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01/02/2023 1 Bacteriologia clínica Teste de sensibilidade a antibióticos Profa. Dra. Brunna Robles Conhecer os principais mecanismos de resistência antimicrobiana. Conhecer os procedimentos envolvidos na realização de um antibiograma pela técnica de disco difusão em Ágar (Método de Kirby-Bauer). Verificar a importância da solicitação de um antibiograma na prática médica. Procedimento Local da prática: Laboratório multidisciplinar. Conhecer os procedimentos envolvidos na realização de um antibiograma pela técnica de disco difusão em Ágar (Método de Kirby- Bauer). Avaliação da resistência aos antibióticos. Fonte: Google Imagens: https://esquadraodoconhecimento.files.wordpress.com/2013/02/ac3a7c3a3o-de-antibic3b3ticos.png acesso març.2022 Principais mecanismos de ação dos antibacterianos Mecanismos de Resistência natural Fonte: Adaptado de Furuya e Lowy (2006) TRANSFORMAÇÃO: absorção de fragmentos de DNA presentes no ambiente, originados de outras bactérias mortas. TRANSDUÇÃO: transferência horizontal de genes de uma célula para outra. CONJUGAÇÃO: contacto direto entre 2 células. Mecanismos de Resistência adquirido Alteração na permeabilidade da membrana Alteração do sítio de ação Bombas de efluxo Ação enzimática (estratégia mais frequentemente observada em bactérias) 01/02/2023 2 Resistência associada a bactérias Gram –. As porinas na membrana das Gram - permitem a entrada dos antibióticos Modificações genéticas nestas proteínas diminuem a entrada do fármaco (Gram- Pseudomonas aeruginosa). Alteração da permeabilidade Alteração do sítio de ação (PBP)) A alteração genética do alvo (PBP) adquirida por plasmídeo, ou por mutação. Alteração do alvo original, local de ligação do antibiótico à bactéria, impossibilitando a ligação do fármaco ao local de ação (Gram + S.aureus, S. pneumoniae e Gram – N.gonorrhoeae, P.aeruginosa). Bomba de efluxo Bombas de efluxo são constituídas por proteínas, que quando mutadas promove efluxo do antibiótico do meio intracelular para o meio extracelular (Gram- E. coli, K. pneumoniae, Enterobacter e P. aeruginosa). Ação enzimática Bactérias produzem enzimas que inativam os antibióticos por meio de enzimas β-lactamases como: penicilinase, cefalosporinases ou carbapenemases (Gram+ E. coli, Gram - H. Influenzae e N. gonorrhaeae). Estratégia mais frequentemente observada em bactérias CLAVULANATO DE POTASSIO COMO AVALIAR A RESISTENCIA BACTERIANA? Antibiograma Determina a escolha da terapia antimicrobiana mais adequada, importante ferramenta no MONITORAMENTO DA EVOLUÇÃO DA RESISTÊNCIA BACTERIANA. TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS (TSA): determinar o perfil de sensibilidade e resistência de bactérias e fungos aos antibióticos. 01/02/2023 3 Técnicas para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos Escala de McFarland 10 UFC Padronizar a diluição da bactéria [ ] 0,5 da escala de McFarland https://www.scielo.br/j/bjorl/a/CvQHrFZqpQjNdJZ66gsmg6w/?lang=pt#ModalFigf03 TESTE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Discos de papel filtro impregnados com concentração padrão de antibiótico Discos fixados no ÁGAR MUELLER-HINTON. Fonte:ttp://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/atm_racional/modulo2/metodos5 .htm. Acesso: 29/01/2018 TESTE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Resultados: bactéria resistente, sensível ou sensibilidade intermediária de acordo com o halo de inibição Utilizado rotineiramente Fácil execução Flexibilidade na escolha dos antibióticos Baixo custo https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Antibiograms.jpg MÉTODO QUALITATIVO Método de suscetibilidade com fita graduada Etest Fonte:http://www.anvisa.com.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo5/etest2. htm. Acesso: 30/01/2018 MÉTODO QUANTITATIVO Eteste é uma tira plástica de gradiente concentração predefinido, estável e com 15 concentrações de antibióticos. Desenvolvimento da prática INSTRUÇÕES: Técnica de disco em difusão em Ágar (Método Kirby-Bauer). Inoculação correta. Disco impregnados com antibióticos conhecidos (Cefalotina, Bacitracina, Penicilina, Norfloxacino, Sulfazotrim- Sulfametoxazol + Trimetropin). Avaliação dos resultados: sensibilidade e resistência microbiana. Desenvolvimento da prática PROCEDIMENTO 1: Teste de sensibilidade a antimicrobianos • Preparar uma suspensão com as cepas bacterianas de Staphylococcus aureus ou Escherichia coli utilizando salina estéril (NaCl 0,85%) comparando com a escala 0,5 de Mac Farland; • Inocular através de estrias em Ágar Mueller Hinton- por toda a placa; • Adicionar os discos de antibióticos com o auxílio da pinça de forma equidistante pressionando-os levemente; • Incubar na estufa à 37ºC por 18-24 horas. 01/02/2023 4 Desenvolvimento da prática PROCEDIMENTO 2: Avaliação da resistência aos antibióticos • Após a incubação, observar o crescimento das bactérias nas placas e os possíveis halos de inibição formados; • Medir o diâmetro da zona de inibição usando uma régua ou paquímetro; • De cada antibiótico: anotar o diâmetro (em mm). • Analisar o perfil de sensibilidade de cada bactéria testada. Desenvolvimento da prática PROCEDIMENTO 2: Avaliação da resistência aos antibióticos • Após a incubação, observar o crescimento das bactérias nas placas e os possíveis halos de inibição formados; • Medir o diâmetro da zona de inibição usando uma régua ou paquímetro; • De cada antibiótico: anotar o diâmetro (em mm). • Analisar o perfil de sensibilidade de cada bactéria testada. Teste de sensibilidade aos antibióticos Leitura e interpretação https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/05/agar-mueller-hinton.html Leitura e interpretação SENSÍVEL: infecção pode ser tratada com a dosagem do antibiótico recomendado. INTERMEDIÁRIO: permite o uso do antibiótico quando doses maiores podem ser utilizadas. RESISTENTES: bactérias não tem seu crescimento inibido pelas concentrações padrões. Maior ou menor halo de ação Escolha dos antibióticos 01/02/2023 5
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