BBM_aula7_CDParte1

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Dicroísmo circular de transições eletrônicas: princípios básicos.
Caracterização de Biomoléculas - BBM5007
Profa. Dra. Patricia Targon Campana
Grupo de Biomateriais e Espectroscopia
pcampana@usp.br
Sala 339C – Titanic 
ramal: 3091-8883
sciencenebula.tumblr.com
/Campana.PT
@profaPCampana
Conteúdo:
Princípios básicos
Instrumentação
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E = jEosen(wt) Ed = 1/2[i Eosen(wt) + j Eocos(wt)] 
 
E = Ed + Ee Ee = 1/2[i Eosen(wt) - j Eocos(wt)] 
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E = Ed + Ee Ed = 1/2[i Eosen(wt) + j Eocos(wt)]
 
 E1 < Eo Ee = 1/2[i E1sen(wt+f) - j E1cos(wt+f)] 
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ED
EE
ED
EE
Adaptado de http://www.photophysics.com/tutorials/circular-dichroism-cd-spectroscopy
ED
EE
ED
EE

ED
EE

DA = arctg q
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Expandindo as exponenciais, ignorando os termos de menor ordem e convertendo em graus, temos:
ED +EE
ED +EE
EE
ED
EE
ED
 f
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Lei de Beer-Lambert-Bouguer
 A = log10 Io/I = lc
 DA = AE  AD = log10 Io/IE log10 Io/ID= log10 ID/IE= lcDe
De = (1/cl) DA 
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Os instrumentos atuais medem em miligraus e no caso de proteínas e peptídeos:
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As propriedades óticas da molécula são compostas pelas propriedades óticas de grupos individuais
Experimentalmente
Mecânica quântica
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CD de proteínas
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Cromóforos oticamente ativos em proteínas
Amidas
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Cadeias laterais aromáticas
Ligações dissulfeto
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Região UV-distante (Far-UV)
Contribuição dominante: amidas
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p0
p+
n’
n
p*
n’
n’
p0
p+
n’
n
p*
p+
p*
p0
p+
n’
n
p*
p0
p*
p
p*
140 nm e 190 nm
p0
p+
n
p*
n
p*
p0
p+
n
p*
p*
n
p*
n’
220 nm
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Manning e Woody Biopol. 1991 (31): 569-586
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n-* (~220 nm):
apesar de proibida, possui um m muito grande
Muito afetada pelo solvente (230nm: apolar e 210nm: polar)
 p-* (~190 nm):
Permitida
Não é afetada pelo solvente
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Figura modificada de G. D. Fasman, 1980.
Poli-ácido glutâmico
p0
p*
p0
p*
n
p*
 acoplamento de éxcitons p-*:
separação do pico p0-* 
6 a 8 nm e duas a três vezes a intensidade se f (-57 a -48 ou -67) e y (-47 a -41 ou -64) 
25-30% na intensidade com aumento # resíduos (4-8 para 12)
Biochemistry, 1974, 13 (16), pp 3350–3359
Hélices alfa
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Figura modifica de http://www.inbiochem.com/grafico-di-ramachandran-proteine/
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Chen (1974): V(r) = (V(infinito)(r-K))/r
Vr = amplitude no lambda= r , r = número de resíduos e k = experimental (~4)
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Figura modificada de G. D. Fasman, 1980.
Folhas beta
 acoplamento de éxcitons p-*:
Banda positiva ~198nm e banda negativa ~175 nm
transição n-*:
Banda negativa ~ 215 nm
Difíceis de caracterizar
Pouca solubilidade 
Grande variabilidade estrutural
Sinal aumenta com:
Twist da folha e comprimento da cadeia
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Modificado de Silva-Lucca et al, Biophys. Chem (79-2):1999, Pg 81–93
Experimentalmente
Lectina KM+
__ água
- - - PBS
Voltas-beta
Predições (décadas de 80 e 90)
similares às folhas beta, mas com deslocamento em direção ao vermelho
Tipo II’: similar às hélices (favorecida pela Pro)
Djakovi et al. Tetrahedron 70 (2014) 2330-2342
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Poli(Pro) e estruturas desordenadas
Figura modificada de G. D. Fasman, 1980.
____ Poli(Lys)
- - - - Poli(Ser)
......... Poli(Lys-Leu)
Poli(Pro) Tipo I (PI)
cis, “mão direita”, 3,3 res/volta
Poli(Pro) Tipo II (PII)
trans, “mão esquerda”, 3 res/volta
Estruturas desordenadas e proteínas desnaturadas
Características similares à PII
	
PI
PII
PI
PII
O estado desnaturado é um conjunto de estados conformacionais randômicos, de geometria variável restrita apenas por f e y
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J. R. Platt, J. Chem. Phys., 1949, 17, 484–495.
4 transições p p* 
Bb
Ba
La
Lb
Acoplamento vibrônico:
L “empresta” a energia de B
Contribuição dominante: aromáticos
Benzenos e seus derivados
~250 nm
Região UV-próximo (Near-UV)
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Biochemistry. 1999 Aug 17;38(33):10814-22. Sreerama N
Y.Yamamoto and J. Tanaka, Bull. Chem. Soc. Japan, 1972, 45, 1362.
B. Albinsson and B. Norden, J. Phys. Chem.. 1992, 96, 6204.
Assim...
Ba e Bb = 185 nm
La = 210 nm
Lb = 260 nm
Ba e Bb = 190 nm
La = 230 nm
Lb = 275 nm
Bb ~ 225 nm
Lb e La entre 270 e 280 nm
(com componente vibrônico)
La é muito sensível à vizinhança
L
> l
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2 transições n s* 
pares não-ligados em s* 
apesar de proibidas, possuem m muito fortes, dependendo do ângulo diedral
~230-240 nm
Woody, R. (1973) Tetrahedron. (29): 1273-1283. 
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...... BSA (20mM PBA pH 2)
___ BSA (20mM PBA pH 5,4)
 - - - BSA (20mM PBA pH 9 )
Figura modificada de G. D. Fasman, 1980
Predições teóricas X medidas experimentais
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Cromóforos e transições em ácidos nucleicos
Grupos fosfatos: 170 nm
Açúcares (s-s*): 190 nm
Fracas
adenina
Bases aromáticas: 5 dos 7 orbitais de energia mais baixa serão ocupados e um número muito grande de transições p - p* (6 entre 175-281nm ) e n -p* (essas mais fracas) poderão ocorrer 
citosina
timina
uracil
guanina
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Para estruturas mais complexas
Estimativa das frações de estrutura secundária através dos programas de desconvolução espectral:
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Métodos matemáticos
ridge regression, SVD, redes neurais entre outros
Flexibilidade do conjunto das referências (VarSelc e SelCon)
CDsstr e Contin: combinam várias características
É aconselhado combinar CD com FT-IR e/ou VCD
		Hélice alfa		Folha beta		Volta beta		Poli(Pro)II		desordenada	
		d r		d r		d r		d r		d r	
	Selcon3	0,06	0,97	0,05	0,92	0,04	0,40	0,03	0,78	0,05	0,87
	CDsstr	0,04	0,99	0,04	0,93	0,04	0,42	0,03	0,77	0,05	0,89
	CONTIN	0,05	0,98	0,05	0,90	0,04	0,45	0,03	0,74	0,04	0,90
d: RMS e r : coeficiente de correlação . 22 proteínas analisadas.
Modificado de Woody 2000. 
Greenfield NJ. Anal Biochem. 1996 Mar 1;235(1):1-10.
Narasimha Sreerama, Robert W. Woody. Methods in Enzymology, Volume 383, 2004, Pages 318–351
 Norma J. Greenfield. Methods in EnzymologyVolume 383, 2004, Pages 282–317
Ótima correlação entre a estrutura secundária por CD e por raios-X
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cleaning
Watch out!
Kelly S.M., Jess T.J., Price N.C. BBA 1751 (2005) 119 – 139
50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5 (spectrum 1)
sodium phosphate buffer containing either 150 mM NaCl (spectrum 2)
150 mM imidazole (spectrum 3)
50 mM Tris/acetate, pH 7.5 (spectrum 4)
CDProWin7:
http://www.each.usp.br/aprender-ciencia/index.php#
Convex Constraint Analysis (CCA+) (PAGO)
http://www.chem.elte.hu/departments/protnmr/cca/
Dichroweb
http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/links.shtml#soft
K2D2:
http://k2d2.ogic.ca/
http://www.expasy.org/proteomics
Predições de estrutura: GOR e Agadir
Programas de desconvolução
Outras informações estruturais
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Referências adicionais
Theory of vibrational circular dichroism, Philip J. Stephens, J. Phys. Chem., 1985, 89 (5), pp 748–752, February 1985
Norma J. Greenfield (9/20/04). Circular Dichroism. Disponível em: http://www.niu.edu/analyticallab/cd/handout.pdf
Circular Dichroism: Theory and Spectroscopy. Vários autores. Nova Science Editora (https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.php?products_id=15490)
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graus
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240
260
280
300
320
340
360
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
CD (miligraus)
comprimento de onda (nm)
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