Aula 2 - Proteinas e Proteomica

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LGN5809 -GenéticaMolecular
MOLÉCULAS CELULARES: UM 
ENFOQUE NAS PROTEÍNAS
Ilara Budzinski
Departamento de Genética
ilara@usp.br
Sumário
➢ Macromoléculas celulares
➢ Proteínas–forma e função
➢ Conceito e princípios da “proteostase”
➢ Dobramento de proteínas
➢ Degradação de proteínas
➢ Proteômica
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O QUE É A 
VIDA?
➢ Sistema altamente regulado
de síntese e manutenção de
moléculas.
INTRODUÇÃO
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➢ Os organismos vivos utilizam o mesmo padrão molecular para
assegurar o seu metabolismo, mas cada espécie possui um
conjunto específico de ácidos nucléicos e consequentemente de
proteínas responsáveis pela sua identidade.
INTRODUÇÃO
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INTRODUÇÃO
➢ Vida celular: interações e reações químicas
➢ Composição química da célula
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MACROMOLÉCULAS
Nucleotídeo Ácido Nucleico
Aminoácido Polipeptídeo
Monômero Monômero Polímero
Monossacarídeo Polissacarídeo
Lipídeos (ácidos graxos + glicerol)
*os lipídios não são polímeros, isto é, não são
repetições de uma unidade básica.
Monômero
Monômero
Polímero
Polímero
Monômero
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PROTEÍNAS: DEFINIÇÃO
Tradução
Mais versátil composto celular:
estrutura dinâmica, altamente
moldável, responsável por
inúmeras funções celulares.
MOLÉCULAS QUE FAZEM MOLÉCULAS
PROTEÍNAS
PROTEÍNAS: PROPRIEDADES
➢ Aminoácidos
▪ Forma
▪ Hidrofobicidade
▪ Solubilidade 
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PROTEÍNAS: PROPRIEDADES
➢ ESTEREOQUÍMICA DOS AMINOÁCIDOS
Aminoácidos são denominados "D-" ou "L-“
✓ Os aminoácidos nas moléculas protéicas são L estereoisômeros;
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PROTEÍNAS: PROPRIEDADES
➢ PROPRIEDADES ÁCIDO-BASE DE AMINOÁCIDOS
• Podem ser classificados de acordo com a estrutura da cadeia
lateral em neutros, ácidos ou básicos.
Básicos: lisina, arginina e histidina,
Ácidos: glutamato e o aspartato,
Neutros: os demais 
✓ Solúveis em água,
✓ São Anfóteros – podem doar ou receber prótons (H+),
✓ A forma predominante do aminoácido depende do pH,
✓ Ponto de fusão elevado.
PROTEÍNAS: PROPRIEDADES
Direcionalidade da cadeia
N --- C
PROTEÍNAS: PROPRIEDADES
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Mas para que toda essa diversidade estrutural? 
PROTEÍNAS: DIVERSIDADE ESTRUTURAL
DOI: 10.1126/science.aah404
14
A função de uma proteína é derivada da sua
estrutura tridmensional, e a estrutura
tridimensional especificada pela sequência
de aminoácidos e interações não covalentes.
PROTEÍNAS: FORMA E FUNÇÃO
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Influência na arquitetura orgânica
“FORMA É FUNÇÃO”
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• Proteínas estruturais,
• Proteínas transportadoras de membranas,
• Enzimas,
• Proteínas andaime (scaffold),
• Proteínas reguladoras (e.x. proteínas de sinalização),
• Proteínas motoras.
PROTEÍNAS : FORMA E FUNÇÃO
➢CLASSES: 
PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERARQUICA
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➢ Proteínas ativas tem conformação específica
PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
➢ ESTRUTURA PRIMÁRIA
▪ Arranjo linear de aminoácidos
▪ Peptideo – até 30 resíduos de aminoácidos
▪ A massa das proteínas é calculada em Daltons (Da)
▪ Em média, o peso molecular de aminoácidos em proteínas é 
de 113 Da
PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
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PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
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PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
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PROTEÍNAS: PRIMEIRA PROTEÍNA SEQUENCIADA
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PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
➢ ESTRUTURA SECUNDÁRIA
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PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
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PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
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PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
➢ Estrutura Terciária
▪ Arranjo tridimensional de todos os resíduos de aminoácidos
▪ Estabilizadas por pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e hidrofílicas 
▪ Não são rígidas
α-hélice
Folha Beta
PROTEÍNAS: ESTRUTURA MOLECULAR
➢MOTIVOS ESTRUTURAIS 
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Funções como: ligação a um íon específico, ou molécula pequena (e.x. 
cálcio ou ATP). 
PROTEÍNAS: ESTRUTURA MOLECULAR
➢ DOMÍNIOS 
▪ Regiões distintas das proteínas onde há dobramentos compactos do
polipeptídeo.
Domínios funcionais
Domínios estruturais
Domínios topológicos
Hemaglutinina – dominioglobular e fibroso
Geralmente domínios estruturais são domínios 
funcionais!
PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
▪ Composta por dois ou mais polipeptideos ou subunidades que podem
ser iguais ou não.
➢ ESTRUTURA QUATERNÁRIA
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PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
33
PROTEÍNAS: ESTRUTURA HIERÁRQUICA
Hoje você identifica milhares de 
proteínas, o grande desafio é 
definir a função 
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PROTEÍNAS: DIVERSIDADE
➢ Modificações pós-traducionais
Serina, Treonina e 
Tirosina e Histidina
FosforilaçãoAcetilação
Glicosilação
Ubiquitinação
Estabilidade e proteção das 
proteínas e regulação da 
interação DNA/Proteína
Ativação/Desativação de 
atividade, sinalização
80% das PTM
Adição de Carboidratos 
às proteínas
Aspargina, Serina e 
Treonina
Degradação
Lisina
DOBRAMENTO DE PROTEÍNAS
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DOBRAMENTO DE PROTEÍNAS
PROTEÍNAS: PROTEOSTASE
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39
PROTEÍNAS: PROTEOSTASE
PROTEÍNAS: PROTEOSTASE
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PROTEÍNAS: PROTEOSTASE
Cochaperonas
auxiliam na ligação 
do substrato e 
hidrólise do ATP!!
➢Chaperonas individuais
PROTEÍNAS: PROTEOSTASE
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PROTEÍNAS: MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS
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➢ Função é resultado da estrutura!!
PROTEÍNAS: MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS
Quase todas as funções dependem da 
especificidade e afinidade das proteínas!
Catalização par aoutras atividades proteícas
• Fosforilação de proteínas–sinalização
• Hidrólise do ATP 
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PROTEÍNAS: ENZIMAS
• Alteração química do ligante (substrato)
• Reduz a energia de ativação 
• Altamente especializadas (especificidade)
Otimização do processo catalítico:
• Mesma localização
• Estruturas multiméricas
• Coevolução
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PROTEÍNAS: ENZIMAS
➢ ESTRUTURAS MUTIMÉRICAS
➢ Movimento celular e transporte intracelular
PROTEÍNAS: MOVIMENTO
Nas células tudo é controlado - palavra de ordem é otimização!
PROTEÍNAS: ALOSTERIA
Alosteria: qualquer alteração na estrutura terceária ou
quartenária induzida pela ligação à um ligante.
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PROTEÍNAS: ALOSTERIA
➢ Cálcio: modulador da atividade protéica
PROTEÍNAS: SINALIZAÇÃO
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PROTEÍNAS: UBIQUITINAÇÃO
➢ Há também o controle da quantidade de proteínas
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PROTEÔMICA: O INÍCIO
Qual é a diferença?
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PROTEÔMICA: O INÍCIO
Como esses genes 
são “usados” ? 
✓ As proteínas fornecem informações, em nível molecular,
sobre a variabilidade genética que é efetivamente expressa
pelo genoma !!!
PROTEÔMICA: O INÍCIO
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• Conjunto de todas as proteínas de uma célula, organela,
tecido, ou organismo em um dado momento/ condição.
❖ PROTEOMA
❖ PROTEÔMICA
• Metodologia, conjunto de técnicas utilizadas para se estudar
o Proteoma.
PROTEÔMICA: DEFININDO CONCEITOS
Análise qualitativa e quantitativa; identificação de modificações
pós-traducionais (PTMS), identificação de proteoformas ...
PROTEÔMICA: O INÍCIO
Marc Wilkins em 1994.
“The entire protein complement expressed by a genome, or
by a cell or tissue type”
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PROTEÔMICA: POSSIBILIDADES
http://mmbr.asm.org/content/66/1/39/F1.large.jpg
60
PROTEÔMICA: ABORDAGENS EM PROTEÔMICA
➢ BOTTOM-UP E TOP-DOWN
• Identificação de amostras complexas.
• Limitação na identificação de MPT.
• Separa proteoformas.
• Identificação de proteínas desconhecidas e MPT
PROTEÔMICA: BOTTOM-UP E TOP-DOWN
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Gel-based Gel-free
➢ BOTTOM-UP
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PROTEÔMICA: ESTRATÉGIAS DE QUANTIFICAÇÃO
Anal Chem. 2016 Jan 5; 88(1): 74–94.
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PROTEÔMICA: EXEMPLO
• Quantitative atlas 30 tissues
• more than 18,000 proteins, representing 66% of the annotated protein-coding genes
• 43,000 sites phosphorylation
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PROTEÔMICA: EXEMPLO
• Obtained 1,058 candidates for NE-enriched proteins
• Identified ~200 potential candidates for plant nuclear envelope
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PROTEÔMICA: EXEMPLO
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
Extração e 
Separação das 
Proteínas
Cromatografia e 
Espectrometria de 
Massas
Processamento 
Análise de Dados
Estatística
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PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
Coleta Extração Análise dos dados
Análise da amostra
(separação e detecção)
• Interrupção RÁPIDA do metabolismo (Quenching)Minimizar a formação ou a 
degradação de proteínas e 
metabólitos após a coleta 
• Repetição biológica
• Armazenamento em -80ºC
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PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
➢ EXTRAÇÃO
✓ Romper as interações macromoleculares (interações covalentes).
✓ Evitar modificações pos-traducionais.
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Diferentes protocolos para a extração de proteínas totais:
Extração com ácido tricloroacético (TCA)/Acetona (Damerval et al., 1986): rápida
inativação de proteases;
Extração fenólica (Hurkman & Tanaka, 1986): própria para tecidos ricos em compostos
fenólicos;
Extração fenólica + TCA/Acetona (Wang et al., 2003): própria para tecidos ricos em
fenóis, lipídeos e pigmentos;
Extração de proteínas com remoção da rubico;
Da-Gin et al. 2014. bio-protocol.org/e1277
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
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PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
➢ SOLUBILIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS:
✓ Agentes caotrópicos (e.x. uréia, tiouréia)
• Rompem as interações não covalentes (ex: interações hidrofóbicas)
✓ Agentes redutores (e.x. DTT, β-mercaptoetanol)
• Rompem as pontes dissulfeto
✓ Detergentes (e.x. CHAPS e Triton)
•Rompem as interações hidrofóbicas, promovendo a
solubilização de proteínas de membrana e o
rompimento das interações entre proteínas.
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters for DNA and Protein Purification and Concentration
✓ DESSALINIZAÇÃO
✓ QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
* NanoDrop * Bioanalyzer* Método de Bradford
✓ DIGESTÃO DE PROTEÍNAS: Tripsina
SDS (dodecil-sulfato de sódio) - PAGE (poliacrilamida)
➢ GEL SDS-PAGE
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
➢ Separação das proteínas em gel de sds-page
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
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PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
➢ ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2DE)
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
Pool proteico
• Focalização Isoelétrica (1D): SEPARAÇÃO POR CARGA
• Eletroforese Bidimensional (2D): SEPARAÇÃO POR MASSA
Sarcófago Focalizador
isoelétrico
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http://www.clker.com/clipart-10885.html
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICAPROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
pH 3 pH 10
Omics Technol. Bio-Eng. 2018, Pages 317-351 76
Ácido BásicoPrimeira Dimensão
Se
gu
n
d
a 
D
im
en
sã
o
Alto MW
Baixo MW
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
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PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
CONTROLE TRATAMENTO
➢ ANÁLISE DOS GÉIS
Análise de imagens (ImageMaster)
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PROTEÔMICA: PUBLICAÇÕES 2-DE
2018
2017
2020
2022
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Amostras
0,2% Rapigest SF
DTT 100mM
Iodocetamida 300mM
Tripsina 1:100 enzima/proteína
TFA 5%
Enolase 100fmol. μL-1
200 ng.uL
Desnaturação
Redução
Alquilação
Digestão
Overnight
37ºC
Hidrólise do Rapigest
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
➢ Digestão Shotgun (Amostra Complexa)
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http://www.clker.com/clipart-10885.html
➢ DIGESTÃO
PROTEÔMICA: FLUXO DE ANÁLISE EM PROTEÔMICA
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PROTEÔMICA: CROMATOGRAFIA LÍQUIDA E ESPECTROMETRIA
PROTEÔMICA: CROMATOGRAFIA LIQUIDA E
ESPECTROMETRIA DE MASSAS (LC-MS)
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• Métodos físico-químico de separação dos componentes de uma
mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas
fases: a fase móvel (líquidos ou gases) e a fase estacionária (sólidos
ou líquido).
• Separação de compostos considerando o tempo necessário para
que eles eluam da fase estacionária.
PROTEÔMICA: CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
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Colunas entre 10 e 30 cm e 3-5 mm diâmetro
PROTEÔMICA: CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
nanoEase M/Z HSS T3 Column
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PROTEÔMICA: ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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• Ferramenta analítica para determinar a composição molecular de
uma amostra, através da relação massa/carga (m/z) da molécula
ionizada.
• O requisito básico para uma análise por espectrometria de massas é
a formação de íons livres em fase gasosa.
• Em resumo, o MASSAS permite identificar a estrutura molecular e a
composição qualitativa e quantitativa de moléculas.
PROTEÔMICA: ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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PROTEÔMICA: FRAGMENTAÇÃO DE PEPTÍDEOS
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PROTEÔMICA: BUSCA EM BANCO DE DADOS
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PROTEÔMICA: IDENTIFICAÇÃO BANCO DE DADOS
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➢PEPTIDE MASS FINGERPRINTING
➢ MS/MS ion search
PROTEÔMICA: IDENTIFICAÇÃO BANCO DE DADOS
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PROTEÔMICA: IDENTIFICAÇÃO BANCO DE DADOS
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PROTEÔMICA: RESULTADOS
PROTEÔMICA: QUANTIFICAÇÃO
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PROTEÔMICA: ESTATÍSTICA
•Univariada: Teste t, Anova, Volcano Plot
•Multivariada: PCA e PLS
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PROTEÔMICA: ESTATÍSTICA
HIERARCHICAL CLUSTERING
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PROTEÔMICA: ESTATÍSTICA
➢ CATEGORIZAÇÃO FUNCIONAL
INTERAÇÃO PROTEÍNA-PROTEÍNA
PROTEÔMICA: REPOSITÓRIO
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	Seção Padrão
	Slide 1
	Slide 2
	Slide 3
	Slide 4
	Slide 5
	Slide 6
	Slide 7
	Slide 8
	Slide 9
	Slide 10
	Slide 11
	Slide 12
	Slide 13
	Slide 14
	Slide 15
	Slide 16
	Slide 17
	Slide 18
	Slide 19
	Slide 20
	Slide 21
	Slide 22
	Slide 23
	Slide 24
	Slide 25
	Slide 26
	Slide 27
	Slide 28
	Slide 29
	Slide 30
	Slide 31
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	Slide 33
	Slide 34
	Slide 35
	Slide 36
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	Slide 38
	Slide 39
	Slide 40
	Slide 41
	Slide 42
	Slide 43
	Slide 44
	Slide 45
	Slide 46
	Slide 47
	Slide 48
	Slide 49
	Slide 50
	Slide 51
	Slide 52
	Slide 53
	Slide 54
	Slide 55
	Slide 56
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	Slide 58
	Slide 59
	Slide 60
	Slide 61
	Slide 62
	Slide 63
	Slide 64
	Slide 65
	Slide 66
	Slide 67
	Slide 68
	Slide 69
	Slide 70
	Slide 71
	Slide 72
	Slide 73
	Slide 74
	Slide 75
	Slide 76
	Slide 77
	Slide 78
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	Slide 80
	Slide 81
	Slide 82
	Slide 83
	Slide 84
	Slide 85
	Slide 86
	Slide 87
	Slide 88
	Slide 89
	Slide 90
	Slide 91
	Slide 92
	Slide 93
	Slide 94
	Slide 95
	Slide 96
	Slide 97