que modo ou
por que o fenômeno é produzido. Assim, a partir da ideia de relação de
causa-efeito em que se acredita que existe uma relação entre a
construção da causa e o efeito observado, formulamos as hipóteses a
serem testadas, temos os vários tratamentos (variáveis independentes)
e executamos o experimento e observamos os resultados (variáveis
dependentes). Se o experimento for bem elaborado e planejado,
podemos formular conclusões a respeitoda relação de causa-efeito
para a hipótese estabelecida.
Hipóteses
São afirmações provisórias, enunciadas de forma curta e objetiva, que
serão verificadas para ser ou não demonstradas. Seguem teorias já
existentes.
Variáveis dependentes e
independentes
Mas o que são variáveis dependentes e independentes? Para responder
a essa pergunta, aprenderemos alguns conceitos essenciais para o
desenho experimental!
Sempre que fazemos um experimento, queremos verificar os seus
resultados. Todos os resultados (outputs) são originados a partir
das entradas do experimento (inputs).
Entradas do experimento
A palavra entrada corresponde a todos os valores inseridos em
determinado modelo, ou seja, em um modelo experimental em que valores
são dados, as entradas são todos estes valores.
trabalho definidos na etapa 1, fechando dessa
forma o ciclo do desenho experimental.
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Considerando a necessidade de se extrair o DNA com sucesso,
o input será o material coletado, por exemplo, o raspado da face interna
da bochecha, e o output será o DNA extraído desse material.
Os inputs são suscetíveis às diversas variáveis. Elas são agrupadas em
dois grupos: variáveis dependentes e variáveis independentes. Vamos
conferi-las?
Variáveis
independentes
São aquelas que
podemos controlar e
modificar, e possuem
certo efeito sobre a
variável dependente.
Variáveis
dependentes
São aquelas que
medem o efeito do que
está sendo avaliado e
dependem da variável
independente.
O experimento será medir a concentração plasmática do colesterol. As
variáveis independentes, ou seja, as que são possíveis controlar, seriam:
“Fiz jejum? Me alimentei bem? Usei algum medicamento nos últimos
dias?” Essas perguntas influenciarão diretamente no resultado do
colesterol encontrado, ou seja, na variável dependente, que nesse caso é
a concentração de colesterol dosada no soro.
Hipótese nula e hipótese
alternativa
Após os resultados do experimento, baseando-se nos dados coletados e
processos realizados, como garantir que o dado obtido em uma amostra
pode ser generalizado para toda a população e verificar se a hipótese
inicial estava correta?

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Amostra
Subconjunto de pessoas, itens ou eventos de uma população selecionados
para analisar e fazer inferências.
Resposta
Para tentar responder a essas perguntas, os cientistas utilizam modelos
estatísticos e testes de hipóteses para analisar os dados e testar a
validade desses resultados. Por meio da inferência estatística, os testes
de hipótese são utilizados para tomar a decisão de aceitar ou rejeitar
uma hipótese estabelecida no início do desenho experimental.
Existem dois tipos de hipótese:
Hipótese nula
Indica que não há uma relação causa-efeito.
Hipótese alternativa
Indica que existe uma relação causa-efeito, ou seja, rejeita a hipótese
nula.
Vamos entender melhor a partir de um exemplo:
Para provar que existe um padrão, ou seja, uma relação causa-efeito,
vamos estudar se, ao falar com um papagaio, ele repete exatamente o
que nós falamos. Nesse caso, a hipótese inicial, aquela que se deseja
provar, é que o papagaio repete o que falamos.
Para isso, o experimento será falar várias vezes para o papagaio a
palavra Vasco e observar o que ele diz. Como resultado, podemos
esperar que ele repita a mesma palavra (Vasco) ou não (Flamengo, ou
qualquer outra palavra diferente de Vasco). Assim, teremos duas
hipóteses: a hipótese nula (aquela em que não há relação causa-efeito),
que ele não repete o que falamos, ou seja, ao ouvir Vasco, ele diz
Flamengo. Quando isso acontece, dizemos que a H0 é verdadeira; e a
hipótese alternativa (aquela que confirma a relação causa-efeito), em
que ele repete o que estamos falando, ao ouvir Vasco, ele repete Vasco.
Nesse caso, rejeitamos a H0 e a H1 é verdadeira.
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Hipótese nula
Hipóteses alternativa.
Tipos de erros
Todos os experimentos e análises de resultados são passíveis de erros
de interpretação e/ou do processo realizado. Os erros são causados
quando temos uma interpretação errônea dos dados, o que nos leva a
rejeitar uma hipótese verdadeira (falso positivo) ou não rejeitar uma
hipótese falsa (falso negativo). Os erros podem ser classificados como
tipo 1 e 2, de acordo com a hipótese que será rejeitada.
A hipótese nula 
verdadeira
Decisão
Decidimos rejeitar
a hipótese nula.
Erro tipo 1 (rejei
de uma hipótese
nula verdadeira)
Aceita-se a
hipótese nula.
Decisão correta
Erros do tipo 1 e 2.
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Vamos voltar ao exemplo anterior para entender melhor esses erros:
Como aprendemos anteriormente, ao falar para o papagaio a palavra
Vasco e ele repetir Flamengo ou qualquer outra palavra além de Vasco, a
hipótese nula é verdadeira (sem relação causa-efeito). No entanto,
quando falamos Vasco para o papagaio e ele repete outra palavra,
enviesados para a obtenção de uma relação de causa-efeito, rejeitamos
a H0, mesmo ela sendo verdadeira. Temos um erro do tipo 1 ou falso
positivo. Nesse tipo de erro, a hipótese nula é verdadeira (ou seja, ele
não repetiu a palavra Vasco) e nós a rejeitamos (pois entendemos
Vasco).
Vimos também que, quando falamos Vasco, e ele repete Vasco, a H0 é
falsa. Qualquer outra palavra dita pelo papagaio torna a H0 verdadeira,
pois ele não repetiu a palavra que queríamos (Vasco). No entanto, se ao
falar Vasco ele repetir a exata palavra Vasco e nós entendermos “Asco”
por engano, vamos entender que a H0 é verdadeira, porém, nesse caso,
a hipótese nula é falsa, uma vez que ele de fato repete a palavra Vasco.
Esse é um erro do tipo 2 ou falso negativo: aceitamos uma H0
verdadeira (pois entendemos que ele disse Asco), mas, na verdade, a
hipótese nula era falsa (ou seja, ele disse Vasco).
Saiba mais
Esses conceitos podem ser utilizados em qualquer desenho
experimental e são muito comuns na área médica, principalmente em
testes de diagnóstico clínico, nos quais kits de diagnóstico demonstram
resultado positivo para uma doença inexistente ou resultado negativo,
quando, na verdade, há presença de doença.
O desenho experimental
Entenda melhor o desenho experimental.

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Seleção de participantes
A seleção dos participantes, população de estudo, deve ser a mais
representativa possível, para termos menor chance de errar ao
generalizar os resultados.
A seleção de participantes de um estudo também pode ser chamada de
amostragem, que pode ser não probabilística ou probabilística.
A amostragem não
probabilística ocorre
quando a probabilidade
da seleção de cada
participante não é
conhecida. A seleção da
amostra depende do
julgamento do
pesquisador e esta
pode ser feita pela
amostragem por
conveniência (o
pesquisador escolhe
quem está disponível)
ou julgamento (o
pesquisador escolhe
quem ele acha
interessante).
A amostragem
probabilística ocore
quando cada elemento
da população possui a
mesma probabilidade
de ser selecionado para
compor a amostra.
Nesse caso, a
probabilidade da
seleção de cada
participante é
conhecida. Por
exemplo, em uma
amostra aleatória
simples com 10
participantes, a chance
de um deles ser
escolhido é 1/10, ou
seja, 10%.
A amostragem probabilística pode ser:
Participantes são selecionados aleatoriamente em uma
determinada população. Em uma população de 12 participantes,
eu escolho 9 de forma aleatória, ou seja, ao acaso. Issopoderia
ser realizado por sorteio, por exemplo.

Amostragem aleatória simples 
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O primeiro participante é selecionado a partir de um número
preestabelecido e os outros participantes são escolhidos
seguindo um mesmo coeficiente. Por exemplo, em uma
população com 13 participantes, vamos padronizar um
coeficiente de 3. Além disso, vamos utilizar a fórmula 1 + (K x N),
onde K é meu coeficiente e N o número do participante. Se
definimos o primeiro participante como o número 1 (poderia ser
qualquer outro), quais seriam os outros participantes?
O segundo participante será o número 1 + o coeficiente (3) X
a quantidade de participantes já escolhidos, assim teríamos
1 + 3 (coeficiente) X 1 (número já selecionado). Ou seja, o
participante seria o número 4.
O terceiro participante será o número 1 + 3 x 2 = 7.
O quarto 1 + 3 x 3 = 10.
O quinto 1 + 3 x 4 = 13, fechando, assim, a amostra.
Com os conceitos básicos sobre desenho experimental estabelecidos,
podemos seguir para as próximas etapas da fase pré-analítica do
isolamento de ácidos nucleicos. Os conceitos aprendidos neste tópico
são valiosos e podem ser utilizados em qualquer situação da vida, seja
ela profissional ou do nosso cotidiano.
Amostragem sistemática 
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Coleta, transporte e
armazenamento de
amostras biológicas
destinadas aos testes
moleculares
Atualmente, o mercado dos testes moleculares está em intensa
expansão. O marketing feito pelos laboratórios, as divulgações
promovidas por celebridades, as regulações nos preços dos testes, o
desenvolvimento de marcadores e os kits acessíveis, entre outros
fatores colaboram para o crescimento desse ramo de mercado.
São várias as empresas que fazem testes utilizando material genético
para diferentes fins, por exemplo, indicar a ancestralidade e a origem
genética, e apontar marcadores genéticos para doenças, além dos
testes laboratoriais para diversos tipos de infecções (incluindo covid-
19).
Saiba mais
Em um passado recente, pensar nesse tipo de tecnologia de diagnóstico
era deixado para filmes de ficção científica, aqueles em que um médico
high-tech coleta o sangue do paciente, passa em uma máquina e depois
de alguns segundos um papel é impresso indicando todas as doenças e
quais os medicamentos utilizar.
Hoje, esse tipo de abordagem é real, ou pelo menos bem parecido com
filmes, pois a população tem acesso aos testes de forma mais fácil e
barata. É importante ressaltar que, no Brasil, existem algumas empresas
com esse perfil.
Sempre que pensamos nos testes moleculares, automaticamente,
temos a ideia de perfeição, por se tratar de tecnologia de ponta, pela
propaganda ser sempre bem feita e por ser algo muito misterioso, de
entendimento distante do senso comum. Apesar de muitos acharem
que os resultados de testes genéticos são absolutos, isso não é uma
verdade: eles estão sujeitos a erros assim como qualquer teste de
laboratório e a maioria desses erros ocorre justamente na fase pré-
analítica, que compreende desde a coleta do material até o cadastro e
armazenamento das amostras no laboratório, antes da análise
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propriamente dita.
Diferentes amostras biológicas podem ser coletadas para os testes
moleculares, como sangue, escarro, amostra de tecidos, um fio de
cabelo, dentre outras. A partir dessas amostras, podemos detectar a
presença tanto do nosso material genético (DNA/RNA) quanto o de
microrganismos, conseguindo verificar e quantificar a presença de vírus,
bactérias, protozoários; analisar a predisposição ou o estado de
doenças genéticas; e fazer os famosos testes de paternidade. Além
disso, é amplamente utilizado em perícias médicas: o jornalista Tim
Lopes foi identificado com auxílio dos testes moleculares.
Jornalista Tim Lopes
Arcanjo Antonino Lopes do Nascimento, conhecido como Tim Lopes, foi um
repórter investigativo brasileiro. Ele desapareceu em 2 de junho de 2002,
porém sua morte somente foi confirmada no mês seguinte, após exame de
DNA dos fragmentos de ossos encontrados em um cemitério clandestino.
Atenção!
É importante destacar que, além das amostras biológicas, os testes
moleculares podem ser realizados a partir de cultura de células e de
microrganismos. Nesses casos, também é essencial os cuidados com a
fase pré-analítica, para um resultado de qualidade. A coleta e
manipulação de todas essas amostras, assim como na coleta de
qualquer material biológico, deve ser realizada seguindo todas as
normas de biossegurança, com utilização dos equipamentos de
proteção individual, para evitar contaminação.
Além disso, as amostras devem estar devidamente identificadas com o
nome do paciente e data da coleta, assinatura de quem coletou e um
código numérico para dupla verificação. Amostras que não estiverem
identificadas corretamente ou aquelas que apresentem características
que impossibilitem o teste, como a presença de hemólise no tubo de
sangue, devem ser descartadas.
Hemólise
Extravasamento de componentes intracelulares das hemácias para o meio
extracelular, por conta de um rompimento das membranas celulares.
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Alguns tipos de testes possuem critérios específicos de acordo com o
procedimento realizado. É obrigação do laboratório deixar evidente para
os pacientes os critérios de aceitação e exclusão de amostras para cada
tipo de ensaio.
A quantidade de material genético extraído depende diretamente do
local de coleta, do número de células presentes e pode variar conforme
a idade do paciente, além de depender diretamente das condições de
transporte e armazenamento.
Em algumas ocasiões, um resultado negativo em um exame pode ser
resultado de um erro durante a fase pré-analítica, uma vez que o
material genético tem que estar viável para conseguir realizar as
técnicas moleculares que envolvem sua amplificação. É sempre
preferível trabalhar com amostras frescas para melhorar o rendimento.
Vamos conferir alguns cuidados para extração de amostras de DNA e
RNA:
Para extração de DNA, a coleta deve seguir alguns cuidados,
pois, no nosso organismo, existem moléculas capazes de
degradar o DNA, como as desoxirribonucleases (DNases) que
necessitam de íons metal para a sua atividade. Então, para
inativação da enzima, pode ser necessária a utilização de
agentes quelantes como o EDTA. Ela também é inativada pelo
calor durante 10 minutos a 65°C.
Extração de DNA 
Extração de RNA 
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A coleta de amostras para a extração de RNA requer mais
cuidados. O RNA é uma molécula altamente instável e que
apresenta grande fragilidade e se degrada rapidamente pela
ação de ribonucleases (RNase). Essas enzimas não precisam de
cofator para se ativar, são estáveis, ficando ativas mesmo após a
fervura e autoclavagem, e estão presentes em uma série
materiais biológicos e na nossa pele. É muito importante a
adição de agentes estabilizadores (Os agentes estabilizadores
de RNA são reagentes que visam inativar enzimas capazes de
degradar o RNA.) de RNA o mais rápido possível e que o
recipiente utilizado seja certificado como Ribonucleases (RNase)
free, ou seja, livre de agentes degradantes de RNA, estéril, e
sempre deve ser manipulado com luvas!
Agora é hora de conhecer as peculiaridades de algumas amostras
destinadas à extração do DNA/RNA. Vamos lá?
Sangue e aspirado de medula
óssea
Amostras de sangue e aspirado de medula ósseaprecisam ser
armazenados junto a agentes anticoagulantes para manter a
estabilidade da amostra, impedindo a coagulação sanguínea. Entretanto,
a heparina (agente anticoagulante amplamente utilizado) é um potente
inibidor de algumas técnicas moleculares, dentre elas o famoso PCR
(Polymerase Chain Reaction).
PCR
É a técnica utilizada para amplificar a quantidade de material genético e
que é fundamental para as análises posteriores ou até pode ser utilizada
como ferramenta principal de diagnóstico.
Saiba mais
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A impossibilidade do uso de heparina fez com que outros
anticoagulantes fossem preferíveis, sendo normalmente utilizados o
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou o ACD (citrato de dextrose)
para essas amostras. A coleta de amostras com o anticoagulante EDTA,
apesar de ser mais utilizada e indicada para amostras de sangue,
também pode interferir em algumas metodologias, já que o EDTA pode
inibir drasticamente a atividade da DNA polimerase se estiver em
excesso.
Quando o objetivo é a análise do DNA, o sangue total é estável por até
24 horas em temperatura ambiente. Na temperatura de 2°C a 8°C, é
estável por até oito dias. De forma diferente, o plasma fica estável
apenas 5 dias na temperatura de 2°C a 8°C, suportando tempos maiores
se for congelado, e a amostra deve ser transportada em ambiente
refrigerado.
Além disso, se congelada, é necessário que não haja ciclos de
congelamento-descongelamento. Para análise de RNA viral, o sangue
deve ser centrifugado e o plasma transferido para outro tubo estéril e
livre de RNases em até quatro horas da coleta.
Para as amostras de aspirado de medula óssea, a seringa deve conter
EDTA e, após a coleta, o aspirado pode ser armazenado por até 72 horas
na temperatura de 2°C a 8°C. Caso seja necessário maior tempo para o
processamento, os eritrócitos precisam ser removidos e a amostra
congelada a -20°C, assim a estabilidade do material permanece por
meses.
Atenção!
A amostra só pode ser congelada após a remoção dos eritrócitos!
Vamos entender um pouco mais a seguir:
Para a extração de RNA após a coleta, esta deve ser colocada
imediatamente em solução estabilizante de RNA. Caso não tenha
essa solução e não seja congelada, ela deve ser transportada em
gelo seco e analisada em até 4 horas.
O grupamento heme presente nas hemoglobinas pode inibir a
reação de PCR, então amostras que tenham algum tipo de hemólise
não são satisfatórias para análise. Além disso, caso haja
necessidade de remoção dos eritrócitos, esta deve ser feita de
forma cuidadosa, para evitar a hemólise e liberação do grupo heme
e causar problemas nos testes moleculares.
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Amostra de tecidos
As amostras de tecido são preferíveis quando os agentes etiológicos
estão alojados no tecido e/ou o diagnóstico das possíveis infecções
seja difícil por meio da simples coleta de sangue. Além disso, essas
amostras são as de escolha durante as autópsias e para a análise de
tecidos tumorais para comparar o DNA das células tumorais com as
normais.
Saiba mais
Para garantir uma boa análise, é recomendado coletar de 1g a 2g de
tecido-alvo. No entanto, a quantidade pode variar de acordo com o
tecido. Apenas para termos uma ideia, 10mg de tecido fornece cerca de
10µg de material genético. Essa quantidade já é suficiente para análise,
mas sempre devemos trabalhar com uma margem de segurança, pois
possíveis perdas de material podem ocorrer.
Para tecidos, o ideal, após a coleta por biópsia, é o rápido congelamento
em nitrogênio líquido (-196°C) ou manter esse tecido em solução de
preservação de ácidos nucleicos. Não é recomendável manter esse tipo
de material em temperatura ambiente por muito tempo.
Amostras pequenas devem ser embrulhadas em gazes umedecidas
com salina para evitar ressecamento, além da solução de preservação
de ácidos nucleicos. Tecidos sólidos apresentam muitas endonucleases
e devem ser processados ou congelados o mais rápido possível!
Tecidos de biopsia embebidos em fixadores utilizados
para a preservação de tecidos para exame
histopatológico não devem ser empregados para os
exames de biologia molecular!
A estabilidade do tecido depende do tipo de tecido coletado.
Observe a estabilidade do DNA nas seguintes condições:
Mantido em banho de gelo triturado ou
refrigerado em temperatura entre 2°C
e 8°C
Até 24h
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Congelado a -20°C Duas semanas
Congelado a -70°C Dois anos
Eldio dos Santos.
Se houver impossibilidade de congelar ou usar a solução preservadora,
a amostra deve permanecer em ambiente com gelo, inclusive no
transporte e ser processada em 24 horas para o isolamento do DNA.
Quando a amostra for coletada para a extração do RNA, essa amostra
deve ser rapidamente congelada em nitrogênio líquido (-196°C) antes de
ser congelada a -70°C, processada em no máximo uma hora após a
coleta ou colocada em solução estabilizadora do RNA. No momento da
extração, as amostras não podem ser descongeladas, e sim
homogeneizadas diretamente em solução adequada para a extração
(chamado agente de extração, geralmente isotiocianato de guanidina).
Os tubos de coleta também devem ser livres de RNases, estéreis e
apenas manipulá-los com luvas, para evitar a degradação do RNA.
Normalmente, em temperatura de -20°C, as RNases ainda estão ativas,
assim, é recomendado manter as amostras para análise de RNA em
temperaturas inferior ou igual a -70°C.
Células bucais
A coleta das células bucais para a extração de DNA ou RNA pode ser
realizada por meio de um raspado de células da parte interna da boca
utilizando um swab (cotonete estéril, específico para coleta de exames
microbiológicos) ou a partir do bochecho. Para extração de RNA, essa
amostra deve ser inserida em um tubo contendo solução estabilizante
de RNA/DNA. De forma diferente, amostras para extração de DNA
podem ser secas ou estabilizadas e transportadas à temperatura
ambiente. As amostras estabilizadas dentro do tubo possuem validade
de até uma semana em temperatura ambiente, podendo ser
transportadas sem maiores cuidados.
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Alguns swabs mais longos também podem ser utilizados para coletar
material presente na orofaringe e na nasofaringe para o diagnóstico de
algumas doenças, em que o agente infectante colonize as vias
respiratórias, como o novo coronavírus e o vírus influenza.
Atualmente, as empresas enviam os kits de coleta para o paciente
realizar o procedimento em casa: o swab deve ser esfregado na parte
interna da bochecha, cerca de 10 vezes de cada lado e, em seguida,
inserido no tubo que vem no kit contendo a solução estabilizante. Os
erros mais comuns que ocorrem nesse tipo de abordagem são: o
paciente descartar a solução estabilizante, a contaminação do swab
com restos de alimentos, batom e em outros casos até mesmo o
paciente não identificar corretamente o tubo.
Deve-se evitar a coleta desse material após refeições, pois não é tão
raro encontrar, nas amostras encaminhadas para o laboratório, o DNA de
alimentos, como frango, bovino etc. nos testes onde supostamente era
para ser feita a detecção de DNA de um ser humano.
Coleta de líquido cefalorraquidiano
(líquor ou LCR)
O LCR quando coletado para análise do DNA deve ser coletado em
frascos estéreis, transportado na temperatura de 2°C a 8°C e, caso não
seja processado rapidamente, congelado na temperatura a partir de
-20°C. Para análise de RNA, se o processamento não for realizado em
até 4 horas, essa amostra deve ser congelada. No entanto, caso a
amostratenha eritrócitos, esses devem ser removidos antes do
congelamento.
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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
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Questão 1
Estudamos as diferenças entre hipótese nula e hipótese alternativa
e os possíveis erros gerados a partir da interpretação errada dessas
análises. O erro tipo 1 consiste em:
Parabéns! A alternativa E está correta.
O erro tipo 1 acontece quando rejeitamos a hipótese nula, sendo
esta verdadeira, ou seja, não aceitamos que não existe relação
causa-efeito. Sendo assim, temos um resultado falso-positivo. Um
resultado falso-positivo é quando, por exemplo, assumimos que um
paciente tem uma doença, quando na verdade ele não tem.
Questão 2
O armazenamento de amostras biológicas é fundamental para uma
boa análise. Com base no que estudamos, qual seriam as melhores
condições para armazenamento de uma amostra de tecido, por
mais de 1 semana, para a extração de RNA?
A
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese
nula é falsa.
B
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese
nula é verdadeira.
C
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese
nula e a alternativa são falsas.
D
Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese
nula é falsa.
E
Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula
é verdadeira.
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Parabéns! A alternativa B está correta.
O RNA tende a uma maior estabilidade quando primeiro congelado
em nitrogênio líquido (-196°C), e depois em -70°C. Na temperatura
de -20°C, as RNases que ainda estão presentes no tecido podem
degradar o RNA ao longo do tempo. Além disso, amostras de
tecidos para análise de material genético não podem ser fixadas em
soluções fixadoras como o formol!
A Após a coleta, manter em temperatura ambiente.
B
Após a coleta, um rápido congelamento em
nitrogênio líquido (-196°C), seguido do
congelamento a -70°C.
C
Após a coleta, colocar o tecido em um pote com
formol, congelar em nitrogênio líquido (-196°C),
seguido do congelamento a -70°C.
D
Após a coleta, manter na temperatura de 2°C-8°C
por 24 horas.
E
Após a coleta, colocar o tecido em um pote com
formol, congelar em nitrogênio líquido (-196°C),
seguido do congelamento a -20°C.
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2 - Extração e quanti�cação do material
genético
Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever os
procedimentos de extração e quanti�cação do DNA e RNA e síntese
do cDNA.
Extração do DNA e do RNA
a partir das amostras
coletadas
Agora que conhecemos todas as etapas pré-analíticas, estamos prontos
para colocar a mão na massa! Vamos então estudar de fato como é
feita a extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas para
a obtenção do nosso material genético.
No entanto, antes de começarmos a estudar a extração, é interessante
relembrar que qualquer técnica ou procedimento utilizado no laboratório
– seja ele qual for – é como fazer um bolo, e por isso devemos seguir
determinada receita.
No laboratório, chamamos a receita de POP (procedimento operacional
padrão) e temos que ter os ingredientes (os reagentes) e os utensílios
para fazer o bolo (os materiais e instrumentos).
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Ler a receita e fazer o bolo é um processo mecânico, qualquer pessoa
com um mínimo de conhecimento e que saiba como manusear os
instrumentos consegue seguir o passo a passo, e dependendo da
experiência, vai conseguir ter um resultado satisfatório.
No fim do procedimento, pode ser que saia um bolo maravilhoso ou
pode ser que não saia. Dessa forma, percebemos que é importante
saber qual é a função de cada componente do bolo para entendermos o
processo como um todo. Caso o bolo saia pequeno, faltou fermento, se
ele saiu seco é porque faltou leite, e assim temos uma noção de causa-
efeito. O inverso também é válido: podemos saber tudo sobre como
funcionam os ingredientes do bolo, o nome da levedura usada no
fermento, a temperatura ideal para assar o bolo, qual a importância de
cada componente na construção do bolo, mas se não soubermos como
mexer o bolo ou como ligar o forno, o processo simplesmente não
funciona!
Assim como fazer um bolo, é de suma importância primeiro entender os
conceitos teóricos da extração do DNA e depois ver como funciona o
passo a passo da técnica.
Atenção!
Antes de iniciar nos procedimentos, é importante ressaltar que, após a
obtenção de nossa amostra, devemos sempre tomar cuidado onde ela
será manipulada e com a preparação dos reagentes, evitando, assim, a
contaminação com materiais genéticos de outros organismos, ou até
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mesmo com enzimas que podem degradar o nosso material de estudo e
gerar resultados falhos.
Procedimentos de extração
de dna
As células eucariontes possuem uma membrana celular, formada por
uma bicamada fosfolipídica, além de diversos elementos dispersos no
citoplasma, como as proteínas, os carboidratos, as organelas, os lipídios
e os elementos minerais (sódio, potássio, magnésio, cálcio, entre
outros). Além disso, a célula eucarionte também possui uma membrana
nuclear e dentro do núcleo estão as proteínas, DNA e RNA
majoritariamente.
Para a extração do DNA, todos os outros elementos são considerados
contaminantes, até mesmo o RNA. Assim, a estratégia básica da
extração de DNA é, então, separar o DNA de todos esses outros
elementos que não são DNA. Existem algumas formas diferentes de se
fazer isso, mas alguns procedimentos devem ser feitos
independentemente da forma de extração. A partir da amostra de
células, a primeira etapa a ser realizada é o rompimento da parede
celular (quando as células são de origem vegetal ou fungos), da
membrana plasmática e da membrana nuclear, liberando, assim, o
material genético.
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Podemos fazer isso de diversas formas, a saber: com o uso de
detergentes específicos de desestabilizar a membrana celular e nuclear,
abrasão física, ação de enzimas capazes de degradar a membrana e/ou
parede celular, pressão osmótica, aquecimento, entre outras.
Quando a intenção é extrair o DNA, junto ao rompimento das
membranas, é importante adicionar uma enzima capaz de destruir
outras proteínas (proteinases), principalmente para inativar todas as
DNases, impedindo a degradação do DNA. Em seguida, para remover o
RNA, que neste caso é um contaminante, basta adicionar RNase no
meio. Nessa etapa, já removemos lipídios, proteínas e o RNA, mas ainda
faltam os carboidratos e os elementos minerais.
Existem algumas formas de se realizar essa etapa, vamos conhecer as 3
principais.
Adição de solvente orgânico
Podemos usar um solvente como o fenol ou o clorofórmio. É importante
lembrar que já degradamos lipídeos e RNA, rompemos as membranas e,
se for o caso, a parede celular. Mas o que acontece?
O fenol ou clorofórmio tornam essas moléculas insolúveis, assim como
os carboidratos e todos os elementos minerais. Após a adição dos
solventes, seguida da centrifugação, formam-se duas fases:
Fase aquosa: DNA
Nesta fase superior, o DNA, que não é solubilizado nos solventes (fenol
ou clorofórmio), vai permanecer na fase aquosa.
Fase orgânica
Nesta fase, todos os outros elementosirão para a fase orgânica
(inferior), como proteínas, lipídeos, RNA degradados, carboidratos e
outros elementos minerais solúveis em fenol/clorofórmio.
Assim, com auxílio de uma pipeta, podemos transferir a fase aquosa
com o DNA para outro tubo.
Saiba mais
O RNA degradado se torna nsolúvel, pois forma reações de
complexação com outros elementos do citoplasma. Se estiver íntegro,
ele pode ir para a fase aquosa, dependendo do pH do solvente orgânico.
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Solução concentrada de NaCl
O cloreto de sódio concentrado é capaz de precipitar os elementos
degradados do citoplasma, deixando o DNA íntegro na fase aquosa.
Assim, basta centrifugar e remover a fase aquosa do pellet precipitado,
ou seja, recuperar apenas o sobrenadante, pois nele estão nossas
substâncias de interesse.
Pellet
Pequena porção precipitada de uma solução.
Coluna de adsorção do DNA
O DNA possui carga total negativa vinda do grupamento fosfato. Assim,
podemos adicionar uma coluna com carga positiva (normalmente é
utilizada uma coluna de sílica) no nosso tubo e centrifugar. Dessa
forma, o DNA vai ficar retido na coluna devido à sua carga negativa e os
outros elementos irão passar direto pela coluna, ficando no fundo do
tubo. Para remover o DNA da coluna, usamos um tampão de eluição
carregado negativamente em grande quantidade. Normalmente, são
usados os tampões Tris-HCl ou o EDTA. Eles irão competir com o DNA
pela ligação na coluna de adsorção e, como estão em grande
quantidade, ganham a competição e se aderem à coluna expulsando o
DNA. O procedimento é feito também por centrifugação, porém o
material que sairá da coluna será rico em DNA.
Após a obtenção do DNA por qualquer um desses métodos
supracitados, precisamos eliminar qualquer resíduo que por um acaso
ainda esteja misturado ao DNA. Para isso, adicionamos isopropanol, que
precipita apenas o DNA. Após centrifugação, como o DNA encontra-se
precipitado, nosso DNA puro encontra-se no pellet.
Curiosidade
O pellet fica bem aderido no fundo do tubo, podemos lavar o tubo com
etanol 70%, por exemplo, para remover todos os reagentes e secar o
tubo, que o DNA continua aderido ao tubo.
A etapa final consiste em ressuspender DNA (técnica que possibilita que
um pellet volte a ficar em solução), em água ou em tampão de eluição,
basta adicionar um pouco do líquido escolhido e forçar a quebra do
pellet, no final de todo o protocolo, teremos um tubo contendo apenas o
DNA puro.
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O processo de extração de DNA nos plasmídeos é bem
semelhante ao processo geral de extração de DNA. No
entanto, depois da lise da membrana e precipitação
das proteínas citoplasmáticas, é adicionada uma
solução de NaOH com pH bastante básico a ponto de
desnaturar o DNA cromossomal e o também o próprio
DNA plasmidial. Em seguida, é adicionada uma
solução ácida neutralizadora que regenera o DNA
plasmidial, mas não o cromossomal. Assim, podemos
então separar por centrifugação, pois o DNA do
plasmídeo fica em suspensão enquanto o DNA
cromossomal precipita.
Agora que sabemos os princípios teóricos da extração do DNA, vamos
simular uma situação em que estamos no laboratório e temos que
extrair o DNA de uma amostra coletada. Para isso, vamos utilizar o
protocolo desenvolvido pela Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária) (OLIVEIRA et al., 2007).
Vamos ver se você consegue identificar e entender o passo a passo de
um POP utilizado em uma situação real. Parece desafiador, mas não se
assuste, vamos juntos!
A primeira etapa é conferir todos os reagentes que vamos precisar. São
eles:
Tampão de digestão.
Solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1).
Microtubos de polipropileno; frascos e bastões esterilizados.
Solução Tampão TE (tris-HCL 10 mM; EDTA 1 mM com pH 8.0; tris =
hidroximetil aminometano).
Etanol 70%; etanol absoluto; acetato de amônio 7,5M; micropipetas
de 1mL, 200μL, 100μL e 10μL.
Centrífuga.
Isopor com gelo.
Vidraria de laboratório; banho-maria a 50°C.
Tampão de digestão
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No POP da EMBRAPA, o tampão de digestão é formado por NaCl 100 mM;
Tris-HCl com pH 8.0 10 mM; EDTA, com pH 8.0 25 mM; SDS 0,5% (usado
como detergente) e proteinase K 0,1 mg/mL.
Álcool isoamílico
O álcool isoamílico serve para prevenir a formação de espuma quando a
mistura é agitada, facilitando a separação da fase orgânica da aquosa.
Solução de tampão
Solução tampão é uma solução em que o pH permanece em uma
determinada faixa de pH, mesmo após a adição de substâncias ácida ou
básica, a não ser que o “tamponamento” seja extrapolado.
Após conferirmos todo o material, vamos começar a extração do DNA
de um tecido de origem animal, e que por isso não apresenta parede
celular.
Dica
Lembre-se de que nossa amostra depois da coleta tem que estar
armazenada no gelo, para manter a temperatura entre 2°C a 8°C.
Vamos entender melhor esse processo:
 Se o tecido for duro, devemos macerar, usando um
bastão de vidro, e se tiver grande quantidade de
líquidos, a amostra deve ser centrifugada para
remover o líquido em excesso. Na primeira etapa da
extração, adicionamos o tampão de digestão, na
concentração de 1,2mL de tampão para cada
100mg de tecido.
 Em seguida, devemos deixar o tubo em banho-
maria a 50°C por cerca de 8 a 16 horas, para
garantir a digestão completa das membranas
plasmáticas e nucleares e proteínas. No final, o
material apresentará um aspecto viscoso. O tempo
de incubação no banho-maria varia de acordo com
o tamanho da amostra.
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 A segunda etapa é a extração do DNA com fenol e
precipitação dos compostos indesejáveis. Para
isso, o tubo é retirado do banho-maria e esperamos
ele chegar a 37°C para adicionar 5μL de RNase, e
depois incubamos por 15 minutos sob leve
agitação. A adição de RNase é opcional e deve ser
empregada quando o RNA é considerado um
contaminante.
 Em seguida, a solução de fenol, clorofórmio e álcool
isoamílico é adicionada na proporção de 1:1 com a
quantidade de amostra do tubo, ou seja, para cada
500μL de material, adicionamos 500μL de solução
de fenol. É importante atentarmos para o pH da
solução de fenol, pois em pH abaixo de 7.0 o DNA é
degradado e vai para a interface, região entre a fase
orgânica e a fase aquosa, mas é preconizado para
extração de RNA. Resumindo: a solução de fenol
com pH em torno de 7.0 é usada para extração de
DNA e em pH entre 4,5 e 5,5 é usado na extração de
RNA.
 Após a adição do fenol, homogeneizamos e
centrifugamos o tubo por dez minutos a 1.700g.
Uma vez com as fases aquosa e orgânica bem
definidas, separamos a fase aquosa contendo o
DNA e descartamos a fase orgânica com todos os
contaminantes. Nessa etapa, é importante separar
bem as fases, pois o fenol pode ser um
contaminante, então é recomendado centrifugar
duas vezes.
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Nesse POP do EMBRAPA, o etanol é utilizado como agente precipitante
do DNA, entretanto poderíamos utilizar o isopropanol também.
Saiba mais
A unidade volume é usada para padronizar as quantidades em qualquer
sistema, supondo um volume de 500μL de fase aquosa, meio volume
significa 250μL e dois volumes significam 1.000μL
O acetato de amônio facilita a precipitação do DNA pelo etanol e o
etanol absoluto, além de concentrar o DNA, também ajuda a remover os
resíduos remanescentes de fenol e clorofórmio. Centrifugamos a
amostra a 1.700g por cerca doisminutos. Após a centrifugação, será
possível visualizar o >em>pellet bem aderido ao fundo do tubo.
Removemos toda a solução alcoólica e depois vamos ressuspender o
pellet em etanol 70%. Centrifugamos novamente a 1.700g por dois
minutos e tiramos o sobrenadante (uma dica é deixar o tubo aberto por
um tempo, para o etanol evaporar por inteiro). Agora com o pellet limpo,
a fase final é a adição do tampão TE, para facilitar a dissolução do DNA,
ou ainda podemos deixar o tubo em banho-maria a 50°C por algumas
horas.
Recomendação
Vale lembrar que, nesse exemplo, estamos extraindo o DNA a partir de
amostras de tecidos. No entanto, existem variações do protocolo.
Mesmo que a amostra também seja proveniente de tecido, o protocolo
pode ser modificado, com a utilização de outros reagentes. Entretanto,
esse é o procedimento básico e em geral usado em laboratórios para
extração de DNA.
Procedimentos de extração
de RNA
 A terceira fase é a purificação do DNA por meio da
precipitação com etanol. Antes de usarmos o
etanol em si, adicionamos meio volume de acetato
de amônio 7,5M e dois volumes de etanol absoluto.
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O procedimento de extração de RNA é bem parecido com o método de
extração de DNA, mesmo o RNA sendo mais frágil e demandando mais
cuidados. Todo material que entra em contato com a amostra deve ser
tratado com soluções neutralizadoras de RNase e possuir a
característica de ser RNase free. Além disso, a amostra deve sempre ser
refrigerada em nitrogênio líquido ou gelo para evitar a ação de alguma
RNase remanescente.
Vamos agora rever as três etapas do protocolo de extração de DNA,
ressaltando quais são as diferenças entre a extração do DNA e RNA.
Fase 1
Quebra da membrana - A quebra pode ser feita de forma
mecânica ao invés de utilizar o tampão de digestão, usando um
pistilo, bastão ou sonicador, aparelho capaz de utilizar energia
das ondas sonoras para agitar partículas. Esta técnica apresenta
uma vantagem: por ser mais rápida, diminui a chance de
degradação do RNA.
Fase 2
Extração do RNA - Não são utilizadas as RNases. A solução de
fenol/clorofórmio na extração de RNA deve ter pH ácido (entre
4,5 e 5,5) para que o RNA fique na fase aquosa e o DNA fique na
interface (essa fase intermediária só é formada durante a
extração do RNA devido ao pH ácido).
Fase 3
Purificação do RNA - A purificação do RNA é muito parecida com
a do DNA, a diferença está no armazenamento: para RNA é
preferível utilizar nitrogênio líquido.
Vamos acompanhar o passo a passo a seguir:
 Extração de DNA/RNA
Amostra inicial com as células digeridas.
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 Adição de solução
fenol/clorofórmio
Centrifugação da amostra, formando duas fases:
orgânica (em amarelo no fundo do tubo) e aquosa
(em azul acima da fase orgânica). No tubo A, temos
DNA e RNA dissolvidos na fase aquosa e no tubo B
o DNA degradado fica na interface.
 Separação da fase orgânica por
centrifugação
A fase orgânica é descartada, permanecendo
apenas a fase aquosa no tubo.
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Importância do DNA na
Biologia Molecular
Confira agora a importância do DNA na Biologia Molecular, entendendo
como o material genético obtido será utilizado.
 Adição de acetato de amônio e
etanol absoluto
Após centrifugar, ocorre a formação de um pellet no
fundo do tubo. Todo o líquido restante é
descartado.
 Ressuspensão e armazenamento
do material genético extraído
O pellet é ressuspendido em tampão TE e agora o
DNA ou RNA pode ser armazenado.

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Armazenamento do DNA e
do RNA puri�cados
Após o isolamento (purificação), o DNA e o RNA precisam receber
cuidados imediatos. Para o DNA, devemos armazená-lo em um tubo de
plástico (preferencialmente de propileno) vedado a fim de evitar
evaporação, em uma temperatura abaixo de 0°C. Dessa forma,
diminuímos a atividade biológica das DNases.
O DNA purificado é mantido em solução tampão tris-EDTA, com pH 7,2.
A validade do DNA nessas condições, é bastante alta. Confira:
Plástico
O DNA tem afinidade por vidro, por isso o uso de tubos de plástico.
Propileno
Tipo de polímero que não interage com o DNA.
Temperatura ambiente Até 26 semanas
Temperaturas baixas de 2°C a 8°C 1 ano
Congelado a -20°C 7 anos
Congelado a -70°C +7 anos
Atenção!
O DNA purificado é bastante resistente, uma vez que a sua solução não
contenha água, pois a água quando congela forma cristais que podem
danificar os materiais orgânicos.
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Após a extração do RNA, ele deve ser armazenado como um precipitado
em etanol a 70% congelado na temperatura de -70°C. Alguns estudos
mostram que, após 2 meses, mantido na temperatura de -20°C, o RNA
não perde sua integridade. No entanto, é importante destacar que, na
temperatura de -20°C, ainda temos uma atividade RNases, sendo assim
mais recomendado o congelamento em temperaturas de -70°C ou
inferior. Assim como no DNA, os tubos devem ser de plástico estéril e
manuseados com luvas limpas por uma solução de água com
dietilpirocarbonato (composto capaz de eliminar RNases dos tubos) ou
então por tubos com garantia de serem RNase-free.
O etanol auxilia na precipitação do RNA, ajudando a concentrá-lo. Dessa
forma, o RNA fica menos suscetível a agentes degradantes.
Quanti�cação, análise de
pureza e integridade do
material molecular
A extração do DNA/RNA é sem nenhuma dúvida um dos processos mais
importantes da Biologia Molecular, pois esses materiais servem de
matéria-prima para diversas outras técnicas da Biologia Molecular,
como a reação da cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento,
clonagem, hibridização, entre outras. Uma boa extração determina a
qualidade do resultado dessas técnicas. O controle de qualidade da
extração é dado pela quantificação, pureza e integridade desses
materiais.
Vamos entender melhor esses procedimentos?
Quanti�cação
Na quantificação, determinamos a quantidade de DNA/RNA extraído da
amostra inicial. A técnica mais utilizada é a fluorometria. Nesta técnica,
uma pequena alíquota da amostra é transferida para outro tubo, onde é
adicionada uma solução e um agente fluorescente capaz de se ligar
entre as bases do DNA e RNA.
Quando o agente fluorescente (fluoróforo) se liga a algo (DNA ou RNA),
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ele emite fluorescência e assim podemos medir, com ajuda de um
aparelho (fluorímetro), a quantidade de fluorescência da amostra.
A quantidade de fluorescência da amostra é
diretamente proporcional, ou seja, quanto maior for a
fluorescência, maior é a quantidade de DNA ou RNA.
Uma vantagem dessa técnica é que ela é simples e, após a
quantificação, sabemos se temos a quantidade de material suficiente
para as próximas etapas. Além disso, podemos utilizar diferentes
agentes fluorescentes: um específico para DNA e outro específico para
RNA. Assim, podemos quantificar o quanto temos de cada um desses
materiais moleculares.
Quantificação do DNA fluorescente. Na foto, temos o gráfico de duas amostras de DNA diferentes.
Tradução: dsDNA = double-strand DNA; A1= amostra 1; A2= amostra2.
Pureza
Em relação à pureza, podemos avaliar se um DNA ou RNA apresenta
contaminantes. A pergunta aqui é: será que com o material extraído
temos também fenol, álcool, proteínas, RNA (quando o desejo é DNA) e
algum reagente residual?Para essa análise, a técnica mais utilizada é a espectrofotometria.
Antes de entender a técnica, é importante lembrar que luz visível é uma
pequena parte de todo o espectro de radiação eletromagnética
existente, compreendendo comprimentos de onda entre 380-750 nm. Os
comprimentos de ondas inferiores estão na zona de espectro da
ultravioleta (UV) e superiores na zona de infravermelho. Quando uma luz
branca passa por um prisma, ela se decompõe em raios de luz de
diferentes comprimentos de onda, variando do vermelho ao violeta. Em
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um arco-íris, por exemplo, enxergamos 7 diferentes cores, cada uma
dessas cores representa uma diferente faixa de comprimento de onda.
Comprimento de onda no espectro da luz. UV e infravermelho não são visíveis.
Além disso, é importante relembrar que todo o composto químico
apresenta a capacidade de absorver, transmitir ou refletir a luz em
determinado comprimento de onda.
Assim, a espectrofotometria tem como princípio básico utilizar a
capacidade das moléculas orgânicas de absorverem (absorbância) ou
transmitir (transmitância) luz em determinado comprimento de onda,
em um equipamento chamado de espectrofotômetro.
A partir dela, podemos identificar os componentes em uma solução,
pois as biomoléculas apresentam espectros característicos ao UV,
visível ou infravermelho. Por exemplo, já é estabelecido que as proteínas
absorvem comprimentos de onda de 280nm; o RNA e DNA absorvem no
comprimento de onda de 260nm e o fenol e outros constituintes no
comprimento de onda de 230nm.
Saiba mais
Além da possibilidade de indicar a biomolécula presente, podemos
quantificá-la. Na prática, a quantidade de luz absorvida é diretamente
proporcional à concentração da substância, assim, quanto maior for a
concentração, maior é a absorção de luz (medido pela densidade óptica
– OD).
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Confira o passo a passo para a realização dessa técnica:
Etapa 1
Nesta etapa, precisamos indicar para o aparelho onde nossa
amostra está diluída um procedimento parecido com a tara da
balança. Para isso, apenas o tampão usado na extração é
colocado em uma cubeta transparente e limpa, e no aparelho,
ajustamos o comprimento de onda desejado.
Etapa 2
Nesta etapa, quando a luz incide na cubeta, apenas uma
quantidade consegue ultrapassar a amostra e o aparelho
consegue quantificar a luz que é absorvida (absorbância) e isso
gera um valor.
Etapa 3
Nesta etapa, como nesse momento apenas temos o tampão,
informamos ao aparelho que esse é nosso controle e que essa
leitura não deve ser considerada, zerando o aparelho.
Etapa 4
Nesta etapa, colocamos a amostra com o material purificado em
outra cubeta transparente e limpa e medimos a luz absorvida, que
representa a quantidade da substância analisada.
Lembre-se de que isso depende do comprimento de onda que estamos
pesquisando (280nm, 260nm ou 230nm). Novamente, aqui, quanto
maior for a absorção de luz, maior a quantidade de determinado
material.
Na imagem a seguir, vemos um resultado de uma análise
espectrofotométrica, mostrando um pico de absorção da luz no
comprimento de onda 260nm, o que indica a presença de DNA ou RNA.
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Resultado de uma análise de espectrofotometria.
Com os resultados, podemos verificar a pureza a partir da razão
(divisão) da densidade óptica (OD) no comprimento de onda 260nm pela
OD no comprimento de onda 280nm.
Dizemos que o material genético está puro quando essa relação é maior
ou igual a 1,8. Valores inferiores a esse indicam contaminação com
proteínas e que o processo extrativo não foi realizado de forma correta.
Outra forma de verificar essa pureza seria pela razão entre a OD 260nm
OD 230nm, com material genético considerado puro quando estiver na
faixa entre 1,8-2,2.
Integridade
Integridade avalia se o DNA/RNA extraído está íntegro. Essa avaliação é
feita a partir da técnica de eletroforese. A eletroforese é uma técnica
com uma enorme quantidade de variações e desdobramentos e é
utilizada para os mais variados objetivos. Aqui iremos nos ater ao
princípio básico da técnica e a sua aplicação no controle da integridade
do material que foi extraído.
Esta técnica consiste na migração e separação de moléculas de acordo
com a carga após a geração de um campo elétrico. Ela utiliza diferentes
meios de suporte, como fitas ou membranas de poliacetato de celulose
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e géis de agarose, que apresentam poros por onde as moléculas devem
passar.
Saiba mais
No nosso organismo, as moléculas apresentam diferentes cargas. O
DNA/RNA, devido ao grupamento fosfato, apresenta carga negativa.
Além disso, as moléculas são separadas pelo tamanho.
Para isso, uma pequena quantidade de amostra é aplicada em um gel,
geralmente a agarose, inerte (que não reage com a amostra) em um
poço (local de aplicação da amostra). Em seguida, é gerado um campo
elétrico onde um polo do gel fica com a carga negativa (local onde a
amostra é aplicada) e outra positiva. Como o DNA/RNA possui carga
negativa, migrará para o polo positivo através do gel. No entanto, esse
gel apresenta poros, conferindo resistência ao movimento das
moléculas. Assim, moléculas mais pesadas e maiores ficarão presas no
gel, enquanto as menores e mais leves migram com mais facilidade no
gel.
Esquema da eletroforese para DNA.
Após a eletroforese, podemos detectar o DNA/RNA pela coloração
(normalmente é utilizado o brometo de etídio, um corante que intercala
no DNA) e visualização de bandas de DNA em um equipamento
chamado transiluminador. Se a amostra estiver íntegra, verificamos
apenas uma marca (banda) intensa no gel de eletroforese. No entanto,
caso a nossa amostra esteja fragmentada, essa banda se apresenta
“espalhada” (arraste) ao longo do comprimento do gel, indicando que
existem diversos fragmentos, ou seja, o DNA/RNA não está íntegro.
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Bandas bem de�nidas
Bandas com arraste
Síntese de cDNA
Como aprendemos anteriormente, existem várias técnicas na Biologia
Molecular, PCR, sequenciamento, clonagem e hibridização que são
dependentes da matéria-prima (DNA, na maioria dos casos). Essas
técnicas podem ser utilizadas para diferentes fins, mas nem sempre a
simples extração de DNA/RNA é suficiente para analisar o que se
deseja.
Vamos supor que queremos verificar se a expressão de uma proteína x
está alta ou baixa nas células de um tecido. Para isso, extraímos o DNA
e o material purificado representa todo o DNA da célula, incluindo o
gene x, responsável pela expressão da proteína x. Entretanto, a detecção
do gene x não indica muito sobre a expressão da proteína, uma vez que
não conseguimos saber se ele foi transcrito, se o splicingalternativo
gerou a proteína correta, se o RNAm foi devidamente processado. Nesse
caso, o ideal é avaliar o RNAm, já processado, sem a presença de
íntrons.
Além disso, algumas técnicas utilizam apenas o DNA para realizar a
amplificação e detecção, como PCR.
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Splicing alternativo
Procedimento realizado pelas células para a maturação do RNA
mensageiro (RNAm).
Íntrons
Íntrons são trechos de RNA retirados do RNAm maduro durante o
processamento do RNA.
Por exemplo, queremos ver se uma pessoa tem uma infecção pelo novo
coronavírus (Sars-CoV-2), um vírus de RNA.Nesse caso, a amostra
extraída é o RNA viral, mas é inviável a sua detecção, pois precisamos
de grandes quantidades de material, preferencialmente de DNA, por ser
mais estável. Logo, o material precisa ser multiplicado o suficiente para
poder ser devidamente analisado. Para isso, usamos a técnica do PCR,
que consiste em amplificar uma amostra de DNA.
Então fica uma dúvida: como fazer essa análise? Isso porque, segundo o
dogma central da Biologia, o DNA é transcrito em RNA e o RNA é
traduzido em proteína.
Essa questão foi resolvida por meio de outro vírus, o vírus da
imunodeficiência humana (HIV), que revolucionou a Biologia Molecular.
Vamos entender como?
Este é um vírus de RNA, que após a penetração na célula-alvo, injeta o
RNA viral no citoplasma. Lá, uma proteína do vírus
chamada transcriptase reversa converte o RNA em DNA, esse DNA
entra no núcleo e outra proteína chamada integrase junta o DNA do vírus
com o da célula-alvo. Agora, a célula-alvo é capaz de transcrever o DNA
viral (presente no genoma da célula hospedeira) em RNA viral, que
forma outro vírus de HIV, e assim continua o processo de infecção.
Comentário
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Nesse processo, algo muito curioso acontece: a transcriptase reversa do
vírus é capaz de alterar o dogma central da Biologia, transformando o
RNA em DNA.
E se usássemos essa polimerase na Biologia Molecular para gerar DNA
a partir de, por exemplo, um RNA mensageiro (RNAm)? E assim foi feito.
O DNA obtido a partir do RNA é chamado de cDNA (DNA
complementar). Recebe esse nome pois é complementar ao RNA
molde.
A construção do cDNA é feita em um tubo contendo:
RNA molde: é a sequência de RNA usada para a construção do
cDNA.
Transcriptase reversa: é a polimerase capaz de transcrever o RNA
em cDNA.
Nucleotídeos (A, T, C, G): são unidades funcionais para a síntese do
cDNA.
Íon bivalente de magnésio (Mg2+): é um cofator essencial para o
funcionamento da transcriptase reversa.
Primers: são pequenos fragmentos de DNA fita simples que se
complementam ao RNA para dar início à transcrição reversa.
DNA polimerase: responsável por sintetizar o DNA a partir dos
nucleotídeos presentes.
A síntese do cDNA começa pelo anelamento do primer no RNA, seguido
pelo acoplamento da transcriptase reversa e início da sua atividade,
formando o cDNA no sentido 5’ – 3’. Uma vez formado o cDNA, o
fragmento de RNA usado como molde é degradado pela RNase H, um
domínio do próprio complexo da transcriptase reversa.
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Síntese do cDNA.
Durante a construção do cDNA, uma etapa crítica para termos um cDNA
de boa qualidade é a construção do primers. Existem três estratégias
gerais de construção de primers:
É o primer formado por vários nucleotídeos do tipo timina que se
anela a cauda poli-A do RNAm maduro. A cauda tem esse nome
por ser formada de 80 a 250 resíduos de adenina. A cauda serve
para proteger o RNAm de degradação enzimática durante todo o
processo de locomoção em direção ao ribossomo. A cauda poli-
A é clivada por endonucleases quando o RNAm encontra o
ribossomo. Ele é preferencialmente utilizado quando queremos
fazer cDNA de RNAm. Para o oligo dT é importante que o RNAm
esteja íntegro, uma vez que ele se anela na extremidade 3’ do
molde. Se o RNAm estiver fragmentado, o cDNA vai ser feito
apenas de um pequeno trecho e talvez seja não funcional.
Este primer é feito de pequenas sequências aleatórias que se
anelam a qualquer RNA presente, incluindo rRNA (RNA
ribossomal) e tRNA (RNA transportador). Ele é indicado para
amostras de sequência desconhecida ou de difícil manipulação.
É o primer construído especificamente para um determinado
RNA, sendo utilizado quando se tem um alvo determinado, por
exemplo, diagnosticar um RNA viral. O primer é desenhado de
forma complementar ao RNA viral. Por isso, ao término da
reação, só teremos cDNA se o primer encontrar o seu RNA alvo.
Para o primer específico, é fundamental que toda a sequência do
DNA/RNA seja conhecida.
É importante ressaltar que os três tipos de primers podem ser
combinados, formando um primer com um trecho oligo dT e outro
Oligo dt 
Randômico 
Específico 
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trecho específico. Dessa forma, teremos uma transcrição da porção 3’
de um RNA molde específico ou oligo dT com um randômico, para tentar
formar cDNA de qualquer RNAm do material inicial. A combinação de
primers depende de criatividade do pesquisador e da sua capacidade de
otimizar a síntese do cDNA.
Nesse ponto, temos então uma fita de cDNA íntegra, recém-formada
pela transcriptase reversa e uma fita de RNA ligada ao cDNA
parcialmente degradada pela RNase H. Assim, sintetizamos um RNAm
maduro, sem a presença de íntrons. Esses fragmentos de RNA serão
utilizados como primers de iniciação pela DNA polimerase que irá
construir o DNA complementar ao cDNA.
Com isso, temos finalmente a fita dupla de DNA formada.
Formação da fita dupla de cDNA.
Na imagem, vemos que o RNAm se liga ao primer oligo dT(1). Em
seguida, a transcriptase reversa sintetiza uma fita de cDNA (sequência
de bases representada pela linha azul), a partir do primer oligo dT ligado
ao RNA(2). A RNAse H quebra o RNAm associado ao cDNA recém
sintetizado. Os dNTPs presentes no meio reacional são usados para a
construção de uma nova fita de DNA complementar ao cDNA, pela ação
da DNA polimerase(3). Com isso, a fita dupla de cDNA é formada (4).
A construção de cDNA tem como funções principais:
Possibilitar a construção de uma biblioteca genômica,
estabelecendo relações de quais genes podem expressar
determinadas proteínas, o que pode ser aplicado para elaboração
de terapias, estudo de espécies, doenças etc.
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Possibilitar a amplificação de RNA pela PCR.
Determinar o nível de expressão gênica de uma determinada
proteína no organismo.
O cDNA pode ser utilizado na clonagem, criação de bibliotecas,
testes de microarranjo, detecção de SNP etc.
Clonagem
Formação de novos trechos de DNA em outro indivíduo.
Bibliotecas
São responsáveis por identificação e armazenamento de informação
gênica.
Microarranjo
Serve como uma coleção de DNAs presos em uma superfície sólida, para
estudos de genotipagem, expressão, entre outros.
SNPs
Do inglês Single Nucleotide Polymorphism, são variações pontuais
encontradas ao longo do DNA, isto é, são diferenças num único
nucleotídeo.
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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Vimos que existem diferentes técnicas para avaliação da qualidade
das amostras de DNA e RNA obtidas. Além disso, vimos que uma
das técnicas é a mais utilizada para quantificar as amostras. Sobre
esse assunto, marque a alternativa correta.
A
Espectrofotometria: conseguimos quantificar a
partir do valor de luz refratada.
B
Eletroforese: quantificamos a partir do tamanho da
banda final gerada.
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Parabéns! A alternativa C está correta.
A técnica mais utilizada para quantificação de amostras de RNA e
DNA é a fluorometria, a partir da detecção da fluorescência,
podemos inclusive diferenciar o RNA e o DNA com essa técnica.
Também podemos usar a espectrofotometria, mas esta é limitada,
uma vez que RNA e DNA se encontram na mesma faixa de
absorção de luz.
Questão 2
A extraçãode DNA/RNA é uma importante técnica de biologia
molecular a qual pode ser empregada em amostras clínicas,
alimentos, forenses, plantas entre outras. A partir da extração de
DNA/RNA, é possível a realização de outras técnicas moleculares
como a quantificação de material genético e reação em cadeia de
polimerase (PCR). Sobre a técnica de extração de DNA/RNA,
responda qual desses elementos abaixo é empregado na extração
de DNA/RNA?
C
Fluorometria: quantificamos a partir da intensidade
da fluorescência.
D
PCR: quantificamos a partir da quantidade de DNA
final gerado.
E
Precipitação em NaCl: quantificamos a partir do
tamanho do pellet gerado.
A Transcriptase reversa
B Nucleotídeos
C Solução de fenol/clorofórmio
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Parabéns! A alternativa C está correta.
Todos os itens citados são utilizados em algum momento na
síntese do cDNA, com exceção da solução de fenol/clorofórmio.
Esta é utilizada na extração de DNA/RNA. A transcriptase reversa
faz a fita de cDNA a partir do RNA, os nucleotídeos são usados para
a construção do cDNA, o RNA molde é o que queremos usar para
ter o DNA complementar e o Mg2+ é um cofator da reação da
transcriptase reversa.
Considerações �nais
Ao longo desta jornada, aprendemos que é possível usar o método
científico para quase todas as ações do nosso dia a dia. Vimos também
que o desenho experimental é uma ramificação do método científico.
Visitamos todas as suas etapas, variáveis, hipóteses, erros e o tipo de
amostragem que devemos utilizar para chegar a uma conclusão
confiável.
Com o desenho experimental em mente, partimos para as etapas pré-
analíticas de transporte, coleta e armazenamento do material biológico
seguido da extração de DNA e RNA, e o controle de qualidade do
purificado obtido.
Por fim, entendemos a importância do cDNA e a técnica de construção
do cDNA. Esse foi, sem dúvida um marco que possibilitou o
aprofundamento de diversas técnicas da Biologia Molecular. Ao longo
dos anos, a Biologia Molecular está sendo desenovelada, mostrando a
sua face e permitindo que você adentre ainda mais em seus conceitos.
Agora cabe a você continuar esta jornada!
D RNA molde
E Mg2+
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Podcast
Ouça agora um resumo do tema estudado.
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Explore +
Para saber mais sobre os assuntos tratados neste tema:
Assista:
Ao vídeo Como é feito um TESTE DE DNA?
Ao vídeo Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose.
Leia:
Aprenda a fazer extração de DNA em casa, Hemocentro da FMRP-
USP, e conheça a técnica de extração utilizando cebola e materiais
que temos dentro de casa.
O artigo Coleta, transporte e armazenamento de amostras para
diagnóstico molecular, de Murilo Rezende Melo e colaboradores
(2010).
Referências
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PCR-inhibitory components in blood cells. J Clin Microbiol, v. 39, p. 485-
93, 2001.
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Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 1987.
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denaturation and multimerization of DNA. Science, v. 271, p. 222, 1996.
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buccal cell samples collected with mouthwash. Cancer Epidemiology
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