Técnicas em Biologia molecular

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Tópico 04
Biologia Molecular e Biotecnologia
Técnicas em Biologia molecular
1. Introdução
Classicamente, o estudo da genética envolve o estudo da
informação genética (DNA, RNA). O avanço das técnicas em
biologia molecular permitiu que o estudo dos genes se ampliasse
para além das análises de fenótipo e características herdadas
para o estudo de macromoléculas isoladas de um organismo. 
Atualmente, existem técnicas que permitem isolar DNA ou RNA
transcrito de um gene particular, a fim de estudar suas funções,
por exemplo, ou fazer diagnósticos de patologias, contaminações
ambientais. O DNA também pode ser manipulado e fragmentos
específicos podem ser amplificados, sequenciados e analisados.
Além disso, é possível determinar a sequência do genoma de
qualquer organismo. Também é possível isolar proteínas de
outras moléculas. Vamos conhecer algumas dessas técnicas e
aprender a analisar os resultados de suas aplicações nesse
tópico.
2. Nucleases
As nucleases são um importante grupo de hidrolases, enzimas
que degradam os ácidos nucleicos, com amplo espectro de
aplicações na ciência e na indústria.
As nucleases cortam as moléculas de DNA em lugares
específicos, chamados de sítios de restrição. Os sítios de
restrição são definidos pela sequência curta de nucleotídeos (4-8
pares de bases). Essas sequências são ditas palindrômicas
porque são as mesmas tanto no sentido de 5´-3´ quanto no
sentido de 3´- 5´. A descoberta das nucleases veio da observação
experimental de que as bactérias sempre degradavam DNA
inserido dentro delas (DNA exógeno). Esse DNA não codificado
pelas bactérias era então digerido por elas. Estudos permitiram
entender que essa degradação era realizada pelas nucleases
bacterianas como forma de se protegerem do DNA exógeno de
uma invasão por um vírus, por exemplo. No entanto, os
pesquisadores perceberam que o DNA das bactérias não sofria
degradação (clivagem). Mais adiante, eles entenderam que para
cada sequência reconhecida pelas nucleases, havia uma enzima
que produzia uma modificação no DNA da bactéria hospedeira
para impedir que seu próprio DNA fosse cortado. O mecanismo
de proteção é geralmente a adição de um radical metil nessa
sequência reconhecida pela enzima, impossibilitando assim a
clivagem do DNA bacteriano (LODISH et al., 2014). Veja na
tabela abaixo algumas enzimas frequentemente usadas na
biotecnologia, perceba que seus nomes são derivados dos
organismos que foram isolados, como ECORI, isolada
de Escherichia coli, e assim por diante.
Sequência de reconhecimento de enzimas de restrição.
Enzima Microrganismo Sítio de restrição
EcoRI Escherichia coli 5`…GΔA-A-T-T-C…3`
3`…C-T-T-A-AΔG…5`
SmaI* Serratia marcescens 5`…C-C-CΔG-G-G…3`
3`…G-G-GΔC-C-C…5`
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5`…GΔG-A-T-C-C…3`
3`…C-C-T-A-GΔG…5`
Enzima Microrganismo Sítio de restrição
HindIII Haemophilus influenzae 5`…AΔA-G-C-T-T…3`
3`…T-T-C-G-AΔA…5`
Sau3A Staphylococcus aureus 5`…ΔG-A-T-C…3`
3`…C-T-A-GΔ…5`
As enzimas de restrição fazem cortes nas duas fitas de DNA em
seus sítios de reconhecimento, gerando fragmentos que possuem
uma cauda (ponta) de fita simples em ambas as extremidades.
Quando as pontas são complementares, elas são chamadas de
extremidades coesivas. No entanto, essas pontas podem não ser
coesivas, então são chamadas de pontas cegas. Veja na figura
abaixo um exemplo de pontas coesivas:
Digestão do DNA pelas nucleases.
Muitas nucleases requerem íons metálicos para atividade, outras
não precisam de nenhum. Atualmente, essas enzimas são
compradas com tampões, misturas que garantem sua atividade.
Além disso, nucleases podem clivar uma longa molécula de DNA
nos pontos que tiverem suas sequências de reconhecimento. A
frequência de clivagem depende do tamanho da sequência que
ela reconhece. Assim, uma enzima de restrição que reconhece
um sítio de 4 pb (pares de bases), cliva o DNA em média uma vez
a cada 4 , ou seja, 256, pb. Uma enzima que cliva a cada 8 pb,
cliva em média 4 , 65Kpb, ou seja, 1 vez a cada 65.536 pares de
nucleotídeos (1 kilo base são 1000 pares de bases). Esse
conhecimento é importante na biologia molecular porque
permite determinar com precisão os diversos locais de restrição
em um DNA para uma determinada enzima. Além disso,
clivagem de DNA por enzimas de restrição torna possível o
isolamento e manipulação de partes individuais de um genoma
para o entendimento da função do gene, e para expressão de
uma molécula de interesse (LODISH et al., 2014, JOHNSON et
al., 2017).
Com a análise do resultado dos cortes gerados pelas nucleases, é
possível, então, gerar um mapa desses fragmentos, chamado
mapa de restrição (BORZANI et al., 2001, JOHNSON et al.,
2017). Vamos ver na figura abaixo um exemplo de mapa de
restrição:
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Mapa de restrição.
Vamos analisar o mapa de restrição da figura acima: 1: Corte
usando enzimas nucleases A e B, geram 3 fragmentos (2, 3, 5 Kb)
totalizando 10 Kb. 2: Corte usando-se enzima A, gera 2
fragmentos (2, 8 Kb), totalizando 10Kb. 3: Corte usando-se
enzima B, geram 2 fragmentos (3 e 7 Kb), totalizando 10 Kb.
Vamos analisar os fragmentos para gerar o mapa de restrição: os
cortes gerados pela enzima A nos permite concluir que a enzima
A deve ter um sítio de restrição próximo ao final da molécula (2).
A enzima B tem que ter um sítio próximo ao da enzima A, ou na
extremidade contrária (3). Mas quando se analisam os cortes
gerados pelas 2 enzimas juntas (1), percebem-se 3 fragmentos. O
que significa que a enzima B não corta próxima ao sítio de A,
mas sim na extremidade oposta, gerando o mapa em 4. Se A
cortasse do mesmo lado de B, teríamos 2 fragmentos e não 3,
representado por (1). Mas como é possível determinar o
tamanho desses fragmentos gerados? É o que vamos ver agora
nas técnicas de separação de DNA.
3. Técnicas de Separação de DNA
Os fragmentos de DNA gerados após o seu corte por enzimas de
restrição precisam ser visualizados para entender seu tamanho.
O procedimento mais utilizado é o de separação de DNA por
uma técnica chamada de eletroforese.
A eletroforese separa os fragmentos de DNA baseado no
princípio de que os grupos fosfatos da molécula de DNA estão
carregados negativamente. Perceba na imagem como a
eletroforese funciona:
Eletroforese. Samples wells (pocinhos para colocar as amostras),
electrode (-), eletrodo (-, negativo), electrode (+), eletrodo (+,
positivo), direction of moviment (direção do movimento), buffer
solution (tampão de corrida), electrophoresis tank (cuba de
eletroforese), power supply (fonte de energia).
Vamos voltar à imagem para entender como a separação das
moléculas de DNA ocorre. Por convenção físico-químicas,
opostos se atraem, sendo assim, moléculas carregadas
negativamente serão atraídas para o polo positivo em um campo
elétrico na eletroforese. Para a separação do DNA, usa-se colocar
o DNA em um gel de agarose, e depois inserir o gel em uma cuba
em um campo elétrico. Durante a aplicação desse campo, os
fragmentos de DNA serão separados por tamanho. Essa
molécula produzirá fragmentos de tamanhos diferentes, se tiver
sido tratada com enzimas de restrição. Assista ao vídeo abaixo
para entender melhor como a eletroforese de DNA é montada:
O DNA é aplicado em uma substância gelatinosa, a agarose. A
agarose é um polissacarídeo (polímero de galactose) extraído de
algas, usado para fazer o gel onde o DNA irá migrar. A corrida do
gel se faz em uma cuba de eletroforese, contendo um liquido
chamado de tampão, que discutiremos em seguida. Uma
extremidade da cuba é ligada a um eletrodo positivo, enquanto a
outra extremidade é ligada a um eletrodo negativo. Os diferentes
polos irão provocar a atração da molécula de DNA carregada
negativamente. Essa atração irá separar as moléculas por
tamanho.
A agarose forma poros de maior ou menor diâmetro de acordo
com a sua porcentagem. A percentagem de agarose deve variar
de acordo com o tamanho de fragmento que queremos separar.
Veja no vídeocomo é feita a eletroforese de DNA

Eletroforese horizontal de DNA em gel de agEletroforese horizontal de DNA em gel de ag……
https://www.youtube.com/watch?v=vL3EfRx78P0
Quanto mais concentrada a agarose, menor será o poro formado.
Ainda, a mobilidade de uma molécula de DNA na matriz de
agarose é inversamente proporcional ao log de sua massa
molecular. Com isso, o tamanho do fragmento do DNA em pares
de base, ou seja, sua sequência linear, influencia a migração no
gel. Moléculas linearizadas migram com velocidade proporcional
ao seu tamanho. Portanto, moléculas maiores, de maior massa,
migram mais lentamente, moléculas menores, menor massa,
migram mais rapidamente.
A voltagem aplicada deve ser de 1 a 5 Volts/cm de distância entre
os eletrodos (SAMBROOK e RUSSEL, 2001).
Veja na tabela abaixo a porcentagem de agarose e o tamanho de
DNA que ela separa.
Percentagem de agarose para separar fragmentos de
DNA
Percentagem de agarose
(peso/volume %) Tamanho do fragmento (Kb)
0,7 0,8-10,0
1,0 0,5-10,0
1,2 0,4-6,0
1,5 0,2-3,0
2,0 0,1-0,2
No entanto, nem sempre o DNA encontra-se linear. As
moléculas de DNA circular podem estar relaxadas (quando
possuem um corte) ou na sua forma superenovelada
(supercoiled). Já o DNA genômico possui sua estrutura
condensada e complexa que não permite que os fragmentos
migrem de acordo com o tamanho em pares de base e sim que
fiquem presos nos poros do gel devido à sua estrutura densa e
irregular.
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A eletroforese é realizada em meio líquido, usa-se para isso um
tampão de eletroforese. Os dois tipos de tampão mais utilizados
são o tampão Tris-acetato-EDTA (TAE) e o Trisborato-EDTA
(TBE). Nesses tampões, o composto tamponante, ou seja, que irá
ajustar o pH da solução, também atua como fornecedor de
eletrólitos para a manutenção da corrente. O ácido
etienodiamino tetracético (EDTA) sequestra íons de magnésio e
tem como principal função impedir que o DNA seja clivado
durante a eletroforese. A função sequestrante do EDTA inibe as
nucleases que dependem da presença de magnésio para
degradar o DNA. Ainda, o tampão TAE possui a menor
capacidade tamponante, mas apresenta maior poder de
resolução para moléculas grandes de DNA quando comparado
ao TBE. O TBE é preferido para a separação de moléculas
pequenas de DNA, menores do que 1 kb, e para longas corridas
por sua maior capacidade tamponante. O TBE é um potente
inibidor de várias enzimas.
Para se aplicar o DNA no gel, usa-se também um tampão
conhecido rotineiramente como tampão de aplicação (loading
buffer), geralmente azul para facilitar a visualização. Esse
tampão serve para aumentar a densidade da amostra de DNA,
permitindo que ela entre nos pocinhos que são feitos no gel de
agarose com um pente, em cada dente do pente é colocada uma
amostra (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). Retorne no vídeo
acima para você entender melhor.
Antes da corrida do gel começar, é importante que um padrão
seja também colocado no gel. Normalmente, esse padrão é
colocado no primeiro pocinho. Ele contém diferentes fragmentos
de DNA com tamanhos conhecidos. Esse padrão irá ajudar por
comparação a entender o tamanho do fragmento amostra.
Depois da corrida é muito importante que o DNA seja
visualizado. O corante comumente utilizado para a visualização é
o brometo de etídio, pois ele consegue se intercalar entre os
pares de bases de DNA e emite fluorescência quando exposto à
luz UV, tornando assim possível a visualização dos fragmentos
de DNA. No entanto, esse corante é um agente mutagênico,
podendo causar câncer e deve ser manipulado usando
equipamentos de proteção individual (EPIs como luvas, jalecos e
óculos). Além disso, o seu descarte também deve ser especial,
uma vez que pode gerar riscos à saúde e ao meio ambiente.
Embora esse corante continue a ser usado, hoje em dia, existem
outros corantes não mutagênicos e mais amigos do ambiente
para corar o DNA.
Na imagem abaixo, você pode visualizar como os fragmentos de
DNA aparecem após a eletroforese. A primeira e a segunda
coluna são os perfis de corrida de padrões com o tamanho dos
fragmentos conhecidos.
Gel de eletroforese mostrando a separação de fragmentos de DNA.
A concentração visualizada mínima de DNA em gel de agarose é
de 20 picogramas (1 miligrama é igual a 10 picogramas). No
entanto, existem máquinas que determinam a concentração com
melhor precisão, por exemplo, nanodrop. Ainda, máquinas que
fazer a eletroforese totalmente automatizada, sem o uso de géis.
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Nesse caso, a amostra é colocada em pequenos orifícios de um
chip. Essa amostra pode ser de DNA ou RNA. Esses
equipamentos permitem determinação de tamanho e
concentração com precisão muito maior do que os géis.
Agora que vimos como as moléculas de DNA podem ser
separadas pela eletroforese, podemos entender que fragmentos
de DNA podem ser amplificados. Nesse caso, se as extremidades
de um fragmento de DNA forem conhecidas, o fragmento
completo pode ter seu número de cópias aumentado “in vitro”, a
fim de produzir material suficiente para as diversas análises.
Vamos estudar qual a técnica que possibilita essa amplificação
do número de cópias a seguir.
4. Técnicas de Amplificação de
DNA
A técnica de amplificação de fragmentos de DNA in vitro que
vamos ver agora é conhecida como PCR, do inglês polymerase
chain reaction, ou reação em cadeia da polimerase. O
desenvolvimento de técnicas de amplificação de DNA está
fundamentado no descobrimento de enzimas termoestáveis,
DNA polimerases, isoladas de procariotos. Essas enzimas
possuem capacidade de suportar incubação prolongada a
temperaturas de até 95 °C, sem perda significativa de atividade.
Elas são constituídas de um único polipeptídeo com atividade de
polimerase 5 “→ 3”, sintetizando moléculas de DNA, utilizando
para isso os quatro desoxirribonucleotídeos trifosfato (dATP,
dCTP, dGTP e dTTP). A primeira enzima isolada foi a da
bactéria Thermus aquaticus, sendo denominada de Taq
polimerase. Geralmente, para que uma reação de amplificação
ocorra, são necessários alguns ingredientes. Esses ingredientes
têm que conter o fragmento de DNA que se deseja amplificar,
uma DNA-polimerase termoestável, dois oligonucleotídeos
iniciadores (primers, que contêm a sequência dos extremos do
fragmento que se deseja ampliar), desoxirribonucleotídeos,
(dNTPs), tampão de reação (tampão fornece as condições ideais
de atividade da enzima DNA polimerase) e concentração
adequada de MgCl para funcionamento da enzima. Essas
enzimas são tão eficientes que podem permitir a extensão de um
fragmento em uma taxa de 2 a 4 kb/min, por exemplo. Além
disso, para a reação são necessárias quantidades mínimas de
enzima que podem variar, mas podem ser, por exemplo, de 1 a
1.5 unidades de enzima para uma reação de 20μl de reação de
PCR. Veja na imagem os passos para amplificação de DNA, na
reação em cadeia da polimerase:
Reação em cadeia da polimerase (PCR). 1. Denaturation (1.
Desnaturçaõ), 2. Annealing (anelamento, pareamento), 3. Enlongation
(extensão), Exponential growth of short product (amplificação
exponencial do fragmento amplificado).
Para que a reação em cadeia PCR propriamente dita ocorra, é
necessário um aparelho, o termociclador, porque para a
amplificação do fragmento são feitas variações na temperatura.
Esses termocicladores permitem que os ciclos de temperatura
necessários ao PCR aconteçam de forma automatizada. O
primeiro ciclo é a desnaturação da molécula de DNA, que ocorre
2
normalmente na temperatura de 95°C. Essa temperatura
permite que a molécula de DNA se abra para ser copiada. Na
etapa seguinte, a temperatura é abaixada para permitir o
anelamento (pareamento) dos primers (um para a região inicial,
5`>3` Forward, e outro para a região final, 3`>5` Reverse). Essa
temperatura vai depender do conteúdo de adenina (A), timina
(T), guanina (G), citosina (C) do fragmento. Essa temperatura é
conhecida como temperatura de melting e pode ser calculada
pela fórmula Tm = 2.(A+T)+[4. (C+G)], de acordo com a
quantidade de adenina, timina, citosina e guanina dos primers.
Aqui vale a pena ressaltar que se a sequência do fragmento não
for toda conhecida, pode-se, por exemplo, comparar essa
sequência com a de outros organismos parecidos para poder
elaborar os primers. Os primers são normalmente comprados de
empresas especializadas em sua síntese. Voltando aos ciclos do
PCR, o último é uma etapa de extensão do fragmento, que pode
ter temperatura de 72 °C, por exemplo, e duração de 2 minutos.
Estes parâmetros variam de acordo com o tamanho do
fragmento a ser amplificado, conteúdo de GC, pois citosina e
guanina fazem 3 pontes de hidrogênio, e para quebrá-las são
necessárias temperaturas maiores do que para as duas pontes de
hidrogênio entre AT (adenina, timina).
Normalmente, cada DNA polimerase é comprada e possui suas
especificações. Para terminar o PCR, é feita uma etapa de
repetição dos ciclos, em torno de 20 a 30 vezes. A amplificação
da região delimitada pelos dois iniciadores ocorre de forma
exponencial, após 20 ciclos de amplificação o número de
moléculas no final do processo pode chegar a um milhão de
cópias (LODISH et al., 2014, JOHNSON et al., 2017). Os ciclos
permitem amplificar um segmento que está em baixíssimas
concentrações. Isso é muito útil em diagnósticos. Veja no vídeo
abaixo como a reação em cadeia da polimerase ocorre.
A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, pesquisa
em biologia molecular, diagnósticos médicos e ecologia. Existem
outros tipos de PCR, vamos ver como eles funcionam!
RT -PCR
A PCR de transcrição reversa, ou RT-PCR, permite o uso de RNA
como molde. No entanto, é necessário um passo adicional ao
PCR convencional. Nesse passo, o RNA é transcrito
reversamente em DNA complementar (cDNA), usando a
transcriptase reversa. Essas enzimas são isoladas normalmente
de vírus, AMV (Avian Mieloblastosis Vírus) e a M-MuLV
(Moloney Murine Vírus), por exemplo. O fragmento obtido é
chamado de cDNA(DNA complementar). A qualidade e pureza
do RNA é essencial para o sucesso da RT-PCR. O primeiro passo
do RT-PCR é a síntese de um híbrido de DNA/RNA. A
transcriptase reversa também possui uma função RNase H, que
degrada a porção de RNA do híbrido. A molécula de DNA de fita
simples é então completada pela atividade da polimerase de
DNA, dependente da transcriptase reversa em cDNA. A
eficiência da reação da primeira fita pode afetar o processo de
amplificação. A partir daqui, o procedimento padrão de PCR é
usado para amplificar o cDNA. A possibilidade de reverter o
Assista ao vídeo abaixo para entender como a cadeia da
polimerase acontece.

Reação em cadeia da DNA-Polimerase | BiotReação em cadeia da DNA-Polimerase | Biot……
https://www.youtube.com/watch?v=ewt3k_C4JbQ
RNA para o cDNA por RT-PCR tem muitas vantagens. O RNA é
de cadeia simples e muito instável, o que dificulta o trabalho. O
RT-PCR é uma ferramenta que permite os estudos de expressão
de genes e que permite entender quais proteínas estão sendo
expressas. No entanto, para RT-PCR, não é possível saber de
antemão quais fragmentos vão estar no pool de amostras. Por
isso, os iniciadores (primers) têm uma característica essencial,
eles são inespecíficos, mas possuem várias timinas consecutivas
(6 a 35), que são anelados às regiões Poly-A (ou A-Rich) do RNA,
as caudas do RNA que são ricas em adeninas.
Existem outros tipos de PCR que devem ser citados aqui.
Aproveite a leitura!
qPCR e RT-qPCR
A PCR quantitativa (qPCR) é usada para detectar, caracterizar e
quantificar ácidos nucleicos em uma amostra biológica.
Quantitativo, porque além de detectar presença ou não, pode-se
detectar quanto do vírus está presente na amostra, chamada
carga viral, por exemplo. No qPCR em tempo real, além de ser
quantitativo, a marcação fluorescente permite a coleta de dados
à medida que a PCR progride. Já no RT-qPCR, a amostra inicial
é um RNA. Como já vimos, o RNA é quantificado por transcrição
reversa primeiro em cDNA, como descrito acima e, em seguida, é
subsequentemente realizado como na PCR padrão, onde o DNA
é amplificado por três etapas repetidas: desnaturação,
anelamento e alongamento. Mas aqui, se tiverem marcadores
fluorescentes a detecção será em tempo real. Veja na figura
abaixo os passos do RT-qPCR:
Real time quantitative polymerase chain reaction (real time
quantitativo da reação em cadeia polimerase), cDNA sequence
(sequência de cDNA), cDNA template (cDNA molde), DNA primers
(DNA iniciadores, primers), dNTPs, DNA polimerase, buffer solution,
probe (dNTPs, DNA polimerase, tampão, sonda), The reaction (mistura
dos reagentes no eppendorf), Termo cycler (termociclador),
Desnaturation (desnaturação), annealing (anelamento, pareamento
dos primers)  Probe hybridazition, reporter dye, quencher,
fluorescence signal blocked (hibridização da sonda, fluoróforo,
extintor), enlogation (alongamento), Fluorescence signal, probe
degradation (sinal de fluorescência, degradação da sonda), Products,
cycle 1 (produtos, ciclo 1), 40 cycles (cycle 1, 2,3….40), (40 ciclos,
1,2,3….40), Fluorescence Reading from each cycle (fluorescência sendo
lida a cada ciclo)
Existe o qPCR baseado em corante (normalmente verde), a
marcação fluorescente permite a quantificação das moléculas de
DNA amplificadas. O sinal será emitido quando o corante estiver
ligado ao DNA dupla fita (ds-DNA). Durante cada ciclo, a
fluorescência é medida. O sinal de fluorescência aumenta
proporcionalmente à quantidade de DNA replicado e, portanto,
o DNA é quantificado em “tempo real”. Uma desvantagem do
qPCR baseado em corante é que apenas um alvo pode ser
examinado por vez e que o corante se ligará a qualquer ds-DNA
presente na amostra.
No qPCR baseado em sonda, muitos alvos podem ser detectados
simultaneamente em cada amostra, mas isso requer otimização e
design de uma (s) sonda (s) específica (s) de alvo, usada (s) em
adição aos iniciadores (primers). Existem vários tipos de sonda
disponíveis, mas o tipo mais comum é uma sonda de hidrólise,
que incorpora o uso de fluoróforo e extintor. A transferência de
energia por ressonância de fluorescência (FRET) evita a emissão
do fluoróforo através do extintor enquanto a sonda está intacta.
No entanto, durante a reação de PCR, a sonda é hidrolisada
(clivada) durante a extensão do primer. A clivagem da sonda
separa o fluoróforo do inibidor e resulta em um aumento na
fluorescência dependente da amplificação. Assim, o sinal de
fluorescência de uma reação de qPCR baseada em sonda é
proporcional à quantidade da sequência alvo da sonda, presente
na amostra. Como o qPCR baseado em sonda é mais específico
que o qPCR baseado em corante, é, portanto, mais usado nos
ensaios de diagnóstico de qPCR. Volte a imagem para entender
como o RT-qPCR é realizado.
A detecção das moléculas amplificadas é feita pela detecção da
fluorescência por um dispositivo acoplado ao computador, o
fotômetro. Veja no vídeo abaixo um pouco como funciona o RT-
qPCR.
RT-qPCR é considerado o padrão-ouro no diagnóstico
da COVID-19. O RT-PCR permite a detecção do RNA do
SARS-CoV-2 na amostra analisada. Primeiro o RNA do
vírus é convertido em cDNA. DNA é amplificado, com
uso de iniciadores específicos para a sequência do vírus.
As curvas para o vírus vão estar presentes se o resultado
for positivo para COVID-19.

Muitas vezes é importante saber a sequência de nucleotídeos de
um fragmento de DNA. Isso é possível através das técnicas de
sequenciamento. Vamos aprender como é possível determinar a
sequência de bases de um fragmento de DNA a seguir.
5. Sequenciamento de DNA
A maioria das aplicações biotecnológicas do conhecimento do
DNA se deve ao conhecimento das sequências de nucleotídeos. O
sequenciamento é o processo de determinação da sequência de
nucleotídeos em um fragmento de DNA. Os primeiros
sequenciamentos foram desenvolvidos na década de 1970 pelo
método Sanger, como é conhecido. Ele utiliza a hibridização
(pareamento)do segmento de DNA do qual se quer determinar a
sequência, com um pequeno fragmento conhecido como
iniciador ou primer, semelhante ao sintetizado pela enzima
primase na replicação do DNA. Nesse caso, o primer é marcado
com um corante fluorescente ou radioisótopo. A DNA-
polimerase e um excesso de quatro desoxirribonucleosídeos
trifosfato normais (dNTPs) (Adenina, ou Timina, ou Citosina ou
Guanina) são adicionados ao DNA com o iniciador (primer).
Esses compostos são então divididos em quatro tubos de reação.
Assista ao vídeo abaixo para entender um pouco sobre o
processo do RT-qPCR.

PCR em tempo real (qPCR)PCR em tempo real (qPCR)
https://www.youtube.com/watch?v=B-cEFNwax1A
Cada um desses tubos também recebe uma pequena quantidade
de um único didesoxirribonucleosídeo (ddNTPs) trifosfato
terminador de cadeia, cada uma marcada com um corante de
uma cor diferente. A diferença entre as bases nitrogenadas
comuns (dNTPs) e as utilizadas no sequenciamento (ddNTPs) é
que falta um grupo hidroxila na posição 3“ do carbono do anel
do açúcar nos ddNTPs. Em um nucleotídeo comum, o grupo 3”
hidroxila (OH livre) permite que um novo nucleotídeo seja
adicionado à cadeia existente. Os nucleotídeos modificados
quimicamente (ddNTPs) não possuem essa hidroxila livre, isso
faz com que a cadeia complementar seja encerrada. Perceba na
figura abaixo como a estrutura da adenosina com OH livre na
posição 3´ (contado a partir do grupo funcional aldeído) na
ribose se parece:
Adenosina formada pela adenina e o açúcar, ribose.
Como os nucleotídeos são incorporados na cadeia
complementar, cada tubo irá produzir um tamanho diferente de
fragmento. Esses fragmentos serão separados em gel de
eletroforese. Cada banda terá seu fragmento terminado em um
dado nucleotídeo com diferentes posições do DNA. Sendo que
cada nucleotídeo de terminação foi marcado com um corante
diferente, a leitura dessas bandas permitirá então entender a
sequência do fragmento (JOHNSON et al., 2017). Não deixe de
assistir ao vídeo abaixo para entender melhor como o
sequenciamento Sanger funciona:
O sequenciamento Sanger foi automatizado e permitiu o
sequenciamento de 900 pares de base de uma vez. Nesse caso,
os produtos da reação são aplicados em um fino e longo gel
capilar e separados por eletroforese. Um detector detecta o sinal
de fluorescência dos ddNTPs quando o gel capilar se move frente
aos detectores. Os dados são alimentados por um computador
que monta a sequência. Cada pico colorido representa um
nucleotídeo na sequência de DNA. Esse processo pode ser
entendido melhor analisando-se a figura abaixo:
Assista ao vídeo abaixo para entender como o
sequenciamento Sanger funciona:

Sanger Sequencing of DNA (Legendado PT)Sanger Sequencing of DNA (Legendado PT)
https://www.youtube.com/watch?v=AI4CnG5Jp4s
Sequenciamento Sanger. 1 Reaction mixture: Primer and DNA
template, ddNTPS with fluorochromes, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP,
dTTP), (1 Mistura reacional: primers e a fita molde de DNA, ddNTPS
marcados com fluorocromos, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),  2
Primer enlongation and chain termination, (2 Anelamento dos primers,
Extenção e terminação da cadeia), 3 Capilary gel electrophoresis
separation of DNA fragments, (3 Eletroforese para separação dos
fragmentos de DNA em géis de capilares),  4 Laser detection of
fluorochromes and computational sequence analysis (4 detecção a
laser dos sinais de fluorescência e analise computacionas das
sequências).
O sequenciamento Sanger foi utilizado para determinar a
sequência de nucleotídeos de vários genomas, incluindo aqueles
de E. coli, moscas-das-frutas, vermes nematódeos, camundongos
e humanos.
Não poderíamos deixar de falar que os métodos de biologia
molecular vêm evoluindo a cada dia, juntamente com o avanço
da tecnologia. Hoje existem sequenciamentos chamados de nova
geração (NGS do inglês Next Generation Sequencing). As
metodologias NGS permitem o sequenciamento direto e paralelo
de milhões ou bilhões de moléculas de DNA, aumentando
consideravelmente a escala e a resolução das análises. Além
disso, se aplica ao sequenciamento de genomas completos,
metagenomas, que é o sequenciamento de todas as espécies de
uma amostra, geralmente usada quando não se pode cultivar os
organismos, RNA-seq (usada para pesquisar as proteínas
expressas), sequenciamento de exons, RNAs não codificantes,
pequenos RNAs, amplicons (fragmento de DNA, RNA derivado
de amplificação, replicação), regiões marcadas,
imunoprecipitadas, bibliotecas enriquecidas com fragmentos-
alvo (quando se deseja sequenciar um vírus que não tenha sido
sequenciado antes, por exemplo, corta-se o material genético e
faz-se um pool – uma biblioteca desses fragmentos). Além disso,
o sequenciamento permite identificar genes responsáveis por
doenças como o câncer e prever quais as chances de a doença
ocorrer. Ainda, o sequenciamento dos genes de um tumor pode
ajudar na escolha da melhor terapia. Veja no vídeo que
separamos como o sequenciamento tem evoluído e quais
aplicações para os seus resultados.
No entanto, muitas vezes é importante saber qual fragmento
contêm a sequência de interesse de DNA ou RNA em meio a
outras sequências sem utilizar a técnica de sequenciamento.
Entenda melhor como o sequenciamento de DNA tem
evoluído.

Sequenciamento de DNA nunca foi tão acessSequenciamento de DNA nunca foi tão acess……
https://www.youtube.com/watch?v=ZvhUjMtOxgc
Nesse caso, o que se está avaliando é a presença desses
fragmentos em um pool de amostras. Existem técnicas que
permitem que fragmentos de DNA e RNA possam ser marcados
para se ter a identificação da sequência de interesse. Vamos ver
como essa técnica funciona!
6. Nothern e Southern Blotting
Essas técnicas servem para identificar uma sequência de
interesse no meio de várias outras. O termo blotting em geral,
em biologia molecular, está relacionado à transferência de
moléculas de um gel, após a eletroforese, para uma membrana.
Analise a imagem abaixo para perceber como a técnica funciona:
Detecção de RNA pela técnica Northern Blotting. Sample (amostra),
RNA extraction (extração de RNA), Electrophoresis (eletroforese), RNA
separation by size (separação de RNA pelo tamanho), Northern blott
(transfer of RNA to membrane), Northern blott (transferência de RNA
para uma membrana), Labeled probes (sondas marcadas),
visualization of labeled RNA on X-ray film (visualização do RNA
marcado em um filme através de raio X). 
Vamos entender melhor como funciona.
Os passos para essa técnica são: fragmentação de uma amostra
de RNA, eletroforese, transferência para uma membrana,
marcação do fragmento de interesse por uma sonda
(hibridização), lavagem, revelação. Parece complicado, mas no
dia a dia laboratorial, é apenas uma rotina. Vamos explicar cada
passo. Primeiro, a fragmentação: feita com enzimas de restrição,
serve para quebrar longas moléculas em moléculas menores;
possibilitará encontrar a sequência de interesse no meio de
várias outras. Segundo, temos a eletroforese: esse processo visa
separar os fragmentos por tamanho. Em terceiro lugar, ocorre a
transferência: nesse processo os fragmentos que foram
separados na eletroforese servirão como um “carimbo”. O
mesmo gel de agarose utilizado na eletroforese será coberto por
uma membrana. Com isso, é possível transferir a impressão dos
fragmentos separados na eletroforese para a
membrana, blotting propriamente dita. No quarto passo,
acontece a hibridização: nela o fragmento de interesse será
marcado com uma sonda. Fragmento de interesse e sonda
hibridizados serão, então, identificados. A sonda é um pequeno
fragmento, nesse caso, de RNA que tem uma sequência
complementar à sequência de interesse. Quando a sonda
encontra a sequência de interesse, chamamos de hibridização.
Em quinto, temos a lavagem: nesse passo o excesso de sonda é
lavado da membrana, e toda a sonda não hibridizada será
removida. Como sexto passo, ocorre a revelação: parasaber onde
a sonda hibridizou faz-se a revelação da membrana. Na
revelação a membrana é autorradiografada em um filme de raio-
X, ou pelo aparecimento de uma cor, no caso de uso de marcador
cromogênico. Outras variações dessa técnica foram inventadas.
Os passos são os mesmos, mas quando o fragmento for de DNA é
chamado de Southem blotting, se for proteína será chamado
de Western blotting (LODISH et al., 2014). Veja na imagem
abaixo como, após eletroforese, a molécula analisada, que pode
ser RNA, DNA ou proteínas, pode ser transferida para a
membrana, blotting:
Blotting. Weight (peso para facilitar a transferência da molécula para a
membrana), Glass plate (placa de vidro), paper towels (papel toalha),
capilar bloting paper (papel que permite a passagem das moléculas
por capilaridade), Agarose gel (gel de agarose), transfer buffer
(tampão de transferência).
Essa técnica se aplica, por exemplo, na detecção de DNA em
determinada amostra, isolamento e identificação de um gene de
interesse, identificação de mutação ou rearranjo gênico na
sequência do DNA, no diagnóstico de doenças causadas por
defeitos genéticos, identificação de agentes infecciosos.
Vimos que o blotting detecta fragmentos em uma membrana. No
entanto, existem técnicas muito mais avançadas que empregam
chips para detecção de sequências de interesse em todo genoma
de uma vez. Vamos ver como funcionam!
7. Microarranjos
Microarranjos é uma técnica mais sensível que os blottings,
porque microarranjos detectam com uma sensibilidade maior
que os blottings (chamado de limite de detecção). Essa técnica
usa uma matriz, que podem ser lâminas de vidro de microscópio,
chips de silicone ou membrana de nylon. Na matriz são
imobilizados milhares de sondas com identidade conhecida. Os
pontos da sonda têm menos de 200 mícrons de diâmetro e
geralmente contêm milhares de pontos. Estas sondas podem ser
de DNA, cDNA ou oligonucleotídeos. A amostra será então
hibridizada com a sonda, gerando um sinal. Assista ao vídeo
abaixo para ter uma ideia do processo de hibridização da sonda
com a amostra gerando os sinais de detecção.
Dependendo do tipo de sonda, os microarranjos (do inglês,
microarrays), podem ser categorizados de três maneiras:
Análise de expressão: nesta configuração experimental, o
cDNA derivado do mRNA de genes conhecidos é imobilizado. A
amostra possui genes tanto dos tecidos normais quanto dos
tecidos doentes. Pontos com mais intensidade são obtidos para o
gene do tecido doente. Esses padrões de expressão são então
comparados entre si para se entender melhor os resultados.
Assista ao vídeo abaixo para poder ter uma ideia sobre o
processo de hibridização da sonda gerando os sinais de
detecção.

DNA MicroarrayDNA Microarray
https://www.youtube.com/watch?v=9U-9mlOzoZ8
Análise de mutação: para esta análise, os pesquisadores usam
o DNA genômico (DNA completo do organismo). Os genes
podem diferir entre si em menos de uma única base nucleotídica.
Uma única diferença de base entre duas sequências é conhecida
como Polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP).
Hibridação Genômica Comparada: é utilizada para a
identificação no aumento ou diminuição de importantes
fragmentos cromossômicos. Essas técnicas possuem aplicação
em descoberta de genes que ainda não foram estudados, para
entender seu funcionamento e níveis de expressão em diferentes
condições.
Os microarranjos podem ser ferramentas muito úteis, por
exemplo, no diagnóstico de doenças. Até recentemente,
diferentes tipos de câncer eram classificados com base nos
órgãos nos quais os tumores se desenvolvem. Agora, com os
microarranjos, os pesquisadores podem classificar ainda mais os
tipos de câncer e separá-los com base nos padrões de atividade
gênica das células tumorais. Isso ajudará profundamente a
comunidade farmacêutica a desenvolver medicamentos mais
eficazes. A tecnologia de microarranjo possui ampla aplicação
em farmacogenômica. A farmacogenômica é o estudo das
correlações entre respostas terapêuticas a medicamentos e o
perfil genético dos pacientes. A análise comparativa entre os
genes de uma célula doente e de uma célula normal ajuda a
identificar a constituição bioquímica das proteínas sintetizadas
pelos genes doentes. Esses dados podem ajudar a sintetizar
medicamentos que combatem com essas proteínas mais
eficazmente. Além disso, microarranjos permitem a realização
de pesquisa toxicológica, na qual o impacto de toxinas nas
células – e sua transmissão para a progênie – pode ser
entendido. A toxicogenômica também estabelece correlação
entre as respostas aos medicamentos e as mudanças no perfil
genético das células expostas a eles (LODISH et al., 2014,
JOHNSON et al., 2017).
Vimos até agora técnicas relacionadas à informação genética,
DNA, RNA, cDNA. Vamos ver como as proteínas podem ser
analisadas. Aproveite a leitura!
8. Técnicas de Separação de
Proteína
A separação de proteínas pode ser feita por diversas técnicas
diferentes. Para escolher qual a técnica a ser empregada, deve-se
pensar, por exemplo: qual será o uso da proteína? Qual é o
material de partida? O que deve ser removido da solução? Quais
as condições iniciais da solução? Qual é a estabilidade da
proteína? Qual é a escala de purificação? Qual é o custo
econômico para a purificação? No final, a proteína deve estar
ativa ou não? Vamos dar a vocês algumas ideias de técnicas
possíveis começando pela mais simples.
Centrifugação
Quando se pretende separar proteínas a partir de
homogeneizado de células, a metodologia mais comum é a
centrifugação diferencial. Nesse processo de purificação de
proteínas, a amostra é comumente composta de células
rompidas mecanicamente. Ela é então colocada dentro de um
tubo e girada (centrifugada). Essa centrifugação pode ter sua
velocidade variada. Se for uma ultracentrifugação, separará
organelas celulares, como o núcleo, além de grandes fragmentos
celulares ou células não rompidas. Estas organelas vão ficar no
fundo do tubo e as proteínas solúveis irão para a parte de cima,
sobrenadante.
A partir desse sobrenadante de proteínas, é possível usar
técnicas mais precisas para separar, dessa mistura de proteínas,
aquela que se deseja estudar ou produzir em larga escala. Antes
de começarmos a falar de técnicas mais precisas, vamos falar de
uma técnica muito comum em biologia molecular quando se
trata de separação de proteínas: gel de eletroforese.
Gel de Eletroforese para Proteínas
A eletroforese é uma técnica de separação de moléculas em uma
mistura sob a influência de um campo elétrico aplicado. Perceba
na figura abaixo como a eletroforese funciona:
Eletroforese. Gel cassete (cuba de gel), Negative electrode chambre
(Cuba com eletrodo negativo), Anode (+), Cathode (-), anodo (+),
catodo (-), Anote buffer, cathode buffer, (tampão anódico), tampão
catódico (-),  Hamilton syringe (seringa de Hamilton), Sample
(amostra),  Power source (fonte elétrica), separated prontein bands
(bandas de proteínas separadas).
Vamos entender como esse processo funciona. As biomoléculas,
como aminoácidos, peptídeos, proteínas, possuem grupos
funcionais ionizáveis, que adquirem carga positiva ou negativa
em um determinado valor de pH. Quando submetidos a um
campo elétrico, essas partículas carregadas irão migrar para o
polo positivo ou negativo, dependendo de sua carga líquida. A
separação se dá pela razão massa/carga e pelas propriedades
físicas do meio pelo qual elas migram (LODISH et al., 2014). A
separação por eletroforese de proteínas é realizada em géis de
poliacrilamida conhecidos como PAGE (polyacrylamide gel
electrophoresis). A polimerização da acrilamida é catalizada por
radicais livres, iniciada pela adição de N,N,N’,N’-
tetramethylenediamine (TEMED). Quando uma mistura de
proteínas é colocada em gel sob uma corrente elétrica, proteínas
menores migram mais rápido pelo gel que as proteínas maiores,
pois a poliacrilamida possui poros, que acabam por selecionar as
proteínas pelotamanho. A voltagem e a forma das proteínas
também influenciam essa migração das proteínas no gel
(chamada de corrida). Proteínas ramificadas migram mais
lentamente que moléculas simétricas. Para melhorar a separação
entre as proteínas, usa-se um detergente, o dodecilsulfato de
sódio (SDS). Esse detergente se liga às cadeias laterais
hidrofóbicas, desestabilizando as interações hidrofóbicas no
centro das proteínas, desnaturando as proteínas (BORZANI et
al., 2001). Ele ainda contribui com carga negativa, o que irá
favorecer a corrida. O SDS pode ser combinado com tratamento
de calor para favorecer as quebras de pontes dissulfeto. O gel de
SDS-PAGE é empregado para análise qualitativa de proteínas,
por exemplo, quando se quer acompanhar a purificação de
proteínas. O tamanho do poro varia com a percentagem de
acrilamida. Veja na imagem as tramas da poliacrilamida
polimerizada formando os poros que permitem a separação de
proteínas.
Gel para separação de proteínas. Mixture of macromolecules (mistura
de macromoléculas), Porous gel (poros do gel), Electrophoresis
(eletroforese).
Quando se deseja fazer uma análise qualitativa de proteína no
seu estado natural, não desnaturado, empregamos o gel nativo.
Nesse caso utiliza-se o gel de poliacrilamida (em geral na
porcentagem de 7.5 %), mas na ausência do SDS. Nestas
condições, as proteínas são separadas de acordo com suas
respectivas mobilidades eletroforéticas no gel. Após a corrida as
proteínas são coradas no gel. A coloração normalmente é feita
com uma solução a 0.1 % de Coomassie Brilliant Blue R-250
(CBB) em metanol:água:ácido acético glacial (45:45:10). Essa
coloração deixa as bandas de proteínas roxas. Deve-se empregar,
para colocar as proteínas no gel, um tampão para aumentar a
densidade das amostras e um padrão com várias proteínas com
tamanho conhecido (LODISH et al., 2014, JOHNSON et al.,
2017).
Os géis de poliacrilamida vistos até agora são géis
unidimensionais. No entanto, existem os géis de separação
bidimensionais.
Quando se deseja analisar a expressão de todas as proteínas de
um determinado sistema, por exemplo, todas as proteínas de um
organismo, para verificar a resposta frente a uma substância em
um experimento (tratamento), dizemos que queremos fazer o
estudo de proteoma. Essa análise é importante para entender
também se há proteínas que estão sendo reguladas e que vão
aparecer ou não diante de um determinado tratamento. Nos géis
bidimensionais primeiramente, a amostra passa por um gel de
poliacrilamida em uma pré-corrida. Esse primeiro gel é feito
usando-se tampões específicos com pH estáveis variando de pH
3 a pH 10. Nessas condições, as proteínas irão migrar pelo
gradiente até atingir o seu ponto isoelétrico (pI), o pH no qual a
carga líquida da proteína é zero. Essa parte do processo é
chamada de focalização isoelétrica. Depois dessa primeira
corrida, segue-se uma segunda corrida que funciona como uma
corrida em poliacrilamida normal. Nessa segunda etapa, o
Quando há concentrações baixas de proteína, utiliza-se a
coloração cor prata que é 100 vezes mais sensível que o
CBB, detectando proteínas em torno de 0.001 µg (1 ng).
Com a redução da prata na presença de oxigênio, as
bandas de proteínas aparecem de cor marrom.

PAGE-SDS bidimensional irá separar as proteínas de acordo
com suas massas (LODISH et al., 2014, JOHNSON et al., 2017).
Podem-se comparar os perfis de proteínas que aparecem na
presença ou ausência de um tratamento. Essas proteínas serão
cortadas do gel e avaliadas por metodologias mais sensíveis,
como na espectrometria de massas que analisa as estruturas
dessas proteínas. Vamos ver agora alguns métodos mais
sensíveis para separação de proteínas: as cromatografias. 
Cromatografia
As cromatografias podem separar as proteínas pela massa, carga
ou afinidade de ligação. Para entender cromatografia é
importante manter em mente que há sempre uma matriz
(superfície sólida, comumente chamada de coluna), a fase
estacionária. E uma fase móvel, que se movimenta pela fase
estacionária. A separação das proteínas se dá dependendo de
propriedades físicas e químicas das proteínas e da fase
estacionária. Assista ao vídeo abaixo para você entender um
pouco sobre os conceitos básicos da cromatografia.
Assista ao vídeo para ter uma noção dos conceitos
básicos sobre cromatografia.

Conceitos Básicos em Cromatogra�a LiquidaConceitos Básicos em Cromatogra�a Liquida……
https://www.youtube.com/watch?v=tf0Rkcq-l-0
Na cromatografia líquida, a fase móvel é um líquido e a fase
estacionária é um sólido. Na fase estacionária, o material de
separação das proteínas é uma coluna empacotada que permite a
fase líquida, com a amostra de proteínas, passar separando-as
por diferenças em massa, carga ou afinidade de ligação (LODISH
et al., 2014, JOHNSON et al., 2017). Vamos ver alguns exemplos
de cromatografia líquida:
1. Cromatografia líquida de filtração em gel: proteínas que
apresentam diferentes massas podem ser separadas quando
passarem por uma coluna composta por esferas porosas
produzidas com poliacrilamida, dextran (polissacarídeo
bacteriano) ou agarose (um derivado de algas marinhas).
2. Cromatografia líquida de troca iônica: as proteínas são separadas
por diferenças nas suas cargas. Esta técnica emprega esferas
cujas superfícies são revestidas por grupamentos amino (NH3 )
com carga positiva ou carboxilas (COO ), ou carga negativa em
pH neutro. As proteínas possuem cargas que variam em
diferentes pHs. Quando uma mistura proteica flui por uma coluna
de esferas carregadas positivamente, somente as proteínas com
carga negativa (proteínas ácidas) ficam retidas; proteínas neutras
e carregadas positivamente (básicas) são repelidas e saem da
coluna. No final, as proteínas retidas podem ser retiradas (eluidas)
da coluna. Para isso, usa-se um tampão que possui quantidade
crescente de sal – gradiente de sal.
3. Cromatografia de afinidade: é aquela que se fundamenta na
capacidade das proteínas de se ligarem especificamente a outras
moléculas. A fase estacionária é um ligante ou outras moléculas
através das quais a proteína de interesse tem afinidade. Os
ligantes podem ser substratos de uma enzima, inibidores ou seus
análogos. Um exemplo comum dessa cromatografia acontece
quando a molécula fixada é um anticorpo específico para a
proteína de interesse. Somente as proteínas com afinidade pelo
ligante serão retidas. No final, essas proteínas agora separadas
das demais serão retiradas da coluna (eluida) pelo uso de
detergentes ou pela mudança na concentração de sal ou pH
(LODISH, et al., 2014, JOHNSON et al., 2017)
Praticamente todas as cromatografias podem usar sistemas
automatizados que captam o sinal da retenção das proteínas.
Esses sinais são importantes para análise dos resultados. As
cromatografias são amplamente utilizadas na indústria
farmacêutica para produção de moléculas em escala comercial.
 Veja na imagem um exemplo desses sinais gerados na
+
–
cromatografia. Nele o chamado cromatograma identifica pelo
tempo de retenção um determinado composto na coluna, pois
ele forma um pico característico. Esse pico de retenção serve
para calcular, por exemplo, a concentração da proteína, ou para
saber o tamanho dessa proteína.
 
Exemplo de cromatograma.
Procuramos dar a você uma noção das técnicas usadas em
biotecnologia. Gostaríamos que você tivesse sempre em mente
que a biotecnologia está em constante evolução e que métodos
estão sendo o tempo todo aprimorados. Um grande aliado nessa
evolução é a bioinformática. Ela pode prever interações entre
proteínas; pode, por exemplo, substituir métodos elaborados e
gerar software para análises mais rápidas. É o chamado processo
de aprendizado da máquina ou machine learning process!
9. Conclusão
Nós enfatizamos nesse tópico diferentes técnicas de análise em
biotecnologia molecular. As nucleases são enzimas que
degradam os ácidos nucléicos. Na eletroforese os fragmentos deDNA são separados, atraídos por um campo elétrico. A
determinação dos nucleotídeos de um pedaço de DNA é feita
pelo sequenciamento. Um fragmento de DNA pode ser
amplificado graças ao descobrimento de enzimas termoestáveis,
as polimerases. Na amplificação do DNA é usada a técnica de
reação em cadeia da polimerase, PCR. Existem variações de
PCR. A RT-PCR ou PCR de transcrição reversa permite o uso de
RNA como molde. No qPCR, PCR, quantitativo em tempo real, a
marcação por fluorescência ou sonda permite a coleta de dados à
medida que a PCR progride.
Para identificar uma sequência de interesse no meio de várias
outras, sua detecção pode ser feita por uma sonda. Se a molécula
for DNA, essa técnica é chamada de Southern blotting, se for
RNA, Northern blotting, se for proteína será chamado de
Western blotting. Já os microarranjos usam chip com sondas de
moléculas que podem ser DNA, cDNA ou oligonucleotídeos.
Para separação de proteínas, existem vários métodos. O mais
simples explicado aqui é o da centrifugação diferencial que
separa proteínas a partir de células e tecidos. A eletroforese
também é usada para separação das proteínas. A separação pode
ser realizada em géis de poliacrilamida conhecidos como PAGE
(polyacrylamide gel electrophoresis). No gel de SDS-PAGE as
proteínas estão desnaturadas. No gel nativo, o detergente SDS
não é utilizado. Quando se deseja analisar a expressão de todas
as proteínas de um determinado sistema utiliza-se gel
bidimensional.
As cromatografias podem separar as proteínas pela massa, carga
ou afinidade de ligação. A cromatografia é uma metodologia
mais sensível e utiliza uma matriz (superfície sólida, comumente
chamada de coluna) chamada de fase estacionária, e a fase móvel
é a que se movimenta pela fase estacionária. Na cromatografia
líquida, fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um
sólido. Cromatografia de gel filtração utiliza uma coluna
composta por esferas porosas produzidas com poliacrilamida,
dextran (polissacarídeo bacteriano) ou agarose (um derivado de
algas marinhas). Cromatografia de troca iônica, quando as
proteínas são separadas por diferenças nas suas cargas.
Cromatografia de afinidade está fundamentada na capacidade
das proteínas de se ligarem especificamente a outras moléculas.
10. Referências
BORZANI, Walter et al. Biotecnologia industrial: volume I:
fundamentos. São Paulo, SP: E. Blücher, 2001. xxix, 254 p. ISBN
8521202784 (v.1).
LODISH, Harvey F et al. Biologia celular e molecular. 7.ed.
Porto Alegre, RS: Artmed, 2014. xxxiv, 1210 p., ISBN
9788582710494.
JOHNSON, Alberts et al. Biologia molecular da célula. 6 ed.
Porto Alegre RS: Artmed, 2017. 1464 p., ISBN 978-85-8271-423-
2.
SAMBROOK. J.; RUSSEL, D. W. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 3.ed. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory, 2001.
YouTube. (2020). Agência Nacional de Vigilância Sanitária –
ANVISA. 09min01. Disponível em:<
https://www.youtube.com/watch?v=B-cEFNwax1A>
YouTube. (2015). Carlos Simeão. Técnicas de Biologia
Molecular – PCR – Animação 3D. 02min25.
YouTube. (2019). Centro de Soluções Analíticas. Conceitos
Básicos em Cromatografia Líquida | HPLC. 03min02.
YouTube. (2020). Instituto Nacional de Perícias e Ciências
Forenses. Técnicas utilizadas no Diagnóstico do
https://www.youtube.com/watch?v=B-cEFNwax1A
Coronavirus. 03min27.
YouTube. (2016). Khan Academy.08min26. Disponível em:<
https://www.youtube.com/watch?v=ewt3k_C4JbQ> 
YouTube. (2011). Kasvi – Produtos para
Laboratório. Eletroforese horizontal de DNA em gel de
agarose. 03min45.
YouTube. (2018). Olhar Digital. Sequenciamento de DNA
nunca foi tão acessível; conheça as
possibilidades. 07min35.
YouTube. (2012). Support Center for Microsystems
Education. DNA Microarray. 00min55.
YouTube. (2014). Zênite. Sanger Sequencing of DNA
(Legendado PT). 03min39.
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