Aula 3- Isolamento de ácidos nucléicos

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Aula 3- Isolamento de ácidos nucléicos
 Módulo 1: Introdução ao isolamento dos ácidos nucleicos
Isolamento de Ácidos Nucléicos
Desenho experimental
O desenho experimental é um planejamento de um estudo realizado em algumas etapas e é uma ramificação do método científico, que é a ferramenta mais poderosa de todas para o avanço tecnológico da humanidade e muda até mesmo a forma que pensamos nas coisas do dia a dia.
· O desenho experimental pode ser uma situação do cotidiano, onde um político presta uma declaração e o leitor ou ouvinte pesquisa tal declaração para chegar a conclusão sobre a veracidade dos dados, após checagem e pesquisa, formulamos uma opinião final sobre aquilo, em vez de simplesmente acreditar no que foi dito.
O método científico foi utilizado para produzir quase tudo que existe, indo do aparelho em que você está lendo este texto até a cadeira em que está sentado(a). Nós utilizamos esse método muitas vezes de forma inconsciente, mas temos que ter em mente que ele existe e que devemos pensar sempre de forma criteriosa.
Observação> Questionamento > Hipótese > Experimento > Análise do resultado > Conclusão.
1. A partir da observação de algum evento – por exemplo, a existência do DNA –, podemos nos perguntar (questionar): “Eu gostaria de purificar o DNA para estudar melhor como ele é construído, tem alguma forma de fazer isso?”
2. A partir dessa pergunta, estabelecemos uma hipótese: “Se eu aplicar um reagente específico e fizer um determinado procedimento, será que consigo o DNA purificado?”.
3. Depois vamos para a bancada, onde o experimento é feito, e a partir da análise dos resultados, as conclusões são obtidas.
O objetivo de tudo isso é estabelecer um resultado confiável e reprodutível. A reprodutibilidade é um dos pontos mais importantes da ciência!
Exemplo: Suponha que sua equipe do laboratório desenvolveu uma nova técnica de quantificação de DNA. Os dados devem ser claros para que, quando outra pessoa ler essa metodologia (por exemplo, alguém do outro lado do mundo, cinco anos depois), ela consiga chegar no mesmo resultado, considerando que todas as condições e manipulação foram realizadas conforme o descrito.
Etapas do desenho experimental:
1. Definir a relação causa-efeito: Estabelecer o problema existente, os objetivos do trabalho e as metas a serem cumpridas.
2. Planejamento: Com o projeto estabelecido, preparar a instrumentação e avaliar possíveis problemáticas do experimento.
3. Execução: Realizar as medições e técnicas planejadas.
4. Análise e interpretação: Após a execução, analisar os dados coletados de forma criteriosa e científica.
5. Formular as conclusões: A partir da análise e interpretação dos resultados, devemos concluir se a relação causa-efeito se mostrou existente e responder aos objetivos do trabalho definidos na etapa 1, fechando dessa forma o ciclo do desenho experimental.
A partir do desenho experimental, pretendemos dizer de que modo ou por que o fenômeno é produzido.
A partir da ideia de relação de causa-efeito em que se acredita que existe uma relação entre a construção da causa e o efeito observado, formulamos as hipóteses a serem testadas e as conclusões as quais chegaremos. Para isso o experimento deve ser bem elaborado e planejado.
Lembrando que as hipóteses são afirmações provisórias e serão verificadas para ser ou não demonstradas.
Variáveis dependentes e independentes
Sempre que fazemos um experimento, queremos verificar os seus resultados. Todos os resultados (outputs) são originados a partir das entradas do experimento (inputs): 
Entradas do experimento (input): São os valores inseridos em determinado modelo experimental.	
· Considerando a necessidade de se extrair o DNA com sucesso, o input (entrada) será o material coletado.
· e o output (resultado) será o DNA extraído desse material.
Os inputs são suscetíveis às diversas variáveis sendo dividida em variáveis dependentes e variáveis independentes.
· Variáveis dependentes: medem o efeito do que está sendo avaliado e dependem da variável independente.
· Variáveis independentes: São aquelas que podemos controlar e modificar, e influenciam a variável dependente.
Se o experimento for medir a concentração plasmática do colesterol, quais são as variáveis:
As variáveis independentes, ou seja, as que são possíveis controlar, seriam: “Fiz jejum? Me alimentei bem? Usei algum medicamento nos últimos dias?”. Isso podemos controlar. Essas perguntas influenciarão diretamente no resultado do colesterol encontrado.
Na variável dependente, que nesse caso é a concentração/resultado de colesterol dosada no soro, essa não podemos controlar.
Hipótese nula e hipótese alternativa
· Hipótese nula: Indica que não há uma relação causa-efeito. Exemplo: o papagaio não repete aquilo que falamos, ele replica outra fala. Falamos “Vasco” ele fala “Flamengo”.
· Hipótese alternativa: Indica que existe uma relação causa-efeito, ou seja, rejeita a hipótese nula. O papagaio repete o que falamos. Falamos “Vasco” ele reproduz “Vasco”.
Por meio da inferência estatística, os testes de hipótese são utilizados para tomar a decisão de aceitar ou rejeitar uma hipótese estabelecida no início do desenho experimental. 
Tipos de erros
Os erros são causados quando temos uma interpretação errônea dos dados.
1. O erro tipo 1 acontece quando rejeitamos a hipótese nula, sendo esta verdadeira. que nos leva a rejeitar uma hipótese verdadeira (falso positivo).
2. ou quando não rejeitamos uma hipótese falsa (falso negativo).
Esses conceitos podem ser utilizados em qualquer desenho experimental e são muito comuns na área médica, principalmente em testes de diagnóstico clínico.
Seleção de participantes
· A seleção dos participantes, população de estudo, deve ser a mais representativa possível, para termos menor chance de errar ao generalizar os resultados.
· Essa seleção pode ser chamada de amostragem, que pode ser não probabilística ou probabilística.
A amostragem não probabilística: ocorre quando a probabilidade da seleção de cada participante não é conhecida. A seleção da amostra depende do julgamento do pesquisador e esta pode ser feita pela amostragem por conveniência (o pesquisador escolhe quem está disponível) ou julgamento (o pesquisador escolhe quem ele acha interessante).
A amostragem probabilística: cada elemento da população possui a mesma probabilidade de ser selecionado para compor a amostra, o pesquisador não decide. Nesse caso, a probabilidade da seleção de cada participante é conhecida.
Amostragem aleatória simples: são selecionados aleatoriamente em uma determinada população. Em uma população de 12 participantes, eu escolho 9 de forma aleatória.
Amostragem sistemática: O primeiro participante é selecionado a partir de um número preestabelecido e os outros participantes são escolhidos seguindo um mesmo coeficiente. Padronizamos o primeiro, para escolher o restante com perfil parecido.
Com os conceitos básicos sobre desenho experimental estabelecidos, podemos seguir para as próximas etapas da fase pré-analítica do isolamento de ácidos nucleicos. Os conceitos aprendidos neste tópico são valiosos e podem ser utilizados em qualquer situação da vida, seja ela profissional ou do nosso cotidiano.
Coleta, transporte e armazenamento de amostras biológicas destinadas aos testes moleculares
Apesar de muitos acharem que os resultados de testes genéticos são absolutos, isso não é uma verdade: eles estão sujeitos a erros assim como qualquer teste de laboratório e a maioria desses erros ocorre justamente na fase pré-analítica, que compreende desde a coleta do material até o cadastro e armazenamento das amostras no laboratório, antes da análise propriamente dita.
Diferentes amostras biológicas podem ser coletadas para os testes moleculares, como sangue, escarro, amostra de tecidos, um fio de cabelo, dentre outras. A partir dessas amostras, podemos detectar a presença tanto do nosso material genético (DNA/RNA) quanto o de microrganismos, conseguindo verificar e quantificar a presença de vírus, bactérias, protozoários; analisar a predisposição ouo estado de doenças genéticas; e fazer os famosos testes de paternidade. Além disso, é amplamente utilizado em perícias médicas.
· Além das amostras biológicas, os testes moleculares podem ser realizados a partir de cultura de células e de microrganismos. Nesses casos, também é essencial os cuidados com a fase pré-analítica, para um resultado de qualidade.
A coleta e manipulação de todas essas amostras, assim como na coleta de qualquer material biológico, deve ser realizada seguindo todas as normas de biossegurança, com utilização dos equipamentos de proteção individual, para evitar contaminação.
Além disso, as amostras devem estar devidamente identificadas com o nome do paciente e data da coleta, assinatura de quem coletou e um código numérico para dupla verificação. Amostras que não estiverem identificadas corretamente ou aquelas que apresentem características que impossibilitem o teste, como a presença de hemólise no tubo de sangue, devem ser descartadas.
Vamos conferir alguns cuidados para extração de amostras de DNA e RNA:
Extração de DNA: a coleta deve seguir alguns cuidados, pois, no nosso organismo, existem moléculas capazes de degradar o DNA, como as desoxirribonucleases (DNases) que necessitam de íons metal para a sua atividade. Então, para inativação da enzima, pode ser necessária a utilização de agentes quelantes como o EDTA. Ela também é inativada pelo calor durante 10 minutos a 65°C.
Extração de RNA: A extração de RNA requer mais cuidados. O RNA é uma molécula altamente instável e que apresenta grande fragilidade e se degrada rapidamente pela ação de ribonucleases (RNase).
É muito importante a adição de agentes estabilizadores (Os agentes estabilizadores de RNA são reagentes que visam inativar enzimas capazes de degradar o RNA.) de RNA o mais rápido possível e que o recipiente utilizado seja certificado como Ribonucleases (RNase) free, ou seja, livre de agentes degradantes de RNA, estéril, e sempre deve ser manipulado com luvas!
Amostras destinadas à extração do DNA/RNA.
Sangue e aspirado de medula óssea
Amostras de sangue e aspirado de medula óssea precisam ser armazenados junto a agentes anticoagulantes para manter a estabilidade da amostra, impedindo a coagulação sanguínea.
Entretanto, a heparina (agente anticoagulante amplamente utilizado) é um potente inibidor de algumas técnicas moleculares, dentre elas o famoso PCR (Polymerase Chain Reaction).
A impossibilidade do uso de heparina fez com que outros anticoagulantes fossem preferíveis, sendo normalmente utilizados o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou o ACD (citrato de dextrose) para essas amostras.
A coleta de amostras com o anticoagulante EDTA, apesar de ser mais utilizada e indicada para amostras de sangue, também pode interferir em algumas metodologias, já que o EDTA pode inibir drasticamente a atividade da DNA polimerase se estiver em excesso.
· Quando o objetivo é a análise do DNA, o sangue total é estável por até 24 horas em temperatura ambiente.
· Na temperatura de 2°C a 8°C, é estável por até oito dias.
· O plasma fica estável apenas 5 dias na temperatura de 2°C a 8°C, suportando tempos maiores se for congelado, e a amostra deve ser transportada em ambiente refrigerado.
Além disso, se congelada, é necessário que não haja ciclos de congelamento-descongelamento. Para análise de RNA viral, o sangue deve ser centrifugado e o plasma transferido para outro tubo estéril e livre de RNases em até quatro horas da coleta.
Para as amostras de aspirado de medula óssea, a seringa deve conter EDTA e, após a coleta, o aspirado pode ser armazenado por até 72 horas na temperatura de 2°C a 8°C.
Caso seja necessário maior tempo para o processamento, os eritrócitos precisam ser removidos e a amostra congelada a -20°C, assim a estabilidade do material permanece por meses. A amostra só pode ser congelada após a remoção dos eritrócitos!
Para a extração de RNA após a coleta, esta deve ser colocada imediatamente em solução estabilizante de RNA. Caso não tenha essa solução e não seja congelada, ela deve ser transportada em gelo seco e analisada em até 4 horas.
O grupamento heme presente nas hemoglobinas pode inibir a reação de PCR, então amostras que tenham algum tipo de hemólise não são satisfatórias para análise. Além disso, caso haja necessidade de remoção dos eritrócitos, esta deve ser feita de forma cuidadosa, para evitar a hemólise e liberação do grupo heme e causar problemas nos testes moleculares.
Amostra de tecidos
As amostras de tecido são preferíveis quando os agentes etiológicos estão alojados no tecido e/ou o diagnóstico das possíveis infecções seja difícil por meio da simples coleta de sangue.
Além disso, essas amostras são as de escolha durante as autópsias e para a análise de tecidos tumorais para comparar o DNA das células tumorais com as normais.
Para garantir uma boa análise, é recomendado coletar de 1g a 2g de tecido-alvo. No entanto, a quantidade pode variar de acordo com o tecido.	
Apenas para termos uma ideia, 10mg de tecido fornece cerca de 10µg de material genético.
Para tecidos, o ideal, após a coleta por biópsia, é o rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C) ou manter esse tecido em solução de preservação de ácidos nucleicos. Não é recomendável manter esse tipo de material em temperatura ambiente por muito tempo.
Amostras pequenas devem ser embrulhadas em gazes umedecidas com salina para evitar ressecamento, além da solução de preservação de ácidos nucleicos. Tecidos sólidos apresentam muitas endonucleases e devem ser processados ou congelados o mais rápido possível!
Tecidos de biopsia embebidos em fixadores utilizados para a preservação de tecidos para exame histopatológico não devem ser empregados para os exames de biologia molecular!
A estabilidade do tecido depende do tipo de tecido coletado.
Se houver impossibilidade de congelar ou usar a solução preservadora, a amostra deve permanecer em ambiente com gelo, inclusive no transporte e ser processada em 24 horas para o isolamento do DNA.
Quando a amostra for coletada para a extração do RNA, essa amostra deve ser rapidamente congelada em nitrogênio líquido (-196°C), após isso deve ser congelada na temperatura de -70°C, processada em no máximo uma hora após a coleta ou colocada em solução estabilizadora do RNA.
No momento da extração, as amostras não podem ser descongeladas, e sim homogeneizadas diretamente em solução adequada para a extração (chamado agente de extração, geralmente isotiocianato de guanidina). 
Os tubos de coleta também devem ser livres de RNases, estéreis e apenas manipulá-los com luvas, para evitar a degradação do RNA.
Normalmente, em temperatura de -20°C, as RNases ainda estão ativas, assim, é recomendado manter as amostras para análise de RNA em temperaturas inferior ou igual a -70°C.
Células bucais
A coleta das células bucais para a extração de DNA ou RNA pode ser realizada por meio de um raspado de células da parte interna da boca utilizando um swab (cotonete estéril, específico para coleta de exames microbiológicos) ou a partir do bochecho.
· Para extração de RNA, essa amostra deve ser inserida em um tubo contendo solução estabilizante de RNA/DNA.
· As amostras para extração de DNA podem ser secas ou estabilizadas e transportadas à temperatura ambiente, possuem validade de até uma semana em temperatura ambiente, podendo ser transportadas sem maiores cuidados.
Alguns swabs mais longos também podem ser utilizados para coletar material presente na orofaringe e na nasofaringe para o diagnóstico de algumas doenças, em que o agente infectante colonize as vias respiratórias, como o novo coronavírus e o vírus influenza.
Atualmente, as empresas enviam os kits de coleta para o paciente realizar o procedimento em casa: o swab deve ser esfregado na parte interna da bochecha, cerca de 10 vezes de cada lado e, em seguida, inserido no tubo que vem no kit contendo a solução estabilizante. Os erros mais comuns que ocorrem nesse tipo de abordagem são: o paciente descartar a solução estabilizante, a contaminação do swab com restos de alimentos, batome em outros casos até mesmo o paciente não identificar corretamente o tubo.
Deve-se evitar a coleta desse material após refeições, pois não é tão raro encontrar, nas amostras encaminhadas para o laboratório, o DNA de alimentos, como frango, bovino etc. nos testes onde supostamente era para ser feita a detecção de DNA de um ser humano.
Coleta de líquido cefalorraquidiano (líquor ou LCR)
O LCR quando coletado para análise do DNA deve ser coletado em frascos estéreis, transportado na temperatura de 2°C a 8°C e, caso não seja processado rapidamente, congelado na temperatura a partir de -20°C.
Para análise de RNA, se o processamento não for realizado em até 4 horas, essa amostra deve ser congelada, caso a amostra tenha eritrócitos, esses devem ser removidos antes do congelamento. 
Módulo 2: Extração e quantificação do material genético
Extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas
Qualquer técnica ou procedimento utilizado no laboratório – seja ele qual for – é como fazer um bolo, e por isso devemos seguir determinada receita.
No laboratório, chamamos a receita de POP (procedimento operacional padrão) e temos que ter os ingredientes (os reagentes) e os utensílios para fazer o bolo (os materiais e instrumentos).
Antes de iniciar nos procedimentos, é importante ressaltar que, após a obtenção de nossa amostra, devemos sempre tomar cuidado onde ela será manipulada e com a preparação dos reagentes, evitando, assim, a contaminação com materiais genéticos de outros organismos, ou até mesmo com enzimas que podem degradar o nosso material de estudo e gerar resultados falhos.
Procedimentos de extração de DNA
As células eucariontes possuem uma membrana celular, formada por uma bicamada fosfolipídica, além de diversos elementos dispersos no citoplasma, como as proteínas, os carboidratos, as organelas, os lipídios e os elementos minerais. Além disso, a célula eucarionte também possui uma membrana nuclear e dentro do núcleo estão as proteínas, DNA e RNA majoritariamente.
· Para a extração do DNA, todos os outros elementos são considerados contaminantes, até mesmo o RNA.
· Assim, a estratégia básica da extração de DNA é, então, separar o DNA de todos esses outros elementos que não são DNA.
A primeira etapa a ser realizada é o rompimento da parede celular (quando as células são de origem vegetal ou fungos), da membrana plasmática e da membrana nuclear, liberando, assim, o material genético.
Podemos fazer isso de diversas formas, a saber: com o uso de detergentes específicos de desestabilizar a membrana celular e nuclear, abrasão física, ação de enzimas capazes de degradar a membrana e/ou parede celular, pressão osmótica, aquecimento, entre outras.
· Se a intenção é extrair o DNA, junto ao rompimento das membranas, é importante adicionar uma enzima capaz de destruir outras proteínas (proteinases), principalmente para inativar todas as DNases, impedindo a degradação do DNA. Em seguida, para remover o RNA, que neste caso é um contaminante, basta adicionar RNase no meio.
Nessa etapa, já removemos lipídios, proteínas e o RNA, mas ainda faltam os carboidratos e os elementos minerais.
Adição de solvente orgânico
Podemos usar um solvente como o fenol ou o clorofórmio. É importante lembrar que já degradamos lipídeos e RNA, rompemos as membranas e, se for o caso, a parede celular.
O fenol ou clorofórmio tornam essas moléculas insolúveis, assim como os carboidratos e todos os elementos minerais. Após a adição dos solventes, seguida da centrifugação, formam-se duas fases:
Fase aquosa: DNA 
Nesta fase superior, o DNA, que não é solubilizado nos solventes (fenol ou clorofórmio), vai permanecer na fase aquosa.
Fase orgânica 
Nesta fase, todos os outros elementos irão para a fase orgânica (inferior), como proteínas, lipídeos, RNA degradados, carboidratos e outros elementos minerais solúveis em fenol/clorofórmio.
Assim, com auxílio de uma pipeta, podemos transferir a fase aquosa com o DNA para outro tubo. O RNA degradado se torna insolúvel, pois forma reações de complexação com outros elementos do citoplasma. Se estiver íntegro, ele pode ir para a fase aquosa, dependendo do pH do solvente orgânico.
Solução concentrada de NaCl
O cloreto de sódio concentrado é capaz de precipitar os elementos degradados do citoplasma, deixando o DNA íntegro na fase aquosa. Assim, basta centrifugar e remover a fase aquosa do pellet precipitado, pois nele estão nossas substâncias de interesse.
Pellet: É uma pequena porção precipitada de uma solução.
Coluna de adsorção do DNA
O DNA possui carga total negativa vinda do grupamento fosfato.
Assim, podemos adicionar uma coluna com carga positiva (normalmente é utilizada uma coluna de sílica) no nosso tubo e centrifugar.
Dessa forma, o DNA vai ficar retido na coluna devido à sua carga negativa e os outros elementos irão passar direto pela coluna, ficando no fundo do tubo.
Para remover o DNA da coluna, usamos um tampão de eluição carregado negativamente em grande quantidade. Normalmente, são usados os tampões Tris-HCl ou o EDTA.
Após a obtenção do DNA por qualquer um desses métodos supracitados, precisamos eliminar qualquer resíduo que por um acaso ainda esteja misturado ao DNA. Para isso, adicionamos isopropanol, que precipita apenas o DNA.
O pellet fica bem aderido no fundo do tubo, podemos lavar o tubo com etanol 70%, por exemplo, para remover todos os reagentes e secar o tubo, que o DNA continua aderido ao tubo.
A etapa final consiste em ressuspender DNA (técnica que possibilita que um pellet volte a ficar em solução), em água ou em tampão de eluição, basta adicionar um pouco do líquido escolhido e forçar a quebra do pellet, no final de todo o protocolo, teremos um tubo contendo apenas o DNA puro.
O processo de extração de DNA nos plasmídeos é bem semelhante ao processo geral de extração de DNA.
Os plasmídeos podem ser definidos como pequenas moléculas de DNA circular que são encontradas em bactérias e também em leveduras.
No processo de extração de DNA nos plasmídeos, depois da lise da membrana e precipitação das proteínas citoplasmáticas, é adicionada uma solução de NaOH com pH bastante básico a ponto de desnaturar o DNA cromossomal e o também o próprio DNA plasmidial. Em seguida, é adicionada uma solução ácida neutralizadora que regenera apenas o DNA plasmidial e não o cromossomal. Assim, podemos então separar por centrifugação, pois o DNA do plasmídeo fica em suspensão enquanto o DNA cromossomal precipita.
Dica: Lembre-se de que nossa amostra depois da coleta tem que estar armazenada no gelo, para manter a temperatura entre 2°C a 8°C.
Observações para um experimento:
Se o tecido for duro, devemos macerar, usando um bastão de vidro, e se tiver grande quantidade de líquidos, a amostra deve ser centrifugada para remover o líquido em excesso. Na primeira etapa da extração, adicionamos o tampão de digestão, na concentração de 1,2mL de tampão para cada 100mg de tecido.
Em seguida, devemos deixar o tubo em banho-maria a 50°C por cerca de 8 a 16 horas. 
A segunda etapa é a extração do DNA com fenol e precipitação dos compostos indesejáveis. Para isso, o tubo é retirado do banho-maria e esperamos ele chegar a 37°C para adicionar 5μL de RNase, e depois incubamos por 15 minutos sob leve agitação.
Em seguida, a solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico é adicionada na proporção de 1:1.
Atentarmos para o pH da solução de fenol, pois em pH abaixo de 7.0 o DNA é degradado e vai para a interface.
A solução de fenol com pH em torno de 7.0 é usada para extração de DNA e em pH entre 4,5 e 5,5 é usado na extração de RNA.
Após a adição do fenol, homogeneizamos e centrifugamos o tubo por dez minutos a 1.700g. Uma vez com as fases aquosa e orgânica bem definidas, separamos a fase aquosa contendo o DNA. Nessa etapa, é importante separar bem as fases, pois o fenol pode ser um contaminante, então é recomendado centrifugar duas vezes.
A terceira fase é a purificação do DNA por meio da precipitação com etanol. Antes de usarmos o etanol em si, adicionamos meio volume de acetato de amônio 7,5M e dois volumesde etanol absoluto.
Vale lembrar que, nesse exemplo, estamos extraindo o DNA a partir de amostras de tecidos. No entanto, existem variações do protocolo.
Fim experimento.
· O acetato de amônio facilita a precipitação do DNA pelo etanol e o etanol absoluto, além de concentrar o DNA, também ajuda a remover os resíduos remanescentes de fenol e clorofórmio.
A unidade volume é usada para padronizar as quantidades em qualquer sistema, supondo um volume de 500μL de fase aquosa, meio volume significa 250μL e dois volumes significam 1.000μL.
Procedimentos de extração de RNA
O procedimento de extração de RNA é bem parecido com o método de extração de DNA, mesmo o RNA sendo mais frágil e demandando mais cuidados.
· Todo material que entra em contato com a amostra, deve possuir a característica de ser RNase free.
· Além disso, a amostra deve sempre ser refrigerada em nitrogênio líquido ou gelo para evitar a ação de alguma RNase remanescente.
Três etapas do protocolo de extração de DNA, ressaltando quais são as diferenças entre a extração do DNA e RNA.
1. Fase 1: Quebra da membrana - A quebra pode ser feita de forma mecânica ao invés de utilizar o tampão de digestão, usando um pistilo, bastão ou sonicador, aparelho capaz de utilizar energia das ondas sonoras para agitar partículas. Esta técnica apresenta uma vantagem: por ser mais rápida, diminui a chance de degradação do RNA.
2. Fase 2: Extração do RNA - Não são utilizadas as RNases. A solução de fenol/clorofórmio na extração de RNA deve ter pH ácido (entre 4,5 e 5,5) para que o RNA fique na fase aquosa e o DNA fique na interface.
3. Fase 3: Purificação do RNA - A purificação do RNA é muito parecida com a do DNA, a diferença está no armazenamento: para RNA é preferível utilizar nitrogênio líquido.
Armazenamento do DNA e do RNA purificados
Para o DNA, devemos armazená-lo em um tubo de plástico (preferencialmente de propileno) vedado a fim de evitar evaporação, em uma temperatura abaixo de 0°C. Dessa forma, diminuímos a atividade biológica das DNases. 
O DNA purificado é mantido em solução tampão tris-EDTA, com pH 7,2. A validade do DNA nessas condições, é bastante alta.
	Temperatura ambiente
	- Até 26 semanas
	Temperaturas baixas de 2°C a 8°C
	- 1 ano
	Congelado a -20°C
	7 anos
	Congelado a -70°C
	+7 anos
O DNA purificado é bastante resistente, uma vez que a sua solução não contenha água, pois a água quando congela forma cristais que podem danificar os materiais orgânicos.
Após a extração do RNA, ele deve ser armazenado como um precipitado em etanol a 70% congelado na temperatura de -70°C.
Após 2 meses, mantido na temperatura de -20°C, o RNA não perde sua integridade. No entanto, é importante destacar que, na temperatura de -20°C, ainda temos uma atividade RNases, sendo assim mais recomendado o congelamento em temperaturas de -70°C ou inferior.
Armazenagem do RNA: ele deve ser armazenado como um precipitado em etanol a 70% congelado na temperatura de -70°C, pois a temperatura de -20°C, ainda temos uma atividade RNases. Assim como no DNA, os tubos devem ser de plástico estéril e manuseados com luvas limpas por uma solução de água com dietilpirocarbonato (composto capaz de eliminar RNases dos tubos) ou então por tubos com garantia de serem RNase-free.
O etanol auxilia na precipitação do RNA, ajudando a concentrá-lo. Dessa forma, o RNA fica menos suscetível a agentes degradantes.
Quantificação, análise de pureza e integridade do material molecular
A extração do DNA/RNA é sem nenhuma dúvida um dos processos mais importantes da Biologia Molecular, pois esses materiais servem de matéria-prima para diversas outras técnicas da Biologia Molecular:
· Reação da cadeia da polimerase (PCR)
· Sequenciamento, clonagem, hibridização.
O controle de qualidade da extração é dado pela quantificação, pureza e integridade desses materiais.
Quantificação
Na quantificação, determinamos a quantidade de DNA/RNA extraído da amostra inicial. 
· A técnica mais utilizada é a fluorometria.
Nesta técnica, uma pequena alíquota da amostra é transferida para outro tubo, onde é adicionada uma solução e um agente fluorescente capaz de se ligar entre as bases do DNA e RNA.
Quando o agente fluorescente (fluoróforo) se liga a algo (DNA ou RNA), ele emite fluorescência e assim podemos medir, com ajuda de um aparelho (fluorímetro), a quantidade de fluorescência da amostra.
· Quanto maior for a fluorescência, maior é a quantidade de DNA ou RNA.
É uma técnica simples e após a quantificação, sabemos se temos a quantidade de material suficiente para as próximas etapas.
Além disso, podemos utilizar diferentes agentes fluorescentes: um específico para DNA e outro específico para RNA. Assim, podemos quantificar o quanto temos de cada um desses materiais moleculares.
Pureza
Em relação à pureza, podemos avaliar se um DNA ou RNA apresenta contaminantes.
Para essa análise, a técnica mais utilizada é a espectrofotometria.
Antes de entender a técnica, é importante lembrar que luz visível é uma pequena parte de todo o espectro de radiação eletromagnética existente, compreendendo comprimentos de onda entre 380-750 nm.
A espectrofotometria tem como princípio básico utilizar a capacidade das moléculas orgânicas de absorverem (absorbância) ou transmitir (transmitância) luz em determinado comprimento de onda, em um equipamento chamado de espectrofotômetro.
A partir dela, podemos identificar os componentes em uma solução, pois as biomoléculas apresentam espectros característicos ao UV, visível ou infravermelho.
Por exemplo, já é estabelecido que as proteínas absorvem comprimentos de onda de 280nm; o RNA e DNA absorvem no comprimento de onda de 260nm e o fenol e outros constituintes no comprimento de onda de 230nm.
· Além da possibilidade de indicar a biomolécula presente, podemos quantificá-la. 
Na prática, a quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da substância, assim, quanto maior for a concentração da substância, maior é a absorção de luz.
· Etapa 1: Nesta etapa, precisamos indicar para o aparelho onde nossa amostra está diluída um procedimento parecido com a tara da balança. Para isso, apenas o tampão usado na extração é colocado em uma cubeta transparente e limpa, e no aparelho, ajustamos o comprimento de onda desejado.
· Etapa 2: Nesta etapa, quando a luz incide na cubeta, apenas uma quantidade consegue ultrapassar a amostra e o aparelho consegue quantificar a luz que é absorvida (absorbância) e isso gera um valor.
· Etapa3: Nesta etapa, como nesse momento apenas temos o tampão, informamos ao aparelho que esse é nosso controle e que essa leitura não deve ser considerada, zerando o aparelho.
· Etapa 4: Nesta etapa, colocamos a amostra com o material purificado em outra cubeta transparente e limpa e medimos a luz absorvida, por sua vez, a luz absorvida representa a quantidade da substância analisada.
Não esquecer que, quanto maior for a absorção de luz, maior a quantidade de determinado material.
· Dizemos que o material genético está puro quando essa relação é maior ou igual a 1,8. 
· Valores inferiores a 1,8 indicam contaminação com proteínas e que o processo extrativo não foi realizado de forma correta. 
Integridade
· Integridade avalia se o DNA/RNA extraído está íntegro.
· Essa avaliação é feita a partir da técnica de eletroforese.
A eletroforese é uma técnica com uma enorme quantidade de variações e desdobramentos e é utilizada para os mais variados objetivos. 
· O princípio básico da eletroforese é sua aplicação no controle da integridade do material que foi extraído.
A eletroforese consiste na migração e separação de moléculas de acordo com a carga após a geração de um campo elétrico. A eletroforese utiliza diferentes meios de suporte, como fitas ou membranas de poliacetato de celulose e géis de agarose, que apresentam poros por onde as moléculas devem passar. Para isso, uma pequena quantidade de amostra é aplicada em um gel, geralmente a agarose, inerte (que não reage com a amostra).
Em seguida, é gerado um campo elétrico onde um polo do gel fica com a carga negativa(onde é aplicado), e outra positiva. Como o DNA/RNA possui carga negativa, migrará para o polo positivo através do gel. No entanto, esse gel apresenta poros, conferindo resistência ao movimento das moléculas. Assim, moléculas mais pesadas e maiores ficarão presas no gel, enquanto as menores e mais leves migram com mais facilidade no gel.
No nosso organismo, as moléculas apresentam diferentes cargas.
· O DNA/RNA, devido ao grupamento fosfato, apresenta carga negativa.
Além disso, as moléculas são separadas pelo tamanho.
Após a eletroforese, podemos detectar o DNA/RNA pela coloração (normalmente é utilizado o brometo de etídio, um corante que intercala no DNA) e visualização de bandas de DNA em um equipamento chamado transiluminador.
· Se a amostra estiver íntegra, verificamos apenas uma marca (banda) intensa no gel de eletroforese.
· Se a amostra estiver fragmentada, essa banda se apresenta “espalhada” (arraste) ao longo do comprimento do gel, indicando que existem diversos fragmentos, ou seja, o DNA/RNA não está íntegro.
Síntese de cDNA
· O DNA obtido a partir do RNA é chamado de cDNA (DNA complementar). Recebe esse nome pois é complementar ao RNA molde.
Como aprendemos anteriormente, existem várias técnicas na Biologia Molecular, PCR, sequenciamento, clonagem e hibridização que são dependentes da matéria-prima (DNA, na maioria dos casos). Essas técnicas podem ser utilizadas para diferentes fins, mas nem sempre a simples extração de DNA/RNA é suficiente para analisar o que se deseja.
A detecção do gene x não indica muito sobre a expressão da proteína, uma vez que não conseguimos saber se ele foi transcrito, se o splicingalternativo gerou a proteína correta, se o RNAm foi devidamente processado:
Nesse caso, o ideal é avaliar o RNAm, já processado, sem a presença de íntrons.
· Íntrons são trechos de RNA retirados do RNAm maduro durante o processamento do RNA.
· splicingalternativo: Procedimento realizado pelas células para a maturação do RNA mensageiro (RNAm).
Além disso, algumas técnicas utilizam apenas o DNA para realizar a amplificação e detecção, como PCR.
· A técnica do PCR, que consiste em amplificar uma amostra de DNA. 
Então fica uma dúvida: como fazer essa análise? Isso porque, segundo o dogma central da Biologia, o DNA é transcrito em RNA e o RNA é traduzido em proteína.
O vírus da imunodeficiência humana (HIV), que revolucionou a Biologia Molecular. Este é um vírus de RNA, que após a penetração na célula-alvo, injeta o RNA viral no citoplasma. Lá, uma proteína do vírus chamada transcriptase reversa converte o RNA em DNA, esse DNA entra no núcleo e outra proteína chamada integrase junta o DNA do vírus com o da célula-alvo. Agora, a célula-alvo é capaz de transcrever o DNA viral (presente no genoma da célula hospedeira) em RNA viral, que forma outro vírus de HIV, e assim continua o processo de infecção.
· Nesse processo, algo muito curioso acontece: a transcriptase reversa do vírus é capaz de alterar o dogma central da Biologia, transformando o RNA em DNA.
O DNA obtido a partir do RNA é chamado de cDNA (DNA complementar). Recebe esse nome pois é complementar ao RNA molde.
A construção do cDNA é feita em um tubo contendo:
· RNA molde, Nucleotídeos, DNA polimerase (sintetiza o DNA)
· Transcriptase reversa: é a polimerase capaz de transcrever o RNA em cDNA.
· Primers: pequenos fragmentos de DNA em fita simples que se complementam ao RNA para dar início à transcrição reversa.
Como começa a cDNA? 
· A síntese do cDNA começa pelo anelamento do primer no RNA, seguido pelo acoplamento da transcriptase reversa e início da sua atividade.
Durante a construção do cDNA, uma etapa crítica para termos um cDNA de boa qualidade é a construção do primers. Existem três estratégias gerais de construção de primers:
1. Oligo dt: É o primer formado por vários nucleotídeos do tipo timina que se anela a cauda poli-A do RNAm maduro.
2. Randômico: Este primer é feito de pequenas sequências aleatórias que se anelam a qualquer RNA presente.
3. Específico: É o primer construído especificamente para um determinado RNA, sendo utilizado quando se tem um alvo determinado, por exemplo, diagnosticar um RNA viral.
É importante ressaltar que os três tipos de primers podem ser combinados, formando um primer com um trecho oligo dT e outro trecho específico. A combinação de primers depende de criatividade do pesquisador e da sua capacidade de otimizar a síntese do cDNA.
A técnica mais utilizada para quantificação de amostras de RNA e DNA é a fluorometria, a partir da detecção da fluorescência, podemos inclusive diferenciar o RNA e o DNA.
Sobre a técnica de extração de DNA/RNA, os elementos mais usados são solução de fenol/clorofórmio.
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