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em eletrônicos, cosméticos, indústria de alimentos, agricultura e materiais de construção (especialmente à base de cimento avaliação de nanomateriais; modelos microbianos; toxicidade; óxidos metálicos; De acordo com as estimativas, o volume chegará a cerca de 5 bilhões de toneladas até 2030. Tal demanda no variedade. Os resultados obtidos mostram vários problemas que podem ocorrer ao estudar nanopartículas para ensaio de formação. Os nanoóxidos apresentaram toxicidade contra microrganismos na concentração utilizada, aplicação adicional específica. Protocolos adequados para dispersão de nanomateriais antes da preparação de Nos últimos anos, a nanotecnologia tem ganhado muita atenção, principalmente devido à versatilidade compostos) [1]. A produção de compósitos cimentícios (argamassas de cimento e concretos) é uma das dos ramos mais importantes em materiais de construção. Em 2012, Imbabi et al. [2] mostrou que o aplicabilidade de nanoóxidos em relação ao seu uso posterior em compósitos à base de cimento. Estudos de (Al2O3, CuO, Fe3O4 e ZnO) e sete microrganismos foram testados para avaliar inicialmente a mercado mundial de Cimento Portland comum atingiu 3,6 bilhões de toneladas métricas anualmente. De acordo com compósitos à base de cimento. No entanto, as normas para avaliação de tais aditivos ainda não nanomateriais problemas que precisam ser resolvidos para produzir compósitos eficientes. , Adrian Augustyniak Palavras- chave: compósitos à base de cimento 1 identidade ,, Krzysztof Cendrowski 3Pawel Sikora Ewa Mijowska Artigo Resumo: Nanopartículas foram propostas como adjuvantes de cimento antibacteriano para a produção de 1. Introdução material leva a trabalhos de desenvolvimento de novos materiais, aditivos, plastificantes, etc. [2,3]. Paweÿ Nawrotek e indicar quais organismos modelo usar, particularmente no que diz respeito à aplicação posterior do material. Nanomateriais 2018, 8, 212; doi:10.3390/nano8040212 www.mdpi.com/journal/nanomaterials Aplicação em materiais de construção à base de cimento Atividade antimicrobiana de Al2O3, CuO, Fe3O4 e Nanopartículas de ZnO no escopo de suas outras Além da conhecida toxicidade dos nanomateriais, no caso dos compósitos à base de cimento existem 3 22,* ID limitações associadas à mistura e dispersão de nanomateriais. Portanto, quatro nanoóxidos entre cepas do mesmo gênero. O efeito das nanopartículas nos biofilmes depende do tipo de embora as populações fossem capazes de voltar a crescer. Além disso, o efeito da ação foi variável mesmo nanopartículas incluíram análise química, cinética de crescimento microbiano, toxicidade de 4 e 24 h e biofilme 3 Departamento de Físico-Química de Nanomateriais, Faculdade de Tecnologia e Engenharia Química, 2 1 compósitos à base de cimento, bem como uma abordagem padronizada para seus testes, são os fundamentos Pecuária, Universidade de Tecnologia da Pomerânia Ocidental, Szczecin, Al. Piastów 45, Faculdade de Engenharia Civil e Arquitetura, West Pomeranian University of Technology, Szczecin, 70-311 Szczecin, Polônia; pawel.nawrotek@zut.edu.pl al. Piastow 50, 71-310 Szczecin, Polônia; pawel.sikora@zut.edu.pl Recebido: 15 de fevereiro de 2018; Aceito: 29 de março de 2018; Publicado: 31 de março de 2018 kcendrowski@zut.edu.pl (KC); ewa.mijowska@zut.edu.pl (EM) Universidade de Tecnologia da Pomerânia Ocidental, Szczecin, Al. Piastow 45, 70-311 Szczecin, Polônia; Departamento de Imunologia, Microbiologia e Química Fisiológica, Faculdade de Biotecnologia e * Correspondência: adrian.inpersona@gmail.com; Tel.: +48-663-713-747 aplicações de seus produtos na indústria. Nanopartículas, incluindo metais e óxidos, encontraram aplicação Machine Translated by Google http://www.mdpi.com/journal/nanomaterials https://orcid.org/0000-0003-1092-1359 http://dx.doi.org/10.3390/nano8040212 http://www.mdpi.com/journal/nanomaterials Apesar do problema metodológico associado à análise das propriedades bactericidas dos compósitos à base de cimento, também existem outros problemas que podem impedir o desempenho dado pelos nanomateriais nos compósitos cimentícios. Em primeiro lugar, devido à dimensão das estruturas de betão ou área das argamassas/rebocos aplicados nas superfícies dos edifícios, a quantidade de nanomaterial deve ser Misturar mesmo uma pequena quantidade de nanomateriais com constituintes à base de cimento (cimento, água e agregado) pode afetar consideravelmente as propriedades mecânicas e a durabilidade dos compósitos à base de cimento, além de fornecer propriedades funcionais adicionais, como autodetecção e autocura. , ou resistividade elétrica [4]. Além disso, esforços de pesquisa específicos foram focados no desenvolvimento de compósitos autolimpantes, por exemplo, contendo nanopartículas de TiO2 que poderiam ser efetivamente usadas como fotocatalisadores [5-7]. A utilidade de materiais à base de cimento como mídia de suporte do fotocatalisador é viável e muito eficaz devido à sua forte ligação. Além disso, a estrutura porosa da matriz cimentícia facilita a reação entre o fotocatalisador e os poluentes [8]. Apesar do foco principal estar em superfícies fotocataliticamente ativas (incluindo argamassas de cimento contendo nanopartículas de TiO2), vários outros nanomateriais fotocatalíticos (por exemplo, ZnO, CuO,) e não fotocatalíticos (por exemplo, Al2O3, Fe3O4, AgO) exibindo propriedades antimicrobianas atividade também foram estudados [7,9-11]. A incorporação de tais nanomateriais pode contribuir para o desenvolvimento de compósitos à base de cimento que seriam aplicáveis em locais onde a luz UV/solar é limitada ou indisponível, como sistemas de esgoto, tanques de águas residuais, etc. Por mais úteis que sejam as nanopartículas, os autores ainda discutem sobre seu impacto em organismos terrestres e aquáticos, publicando estudos baseados em diversos métodos [3,12–14]. Apesar de haver muitos dados sobre seu potencial como agentes antimicrobianos [2–5], ainda não há diretrizes gerais sobre como avaliar essas nanopartículas antes de serem usadas na produção industrial de compósitos cimentícios. As regulamentações atuais na União Européia estão sendo expandidas a cada ano, embora a maioria delas diga respeito à produção de alimentos, biocidas, cosméticos e aplicações médicas [15]. Diretrizes considerando a avaliação de nanomateriais ainda são limitadas, apesar dos procedimentos e padrões que foram estabelecidos ao longo dos anos por, por exemplo, International Organization for Standardization (ISO) e Japanese Industrial Standards (JIS). Eles se dedicaram principalmente à avaliação das propriedades de autolimpeza de materiais fotocatalíticos semicondutores. Esses padrões foram incorporados com sucesso em inúmeras análises sobre a capacidade de autolimpeza de compósitos à base de cimento [6,7,9,10,16]. Vários modelos microbianos (por exemplo, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae) foram incorporados para estudos sobre o desempenho antimicrobiano de semicondutores cerâmicos fotocatalíticos ou outros materiais que foram fabricados por meiode revestimento ou mistura com fotocatalisadores [16]. No entanto, as normas internacionais podem ser aplicadas especificamente para a avaliação da atividade antibacteriana nos materiais cerâmicos fotocatalíticos e não podem ser efetivamente utilizadas para os materiais que são permeáveis ou contêm superfícies rugosas. Assim, vários procedimentos estão sendo desenvolvidos para analisar as propriedades antimicrobianas e antifúngicas de compósitos cimentícios fotocatalíticos [3,5,8,17]. No entanto, nenhum procedimento padronizado foi estabelecido onde superfícies não fotocatalíticas à base de cimento foram aplicadas para o desempenho antimicrobiano. Isso cria muitas discrepâncias entre os estudos em que os autores usam diferentes técnicas e equipamentos. Existe a necessidade de desenvolver métodos padronizados para a avaliação de nanomateriais quanto à sua potencial ecotoxicidade. Com base nisso, diversos métodos dedicados a diferentes materiais (por exemplo, materiais poliméricos) estão sendo desenvolvidos ou adaptados [18-21]. Geralmente, os microrganismos são um modelo adequado para estudos considerando nanomateriais em vários aspectos, desde aplicações industriais a materiais de construção, proteção ambiental e agricultura [22]. Modelos microbiológicos podem ser úteis no teste de numerosos nanomateriais, desde nanopartículas, passando por nanobastões, até nanocompósitos planejados para uso em várias aplicações [23-26]. Além disso, não há consenso sobre quais cepas bacterianas são as mais adequadas para tal avaliação. Por exemplo, Muynck et al. [21] avaliaram o efeito de superfícies à base de cimento antimicrobiano em bactérias Gram-negativas (G-) Escherichia coli e Salmonella enterica, e bactérias Gram-positivas (G+ ) Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus, enquanto outros autores limitaram suas pesquisas a E. coli [3,8,17,27]. Isso dificulta os estudos disponíveis para validar e analisar os resultados do teste. Nanomateriais 2018, 8, 212 2 de 15 Machine Translated by Google ser otimizado para aumentar sua eficácia, reduzir a quantidade necessária de nanomaterial e atender aos requisitos econômicos [28]. O custo dos aditivos não deve aumentar significativamente o valor do compósito à base de cimento [2]. Os nanomateriais, como SiO2, TiO2, Al2O3, Fe3O4, ZnO e CuO, são preferidos porque são relativamente baratos, fabricados sem esforço e amplamente disponíveis. Os nanomateriais disponíveis comercialmente são mais preferidos para aplicação prática do que os sintetizados em laboratório por razões tecnológicas e por causa do caráter adaptativo da engenharia civil [4]. Normalmente, a fim de satisfazer os requisitos econômicos e tecnológicos, a quantidade de nanomateriais incorporados ao compósito à base de cimento não deve exceder 5% em peso da massa de cimento. Portanto, métodos para otimizar a dosagem de nanomateriais e explorar totalmente o desempenho de nanomateriais em compósitos cimentícios ainda estão sendo procurados [28-30]. Misturas orgânicas e diferentes tipos de surfactantes [28] são incorporados para facilitar o processo de dispersão, alcançando assim um certo estado de dispersão. Agentes ativos de superfície são amplamente utilizados para melhorar a homogeneidade da dispersão devido à formação de agregados ao redor das nanopartículas [33]. Tal ação é atribuída à contenção de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos. A agregação de surfactantes em torno de nanopartículas geralmente ocorre na forma de micelas. Os grupos hidrofóbicos interagem com as nanopartículas, enquanto os grupos hidrofílicos reduzem a tensão superficial da água e assim aumentam a dispersão do nanomaterial. Infelizmente, muitos surfactantes que são usados com sucesso para dispersar nanomateriais, por exemplo, em matrizes poliméricas, afetam a cinética de hidratação do cimento, bem como reagem negativamente com outras misturas. Portanto, métodos de incorporação de plastificantes e superplastificantes (especialmente à base de éter policarboxilato-PCE) compatíveis com o cimento têm sido amplamente avaliados como dispersantes [29,30]. O processo típico de dispersão de nanomateriais antes da incorporação de compósitos à base de cimento é apresentado na Figura 1. 3 de 15Nanomateriais 2018, 8, 212 Finalmente, a questão chave na incorporação de nanomateriais em compósitos à base de cimento é a sua dispersão adequada na matriz cimentícia. A aglomeração de nanomateriais diminui significativamente sua atividade química e física, dificultando sua eficiência no desempenho da matriz de cimento e atividade antimicrobiana [29,30]. Portanto, a dispersão adequada de nanomateriais na matriz de cimento é a questão- chave abordada por muitos pesquisadores. Nanomateriais adicionados a granel não fornecem dispersão suficiente; portanto, diversos métodos são desenvolvidos por pesquisadores, incluindo agitação mecânica, ultra-som e moagem de nanopartículas [30]. No entanto, para dispersar o nanomaterial, é necessário um meio de dispersão (provavelmente mistura de água). Devido ao fato de que a mistura de água em argamassas de cimento e concretos forma as propriedades finais, a relação água-cimento (a/c) praticada na engenharia civil é menor ou igual a 0,5. Isso implica que uma quantidade limitada de água está disponível para dispersão. Além disso, a temperatura da água de amassamento antes de sua adição aos componentes secos (cimento e agregados) deve permanecer ambiente; portanto, o processamento térmico da suspensão deve ser evitado para que o processo de hidratação do cimento não seja interrompido [29-32]. Figura 1. Processo esquemático do método de dispersão de nanomateriais comumente usado na preparação de compósitos à base de cimento. Machine Translated by Google 4 de 15Nanomateriais 2018, 8, 212 No entanto, neste nível de desenvolvimento, na produção em massa de compósitos à base de cimento, a sonicação eficiente de um grande número de nanopartículas e, posteriormente, facilitando a dispersão estável e satisfatória em compósitos à base de cimento é um obstáculo considerável. Além disso, a estabilização após a dissolução dos aglomerados e a manutenção do estado disperso parecem ser muito exigentes. Assim, mesmo com dispersão satisfatória, os fenômenos de reaglomeração ainda podem ocorrer, levando a uma mudança significativa na distribuição do tamanho das nanopartículas. Isso provavelmente diminuiria o desempenho dos nanomateriais em compósitos cimentícios [31,32,34]. Portanto, todos esses elementos também devem ser incluídos na fase de teste inicial dos aditivos de cimento propostos. Além da incorporação bem-sucedida de nanomateriais não fotocatalíticos em compósitos cimentícios até o momento, faltam dados sobre métodos para sua aplicação e avaliação, enquanto os artigos existentes não concordam sobre quais microrganismos são os mais adequados para tal avaliação. Portanto, pretendemos contribuir com o estado da arte avaliando as nanopartículas de óxido metálico mais populares comercialmentedisponíveis (Al2O3, CuO, Fe3O4, ZnO) usadas para a modificação de compósitos à base de cimento em modelos microbianos selecionados de forma que eles provavelmente usado na indústria. Os nanomateriais utilizados para os estudos foram adquiridos da Sigma Aldrich (Darmstadt, Alemanha). Todos os nanomateriais foram adicionalmente caracterizados por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e difração de raios-X (XRD). O óxido de alumínio tinha forma e tamanho regulares, formando nanopartículas em forma de bastão, floco e sem forma. O tamanho médio de todos os nanomateriais foi inferior a 100 nm. A análise XRD confirmou que as amostras eram compostas apenas por óxido de alumínio, que correspondia ao padrão JCPDS 10-0425. A área superficial das nanopartículas de Al2O3 medida pelo método BET foi de 110,6 m2/g. As nanoestruturas de óxido de alumínio tiveram a maior área de superfície de todos os nanomateriais estudados. Da mesma forma, o óxido de cobre não expressou forma e tamanho uniformes. As nanopartículas eram mais esféricas com tamanho variando de 100 a 250 nm. A análise de DRX comprovou que o nanomaterial era composto apenas pelo óxido de cobre, correspondente à fase padrão cartão JCPDS 72-0629. A área superficial das nanopartículas de CuO foi menor e calculada em 4,891 m2/g (medida pelo método BET) devido às partículas maiores e à maior densidade do material. No caso das nanopartículas de óxido de ferro, as imagens TEM mostraram que elas tinham tamanho uniforme variando de 50 a 150 nm e formato cúbico. De acordo com a análise XRD e os dados fornecidos pelo fornecedor, as nanopartículas de óxido de ferro estavam na forma de magnetita, que correspondia ao cartão padrão JCPDS 19-629. A área superficial do óxido de ferro medida com o método BET foi de 27,08 m2/g. A caracterização das nanopartículas de óxido de zinco mostrou a composição de duas formas uniformes de nanopartículas nanorods e nanoestruturas esféricas. A análise XRD de estruturas de óxido de zinco correspondeu a um cartão padrão JCPDS 43-1071; portanto, as nanopartículas esféricas estavam principalmente na forma amorfa. O tamanho das nanoestruturas variou de 50 a 300 nm. O método MultiPoint BET mostrou que a área superficial do óxido de zinco era de 14,11 m2/g. Exceto pela massa molecular e forma das nanoestruturas de óxido de zinco, os fatores determinantes da área superficial foram importantes para seu tamanho variando acima de 200 nm. Através da realização de uma série de testes, nosso objetivo foi apresentar problemas e observações associadas a tais estudos no âmbito do uso posterior de nanopartículas em compósitos à base de cimento. 2. Resultados As imagens TEM dos nanomateriais estudados juntamente com os padrões XRD são mostrados na Figura 2. 2.1. Avaliação de Nanopartículas Machine Translated by Google Figura 2. Microfotografias TEM e padrões XRD das nanopartículas estudadas: (a) Al2O3 ; (b) CuO; (c) Fe3O4 ; e (d) ZnO. Curvas de cinética de crescimento foram estabelecidas para todos os microrganismos. Todas as nanopartículas estudadas inibiram o crescimento microbiano na concentração utilizada, embora o resultado dependesse do microrganismo e do nanomaterial. Os resultados mostrando as curvas de cinética de crescimento de P. aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans são apresentados na Figura 3. O efeito das nanopartículas estudadas foi dependente da cepa que é mostrada na Figura 3 que apresenta as curvas de crescimento de quatro cepas diferentes de Escherichia coli. As cepas usadas mostraram várias respostas aos nanomateriais no ambiente de crescimento. Nanomateriais 2018, 8, 212 5 de 15 2.2. Cinética de crescimento O maior efeito inibitório em E. coli ATCC® 8739™ teve nanopartículas de Fe3O4 enquanto em E. coli MG1655 ZnO nanopartículas. As tendências de crescimento mostradas na Figura 3 eram replicáveis. Machine Translated by Google 6 de 15Nanomateriais 2018, 8, 212 2.3. Teste de Toxicidade Aguda de 4 horas O teste de toxicidade de 4 h confirmou a toxicidade das nanopartículas estudadas em modelos microbianos selecionados em dose selecionada. Relativamente, a maior toxicidade foi obtida para as nanopartículas de ZnO. Todas as bactérias utilizadas foram susceptíveis às nanopartículas de Fe3O4 e ZnO. Surpreendentemente, o teste não mostrou toxicidade das nanopartículas de CuO na cepa de E. coli usada, o que foi confirmado em uma rodada adicional de experimentos. A viabilidade de Candida albicans não foi significativamente afetada pelos nanomateriais estudados, exceto pelas nanopartículas de Fe3O4 , que causaram uma leve diminuição na contagem de células viáveis. As nanopartículas de óxido de alumínio foram tóxicas neste teste apenas contra a cepa de S. aureus utilizada. Os resultados são apresentados na Figura 4. Todos os resultados descritos foram estatisticamente significativos com p < 0,05. Figura 3. Curvas cinéticas de crescimento dos microrganismos tratados com nanopartículas em comparação com o cultivo controle: (a) P. aeruginosa; (b) S. aureus; (c) C. albicans; (d–g) quatro cepas diferentes de E. coli. Machine Translated by Google 2.4. Teste de Toxicidade em 24h Figura 4. Contagem em placas de culturas tratadas com nanomateriais em comparação com amostras de controle: (a) E. coli; (b) S. aureus; (c) P. aeruginosa e (d) C. albicans. A toxicidade de 24 horas mostrou que o efeito tóxico dos nanomateriais não foi permanente, e a maioria das culturas foi capaz de crescer novamente após a incubação de 24 horas. Tais fenômenos ocorreram especialmente no caso de S. aureus, que foi capaz de voltar a crescer após 24 h de incubação em meio líquido, após mostrar suscetibilidade às nanopartículas de ZnO no teste de 4 h. De maneira geral, notou-se a toxicidade, principalmente no caso das nanopartículas de ZnO, o que resultou em menores valores de DO obtidos para todas as culturas com maior atividade contra Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. P. aeruginosa apresentou sinais de inibição no teste de 24 h causado por nanopartículas de CuO. A concentração utilizada para o teste de toxicidade não permitiu a obtenção da concentração inibitória mínima (CIM) para nenhum dos nanomateriais estudados. A Figura 5 mostra os resultados descritos em gráficos 3D que, em cada caso, mostram as nanopartículas usadas, sua concentração (começando em 0 no caso das amostras de controle) e a densidade óptica adquirida após 24 h. As fitas mostram a DO média medida após o tempo de incubação, que foi compensada em relação à cultura inicial (timepoint 0) e ao ruído emitido pelos nanomateriais. Os experimentos confirmaram a toxicidade contra Candida albicans observada nas curvas de cinética de crescimento. Todos os resultados descritos foram estatisticamente significativos com p < 0,05. 7 de 15Nanomateriais 2018, 8, 212 Machine Translated by Google Figura 5. Densidade óptica obtida para culturas após 24h de incubação com quatro concentrações de nanopartículas: (a) E. coli; (b) S. aureus; (c) P. aeruginosa; (d) C. albicans. A adesão foi testada no ensaio de formação de biofilme, que testou tanto a viabilidade das células formadoras de biofilme quanto sua biomassa. As nanopartículas testadas foram capazes de reduzir a formação de biofilmes nas bactérias estudadas, embora não tenha havido diferença estatisticamente significativa entre as amostras de C. albicans (dados não apresentados). As nanopartículas afetaram com sucesso a formação de biofilmes bacterianos. 8 de 15Nanomateriais 2018, 8, 212 À semelhança das experiências anteriores, os resultados aqui também foram diferentes em termos de bactéria utilizada. Os biofilmes de E. coli ATCC® 8739™ foram inibidos por todos os nanomateriais, embora a viabilidade das células no biofilme não tenha sido completamente reduzida. Da mesma forma que os resultados obtidos no teste de toxicidade de 4 h, as nanopartículas de CuO reduziram apenas ligeiramente a viabilidade das células. Nesse caso, a biomassa e o número de células (viabilidade) foram menores do que nas amostras de controle. Os biofilmes de P. aeruginosa e S. aureus foram significativamente afetados pelas nanopartículas de ZnO, nas quais a biomassa foi menor do que nos controles; o mesmo ocorreu com a viabilidade das células no caso do S. aureus. A viabilidade das células de P. aeruginosa foi comparável à amostra controle, com exceção da amostra incubada com nanopartículas de Al2O3 , na qual foi significativamente maior. Essas nanopartículas reduziram o biofilme e a viabilidade de E. coli. Os resultados são apresentados na Figura 6. Todos os resultados descritos foram estatisticamente significativos com p < 0,05. 2.5. Ensaio de formação de biofilme Machine Translated by Google Figura 6. Biofilme de biomassa ( linha superior—(a–c)) e viabilidade de células em biofilmes ( linha inferior—(d–f)) em relação à amostra de controle. As nanopartículas não são moléculas únicas e, portanto, sua difusão é minimizada. Nos estudos atuais, utilizamos nanopartículas puras, para que as soluções não contenham íons livres que possam ser responsáveis por 9 de 15Nanomateriais 2018, 8, 212 Portanto, seguindo as questões descritas acima, as nanopartículas foram deliberadamente usadas na suspensão sonicada para corresponder à sua aplicação futura planejada em compósitos à base de cimento. Por esse motivo, não foram aplicadas substâncias/estabilizadores adicionais nos estudos. As nanopartículas foram testadas de forma a serem preparadas antes da incorporação de materiais de construção à base de cimento. Nossos resultados mostraram que a toxicidade foi diminuída de forma que os valores de concentração inibitória mínima (CIM) ou concentração bactericida mínima (MBC) não puderam ser estabelecidos. Isso pode estar associado à dispersão de nanomateriais, seu tamanho, composição e pureza. Como mencionado acima, sabe-se que a dispersão por sonicação produz eficiência limitada na dispersão das nanoestruturas; no entanto, este método é amplamente utilizado por pesquisadores neste campo [28,33,36]. Os resultados obtidos mostram que os nanomateriais não apresentaram toxicidade esperada no ambiente estudado, enquanto de acordo com outros autores, tais nanomateriais deveriam apresentar toxicidade relativamente alta [11,35-37]. 3. Discussão Essas substâncias não agem de forma semelhante aos antibióticos que podem ser transferidos por difusão. Os nanomateriais estão ganhando interesse significativo no campo de modificação de compósitos cimentícios; no entanto, a quantidade de nanomaterial deve ser otimizada para aumentar sua eficácia, reduzir a quantidade necessária de nanomaterial e atender aos requisitos econômicos para aplicá-los em estruturas de concreto ou argamassas/rebocos aplicados na superfície da construção. Infelizmente, a adição de partículas finas em compósitos cimentícios leva à sua aglomeração. Nos estudos atuais, foram utilizadas suspensões sonicadas de nanomateriais, que foram adicionalmente caracterizadas além dos dados fornecidos pelo fabricante (ver Figura 2). Devido ao aumento da área de superfície específica com a diminuição do diâmetro das partículas, as forças de van der Waals, eletrostáticas e magnéticas tornam-se mais dominantes em comparação com as forças de cisalhamento gravitacional, que levam à aglomeração e formação de flocos interconectados [28-30]. Portanto, quando as nanopartículas não seriam dispersas uniformemente na suspensão (antes da mistura com os componentes secos), uma dispersão adicional, mesmo com o uso de misturadores de cimento de alto cisalhamento, pode ser necessária. Conforme afirmado por Korayem et al. [29] 'a dispersão ideal pode ser descrita como o estado em que as nanopartículas estão completamente separadas umas das outras e não existem aglomerados ou aglomerados'. No entanto, obter a dispersão completa do nanomaterial na matriz de cimento é quase impossível, de modo que os pesquisadores buscam atingir o estado de dispersão 'o mais próximo possível'. Neste estudo, usamos o método mais comum - sonicação junto com agitação mecânica, sem quaisquer outros dispersantes, o que provavelmente levou à menor toxicidade observada de nanopartículas nos modelos selecionados. Machine Translated by Google Nanomateriais 2018, 8, 212 10 de 15 Assumimos que o material aglomerado descia no fundo e, portanto, era menos acessível aos microrganismos, apesar do fato de que as culturas eram conduzidas com agitação. Esta observação pode ser apoiada pelos resultados obtidos com o ensaio de formação de biofilme. A biomassa em amostras com E. coli foi significativamente diminuída por todos os nanomateriais. Por outro lado, a biomassa do biofilme de P. aeruginosa foi comparável à amostra controle. A diferença entre essas cepas pode ser a localização dos biofilmes formados. A E. coli tende a produzi-la principalmente no fundo da placa, enquanto a P. aeruginosa direciona a maior parte da biomassa para a superfície. S. aureus foi significativamente afetado apenas pelas nanopartículas de ZnO. Esta bactéria também produz biofilme no fundo do poço; assim, esta descoberta mostrou que as nanopartículas em geral podem ser inacessíveis às células [39-42]. Deve-se destacar que as evidências coletadas não prejudicam a toxicidade conhecida das nanopartículas de óxido metálico sobre os microrganismos. O aspecto principal considera a necessidade de projetar A toxicidade relativamente fraca obtida na maioria dos experimentos conduzidos pode ser atribuída à aglomeração de nanopartículas [30]. No entanto, este processo pode ocorrer no caso de preparação de nanomateriais para os compósitos à base de cimento. Conforme descrito na seção de introdução, a incorporação de nanomateriais à incorporação prévia de compósitos à base de cimento tem certas condições, incluindo quantidade limitada de água e falta de surfactantes. Portanto, a dispersão obtidaneste trabalho foi a dispersão máxima possível que pode ser alcançada usando este método [30,32–34]. Conforme descrito na seção de introdução, atualmente não há padrões para superfícies não fotocatalíticas à base de cimento. Outro problema diz respeito ao material microbiológico utilizado para estudos, muitas vezes pouco diversificado [3,5,8,17]. Além disso, a maioria dos autores não discute as características específicas das cepas que utilizaram. Muitas vezes, as informações limitam-se apenas ao gênero, designação do grupo ou simplesmente ao número do GenBank, referindo-se apenas a um gene que codifica o rRNA 16S que está sendo utilizado para determinar o gênero [3,35]. Na microbiologia atual, a sequência que codifica o rRNA 16S ainda é útil, embora possa não ser suficiente para a determinação precisa da posição taxonômica das cepas [43,44]. Do ponto de vista microbiológico, duas cepas do mesmo gênero podem expressar características diferentes. Por exemplo, cepas de Escherichia coli apresentam diferentes características adaptativas que incluem a variabilidade na capacidade de formação de biofilme e a capacidade de aderir à superfície ou possuir genes responsáveis pela resistência a antibióticos. O genoma de algumas cepas também pode conter toxinas que codificam bacteriófagos, como a toxina Stx [45-47]. Além disso, não é aconselhável fornecer apenas o nome (ou sigla) da cepa, pois ela pode ter muitos derivados como a E. coli K-12 [48]. O navegador de taxonomia NCBI fornece mais de 3.000 ocorrências quando se pesquisa Escherichia coli [49]. Tais questões criam dificuldades na validação e análise dos resultados do teste. Aqui, foi demonstrado em apenas quatro cepas de E. coli que bactérias com perfil genético diferente podem reagir de maneira diferente às nanopartículas, o que significa que a avaliação de nanomateriais em termos de sua atividade antimicrobiana deve ser apoiada não apenas pelo conhecimento das cepas usadas , mas também deve ser executado em cepas estritamente selecionadas ou múltiplas do mesmo gênero. Essa também é uma boa razão para organizar os microbiologistas em equipes para avaliar a atividade antimicrobiana, como no artigo de Piszczek et al. [12], em que os autores utilizaram uma cepa de referência amplamente conhecida. Portanto, esforços particulares devem ser direcionados no futuro para o desenvolvimento de métodos e seleção de cepas que serão representativas. a maior toxicidade dos nanomateriais, o que pode explicar a relativamente baixa toxicidade observada. Este problema foi descrito por Beer et al. [38], que indicou que os íons podem dar resultados falsos positivos em relação à toxicidade. Os nanomateriais adquiridos para este estudo foram adquiridos e testados para diminuir a possibilidade de tal ação. Este artigo revelou uma provável causa da alta eficiência dos nanomateriais da síntese 'verde', que é, por exemplo, baseada na redução de AgNO3 no caso de nanopartículas de Ag. Se o nanomaterial não for purificado após a síntese, sua solução contém íons que aumentam adicionalmente a toxicidade. Isso poderia explicar a eficiência bactericida relativamente baixa obtida em nossos estudos, pois os experimentos foram conduzidos em nanopartículas purificadas suspensas em água ultrapura. Por outro lado, tais resultados mostram que nanomateriais puros e parcialmente aglomerados podem não ser acessíveis às células e, portanto, a toxicidade observada seria menor. Machine Translated by Google Todos os nanomateriais foram adquiridos da Sigma-Aldrich (MERCK, Darmstadt, Alemanha). Para a preparação das suspensões experimentais, nanomateriais sonicados foram usados sem nenhuma modificação adicional. Os nanomateriais foram preparados da mesma forma utilizada nos estudos microbiológicos (descrição abaixo). Os nanomateriais foram investigados por microscopia eletrônica de transmissão (Fei, Tecnai G2 F20 S Twin with energy dispersive X-ray spectroscopy, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A estrutura cristalina e a composição química das amostras foram estudadas por difração de raios X. As medições de XRD foram realizadas com um difratômetro de raios X PRO (difratômetro X'Pert PRO Philips, radiação Co. Ka, Almelo, Holanda). A área de superfície dos nanomateriais foi medida com base nas isotermas de adsorção/dessorção de N2 (Quantachrome Instruments, Quadrosorb SI, Boynton Beach, FL, EUA). A área superficial específica foi calculada pelo método Brunauer-Emmett-Teller (BET). Cepas de referência - Escherichia coli ATCC® 8739™, Staphylococcus aureus ATCC® 25923™, Staphylococcus aureus ATCC® 6538™ (para formação de biofilme), Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27583™ e Candida albicans ATCC® 10231™ foram usadas para estudos biológicos. Os resultados dos estudos de cinética de crescimento foram comparados com três outras cepas de E. coli—E. coli MG1655 e dois de seus derivados - E. coli MDS42 e E. coli MDS69 geneticamente modificados, fornecidos graças ao Dr. Ildikó As nanopartículas foram fornecidas pela Sigma Aldrich (MERCK, Darmstadt, Alemanha). Nanoóxidos os testes padronizados para avaliação de nanoestruturas que incluem a aplicação planejada aos materiais compósitos cimentícios. Culturas noturnas das cepas estudadas foram inoculadas na proporção de 1:200 em meio líquido fresco Tryptone Soya Broth (TSB) contendo nanomateriais na concentração de 100 µg/mL ou água ultrapura na amostra controle. As culturas foram conduzidas a 30 ÿC em incubadora orbital shaker, com agitação a 140 rpm. As curvas de cinética de crescimento foram obtidas medindo a densidade óptica (600 nm) da cultura líquida a cada 1 h por 10 h. As suspensões dos nanomateriais foram preparadas a partir do pó em água ultrapura (grau PCR), na concentração estoque de 1000 µg/mL. A suspensão foi sonicada por 45 min juntamente com agitação mecânica de alta velocidade. A concentração básica de trabalho dos nanomateriais foi de 100 µg/mL, que foi selecionada com base em experimentos de otimização e na literatura. Concentrações mais baixas deram efeitos marginais, enquanto concentrações mais altas criaram problemas com ruído de fundo em experimentos. No entanto, a concentração escolhida foi considerada tóxica para microrganismos [11,35–37]. Deve-se destacar que o uso posterior de nanomateriais requer sua adição aos compósitos à base de cimento. Portanto, a concentração foi mantida no nível que tem potencial antimicrobiano e, ao mesmo tempo, pode ser usada como mistura para compósitos à base de cimento. Todos os experimentos foram conduzidos com a mesma suspensão de nanomateriais para excluir a variabilidade da preparação, o que poderia afetar os resultados. Nanomateriais 2018, 8, 212 11 de 15 Karcagi, da Unidade de Biologia Sintética e de Sistemas do Instituto de Bioquímica, no Centro de Pesquisa Biológica da Academia Húngara de Ciências, Szeged, Hungria. Todas as modificações genéticas nessas cepas estão listadas no artigo de Karcagiet al. [50]. 4.3.1. Cinética de crescimento 4.1. Materiais selecionados para os experimentos foram Al2O3, CuO, Fe3O4 e ZnO. 4.2. Avaliação Fisioquímica de Nanomateriais 4.3. Preparação de Nanomateriais para Estudos Microbiológicos 4. Materiais e Métodos Machine Translated by Google Estudos de toxicidade de 4 h foram conduzidos de acordo com Ivask et al. [23]. Resumidamente, uma cultura noturna de bactérias e fungos foi inoculada em meio TSB fresco e incubada a 30 ÿC até atingir a fase logarítmica. Na etapa seguinte, as células foram centrifugadas (10 min. a 3500 rpm) e ressuspensas em água ultrapura . Os nanomateriais foram suspensos em água ultrapura, sonicados por 30 min e adicionados às células, atingindo a concentração final de 100 µg/mL. Em seguida, as amostras foram mantidas em temperatura ambiente por 4 horas sem acesso à luz. Após a incubação, as células foram diluídas no método de diluições em série e 100 µL foram espalhados em placas de ágar TSA. As culturas foram mantidas a 37 ÿC durante a noite. As colônias foram contadas após 18h. A avaliação das colônias incluiu a comparação da morfologia com placas de controle. Em todos os casos, a inoculação foi realizada em três repetições. Os experimentos foram replicados para confirmar as tendências de resultados obtidos. 4.3.4. Análise estatística 5. Conclusões Culturas noturnas foram inoculadas em ração 1:200 em meio TSB fresco contendo 100 µg das nanopartículas estudadas por mL ou água ultrapura nos controles. A absorbância no comprimento de onda de 600 nm foi medida logo após a etapa de preparação e uma segunda vez após 24 h. Devido ao possível ruído de fundo causado pelos nanomateriais, cada poço foi medido 4 vezes em quatro pontos diferentes. Além disso, todos os controles necessários foram aplicados, incluindo controle de meio sozinho, meio com nanomaterial e meio com adição de água. 4.3.3. Influência na formação de biofilme 4.3.2. Estudos de Toxicidade Os resultados foram analisados estatisticamente usando ANOVA de uma via com o teste de Tukey como teste post-hoc. p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As suposições para a ANOVA foram verificadas para cada conjunto de dados. Após a incubação, as placas foram lavadas três vezes com PBS e cada poço foi preenchido com meio TSB fresco com a adição de 10% de alamarBlue®. Em seguida, a placa foi incubada a 30 ÿC por até 4 h. A fluorescência foi medida no BioTek Synergy HTX (BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA) (ÿex = 520 nm; ÿem = 590 nm) para determinar a viabilidade das células formando biofilmes. Na próxima etapa, as placas foram lavadas três vezes com água deionizada e os biofilmes foram fixados com metanol por 15 minutos em temperatura ambiente. Após esse tempo, as placas foram esvaziadas, secas ao ar e preenchidas com cristal violeta filtrado (1% p/v). A coloração durou 15 minutos, enquanto as placas foram mantidas em temperatura ambiente. Os estudos de formação de biofilme foram preparados em placas de poliestireno transparente de 96 poços com fundo redondo. Cada poço foi preenchido com 120 µL de meio TSB fresco e 15 µL de suspensão de nanomaterial (ou água ultrapura em amostras de controle). As suspensões de nanomateriais foram preparadas de forma a permitir que alcançassem concentrações finais de 100 µg/mL. Em seguida, os poços foram inoculados com 15 µL de cultivo noturno dos microrganismos selecionados. As placas foram incubadas por 24 horas a 30 ÿC. A avaliação de nanomateriais para materiais de construção à base de cimento deve incluir vários Na última etapa, as placas foram lavadas com água corrente e secas ao ar. A biomassa foi descolorida com solução de etanol:acetona (8:2 v/v), adicionando 200 µL para cada poço. Finalmente, 100 µL foram pipetados três vezes e transferidos para uma nova placa de fundo plano de 96 poços. A absorbância a 570 nm foi lida no leitor de microplacas m200 PRO (Tecan, Männedorf, Suíça). cepas microbianas, incluindo diferentes cepas da mesma espécie, pois podem apresentar uma resposta variável aos nanomateriais. Finalmente, com base em estudos in vitro , as nanopartículas de óxido metálico podem não ser eficientes na prevenção do crescimento microbiano quando dispersas de forma inadequada, o que provavelmente será o A avaliação de nanomateriais deve considerar sua aplicação e características adicionais. A má dispersão pode ser o principal problema tecnológico nas tentativas de usar nanopartículas como antimicrobianos. 12 de 15Nanomateriais 2018, 8, 212 Estudos de toxicidade de 24 horas foram realizados em placas de poliestireno transparente de 96 poços com fundo plano. Machine Translated by Google Referências 6. Nath, RK; Zain, MFM; Jamil, M. Uma solução ecológica para a purificação do ar interno usando fotocatalisadores renováveis em concreto: uma revisão. Renovar. Sustentar. 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