AMARAL~1

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS 
 
 
 
 
 
ESTUDO DA ATIVIDADE EDEMATOGÊNICA E DOS EFEITOS DE 
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS ORIUNDAS DA ANÊMONA MARINHA 
Bunodosoma cangicum NA CONTRATILIDADE DO MÚSCULO LISO 
AÓRTICO DE RATO 
 
 
 
 
PATRICIA CAMPÊLO DO AMARAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fortaleza - CE 
2004 
PATRICIA CAMPÊLO DO AMARAL 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO DA ATIVIDADE EDEMATOGÊNICA E DOS EFEITOS DE 
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS ORIUNDAS DA ANÊMONA MARINHA 
Bunodosoma cangicum NA CONTRATILIDADE DO MÚSCULO LISO 
AÓRTICO DE RATO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fortaleza – CE 
2004 
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico 
em Ciências Fisiológicas da Universidade Estadual do Ceará, 
para a obtenção do título de Mestre em Ciências Fisiológicas. 
 
Orientador: Prof. Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho 
Universidade Estadual do Ceará 
Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas 
 
 
 
Título da Dissertação: Estudo da atividade edematogênica e dos efeitos de 
substâncias bioativas oriundas da anêmona marinha Bunodosoma cangicum na 
contratilidade do músculo liso aórtico de rato 
 
Autora: Patricia Campêlo do Amaral 
 
Defesa em: ____/____/____ Conceito obtido: _______________ 
 
 
Banca Examinadora 
 
 
___________________________________________ 
Prof. Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho (Orientador) 
Universidade Estadual do Ceará 
 
 
______________________________________ 
Prof. Dr. Bruno Andrade Cardi (Co-orientador) 
Universidade Estadual do Ceará 
 
 
_______________________________________ 
Profa. Dra. Gisela Costa Camarão 
Universidade Federal do Ceará 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para todos aqueles que estão ao meu 
lado, me orientando e acreditando em 
mim. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Se podeis acredita, tudo é possível 
àquele que crê”. 
Jesus Cristo (Marcos 6, 14-28) 
AGRADECIMENTOS 
 
 
 A Deus, Pai de Divina Sabedoria e Amor, por sempre estar comigo, dando-
me forças, oportunidades e luz. 
 
 À minha amada Mãe, uma rosa com cheiro de mar, pela minha formação 
moral, por sua dedicação, por sempre acreditar em mim e, acima de tudo, por sua 
importância em minha vida. 
 
 A meu pai, Raimundo (in memorian), por seu amor e por estar sempre em 
minhas lembranças como pai amoroso, dedicado e companheiro. 
 
 A meu segundo pai, Moacir, por seu amor, pela minha formação 
humanitária, intelectual, pelos ensinamentos e amizade. 
 
 Ao Prof. Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho por ter me recebido e acolhido 
em seu laboratório, pela orientação, confiança e estímulo. Muito obrigada por me 
mostrar o caminho em direção à ciência. 
 
 Ao Prof. Dr. Bruno Andrade Cardi pelo meu despertar em relação à ciência 
experimental, pelo seu estímulo, otimismo e conselhos sempre tão propícios. 
 
 À Profa. Dra. Gisela Costa Camarão por ter aceitado o convite para 
participar da minha banca examinadora. 
 
 Ao Prof. Dr. Carlos Iberê Freitas por ter participado de minha vida 
acadêmica como professor, pesquisador e como amigo. 
 
 À Profa. Dra. Helena Alves de Carvalho Sampaio por ter sido minha 
primeira orientadora, por ter me aberto as portas da iniciação científica e por ser 
um exemplo como pesquisadora, professora e nutricionista. 
 
 À Profa. Msc. Maria da Penha Baião Passamai, por ter participado 
diretamente de minha iniciação científica e pelo muito que me ensinou. 
 
 À Profa. Msc. Maria Luisa Pereira Melo por seu apoio, amizade, por 
também ter feito parte de minha vida acadêmica como professora e orientadora, e 
por sempre acreditar em mim. 
 
 Ao meu grande amigo, Clemilson, que participou diretamente dos 
experimentos realizados como meu braço direito, dando-me apoio, força e 
estímulo. Muito obrigada pelas conversas, pelos momentos de aprendizado, 
incerteza e pelas alegrias compartilhadas, mas acima de tudo, obrigada pela sua 
amizade. 
 
À Denise por sua disponibilidade, apoio e ajuda, Dóris pela ajuda sempre 
tão preciosa, Rozângela e Delane pela simpatia e presença. 
 
Aos queridos amigos do Curso de Mestrado em Ciências Fisiológicas: 
Adriano, Érica, Everardo, Jackson, Karla, Michele, Neily, Ricardo, Rosinha e 
Vanesca por terem participado de muitos momentos importantes de minha vida. 
 
Aos alunos Alexandre, Amanda, Marcelo, Silvane e Sâmara pela 
convivência tão agradável e educativa, além da amizade. 
 
Ao Leon que muito me ajudou, pelas conversas, pela disponibilidade e pela 
amizade. 
 
À Patrícia e Claudinha por serem amigas fiéis, sempre presentes e 
dispostas a ajudar. 
 
Ao Danilo pelas conversas, pelo otimismo e estímulo, por sua paciência, 
participação tão indispensável no desenvolvimento dos experimentos e por sua 
amizade. 
 
À Luciana que tanto me ajudou, com idéias e conselhos tão preciosos, por 
suas habilidades em informática, por sua disponibilidade e pela valiosa amizade. 
 
À querida Juliana, amiga de todas as horas, para mim uma irmã, sempre 
tão prestativa e fiel. 
 
Aos meus amigos Eduardo e Marcelo por sua amizade, pela ajuda de 
fundamental importância e participação direta em muitos momentos de minha vida 
acadêmica e pessoal. 
 
À Rosa Germana, uma companheira fiel, uma profissional competente, um 
exemplo de vida e uma amiga de todas as horas. 
 
Ao Ricardo Freitas que me ajudou com suas idéias e experiência, 
permitindo a abertura de novas perspectivas nesta pesquisa. Muito obrigada pela 
disponibilidade, acolhimento e amizade. 
 
Ao Emanuel e Pedro Marcos por me auxiliarem com seus conhecimentos e 
experiência. 
 
A todos que fazem parte dos laboratórios de Bioquímica, Eletrofisiologia, 
Farmacologia Cardiovascular e Biotecnologia Celular, Farmacologia dos Canais 
Iônicos e Química Orgânica por toda a ajuda e momentos compartilhados. 
 
Ao Marcos Antonio Machado Ferreira Lima pelo bom humor, pela 
disponibilidade, ajuda e amizade. 
 
Ao Sr. Bento pela disponibilização dos animais. 
 
Aos animais usados nos experimentos, pela vida em prol da ciência. 
 
A todos que direta ou indiretamente contribuíram na realização deste 
trabalho. 
 
Ao Fundo Cearense de Apoio à Pesquisa (FUNCAP) pelo auxílio financeiro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
 
Alguns acidentes com anêmonas marinhas têm sido relatados. A atividade 
inflamatória é dos principais sinais observados, porém poucos estudos, sobre 
essa atividade, foram realizados com anêmonas marinhas. Portanto, este 
trabalho tem como objetivo estudar a atividade edematogênica e os efeitos de 
substâncias bioativas presentes em extratos da anêmona marinha 
Bunodosoma cangicum na contratilidade do músculo liso vascular. Foram 
obtidos três extratos brutos (A1, A2 e A3) que foram fracionados em HPLC 
com uma coluna C18, onde se observou que o animal total (AI) foi um somatório 
das frações dos extratos A2 e A3, isso foi também observado no perfil 
eletroforético. Os extratos A1 e A2, quando inoculados em camundongos i.v., 
apresentaram atividade neurotóxica e letal. A cangitoxina (CGX, fração 13 
isolada do extrato A1) mostrou também atividade neurotóxica e letal, já o 
ANDE (fração 30 isolada do extrato A1) produziu atividade depressora central. 
Tanto os três extratos como a CGX e o ANDE apresentaram atividade 
edematogênica na pata de camundongos. O extrato A1 mostrou atividade 
relaxante dependente de endotélio em anéis aórticos de ratos. Portanto o 
extrato A1 produziu atividade pró-inflamatória, abrindo perspectivas para a 
investigação da atividade pró-inflamatória de substâncias bioativas oriundas 
desses animais. E a CGX, fração isolada do extrato A1, possui 48 resíduos de 
aminoácidos e uma homologia com os peptídeos deanêmonas da classe tipo 1 
que agem em canais de sódio dependentes de voltagem, sugerindo que esse 
peptídeo possa ser utilizado como uma ferramenta fisiofarmacológica para o 
estudo desses canais iônicos. 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 
Some accidents with sea anemones have been reported. The inflammatory activity 
is a principal signal observed, however few studies, about this activity, were 
accomplished with sea anemones. Therefore, this work has as objective study the 
edematogenic activity and the Bunodosoma cangicum bioactive substances effects 
on the vascular smooth muscle contratility. It was obtained three crude extracts 
(A1, A2 and A3) that were fractionated by HPLC using a C18 column, where it was 
observed that the total animal (AI) was a union of the fractions isolated of the 
extracts A2 and A3, that was also observed in the eletroforético profile. The 
extracts A1 and A2, when inoculated in mice i.v., presented neurotoxic and lethal 
activity. The cangitoxin (CGX, fraction 13 isolated of the extract A1) also showed 
neurotoxic and lethal activity, already the ANDE (fraction 30 isolated of the extract 
A1) produced central depressive activity. As much the three extracts as CGX and 
ANDE presented edematogenic activity in the paw of mice. The extract A1 showed 
a endotelium dependent relaxing activity in mice aortics rings. Therefore the extract 
A1 produced inflammatory activity, opening perspectives for the investigation of 
this activity in substances bioactives originating from these animals. And CGX, 
isolated fraction of the extract A1, possesses 48 amino acids residues and a 
homology with the anemones peptides of the class type 1 that act in channels of 
sodium voltage dependent, suggesting that this peptide can be used as a 
fisiofarmacologic tool for the study of those ionic channels. 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
LISTA DE FIGURAS ................................................................................. xv 
LISTA DE GRÁFICOS .............................................................................. xvii 
LISTA DE QUADROS .............................................................................. xix 
LISTA DE TABELAS ................................................................................ xx 
LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................... xxi 
 
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................... 01 
 1.1. Biodiversidade: uma fonte de benefícios ........................................ 01 
 1.2. Toxinas animais como ferramentas fisiofarmacológicas ................. 02 
 1.3. Animais marinhos como alvo de estudos fisiofarmacológicos ........ 03 
 1.3.1. Anêmonas marinhas ................................................................. 06 
 1.3.1.1. Biologia .............................................................................. 07 
 1.3.1.1.1. Nematocistos ............................................................... 08 
 1.3.1.2. Anêmonas marinhas, encontradas no litoral nordestino, 
 como modelos biológicos para a descoberta de novas 
 substâncias biologicamente ativas ................................... 
 
 
11 
 1.3.1.3. Componentes bioativos encontrados nas 
 anêmonas marinhas ........................................................ 
 
12 
 1.3.1.3.1. Peptídeos que agem em canais de sódio 
 dependentes de voltagem ........................................ 
 
13 
 1.3.1.3.2. Peptídeos que agem em canais de potássio 
 dependentes de voltagem ......................................... 
 
15 
 1.3.1.3.3. Peptídeos e proteínas com atividade citolítica .......... 16 
 1.3.1.3.4. Inibidores de proteases ............................................. 18 
 1.3.1.4. Anêmonas marinhas e substâncias pró-inflamatórias 18 
 1.3.1.4.1. Inflamação ................................................................. 19 
 
2. OBJETIVOS ......................................................................................... 25 
 2.1. Geral ................................................................................................ 25 
 2.2. Específicos ...................................................................................... 25 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................... 26 
 3.1. Materiais .......................................................................................... 26 
 3.1.1. Substâncias e reagentes ........................................................... 26 
 3.1.2. Aparelhos e instrumentos .......................................................... 27 
 3.2. Métodos ........................................................................................... 29 
 3.2.1. Modelos Animais ....................................................................... 29 
 3.2.2. Coleta de anêmonas marinhas da espécie 
 Bunodosoma cangicum .............................................................. 
 
29 
 3.2.3. Processamento do material coletado ........................................ 32 
 3.2.4. Purificação dos extratos obtidos ................................................ 32 
 3.2.5. Análise do perfil eletroforético dos extratos brutos ................... 33 
 3.2.6. Estudos Farmacológicos ........................................................... 34 
 3.2.6.1. Estudo dos efeitos comportamentais agudos in vivo .......... 34 
 3.2.7. Determinação do grau de pureza da CGX e do ANDE ............. 35 
 3.2.8. Edema de pata .......................................................................... 36 
 3.2.9. Atividade mecânica do músculo liso de aorta ........................... 38 
 3.2.10. Determinação da seqüência de aminoácidos da CGX............. 40 
 3.2.11. Análise estatística .................................................................... 41 
 
4. RESULTADOS ..................................................................................... 42 
 4.1. Perfil cromatográfico dos extratos brutos da B. cangicum .............. 42 
 42. Perfil eletroforético dos extratos brutos da B. cangicum ................. 47 
 4.3. Estudo dos efeitos comportamentais agudos in vivo ...................... 48 
 4.4. Determinação do grau de pureza da cangitoxina e do ANDE ......... 50 
 4.5. Edema de pata ................................................................................ 53 
 
 4.6. Atividade mecânica do músculo liso de aorta ................................. 68 
 4.7. Determinação da Seqüência de Aminoácidos da CGX ................... 73 
 
5. DISCUSSÃO ........................................................................................ 74 
 
6. CONCLUSÕES .................................................................................... 85 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 87 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
 
FIGURA PÁGINA 
1. Serpente Bothrops jararaca .................................................................. 03 
2. Biodiversidade marinha ........................................................................ 04 
3. Cnidários: A – Hidra, B – Água-viva em formato de caixa, C – Água-
viva verdadeira e D – Anêmona marinha (Bunodosoma cavernata) ........ 
 
05 
4. Recife de corais .................................................................................... 06 
5. Representação geral daestrutura corporal de anêmonas marinhas ... 07 
6. Representação de um cnidócito ........................................................... 08 
7. Animal da espécie Bunodosoma cangicum encontrado na costa norte 
de Fortaleza, Ceará .................................................................................. 
 
30 
8. Mapa do litoral norte de Fortaleza ........................................................ 31 
9. HPLC com coluna preparativa de fase reversa C18 ............................. 33 
10. Aparelho vertical para gel de eletroforese .......................................... 34 
11. HPLC com coluna analítica de fase reversa C18 ................................ 36 
12. Plestismômetro improvisado para camundongos ............................... 37 
13. Paquímetro Mitutoyo .......................................................................... 38 
14. Câmara muscular com capacidade de 10mL ..................................... 39 
15. Cromatografia líquida de alta eficiência do extrato bruto do animal 
intacto (A1) na concentração de 100mg/mL, em coluna preparativa C18 
de fase reversa (Shim-pack PREP 25 x 250mm)...................................... 
 
 
43 
16. Cromatografia líquida de alta eficiência do extrato bruto do animal 
intacto (A1) na concentração de 10mg/mL, em coluna preparativa C18 
de fase reversa (Shim-pack PREP 25 x 
250mm)..................................................................................................... 
 
 
 
44 
17. Cromatografia líquida de alta eficiência do extrato bruto com 
descarga de cnidócitos (A2) na concentração de 10mg/mL, em coluna 
preparativa C18 de fase reversa ............................................................... 
 
 
45 
18. Cromatografia líquida de alta eficiência do extrato bruto da 
descarga dos cnidócitos (A3) na concentração de 10mg/mL, em coluna 
preparativa C18 de fase reversa ............................................................... 
 
 
46 
19. Perfil eletroforético dos extratos brutos da B. cangicum A1, A2 e A3 
.......................................................................................................... 
 
47 
20. CLAE da cangitoxina (CGX) em coluna analítica de fase reversa C18 51 
21. CLAE do ANDE em coluna analítica de fase reversa C18 .................. 52 
22. Registro representativo do efeito do extrato A1 em aorta com e sem 
endotélio contraídas com fenilefrina.......................................................... 
 
69 
23. Registro representativo do efeito do extrato A1 e da solução de 
Tyrode em aortas sem endotélio............................................................... 
 
71 
24. Seqüências de aminoácidos da CGX ................................................ 73 
25. Modelo estrutural em 3D da CGX ...................................................... 83 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE GRÁFICOS 
 
 
GRÁFICO PÁGINA 
1. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A1, num pletismômetro ................................................................. 
 
54 
2. Área/Curva do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A1, medido num pletismômetro .................................................... 
 
54 
3. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A1, num paquímetro ..................................................................... 
 
55 
4. Área/Curva do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A1, num paquímetro ..................................................................... 
 
55 
5. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A2, num pletismômetro ................................................................ 
 
57 
6. Área/curva do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A2, num pletismômetro ................................................................ 
 
57 
7. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A2, num paquímetro .................................................................... 
 
58 
8. Área/curva do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A2, num paquímetro .................................................................... 
 
58 
9. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A3, num pletismômetro ................................................................ 
 
60 
10. Área/curva do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A3, num pletismômetro ................................................................ 
 
60 
11. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A3, num paquímetro .................................................................. 
 
61 
12. Área/curva do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
extrato A3, num paquímetro .................................................................... 
 
61 
13. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com CGX, 
num pletismômetro ................................................................................... 
 
63 
14. Área/curva do volume da pata de camundongos, inoculada com a 
CGX, num pletismômetro ......................................................................... 
 
63 
15. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com a 
CGX, num paquímetro ............................................................................. 
 
64 
16. Área/curva do volume da pata de camundongos, inoculada com a 
CGX, num paquímetro ............................................................................. 
 
64 
17. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
ANDE, num pletismômetro ....................................................................... 
 
66 
18. Área/curva do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
ANDE, num pletismômetro ....................................................................... 
 
66 
19. Medida do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
ANDE, num paquímetro ........................................................................... 
 
67 
20. Área/curva do volume da pata de camundongos, inoculada com o 
ANDE, num paquímetro ........................................................................... 
 
67 
21. Efeito do extrato A1 em anéis de aortas com e sem endotélio 
contraídos com fenilefrina ........................................................................ 
 
70 
22. Efeito do extrato A1 e da solução de Tyrode em anéis de aortas 
sem endotélio contraídos com fenilefrina ................................................. 
 
72 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE QUADROS 
 
 
QUADRO PÁGINA 
1. Comparação da seqüência de aminoácidos da cangitoxina (CGX) 
com as de outras anêmonas .................................................................... 
 
84 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
 
TABELA PÁGINA 
1. Comparação do modelo desenvolvido para a cangitoxina com 
modelos satisfatórios de proteínas presentes no Banco de Dados de 
Proteínas (PDB) ....................................................................................... 
 
 
83 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
 
g Micrograma 
L Microlitro (s) 
m Micrômetro 
5 HT Serotonina 
ºC Grau (s) centrígrado (s) 
A Ampere 
AA Ácido araquidônico 
Ach Acetilcolina 
A1 Animal intacto 
AMPc Adenosina monofosfato cíclica 
ANDE Fração 30 do extrato A1 
Arg Arginina 
ATP Adenosina trifosfato 
AUFS Unidade de absorbância 
BPPs Peptídeos potenciadores da bradicinina 
Ca+2 Cálcio 
CaCl2 Cloreto de cálcio 
CCCS Complexo cnidócito/célula suporte 
CGX Cangitoxina 
CGX3D Modelo tridimensional da CGX 
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência 
CO2Carbogênio 
COX Ciclooxigenase 
Cys Cisteína 
Da Dalton 
A3 Descarga dos cnidócitos 
EGTA Ácido N, N, N’, N’- tetraacético 
END Com endotélio 
S/END Sem endotélio 
G Grama 
IL-1 Interleucina-1 
IP3 Inositoltrifosfato 
i. v. Intravenoso 
K+ Potássio 
KATP Canais de K+ sensíveis ao ATP 
KCl Cloreto de potássio 
KDa Quilodalton 
Kg Quilograma 
Km2 Quilometro quadrado 
mA Miliamper 
MgCl2 Cloreto de magnésio 
Min Minuto 
mL Mililitro 
Mm Milímetro 
mM Milimol 
MS/MS Seqüenciamento por espectroscopia de massa 
mV Milivolt 
Na+ Sódio 
NaCl Cloreto de sódio 
NaHCO3 Bicarbonato de sódio 
NaH2PO4 Fosfato de sódio monofásico 
Ng Nanograma 
NO Óxido nítrico 
NOS Óxido nítrico sintase 
O2 Oxigênio 
P Peso 
PAF Fator de ativação plaquetária 
PDB Banco de dados de proteínas 
PGI2 Prostaciclina 
Phe Fenilefrina 
PKA Proteína quinase dependente de AMPc 
PLA2 Fosfolipase A2 
ROCC Canais de cálcio operados por agonista 
A2 Anêmonas que sofreram descarga dos cnidócitos 
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida 
V Volume 
VDCC Canais de cálcio operados por voltagem 
VP-CGX CGX reduzida por vinilpiridiletil 
TFA Ácido trifluoracético 
TR Solução nutritiva de Tyrode 
Trp Triptofano 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 
1.1. Biodiversidade: uma fonte de benefícios 
 
 
 Biodiversidade parece, à primeira vista, ser um conceito simples (Martens et 
al., 2003) como o conjunto de toda a variedade e variabilidade de vida na Terra 
(Taneja e Koziell, 2003). Mas, na realidade, esse conceito é muito mais complexo, 
pois é usado para indicar a diversidade de espécies (em número), a diversidade 
genética (dentro das espécies) e a diversidade ecológica (de ecossistemas) 
(Norse et al., 1986 apud Harper e Hawksworth, 1994; Martens et al., 2003). De 
acordo com Loomis e White (1996), a biodiversidade produz muitos benefícios 
como: o estímulo do turismo e recreação, educação e informação, além da 
preservação de áreas naturais; a utilização do melhoramento genético e o 
desenvolvimento do controle biológico na agricultura; o uso da informação 
genética no desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos úteis para a saúde 
humana, (Dimasi et al., 1991; Mcneely, 2003; Martens et al., 2003; Mendonça et 
al., 2003) dentre outros. 
 
 A biodiversidade tem sido também uma importante fonte para a descoberta 
de novas substâncias naturais que representam cerca de 50% de todas as drogas 
medicinais (Braz-Filho, 1994; Clarke, 1997). Por séculos, as plantas têm sido a 
maior fonte de compostos ativos importantes para o desenvolvimento de produtos 
farmacêuticos. Nos últimos anos, a pesquisa de novos produtos naturais tem sido 
intensificada com a inclusão de outras fontes além das plantas (Clarke, 1997). 
 
 
 
 
 
1.2. Toxinas animais como ferramentas fisiofarmacológicas 
 
 
 As substâncias bioativas, que ocorrem no reino animal, podem funcionar 
como venenos ou toxinas que são utilizados na defesa contra predadores e 
microorganismos, e na obtenção de alimento. Essas substâncias são introduzidas 
em suas vítimas por meio de uma picada como é o caso dos celenterados, 
moluscos e vários artrópodos (como insetos, aranhas e escorpiões); por meio de 
mordida, como ocorre com as serpentes; ou são produzidas por bactérias, 
dinoflagelados e outros microorganismos (Daly, 1995). 
 
 Durante a história da humanidade, o envenenamento por toxinas animais 
sempre fascinou o homem. Essas toxinas têm contribuído significativamente para 
o crescimento do conhecimento sobre a fisiologia e farmacologia humanas 
(Karalliedde, 1995) por possibilitarem o estudo de canais iônicos e receptores, e 
possuírem atividade terapêutica (Harvey et al., 1998). Por isso algumas dessas 
toxinas têm sido alvos de pesquisas que comprovaram sua utilização para o 
desenvolvimento de novas drogas. Como exemplo, pode-se citar o uso dos 
peptídeos potenciadores da bradicinina (BPPs) no desenvolvimento do captopril e 
enalapril, drogas utilizadas mundialmente no tratamento da hipertensão arterial 
(Unger e Gohlke, 1994). Esses peptídeos foram isolados do veneno da serpente 
brasileira Bothrops jararaca (Figura 1) e inibem a atividade da enzima conversora 
da angiotensina (Camargo e Ferreira, 1971; Harvey et al., 1998). 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 – Serpente Bothrops jararaca. Esse animal produz peptídeos 
potenciadores da bradicinina (BPPs). Fonte: www.google.com.br. 
 
 
1.3. Animais marinhos como alvo de estudos fisiofarmacológicos 
 
 
Durante milhões de anos, os organismos desenvolveram uma seleção de 
substâncias químicas que podem estar envolvidas em diversas fases do seu 
desenvolvimento ontogenético (Kittredge et al., 1974). Os venenos ocorrem em 
todos os Phyla do reino animal. A sua utilização biológica em mecanismos de 
defesa e para obtenção de alimentos, pode ser um resultado da evolução 
acidental de uma seqüência metabólica, com conseqüente produção de 
determinada substância nociva para outros membros da comunidade, dando uma 
vantagem seletiva para o clone que adquiriu esta capacidade (Kittredge et al., 
1974). 
 
 Os oceanos ocupam mais de 70% da superfície da Terra e 90% do volume 
de sua biosfera, documentando que a vida (biodiversidade marinha, Figura 2) 
existente nesta parte do planeta é um enorme desafio (Decker e O’Dor, 2003). 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 – Biodiversidade marinha. Fonte: www.google.com.br. 
 
 Segundo Bourée e Laçon (2002) o envenenamento proveniente de animais 
aquáticos pode ocorrer por meio do contato cutâneo com suas células urticantes 
como é o caso das medusas, corais e anêmonas marinhas; por picada como, por 
exemplo, de moluscos (Conus sp.) e equinodermos; e por mordida, como é o caso 
das serpentes marinhas. 
 
Os produtos oriundos de animais marinhos têm recebido uma atenção 
especial dos químicos e farmacologistas durante as últimas décadas, onde mais 
de 5000 novos metabólitos foram relatados. Entre esses compostos, uma atenção 
particular tem sido dada àqueles que possam atuar como ferramentas de uso 
fisiofarmacológico e com ação potencial no tratamento de doenças humanas ou 
como pesticidas para uso na agricultura (Ireland et al., 1993; Karalliedde, 1995). 
 
Entre as toxinas de animais marinhos mais estudadas do ponto de vista 
biomédico, nas últimas duas décadas, pode-se citar: as que atuam em canais 
iônicos e receptores de membrana no sistema nervoso central, como 
tetrodotoxina, saxitoxina e peptídeos biologicamente ativos de anêmonas 
marinhas; agentes anticancerígenos como o arabinosil citosina e antivirais como o 
ara-A; promotores de tumores como a teleocidina A-1 e aplisiatoxina; e agentes 
 
anti-inflamatórios como a manoalida e lufarielolida (Ireland et al., 1993; 
Karalliedde, 1995). 
 
 Uma análise da biodistribuição dos compostos bioativos oriundos de 
animais marinhos mostra que a maioria (93%) é produzida por quatro grupos: 
macroalgas, celenterados, equinodermos e esponjas (Ireland et al., 1993). Dentre 
esses grupos, os celenterados ou cnidários, que são animais invertebrados 
predominantemente marinhos, podem ser considerados potenciais fontes de 
biofármacos como, por exemplo, corais que produzem agentes antibióticos e 
anêmonas marinhas cujas toxinas agem em canais iônicos (Mackie, 2002). 
 
 As anêmonas e corais são cnidários pertencentes à classe Antozoa, de 
acordo com Barnes (1984). Além da Antozoa, existem mais três classes de 
celenterados ou cnidários: a Hidrozoa (Hidra), a Cubozoa (água-viva em formato 
de caixa) e a Sifozoa (água-viva verdadeira) (Barnes, 1984) (Figura 3). 
 
 
 
 
Figura 3 – Cnidários: A – Hidra (Hidrozoa), B – Água-viva em formato de caixa 
(Cubozoa), C – Água-viva verdadeira (Sifozoa) e D – Anêmona marinha 
(Bunodosoma cavernata) (Antozoa). Fonte: www.google.com.br. 
A C 
B D 
 
Os antozoários são cnidários polipóides solitários ou coloniais nos quais o 
estágiomeduzóide está completamente ausente. Esta é a maior das classes dos 
cnidários, contendo mais de 6000 espécies. Pertencem a essa classe as 
anêmonas marinhas, corais, gorgônias e renilas (Barnes, 1984). Segundo Nagai et 
al. (2002), as toxinas desses animais têm sido extensivamente estudadas. 
 
 
1.3.1. Anêmonas marinhas 
 
 
As anêmonas marinhas habitam águas costeiras em todo mundo, sendo 
particularmente abundantes nos oceanos tropicais. Freqüentemente vivem 
aderidas a rochas, conchas ou madeira submersas sendo que algumas formas 
cavam no lodo ou na areia (Barnes, 1984). Esses animais também são bastante 
encontrados em recifes de corais (Figura 4) (Mitchelmore et al., 2002). 
 
 
 
 
Figura 4 – Recife de corais. Habitat onde anêmonas marinhas vivem em simbiose 
com outros organismos. Fonte: www.google.com.br. 
 
Esses antozoários, considerados a evolução mais primitiva dos 
metazoários, podem produzir várias toxinas que são inoculadas por um aparato 
celular específico para tal atividade. Portanto, apesar de serem animais primitivos, 
os antozoários são biologicamente bem organizados (Jiang et al., 2002). 
 
 
1.3.1.1. Biologia 
 
 
A maior parte do corpo de uma anêmona é formada por uma pesada 
coluna. Na extremidade aboral da coluna existe um disco podal achatado, para 
adesão. Na altura da cavidade oral, a coluna alarga-se um pouco para formar um 
disco oral, que pode ter de oito a centenas de tentáculos ocos. No centro do disco 
oral encontra-se uma boca em forma de fenda apresentando em uma ou ambas 
extremidades um sulco ciliado chamado sifonoglifo, dando, assim, uma simetria 
radial ou bilateral a esses animais. A boca leva a uma faringe achatada que se 
estende por cerca de dois terços do interior da coluna. Essa faringe é mantida 
fechada e achatada devido à pressão da água na cavidade gastrovascular (Figura 
5) (Barnes, 1984). 
 
 
 
Figura 5 – Representação geral da estrutura corporal de anêmonas marinhas. 
Fonte: www.google.com.br. 
 
Os tentáculos, ligados ao disco oral, contém células especializadas (os 
cnidócitos) equipadas com organelas, os nematocistos, que possuem um papel 
muito importante na defesa contra predadores e captura de presas (Norton, 1991; 
Santamaría et al., 2002). 
 
 
1.3.1.1.1. Nematocistos 
 
 
 Os nematocistos (Figura 6) são organelas específicas presentes nos 
cnidócitos. Esses são constituídos de uma cápsula, repleta de fluido, que possui 
em seu interior um túbulo dobrado e invertido (Salleo et al., 1996). Em resposta a 
um estímulo apropriado, os nematocistos são ejetados das anêmonas em direção 
a seu alvo e, dependendo do tipo de cnidócito, eles enlaçam, perfuram ou aderem 
à presa ou predador (Kass-Simon e Scappaticci, 2002). 
 
 
 
 
Figura 6 – Representação de um cnidócito. Nessa célula, o nematocisto encontra-
se em seu estado desativado (A), no início de sua explosão (B), durante a 
liberação do filamento ou túbulo (C) e descarregado (D). Fonte: 
www.google.com.br. 
 
 A B C D 
Nos cnidários há 28 tipos de cnidócitos distintos morfologicamente, que são 
divididos em três categorias diferentes: nematocistos (25 tipos diferentes), 
espirocistos (2 tipos) e pticocistos (1 tipo) (Kass-Simon e Scappaticci, 2002). Os 
animais pertencentes à classe Anthozoa contêm seis tipos de nematocistos, além 
de possuírem espirocistos. Dentre esses nematocistos, dois são exclusivos desta 
classe (Mariscal, 1974 apud Kass-Simon e Scappaticci, 2002). 
 
Os espirocistos são adaptados para aderir à presa e se distinguem por 
possuir uma cápsula fina com um espiral longo enrolado em seu interior, essas 
organelas não possuem atividade perfurante. Já os nematocistos possuem uma 
cápsula espessa e servem para perfurar presas ou predadores (Thorington e 
Hessinger, 1996; Kass-Simon e Scappaticci, 2002). 
 
Os nematocistos se localizam predominantemente nos tentáculos, 
conferindo a estas estruturas um papel de sensores e efetores, o que os torna 
órgãos especializados para alimentação e predação (Kass-Simon e Scappaticci, 
2002). 
 
A descarga dessas organelas in situ requer uma estimulação sensorial que 
envolve eventos intracelulares e intercelulares, tornando isso um processo muito 
bem orquestrado. Em geral, a combinação de um estímulo químico, 
apropriadamente derivado da presa ou predador, com um estímulo mecânico inicia 
uma descarga máxima (Pantin, 1942 apud Ozacmak et al., 2001) que pode ser 
influenciada pelo estado fisiológico do animal (Sandberg et al., 1971 apud 
Greenwood et al., 2003) podendo afetar o ambiente osmótico ou iônico dos 
cnidócitos (Greenwood et al., 2003). 
 
Nas anêmonas, a unidade de descarga dos nematocistos é um complexo 
celular receptor/efetor ectodérmico chamado de complexo cnidócito/célula suporte 
(CCCS), que consiste de um cnidócito individual cercado de células suporte 
(Watson e Hessinger, 1994). O disparo da descarga requer estimulação tanto de 
quimiorreceptores situados, predominantemente, nas células sensoriais de 
suporte, como de mecanorreceptores ciliados (como aqueles sensíveis à vibração 
e ao contato), situados nos próprios nematocistos. A função das células suporte é 
receber o estímulo químico (principalmente de açúcares N-acetilados) e modular a 
sensibilidade do mecanorreceptor que inicia a descarga dessas organelas 
(Watson e Hessinger, 1994; Salleo et al., 1996). 
 
Antes se pensava que os nematocistos eram efetores independentes da 
sua descarga, controlados só por estímulos externos (Parker, 1919 apud Kass-
Simon e Scappaticci, 2002). Mas algumas evidências mostram que essas 
organelas são inervadas e responsivas a sinais recebidos de outras partes do 
corpo do animal, sugerindo que o comportamento dos nematocistos é, ao menos, 
modulado pelo sistema nervoso (Westfall et al., 1999). Portanto a ativação dos 
nematocistos pode ser controlada ou modulada pelo sistema nervoso (Westfall et 
al., 1998), por células suporte que cercam o cnidócito (Salleo et al., 1996) e, 
raramente, por células epidérmicas (Mire-Thibodeaux e Watson, 1993). 
 
Quando os nematocistos são evertidos, os mesmos penetram na pele da 
presa ou agressor injetando uma secreção rica em substâncias biologicamente 
ativas (Karalliedde, 1995). Além dessas substâncias presentes no interior dos 
nematocistos, estes também possuem grande concentração de íons, como o 
cálcio, que são necessários para a estabilização dessas organelas dentro dos 
cnidócitos (Tardent, 1995). 
 
 
1.3.1.2. Anêmonas marinhas, encontradas no litoral nordestino, como 
modelos biológicos para a descoberta de novas substâncias biologicamente 
ativas 
 
 
 Em toda a extensão da costa marinha brasileira podem ser encontrados 
cnidários. Dentre as regiões brasileiras, na Nordeste encontra-se várias espécies 
de anêmonas marinhas como, por exemplo: Actinia bermudensis, Anemonia 
sargassensis, Bunodosoma caissarum, Bunodosoma cangicum, Anthopleura 
cascaia, Stychodactyla duerdeni, Calliactis tricolor, Aiptasia pallida, dentre muitas 
outras, como citado por Clóvis Barreira e Castro (no relatório para o BDT intitulado 
Lista dos cnidaria registrados na costa brasileira, 2003). 
 
 O gênero Bunodosoma, que pertence à classe Hexacoralia, ordem 
Actiniaria e família Actiniidae, é encontrado no Nordeste segundo Clóvis Barreira e 
Castro (no relatório para o BDT intitulado Lista dos cnidaria registrados na costa 
brasileira, 2003), e tem sido alvo de alguns estudos no Ceará, como a 
Bunodosoma granulifera que, após consultoria sistemática com o Prof. José 
Carlos de Freitas (do Instituto Cebimar) foi identificada como Bunodosoma 
cangicum e foi considerada a espécie mais endêmica no Ceará (Santana et al., 
1998; Santana et al., 2001; Treptow et al., 2003). 
 
 A Bunodosoma cangicum tem sido submetida a estudos, no Laboratório de 
Toxinologia e FarmacologiaMolecular da Universidade Estadual do Ceará, que 
permitiram o isolamento e a determinação da seqüência parcial de aminoácidos da 
cangitoxina (CGX), um peptídeo neurotóxico que age em canais de sódio 
dependentes de voltagem (Santana et al., 1998; Santana et al., 2001). 
 
A cangitoxina também altera registros eletroencefalográficos, sugerindo que 
a mesma pode servir não só para o estudo de canais de sódio como para o 
desenvolvimento de um novo modelo experimental de status epilepticus (Carvalho 
et al., 2002; Campêlo et al., 2002; Paiva et al., 2002; Campêlo et al., 2003a; 
Campêlo et al., 2003b; Treptow et al., 2003). Alguns estudos sobre a atividade 
hemolítica do extrato bruto desses animais também têm sido realizados (Paiva et 
al., 2003). 
 
1.3.1.3. Componentes bioativos encontrados nas anêmonas marinhas 
 
 
Os produtos bioativos de um organismo podem provir de fontes exógenas, 
ou se originar endogenamente à custa de suas próprias vias metabólicas (Freitas, 
1981). 
 
Na defesa química, substâncias bioativas podem agir de várias maneiras: 
provocar irritação das membranas quimiorreceptoras dos órgãos sensoriais dos 
predadores (odores crípticos); conferir à presa um sabor desagradável; afastar 
predadores, quando liberados na água ou, ainda, podem ser injetados através de 
estruturas inoculadoras (Freitas, 1981). 
 
Não é estranho encontrar nas anêmonas marinhas substâncias 
biologicamente ativas, dentre elas algumas toxinas potentes (Béress, 1982). 
Peptídeos e proteínas tóxicas têm sido isolados de várias espécies de anêmonas 
(Anderluh e Macek, 2002; Nagai et al., 2002), tais como, Anthopleura fuscoviridis, 
Anemonia sulcata, Radianthus paumotensis, Radianthus macrodactylus e 
Bunodosoma caissarum (Norton, 1991), Aiptasia pallida (Grotendorst e Hessinger, 
2000), Actinia equina (Suput et al., 2001), Bunodosoma granulifera (Goudet et al., 
2001), dentre outros. 
 
Os componentes bioativos presentes nas anêmonas marinhas podem ser 
divididos em quatro classes: a dos peptídeos que agem em canais de sódio 
dependentes de voltagem (Norton, 1991), a dos peptídeos que agem em canais 
de potássio dependentes de voltagem (Gendeh et al., 1997; Minagawa et al., 
1998), a dos peptídeos e proteínas com atividade citolítica (Kem, 1988 apud 
Anderluh e Macek, 2002; Norton, 1991) e a dos inibidores de proteases 
(Minagawa et al., 1998). Além desses componentes, é importante salientar que 
esses animais produzem acetilcolina (Horiuchi et al., 2003), taurina, dopamina, 
adrenalina, noradrenalina, serotonina e melatonina (Mackie, 2002). 
1.3.1.3.1. Peptídeos que agem em canais de sódio dependentes de voltagem 
 
 
Uma série de peptídeos tóxicos com um peso molecular de 3 a 5 kDa, que 
age nos canais de sódio dependentes de voltagem, foi encontrada em várias 
anêmonas marinhas (Norton, 1991; Minagawa et al., 1998). Esses peptídeos 
foram classificados em quatro classes de acordo com as suas características 
estruturais, três delas incluindo longos peptídeos que possuem de 46 a 49 
resíduos de aminoácidos, e uma compreendendo peptídeos curtos com 27 a 31 
resíduos de aminoácidos (Norton, 1991): 
o Classe tipo 1, de peptídeos longos isolados dos gêneros Bunodosoma 
(Bosmans et al., 2002), Anthopleura e Anemonia (Norton, 1991); 
o Classe tipo 2, de peptídeos longos isolados dos gêneros Radianthys e 
Stichodactyla (Norton, 1991); 
o Classe tipo 3, de peptídeos longos isolados do gênero Calliactis, como 
sugerido por Norton (1991); 
o Classe tipo 4, de peptídeos curtos isolados do gênero Parasicyonis e 
Anemonia (ATXlll) (Norton, 1991). 
 
O mecanismo de ação desses peptídeos é muito semelhante àquele das -
toxinas dos escorpiões Androctonus australis, Leirus quinquestriatus e Buthus 
eupeus, pois ambos ligam-se ao mesmo sítio receptor do canal de sódio (receptor 
3 localizado na porção extracelular S3 – S4 do domínio IV da proteína 
transmembranal da subunidade  do canal de Na+), principalmente os peptídeos 
de anêmonas pertencentes a classe tipo 1 (Norton, 1991; Mei et al., 2000). 
Embora ambos tenham seqüências de aminoácidos completamente diferentes, os 
mesmos parecem agir prolongando os potenciais de ação dos tecidos excitáveis 
por lentificarem o processo de inativação dos canais de sódio dependentes de 
voltagem (Strichartz et al., 1987; Norton, 1991; Rogers et al., 1996; Benoit, 1998; 
Mei et al., 2000; Bosmans et al., 2002). Essas toxinas diferem na seletividade 
tecidual, assim como em suas propriedades imunológicas (Harvey et al., 1993). 
Esses peptídeos podem atuar predominantemente como neurotoxinas 
(Béress et al., 1975 apud Norton, 1991) ou como estimulantes cardíacos (Norton 
et al., 1976 apud Norton, 1991) de acordo com o grau de afinidade que eles 
tenham com as isoformas dos canais de sódio presentes no tecido neuronal ou 
cardíaco, respectivamente (Norton, 1991). Essas substâncias bioativas poderão 
ser utilizadas como potentes ferramentas para o estudo da relação estrutura-
função e para o desenvolvimento de novas drogas (Bosmans et al., 2002). 
 
As neurotoxinas, segundo Vital Brasil (1980), são aquelas que produzem 
efeitos decorrentes de sua ação nas terminações nervosas ou no sistema nervoso 
central. Essas toxinas têm diversos efeitos em diferentes tecidos, indicando a 
existência de diferentes subtipos de canais de Na+ (Catteral, 1995). Vários 
peptídeos com atividade neurotóxica foram isolados de anêmonas marinhas, como 
a APE 1-1, 2-1 e 5-3 da Anthopleura elegantissima (Bruhn et al., 2001), o ATXII da 
Anemonia sulcata (Miyawaki et al., 2002) e a cangitoxina da Bunodosoma 
cangicum (Treptow et al., 2003), dentre outros. 
 
Como exemplo da atividade neurotóxica desses peptídeos, pode-se citar: 
uma substância com ação estimulante central isolada da anêmona marinha 
Stoichactis kenti, a qual libera aminas biogênicas do cérebro de camundongos 
(Turlapaty et al., 1973); o potente efeito excitatório da antopleurina-B (da 
Anthopleura xantogrammica) na medula espinhal da rã (Kudo e Shibata, 1980); a 
possível aplicação como inseticida do ShI (do Stichodactyla helianthus), devido a 
sua desprezível ação neurotóxica em mamíferos quando comparada com a sua 
potente ação neurotóxica em crustáceos (Pauron et al., 1985; Norton, 1991); o 
aumento na corrente de sódio e seus efeitos na ativação de neurônios piramidais 
do neocórtex induzidos pelo ATX II (da Anemonia sulcata) (Mantegazza et al., 
1998) e a liberação de glutamato pelos sinaptossomos induzida pela fração Bc2 
do veneno da anêmona marinha Bunodosoma caissarum (Migues et al., 1999). 
 
Os peptídeos estimulantes cardíacos têm sido bem estudados e as suas 
possíveis aplicações na terapêutica de doenças cardíacas foram sugeridas, desde 
que os peptídeos da classe tipo 1 tenham uma combinação dos efeitos inotrópico 
positivo e antiarrítmico. Como exemplo desses peptídeos pode-se citar o ATX II; 
APE 1-1, 2-1, 5-3; equinatoxina III; antopleurinas A, B and C; BgII e BgIII, (Platou 
et al., 1986; Khera e Blumenthal, 1996; Benzinger et al., 1998; Bruhn et al., 2001; 
Goudet et al., 2001; Suput et al., 2001). 
 
 
1.3.1.3.2. Peptídeos que agem em canais de potássio dependentes de 
voltagem 
 
 
 As toxinas que agem em canais de potássio têm sido isoladas de 
escorpiões, aranhas, serpentes e anêmonas marinhas (Harvey et al., 1998). 
 
Alguns peptídeos de anêmonas marinhas com peso molecular entre 3.5 e 
6.5 kDa agem bloqueando os canais de potássio dependentes de voltagem 
(Gendeh et al., 1997; Minagawa et al., 1998; Shiomi et al., 2003), possuindo 
atividade similar a das dendrotoxinas da serpente mamba Dendroapis angusticeps 
(Harvey e Anderson, 1991 apud Minagawa et al., 1998), dos peptídeos 
degranuladores de mastócitos da abelha Apis mellifera (Stansfeld et al., 1987; 
Minagawa et al., 1998) e da noxiustoxina do escorpião Centruroides noxius 
(Carbone et al., 1982 apud Minagawa et al., 1998).Esses peptídeos foram divididos em dois grupos de acordo com a 
seqüência de aminoácidos: 
o Grupo 1, composto de 35 a 37 resíduos de aminoácidos, 
compreendendo as espécies Bunodosoma granulifera, cujo peptídeo 
BgK age na região S5 e S6 dos canais de potássio dependentes de 
voltagem (Aneiros et al., 1993; Gilquin et al., 2002), Stichodactyla 
helianthus (ShK) (Castañeda et al., 1995 apud Gendeh et al., 1997), 
Anemonia sulcata (AsKs - kaliseptina) (Schweitz et al., 1995). Esse 
grupo de toxinas é considerado uma nova família de toxinas que age 
nos canais de K+, já que a seqüência de aminoácidos de seus 
constituintes é completamente diferente dos demais (Gendeh et al., 
1998; Minagawa et al., 1998); 
o Grupo 2, contendo de 58 a 59 resíduos de aminoácidos, envolvendo a 
espécie Anemonia sulcata (AsKCl-3 - kalicludinas) (Schweitz et al., 
1995). Esse grupo parece também pertencer a uma família de inibidores 
de proteases (Gendeh et al., 1997; Minagawa et al., 1998). 
 
 
1.3.1.3.3. Peptídeos e proteínas com atividade citolítica 
 
 
 Os celenterados produzem uma variedade de peptídeos e proteínas, as 
citolisinas, que funcionam formando poros nas membranas celulares. Mais de 32 
espécies de anêmonas marinhas têm sido relatadas por produzirem peptídeos e 
proteínas citolíticas (Anderluh e Macek, 2002). 
 
 Segundo Anderluh e Macek (2002), esses animais produzem, quatro grupos 
de polipeptídeos e proteínas citolíticas, com base em seu peso molecular: 
o Grupo 1 - peptídeos de 5 a 8 kDa com atividade anti-histamínica 
encontrados em anêmonas como Radiathus macrodactylus (Zykova et 
al., 1998), Taelia felina (Elliott et al., 1986), dentre outros. Em geral, 
essas toxinas não são inibidas pela esfingomielina, formam poros em 
membranas contendo fosfatidilcolina e possuem pequena atividade 
hemolítica (Anderluh e Macek, 2002); 
o Grupo 2 – proteínas pesando de 15 a 21 kDa, chamadas de 
actinoporinas, que formam poros nas membranas constituídas de 
esfingomielina. É o grupo mais numeroso e mais extensivamente 
estudado, envolvendo muitas espécies de anêmonas, dentre elas Actinia 
equina (Hinds et al., 2002), Stichodactyla helianthus (Huerta et al., 
2001; Lanio et al., 2001; Martínez et al., 2002), Sagartia rosea (Jiang et 
al., 2002) e Bunodosoma cavernata (Eno et al., 1998; Anderluh e Macek, 
2002); 
o Grupo 3 – proteínas com 30 a 40 kDa que possuem ou não a atividade 
de fosfolipase A2. Como exemplos pode-se citar as fosfolipases A2 
isoladas das anêmonas Aiptasia pallida (Grotendorst e Hessinger, 2000) 
e Adamsia carciniopados (Talvinem e Nevalainen, 2002). Sua atividade 
hemolítica é inibida pela esfingomielina (Anderluh e Macek, 2002); 
o Grupo 4 – constituído de uma proteína com peso molecular de 80 kDa, a 
metridiolisina, da anêmona Metridium senille. Sua atividade é inibida 
pelo colesterol e fosfatídeos (Anderluh e Macek, 2002); 
o Grupo 5 – sugerido por Nagai et al. (2002), que é constituído pelas 
proteínas PsTX-60A e PsTX-60B, da anêmona Phillodiscus semoni, 
ambas com peso molecular de 60 kDa . 
 
 As actinoporinas são solúveis em água (Lanio et al., 2001) e apresentam 
atividade permeabilizante, sobre membranas celulares e modelos lipídicos, que 
aumenta com a presença de esfingomielina, seu principal substrato (Hinds et al., 
2002; Santamaría et al., 2002). De acordo com Hinds et al. (2002), essas 
citolisinas diferem de outras que possuem a mesma atividade, em muitos 
aspectos: são maiores e mais potentes, os poros formados por elas não tem uma 
estrutura estável e não são visualizados diretamente, e são extremamente 
estáveis à degradação protéica. Baseado em sua potência e propriedades, as 
actinoporinas podem ser poderosas ferramentas para a construção de 
imunoconjugados endereçados a células tumorosas malignas (Pederzolli et al., 
1995; Alvarez et al., 2003) e parasitas humanos (Tejuca et al., 1999). 
 
 
1.3.1.3.4. Inibidores de proteases 
 
 
 As proteases são constituídas de quatro classes: cisteínas, serinas, ácido 
aspártico e metalo proteases. Os inibidores de proteases agem inativando essas 
enzimas e para cada tipo de protease há um inibidor específico como, por 
exemplo, inibidores da protease serina (Annadana et al., 2002). 
 
 Até o momento o grupo 2 das toxinas que agem nos canais de potássio 
dependentes de voltagem, apresentou potente atividade inibitória das proteases 
cisteína e ácido aspártico. A kalicludina (AsKCl-3), da Anemonia sulcata, presente 
nesse grupo possui três domínios de tiroglobulina tipo 1, o primeiro domínio N-
terminal age como inibidor da protease cisteína e o segundo como um inibidor da 
protease ácido aspártico (Minagawa et al., 1998; Annadana et al., 2002; 
Outchkourov et al., 2002). 
 
 
 
1.3.1.4. Anêmonas marinhas e substâncias pró-inflamatórias 
 
 
Muitos acidentes com celenterados, principalmente águas-vivas, têm sido 
relatados e uma gama de sintomas decorrentes do contato humano com esses 
animais sugere a presença de substâncias pró-inflamatórias nos mesmos 
(Matusow, 1980; Reed et al., 1984; Mansson et al., 1985; Burnett e Calton, 1985; 
Burnett et al., 1986; Auerbach e Hays, 1987; MacSween et al., 1996). As 
anêmonas marinhas também têm sido apontadas como causadoras de alguns 
acidentes, como a Anemonia sulcata cujo contato causa inflamação aguda local e 
alguns sintomas sistêmicos como náusea, tontura, dor muscular dentre outros 
(Maretic e Russel, 1983) e a Phyllodiscus semoni que também provoca inflamação 
aguda local (com edema, dor, hiperemia e calor) (Nagai et al., 2002). 
 
Para um melhor entendimento da atividade inflamatória causada por 
substâncias bioativas de anêmonas marinhas, faz-se necessária uma revisão 
sobre a inflamação. 
 
 
1.3.1.4.1. Inflamação 
 
 
A importância da inflamação está no fato desta contribuir para o 
melhoramento da defesa do organismo, no que tange a luta contra a intromissão 
de microorganismos, com o aumento do fluxo sanguíneo nas áreas afetadas e 
ajuda no recrutamento de células imunes (Libert, 2003). 
 
Rocha e Silva, em 1994, definem a inflamação como um fenômeno multi-
mediado e padronizado. Já Cotran et al. (1999), a define como uma resposta 
patofisiológica fundamental, desencadeada pela invasão de um patógeno ou pela 
presença de uma substância nociva ou mesmo em decorrência de estímulos 
nocivos de origem química, física ou biológica. Esta reação ocorre em tecidos 
vascularizados e, geralmente, tem como objetivo a reparação tecidual após a 
lesão e a defesa do organismo contra a causa inicial da agressão e suas 
conseqüências. Para Rang et al. (2001), em geral, a resposta inflamatória 
consiste em reações imunologicamente específicas, bem como em várias reações 
inatas, que não têm nenhuma base imunológica. 
Os estímulos acima citados ativam uma seqüência de fenômenos 
microscópicos no foco inflamatório, tais como: vasodilatação, aumento do fluxo 
sanguíneo com aumento da permeabilidade venular, exsudação plasmática e 
migração de leucócitos (Rocha e Silva, 1994). 
 
Cotran et al. (1999) determinam que a passagem dos leucócitos 
provenientes do sangue para o foco inflamatório ocorre em cinco etapas: 
1 – A marginação no lúmen, com conseqüente acúmulo de leucócitos; 
2 – O rolamento de leucócitos no endotélio; 
3 – A adesão dos mesmos; 
4 – A transmigração ou diapedese, que significa a penetração através do 
endotélio; 
5 – E a migração no tecido intersticial decorrente do estímulo quimiotáxico, 
quimiotaxia ou haptotaxia. 
 
A reação inflamatória ocorre em duas fases distintas cada uma com 
mecanismos e mediadores químicos diferentes (Ali et al., 1997). Segundo Rocha e 
Silva (1994) essas duas fases são denominadas como fase aguda e fase crônica. 
No início da era Cristã, Cornelius Celsius descreveu a fase aguda como um 
processo de curta duração que apresenta quatro sinais cardeais da inflamação: 
eritema (rubor ou hiperemia),edema local (tumor), febre (calor) e dor 
(hiperalgesia) (Ferreira, 1981). Já Virchow, no século XIX, apontou a perda da 
função do tecido ou órgão lesado como o quinto sinal cardeal desse processo 
(Sedgwick e Willoughby, 1985; Rocha e Silva, 1994). 
 
A fase aguda da reação inflamatória é identificada pela vasodilatação com 
aumento da permeabilidade vascular, com aumento da pressão hidrostática na 
microcirculação e fuga de líquido para o interstício (edema); extravasamento de 
material protéico e plasma que diminui a pressão oncótica vascular e favorece a 
formação do exsudato inflamatório no interior do tecido; migração de 
polimorfonucleares, acúmulo de macrófagos no sítio da lesão durante as 24 horas 
seguintes, influenciado pela capacidade de adesão de leucócitos e plaquetas; 
alterações sistêmicas como dor, aumento da temperatura e elevação do conteúdo 
plasmático de componentes do complemento (Di Rosa et al., 1971), proteínas 
como fibrinogênio, proteína C-reativa, -2 macroglobulina, dentre outros 
(Bauhmann e Gaudie, 1994; Wannmacher e Ferreira,1998; Cotran et al., 1999; 
Rang et al., 2001). 
 
O processo inflamatório pode cronificar-se, dependendo ou não do estímulo 
a ser combatido durante a fase aguda. Em geral, a fase crônica proliferativa é 
instalada de 36 a 48 horas após o estímulo e se caracteriza, a nível 
histopatológico, por migração de macrófagos e leucócitos, com predominância de 
monócitos, linfócitos, plasmócitos e fibroblastos, e por sinais de regeneração e 
reconstrução da matriz conjuntiva. Estes eventos podem levar a degeneração 
tecidual, proliferação de tecido conjuntivo, neoformação vascular e fibrose 
(Bauhmann e Gaudie, 1994; Wannmacher e Ferreira, 1998; Cotran et al., 1999). 
 
Caso o processo inflamatório persista, este poderá tornar-se prejudicial 
para o hospedeiro, e a sua natureza clínica dependerá tanto do sítio da lesão 
como da natureza da resposta inflamatória (Brodie, 1991). 
 
A resposta inflamatória é constituída de dois eventos principais: os 
vasculares (Cotran et al., 1999) e os celulares (Ferreira, 1980). 
 
Nos eventos vasculares da inflamação é observado o aumento do fluxo 
sanguíneo resultante da dilatação das pequenas arteríolas e abertura de 
capilares. O aumento da permeabilidade vascular das vênulas pós-capilares 
ocorre como resultado do acúmulo de proteínas no líquido extravascular 
formando, assim, o exsudato (Cotran et al., 1999). Este possui uma grande 
variedade de mediadores, os quais incluem os componentes de algumas cascatas 
enzimáticas proteolíticas como o sistema do complemento, da coagulação, 
fibrinolítico e o sistema das cininas. O aumento do fluxo sangüíneo na região 
lesada provoca a formação do eritema e elevação da temperatura corporal, como 
resultado da dilatação e ingurgitamento dos capilares (Rang et al., 2001). 
 
Os eventos celulares do processo inflamatório têm início nas primeiras 3 a 
4 horas após o estímulo. Além das células endoteliais vasculares, mastócitos e 
células mononucleadas, que já se fazem presentes nos tecidos, outras migram 
para o local da lesão como os neutrófilos, basófilos e eosinófilos (células 
polimorfonucleadas), e os monócitos e linfócitos (células mononucleadas). 
Macrófagos residentes também participam de vários eventos da inflamação e são 
considerados como células de alarme, por fagocitarem o agente agressor e 
atuarem na mobilização de neutrófilos para a região agredida. Estas células são 
responsáveis pela liberação de vários mediadores desencadeando outros eventos 
inflamatórios como edema e dor (Ferreira, 1980). 
 
Nos eventos vasculares e celulares existem alguns mediadores 
inflamatórios que podem ser liberados pelas células ou provenientes dos vasos 
sanguíneos. Essas substâncias químicas podem ser: 
o Histaminas liberadas pelos mastócitos (Guo et al., 1997) por exocitose, a 
indução dessa liberação ocorre devido à ação de outros mediadores como 
a substância P, a interleucina-1 (IL-1), dentre outros (Dray, 1995), 
produzindo vasodilatação, extravasamento do plasma e hiperemia (Rang et 
al., 1991); 
o Serotoninas (5 HT) liberadas de mastócitos e das plaquetas, podendo 
induzir dor (Abbott et al., 1996) ou produzir vasodilatação (Cotran et al., 
1999); 
o Bradicininas produzidas pela clivagem do cininogênio pela calicreína, 
produzindo dor e, algumas vezes, vasodilatação, dependendo do endotélio 
e da permeabilidade vascular (Rang et al., 1991; Rang et al., 2001); 
o Eicosanóides que têm como principais representantes as prostaglandinas, 
tromboxanos e leucotrienos. São originários do ácido araquidônico 
convertido em prostanóides pelas enzimas cicloxigenase-1 (COX-1) e 
cicloxigenase-2 (COX-2) (Smith et al., 1998; Vane et al., 1998). Alguns 
desses eicosanóides produzem vasodilatação e hiperalgesia, como as 
prostaglandinas PGE2 (Ferreira, 1981; Bittencourt Júnior, 1998); 
o Fator de ativação plaquetária (PAF) liberado indiretamente por células 
inflamatórias, como os macrófagos, ativadas pela PLA2, promovendo 
dilatação e aumento da permeabilidade vascular, causando edema 
(Landucci et al., 1995; Santos e Rao, 1998; Rang et al., 2001; Hinz e Brune, 
2002); 
o Óxido nítrico (NO) sintetizado pela ação da óxido nítrico sintase sobre a L-
arginina. Produz vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e 
produção de prostaglandinas pró-inflamatórias, podendo apresentar ação 
antiinflamatória quando liberado pelas células endoteliais, inibindo a adesão 
de neutrófilos e agregação de plaquetas (Cotran et al., 1999); 
o Neuropeptídeos, considerados os principais peptídeos envolvidos na 
resposta inflamatória, como a substância P (Zubrzycka e Janecka, 2000) 
que produz vasodilatação; 
o Citocinas liberadas pelo tecido conjuntivo, tecido inflamatório e células do 
sistema imune, essa liberação é inibida pela acetilcolina (Santos e Rao, 
1998; Wang et al., 2002). Como exemplos dessas substâncias pode-se 
citar as interleucinas e interferons. 
 
Baseados nas evidências de reações inflamatórias produzidas pelos 
acidentes com animais marinhos, alguns autores têm estudado a atividade 
inflamatória de substâncias isoladas de celenterados, como o estudo do veneno 
bruto da água-viva Chrysaora quinquecirrha e da descarga de seus cnidócitos na 
córnea de porquinhos da Índia (Glasser et al., 1993) e do extrato dos tentáculos 
da água-viva Catostylus mosaicus submetido à análise de atividade hemolítica e 
edematogênica (Azila et al., 1991). 
 
 Entretanto, ao contrário de alguns celenterados, poucos estudos sobre a 
atividade inflamatória, em modelos animais, de substâncias bioativas oriundas de 
anêmonas marinhas foram realizados até o momento. Portanto, este trabalho 
propõe o estudo da atividade edematogênica, um sinal cardeal da inflamação 
aguda, e da contratilidade do músculo liso vascular, já que a vasodilatação é um 
dos eventos vasculares decorrentes do processo inflamatório. 
 
 
2. OBJETIVOS 
 
 
2.1. Geral 
 
 
- Estudar a atividade edematogênica e os efeitos de substâncias bioativas 
oriundas da anêmona marinha Bunodosoma cangicum na contratilidade 
do músculo liso aórtico de rato. 
 
 
2.2. Específicos 
 
 
- Fracionar e purificar por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE), três tipos de extratos brutos da anêmona marinha B. cangicum, 
comparando-os, de acordo com o perfil cromatográfico e eletroforético; 
- Estudar os efeitos comportamentais dos extratos brutos e de todas as 
frações purificadas do extrato bruto do animal intacto (A1), em 
camundongos, por via intravenosa (plexo retroorbital); 
- Definir o grau de pureza, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE), de duas frações isoladas do extrato bruto do animal intacto 
(A1), cangitoxina (CGX) e ANDE; 
- Identificar a presença ou ausência de atividade edematogênica nos três 
extratos brutos, na CGX e no ANDE, em camundongos; 
- Avaliar a atividade, do extratobruto do animal intacto (A1), em aorta 
isolada de rato, com e sem endotélio; 
- Analisar a sequência completa de aminoácidos da CGX. 
 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
 
3.1. Materiais 
 
 
3.1.1. Substâncias e reagentes 
 
 
 Acetilcolina; Sigma, EUA 
 Acetonitrila; Carlo Erba, Brasil 
 Ácido trifluoracético (TFA) P. A.; Merck, Brasil 
 Acrilamida; Sigma, EUA 
 Agarose; GibcoBRL, EUA 
 Água bidestilada, Universidade Estadual do Ceará (Laboratório de 
Toxinologia e Farmacologia Molecular) 
 Água destilada, Universidade Estadual do Ceará (Laboratório de 
Toxinologia e Farmacologia Molecular) 
 -mercaptoetanol; Merck, Brasil 
 Bicarbonato de sódio; Nuclear, Brasil 
 Bis-acrilamida; Serva, EUA 
 Bromofenol blue; Merck, Brasil 
 Carbonato de sódio; Qeel, Brasil 
 Cloreto de cálcio; Nuclear, Brasil 
 Cloreto de magnésio; Isofar, Brasil 
 Cloreto de potássio; Vetec, Brasil 
 Cloreto de sódio; Vetec, Brasil 
 Comassie Brilliant Blue G 250; Vetec, Brasil 
 Duodecilsulfato de sódio (SDS); Sigma, EUA 
 Fenilefrina; Sigma, EUA 
 Glicerol; Grupo Química, Brasil 
 Glicina; Grupo Química, Brasil 
 Glicose; Qeel, Brasil 
 Natriomazida; Merck, Brasil 
 Persulfato de amônio; Synth, EUA 
 Soro fisiológico 0,9% (salina) 
 TEMED; Fluka AG, Suíça 
 Tiossulfato de sódio; Merck, Brasil 
 
 
3.1.2. Aparelhos e instrumentos 
 
 
 Agitador de tubos; Phoenix AP56, Brasil 
 Agitador magnético; Fisatom, EUA 
 Aparelho de eletroforese Mini V 8.10; Life Technologies, EUA 
 Balança Analítica; Automarte AM 550 
 Bombas para HPLC; Milton Roy, EUA 
 Câmara muscular; 
 Centrífuga refrigerada; Annita I, Eslovênia 
 Cronômetro; Sportstimer, China 
 Coluna preparativa de fase reversa; C18 (Shim-pack PREP 25 x 250 mm) 
 Coluna analítica de fase reversa; C18 (Shim pack ODS 0,5 x 15 mm) 
 Freezer; Consul, Brasil (- 20oC) 
 HPLC; Shimadzu LC-10AD, Japão 
 HPLC; Shimadzu LC-10AS, Japão 
 Liofilizador; Edwards, Inglaterra 
 Liquidificador; Arno 
 Microsseringas, 50 e 500L; Gilson, França 
 Papel de registro para EGB 001 
 Papel imperfax 
 Paquímetro; Mitutoyo Sul Americana, Brasil 
 Pastilhas para agitador magnético 
 Pipetas automáticas; Gilson, França 
 Pipeta Pasteur plástica 
 Pletismômetro 
 Ponteiras; Brasil 
 Refrigerador; GE 440 
 Registrador Chromatopac; Shimadzu, Japão 
 Registrador; EGB-SP 001, Brasil 
 Seringas de 1mL; BD Plastipack, Brasil 
 Tubos eppendorf; Brasil 
 Tubos Falcon; Brasil 
 Tubos para centrífuga refrigerada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.2. Métodos 
 
 
3.2.1. Modelos Animais 
 
 
 Foram utilizados camundongos Swiss machos com peso de 20 a 25 gramas 
e ratos Wistar machos (200-300 gramas) provenientes do Biotério do HEMOCE. 
Os mesmos foram mantidos em gaiolas de plástico (camundongos: 05 
animais/gaiola; ratos: 02 animais/gaiola) esterilizadas, forradas com maravalha de 
pinho, atóxica e estéril, com ração e água ad libitum. A manipulação dos animais, 
antes, durante e depois dos experimentos, foi conduzida de acordo com as regras 
para manipulação de animais experimentais, preconizadas pelo Colégio Brasileiro 
de Experimentação Animal (COBEA). 
 
 
3.2.2. Coleta de anêmonas marinhas da espécie Bunodosoma cangicum 
 
 
Anêmonas da espécie Bunodosoma cangicum (Figura 7) identificadas após 
consultoria sistemática com o Prof. José Carlos de Freitas (do Instituto Cebimar) 
foram coletadas ao longo da costa norte de Fortaleza. Os materiais utilizados para 
essa atividade foram espátulas, béckers, sacos plásticos, água bidestilada, gelo e 
isopor para o acondicionamento dos animais. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7 – Animal da espécie Bunodosoma cangicum encontrado na costa norte 
de Fortaleza, Ceará. Fonte: Laboratório de Toxinologia e Farmacologia Molecular. 
 
Foram realizadas duas coletas na costa norte de Fortaleza, Ceará (Figura 
8). A primeira ocorreu em março de 2001, com a obtenção de 100 anêmonas, 
colhidas intactas. A segunda, em março de 2003, com a aquisição de 25 animais 
que foram mergulhados em água bidestilada (10 animais em 200mL) por 30 
minutos (metodologia desenvolvida no Laboratório de Toxinologia e Farmacologia 
Molecular por Santana et al., 1998) para a obtenção da descarga dos cnidócitos 
(Greenwood et al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8 – Mapa do litoral norte de Fortaleza. O círculo indica a área onde foram 
realizadas as duas coletas. Fonte: www.ceara.com.br. 
 
A primeira amostra de animais coletada em 2001 foi acondicionada em 
sacos plásticos e colocada num isopor com gelo. A segunda amostra de animais 
coletada em 2003 foi submetida à descarga de cnidócitos, após isso os animais 
foram acondicionados em sacos plásticos e colocados num isopor com gelo e os 
béckers com a descarga dos cnidócitos foram devidamente tampados e também 
colocados num isopor com gelo. Esse material foi levado ao laboratório de 
Toxinologia e Farmacologia Molecular da Universidade Estadual do Ceará, o que 
levou aproximadamente 40 minutos, para seu processamento. 
 
Nesse estudo, o material obtido nas coletas realizadas, foi dividido em três 
grupos de extratos brutos: animal intacto (A1), animal que sofreu a descarga dos 
cnidócitos (A2) e a descarga dos cnidócitos (A3). 
 
 
 
 
 
3.2.3. Processamento do material coletado 
 
 
Os extratos A1 e A2 foram homogeneizados em liquidificador, 
separadamente, com água bidestilada (1:5; p:v). A suspensão proveniente dos 
extratos homogeneizados foi centrifugada a 10.000 rpm por 30 minutos a 4°C, 
quatro vezes, até a obtenção de um sobrenadante translúcido, segundo 
metodologia adaptada de Cariello et al. (1989). Esse sobrenadante foi liofilizado e 
estocado a – 20°C. O extrato A3 foi imediatamente centrifugado a 10.000 rpm por 
30 minutos a 4°C até que seu sobrenadante ficasse transparente. Este foi 
liofilizado e estocado também a - 20°C. 
 
 
3.2.4. Purificação dos extratos obtidos 
 
 
O pó liofilizado dos extratos brutos A1, A2 e A3 da Bunodosoma cangicum 
foi dissolvido em água bidestilada com ácido trifluoracético (TFA) 0.05% e em 
seguida centrifugado a 10.000 rpm por 30 minutos. 
 
Realizou-se Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), dos 
sobrenadantes obtidos (dos três grupos processados: A1, A2 e A3), com uma 
coluna preparativa de fase reversa C18 (Shim-pack PREP 25 x 250mm, Figura 9) 
que foi eluída com um gradiente de acetonitrila (contendo TFA 0,05%) de 25 a 
80% em um período de 120 minutos com um fluxo de 5mL/min. As frações 
coletadas foram liofilizadas e estocadas a – 20°C, segundo metodologia adaptada 
de Santana et al. (1998). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9 – HPLC com coluna preparativa de fase reversa C18 (Shim-pack PREP 25 
x 250 mm) à direita. 
 
 
3.2.5. Análise do perfil eletroforético dos extratos brutos 
 
 
 Realizou-se eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5% (SDS-PAGE) 
(Figura 10), com o objetivo de comparar os três extratos brutos obtidos (A1, A2 e 
A3) da Bunodosoma cangicum. 
 
 O gel de poliacrilamida a 12,5% teve como tampão de corrida 30g de Tris 
com pH 6,8, 144g de glicina e 10g de SDS. As amostras dos extratos brutos foram 
diluídas em tampão de amostra (Tris HCl (pH 6,8) 0,5M, 2mL de glicerol, 2,5mL de 
SDS 10%, 0,8mL de -mercaptoetanol, 1mL de bromofenol blue 1% e 8mL de 
água bidestilada). Foram aplicados no gel 10L de cada amostra diluída em 10L 
do tampão de amostra, após aquecimento a 100ºC por 5 minutos. 
 
 A corrida teve uma duração de 2 horas, a uma voltagem de 100V e 
amperagem de 20mA de acordo com o procedimento de Laemli (1970). 
 
 Após a corrida o gel foi colocado em solução fixadora (Metanol 30% e 
Etanol 10%) por 20 minutos. Depois da fixação, o mesmo foi corado com 
Comassie Brilliant Blue G250, previamente aquecido a 100ºC, por 20 minutos e, 
posteriormente, foicolocado numa solução descorante (contendo 10% de metanol 
e 5% de ácido acético, previamente aquecida a 100ºC) até o gel descorar. 
 
 
 
Figura 10 – Aparelho vertical para gel de eletroforese (Mini-V 8.10, Life 
Technologies, GibcoBRL, U. S. A.) ligado a uma fonte (Intéc Ltda, Brasil) à direita. 
 
 
3.2.6. Estudos Farmacológicos 
 
 
3.2.6.1. Estudo dos efeitos comportamentais agudos in vivo 
 
 
A observação dos efeitos comportamentais foi realizada em camundongos 
Swiss machos (20 a 25 gramas). Foram analisados os efeitos dos extratos brutos 
(A1, A2 e A3) e das frações isoladas por cromatografia do extrato A1. O material 
foi diluído em 300L de salina (os extratos brutos numa dose de 1,1mg/kg, já as 
frações purificadas tiveram uma dose de 550g/kg) e injetou-se 100L no plexo 
retro-orbital (i.v.) dos camundongos (n=6). Os mesmos foram mantidos livres e sob 
observação acurada e constante que se iniciou imediatamente após o inóculo, 
durando 180 minutos (em intervalos de 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 
minutos). Os animais foram acompanhados por 2 dias, a partir do inóculo. 
 
Observou-se os parâmetros comportamentais determinados por Loomis e 
Hayes (1996), tais como: atividade locomotora geral, cauda (rígida, flexível, sinal 
de Straub), salivação, tremores, apnéia, dispnéia, cianose, reações bizarras 
(movimento de circo ou acrobático, movimento de valsa, caminhada na ponta das 
patas, para trás, sem objetivo), interação social, sensibilidade ao toque, 
sensibilidade ao som, convulsões (tônicas, clônicas, mixadas, subconvulsões), 
comportamento agressivo, ataxia, tônus muscular, paralisia, prostração, 
exoftalmia, fotofobia, déficit motor, piloereção, morte, nenhum efeito, dentre 
outros. 
 
 
3.2.7. Determinação do grau de pureza da CGX e do ANDE 
 
 
Uma alíquota da cangitoxina (CGX) e ANDE, purificados do extrato A1, foi 
submetida novamente à Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
utilizando-se coluna analítica de fase reversa C18 (Shim pack ODS 0,5 x 15mm, 
Figura 11) eluída com um fluxo de 1mL/min em um gradiente de acetonitrila de 0-
80% em 120 minutos para confirmação do grau de pureza, de acordo com 
metodologia adaptada de Santana et al. (1998). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11 – HPLC com coluna analítica de fase reversa C18 (Shim pack ODS 0,5 x 
15 mm) à direita. 
 
 
3.2.8. Edema de pata 
 
 
 Foram usados camundongos Swiss machos (20 a 25g) que receberam via 
intraplantar, na pata direita posterior, uma injeção de 20L com 22g dos três 
extratos brutos A1, A2 e A3 (dose de 1,1mg/kg de peso, n=6 para cada extrato), 
com 11g da CGX isolada do extrato A1 (na dose de 550g/kg de peso, n=6) e 
com 11g do ANDE isolado do extrato A1 (na dose de 550g/kg de peso, n=6). 
Para cada experimento, os animais foram divididos em dois grupos, o tratado 
(salina + extrato ou fração, n=6) e o controle negativo (salina, n=6). 
 
 A atividade edematogênica dos extratos (A1, A2 e A3) e das frações (CGX 
e ANDE) foi avaliada por deslocamento de líquido, após imersão da pata teste 
 
num pletismômetro (L) (Figura 12) como descrito por Santos e Rao (1998) e pela 
medida da altura da pata ao nível do metatarso por um paquímetro Mitutoyo (cm) 
(Figura 13) de acordo com Samud et al. (1999), Carneiro et al. (2002) e Filho et al. 
(2003). O volume da pata foi medido, três vezes, durante os intervalos de tempo 
de 0 (antes da aplicação), 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos, média foi 
considerada o resultado observado nesses intervalos de tempo. O  foi calculado 
segundo a diferença do volume final pelo volume inicial da pata (antes da 
administração das frações, do controle positivo ou do controle negativo). 
 
 
 
Figura 12 – Plestismômetro construído, no Laboratório de Toxinologia e 
Farmacologia Molecular, para camundongos. Constituído, principalmente, de uma 
seringa de vidro (10mL, em cima) que serve para a imersão da pata, onde há uma 
linha (mostrada pela seta) que serve para observar o deslocamento de líquido e 
de uma seringa plástica de 1mL (em baixo) que mede o volume deslocado com a 
imersão da pata. 
 
 
 
 
Figura 13 – Paquímetro Mitutoyo. O círculo branco mostra o local do paquímetro 
que é usado para medir o volume da pata, as duas extremidades são separadas e 
colocadas logo após o calcanhar do animal, a nível de metatarso. 
 
 
3.2.9. Atividade mecânica do músculo liso aórtico 
 
 
Utilizou-se ratos Wistar machos (200 a 300 gramas) sacrificados por 
concussão cerebral. Em seguida a aorta foi retirada e dividida em anéis de 2-3mm, 
após a remoção de gordura e tecido conjuntivo. Posteriormente os anéis foram 
montados verticalmente numa câmara muscular (Figura 14) com capacidade de 
10mL, contendo solução nutritiva (Tyrode, composição em milimoles (mM): NaCl, 
136; KCl, 5; CaCl2, 2; MgCl2, 0,98; NaH2PO4, 0,36; NaHCO3, 11,9; Glicose, 5,5), 
aerada continuamente com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2) e mantida à 
37ºC com pH 7,4. Uma das extremidades da preparação ficou presa a uma base 
fixa e a outra a um transdutor de força isométrico ligado a um sistema 
computadorizado (Powerlab, AD Instruments) para a aquisição de dados. 
 
 Nos experimentos usou-se aorta com (n=8) e sem endotélio (n=6). A 
retirada do endotélio ocorreu mecanicamente por fricção da superfície íntima dos 
anéis de aorta numa superfície áspera (Mateo e Artiñano, 2001). A avaliação da 
preservação do endotélio foi feita pela a adição de aceticolina (ACh) 10-6M 
 
 
(Furchgott e Zawadzki, 1980) sobre as contrações induzidas por fenilefrina 0,1M, 
a inexistência de relaxamento foi interpretada como a ausência de endotélio. 
Submeteu-se o tecido a uma tensão de 2g e estabilização por um período de 1 
hora. O registro e análise das contrações foram realizados pelo programa Chart® 
(versão 4.1, Panlab, Barcelona). 
 
 Após a estabilização da contração do tecido com fenilefrina, foram 
colocadas alíquotas, do extrato bruto A1, na câmara muscular (nas concentrações 
de 1g/mL, 3g/mL, 10g/mL, 30g/mL e 100g/mL), com um intervalo de 10 
minutos entre a aplicação de cada. Dez minutos depois da última dose, a aorta foi 
lavada e recebeu KCl e ACh para a observação da integridade do tecido. 
 
 Esse procedimento foi realizado no Laboratório de Farmacologia dos 
Canais Iônicos da Universidade Estadual do Ceará. 
 
 
 
 
Figura 14 – Câmara muscular com capacidade de 10mL. Nessa câmara é 
colocada a solução nutritiva de Tyrode, aerada continuamente com mistura 
carbogênica (95% O2 e 5% CO2) e mantida à 37ºC com pH 7,4. 
 
3.2.10. Determinação da seqüência de aminoácidos da CGX 
 
 
O método inicialmente utilizado foi o de Edman (1950) e a seqüência de 
aminoácidos da CGX, isolada do extrato A1, obtida a partir do N-terminal e dos 
fragmentos internos obtidos pela clivagem tríptica dos peptídeos separados por 
CLAE utilizando uma coluna de fase reversa C18. Como os peptídeos contêm 
mais de vinte aminoácidos, a continuação do seqüenciamento foi realizada pelo 
Prof. Dr. Marcelo do Valle, pertencente ao grupo do Prof. Dr. Lauro Morhy, do 
Centro Brasileiro de Estudo de Proteínas da Universidade de Brasília. 
 
Determinou-se o restante da seqüência de aminoácidos dessa fração 
juntando-se a sequencia N-terminal com aquelas internas da toxina reduzida 
por vinilpiridiletil (VP-CGX). Seqüências internas foram obtidas através do 
seqüenciamento de fragmentos purificados em CLAE (C18), obtidos pela 
quimotripsinização e reação com ácido iodosobenzoico da VP-toxina. 
 
O seqüenciamento químico foi executado por um seqüenciador de 
proteínas automatizado (Applied Biosystems), modelo 477A acoplado 
diretamente a um sistema de CLAE de fase reversa, modelo 120A (Foster City, 
Califórnia) com algumas modificações de hardware e software para melhor 
recuperação de PTH-Lys, como previamente descrito (Fontes et al., 1998). A 
química de seqüênciamento foi baseada no método