EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA E RNA

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EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA E 
RNA 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
As moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA – deoxyribonucleic acid) e de 
ácido ribonucleico (RNA – ribonucleic acid) são formadas por pequenas estruturas 
denominadas nucleotídeos. Os nucleotídeos, por sua vez, são formados por um açúcar 
composto por cinco carbonos (pentose), um grupamento fosfato e uma base 
nitrogenada (adenina, timina ou uracila, guanina e citosina). Cada base nitrogenada 
diferencia-se da outra pela composição de sua estrutura química. Entretanto, elas 
apresentam similaridades entre si. Por exemplo, a citosina (C), a timina (T) e a uracila 
(U) são classificadas como pirimidinas, porque suas estruturas provêm do anel das 
pirimidinas, com seis átomos. Já a guanina (G) e adenina (A) são classificadas como 
purinas, porque suas estruturas são compostas de dois anéis, um com seis átomos e o 
outro com cinco. 
A junção dos nucleotídeos resultará na síntese das moléculas de DNA ou RNA, e 
ocorre por meio de ligações fosfodiéster. As ligações fosfodiéster se devem ao ataque 
nucleofílico de uma hidroxila da pentose de um nucleotídeo ao grupamento fosfato do 
nucleotídeo anterior, resultando em uma estrutura semelhante a um “colar de 
miçangas”, no qual cada “miçanga” corresponde a um nucleotídeo e o “cordão” que as 
une é a ligação fosfodiéster. 
É interessante ressaltar que, em 1953, Watson e Crick propuseram o modelo 
tridimensional das moléculas de DNA com base em descobertas anteriores de difração 
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por raio X das fitas de DNA e experimentos realizados por outros cientistas, como Erwin 
Chargaff. Nesse modelo, as fitas de DNA foram caracterizadas como uma dupla-hélice 
formada por duas cadeias helicoidais enroladas ao próprio eixo. Uma das forças que 
mantêm essa dupla-hélice são as ligações de hidrogênio entre os pares de bases 
nitrogenadas que são denominadas como complementares (adenina e timina/uracila e 
citosina e guanina). Cada porção do “colar de miçanga” (nucleotídeos) tem regiões 
específicas, chamadas de genes. Os genes são responsáveis por todas as características 
que um indivíduo herda de seus ancestrais. Cada gene tem regiões conhecidas como 
éxons e íntrons. Os íntrons são geralmente porções do gene responsáveis por 
mecanismos de regulação, enquanto os éxons são responsáveis pela síntese de 
proteínas. Os íntrons e os éxons são organizados e separados pelo mecanismo de 
splicing da molécula de RNA transcrita da fita de DNA. 
O DNA é dividido em cromossomos, e cada gene tem um “lugar” específico no 
cromossomo, denominado lócus. Cada espécie tem um conjunto característico de 
cromossomos. Por exemplo, o genoma (informação genética) humano tem 22 
cromossomos diferentes, sendo mais dois cromossomos os sexuais (X ou Y). Dessa 
forma, cada célula (com exceção das de linhagem germinativa e outros tipos muito 
raros, que não são capazes de se dividir) tem duas cópias de cada um desses 
cromossomos, resultando em um total de 46 cromossomos. Por outro lado, as bactérias 
têm um único DNA, no qual todos os genes estão distribuídos. 
Diante do exposto, os ácidos nucleicos apresentam características estruturais 
específicas que permitem que sejam isolados e manipulados para diversos tipos de 
aplicações. A técnica de hibridização in situ, por exemplo, baseia-se na 
complementaridade das fitas de DNA ou RNA, utilizando sondas fluorescentes para a 
detecção da fita complementar em uma determinada amostra. Essa técnica permite o 
estudo da expressão gênica. Outra técnica, que também tem o mesmo princípio e 
finalidade, é a reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa (RT-PCR), muito 
utilizada no diagnóstico de algumas infecções e doenças. À vista disso, o primeiro passo 
para a maioria das técnicas citadas é o isolamento e purificação das moléculas de DNA 
e RNA, que será apresentado detalhadamente a seguir. 
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2. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA OU RNA 
 
As técnicas de extração e purificação das moléculas de ácidos nucleicos (DNA ou 
RNA) têm basicamente dois princípios: a extração do DNA ou RNA, por meio da lise das 
membranas celulares, e a purificação das moléculas de DNA ou RNA, por meio da 
exclusão de outros componentes celulares, como proteínas, e de lavagens específicas. 
Assim, cada protocolo utilizará sempre esses mesmos princípios. Entretanto, o que 
muda entre um protocolo e outro? 
Ao se explicarem as finalidades e funções de cada reagente utilizado nas etapas 
de purificação do DNA ou RNA, as mudanças entre os protocolos ficarão mais claras. 
A primeira etapa, como já citado, é a lise das membranas celulares. Para isso, 
geralmente, são utilizados alguns tipos de detergentes, como o SDS (dodecil sulfato de 
sódio) e o CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio). 
A segunda etapa envolve a separação do DNA dos outros componentes celulares, 
como as proteínas. Para isso, são utilizados diversos tipos de reagentes, como: 1) 
agentes desnaturantes de proteínas, como o tiocianato de guanidina, a proteinase K (faz 
a “digestão” das proteínas que podem degradar os ácidos nucleicos ou daquelas que 
podem estar associadas a eles), o β-mercaptoetanol (“quebra” as ligações dissulfeto 
formadas entre os aminoácidos de cisteínas das proteínas); 2) agentes “quelantes”, 
como o EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), tanto para a remoção de outros 
contaminantes, como taninos e polifenóis, quanto para a inativação de íons de magnésio 
necessários para a atividade enzimática da DNAse (uma enzima que cliva o DNA, 
resultando em sua degradação); e 3) um tampão alcalino composto de Tris (pH 8,0) que, 
juntamente com altas concentrações de um sal (geralmente, cloreto de sódio), auxilia 
na neutralização das cargas negativas das moléculas de DNA ou RNA e na posterior 
precipitação dessas moléculas. 
Alternativamente, usam-se solventes orgânicos, em vez de altas concentrações 
de sais, como o fenol e/ou o clorofórmio, que auxiliam na degradação das proteínas e 
na formação de duas fases: uma solúvel, em que as moléculas de DNA ou RNA são 
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dissolvidas, e uma insolúvel, na qual se encontram os restos ou debris celulares, as 
proteínas e outros componentes celulares diferentes dos ácidos nucleicos. 
Outra alternativa para a não utilização de solventes orgânicos – que podem 
irritar as mucosas e tornarem-se tóxicos – é o uso das colunas de sílica. As colunas de 
sílica são extremamente versáteis na purificação do DNA ou RNA, porque são compostas 
de cargas positivas e, portanto, têm alta afinidade com as moléculas de ácidos nucleicos 
de carga negativa. Geralmente, kits comercialmente disponíveis utilizam essas colunas 
de sílica para a separação dos ácidos nucleicos. Entretanto, além da lise e da separação 
do DNA ou RNA de outros componentes celulares por meio da sílica, durante o uso 
desses kits comerciais, há algumas etapas adicionais de lavagens, seguidas da eluição do 
DNA ou RNA da sílicacom o auxílio de água ou tampões de baixa força iônica (pH ≥ 7,0). 
Ainda, após a separação de DNA ou RNA de outros componentes celulares, para a 
garantia da máxima pureza, os ácidos nucleicos são precipitados em etanol ou 
isopropanol na presença de cátions monovalentes. Nessa fase, dependendo da 
quantidade de DNA ou RNA extraído, eles ficam visíveis a “olho nu” como um 
precipitado branco. 
 
3. CUIDADOS COM AS AMOSTRAS 
 
As amostras contendo o DNA ou RNA purificados devem ser: 1) ressuspensas em 
um tampão e armazenadas em tubos, ambos “livres” de enzimas que possam degradá-
las (como DNAse ou RNAse – nucleases); e 2) mantidas em baixas temperaturas (–20oC 
ou –80oC). Todos os procedimentos devem ser realizados com luvas para evitar a 
degradação das amostras, devido à presença de nucleases nos fluidos corporais das 
mãos. 
 
 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
 
ALBERTS, Bruce et al. Biologia molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. 
1.728 p. ISBN 978-85-363-2170-7. 
 
BROWN, Theodore L. et al. Química: a ciência central. 9. ed. São Paulo: Pearson Prentice 
Hall, 2005. 987 p. ISBN 85-87918-42-7. 
 
CHACON-CORTES, Diego; GRIFFITHS, Lyn R. Methods for extracting genomic DNA from 
whole blood samples: current perspectives. Journal of Biorepository Science for 
Applied Medicine. 2014; 2:1-9. Disponível em: https://doi.org/10.2147/BSAM.S46573. 
Acesso em: 11 fev. 2021. 
 
GRIFFITHS, Anthony J. F. et al. Introdução à genética. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara 
Koogan, 2008. 712 p. ISBN 978-85-277-1497-6. 
 
LODISH, Harvey et al. Biologia celular e molecular. 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 
1.210 p. ISBN 978-85-8271-050-0. 
 
NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. 6. ed. Porto 
Alegre: Artmed, 2014. 1.220 p. ISBN 978-85-8271-073-9. 
 
REECE, Jane B. et al. Biologia de Campbell. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2015. 1.442 p. 
ISBN 978-85-8271-230-6. 
 
 
 
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