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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE COORDENADORIA ACADÊMICA COORDENAÇÃO DE PESQUISA REGISTRO DE PROJETO DE PESQUISA ⚫ Selecione a(s) característica(s) da solicitação de registro: ( X ) 1ª versão ( ) 2ª versão (presença de alterações da 1ª versão) - Portaria de registro da 1ª versão________________. ( ) Prorrogação (necessidade de período para finalizar o cronograma vigente) - Portaria de registro do projeto _________________. ( ) Renovação (quando há um novo cronograma para desenvolvimento do mesmo projeto) ( ) Projeto de Curto Prazo (Até 2 anos) ( ) Plano(s) de Trabalho vinculado a Projeto de Curto Prazo ( ) Projeto de Longo Prazo (Macroprojeto/Projeto Guarda-chuva - Prazo > 2 anos) ( ) Projeto ou Plano de trabalho vinculado a Macroprojeto/Projeto Guarda- chuva Código de Registro: __________ *Para ser preenchido pela CAD 1. Título: Impacto do Hiperandrogenismo Gestacional no Sistema Urogenital de Ratos Wistar Durante o Processo de Envelhecimento 1.1 Vinculação: Instituto de Ciências da Saúde (ICS) Portaria: *Quando projeto ou plano de trabalho vinculado, informar acima o título e portaria de registro do Macroprojeto/Projeto guarda-chuva a que se vincula. **Quando plano de trabalho vinculado, informar acima o título e portaria de registro do Projeto a que se vincula. 2. Resumo: Introdução: O quadro de hiperandrogenismo ou excesso de hormônios andrógenos, de origem ovariana ou suprarrenal, configura-se como uma endocrinopatia frequente em mulheres em idade reprodutiva. A testosterona é a principal substância envolta neste processo e diante do parâmetro do hiperandrogenismo afeta a geração neonatal no que diz respeito ao desenvolvimento do sistema reprodutivo e urinário com repercussões diretas na vida adulta. Objetivo: Verificar os efeitos do hiperandrogenismo gestacional induzido em ratas sobre o sistema urinário e genital da prole masculina durante o processo de envelhecimento. Metodologia: Os animais do projeto serão os que nasceram nas ninhadas do projeto, os quais as mães de indução à Síndrome dos Ovários Policísticos. Desse modo, serão utilizados somente a prole masculina, a qual irá ser distribuída em 4 grupos (5/grupo): hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias, não hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias, não hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias e hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias. Os ratos serão obtidos a partir de mães tratadas com 5 mg de testosterona (s.c.) no 20° de prenhez, segundo modelo experimental estabelecido para indução da doença. Os animais serão avaliados de acordo com o ciclo correspondente ao adulto (313 dias) e jovem humanos (153 dias), sendo sacrificados para coleta dos órgãos genitais (testículos, epidídimo e próstata) e urinários (rins, ureteres, bexiga e uretra), bem como direcionamento para processamento histofisiológico. 3. A pesquisa envolverá Seres humanos e/ou Animais? ( X ) Sim ( ) Não Caso sim, a pesquisa já tem parecer de aprovação do CEP ou CEUA? ( X ) Sim ( ) Não 4. Período de realização do Projeto ou Plano de trabalho: 12 meses (Setembro/2022 a Agosto/2023 5. Dados do Coordenador do Projeto ou Plano de Trabalho: Nome: João Simão de Melo Neto Telefone: (91) 98357-6331 E-mail institucional: jsmeloneto@ufpa.br Subunidade: Faculdade de Fisioterapia e Terapia Ocupacional 6. Membro(s) interno(s) do Projeto ou Plano de trabalho: Nome: Davi Silva Santana Titulação: Graduando Telefone: (91) 98322-5578 E-mail institucional: davi.santana@ics.ufpa.br Subunidade: Faculdade de Enfermagem UFPA Membro: ( ) Docente ( X ) Estudante de Graduação ( ) Estudante de Pós-Graduação stricto sensu ( ) Técnico 7. Subunidade onde está alocado do Projeto ou Plano de trabalho: Programa de Pós-Graduação em Saúde, Ambiente e Sociedade na Amazônia (PPGSAS) 8. Financiamento: ( X ) Próprio da equipe de pesquisa ( ) UFPA (Fonte: __________________________) ( ) Agência de Fomento (Informar:__________________________________) Especificar tipo de financiamento: ***Caso o projeto não tenha fomento, o(a) coordenador(a) deverá declarar se o projeto poderá ser realizado sem o devido suporte institucional para custeio e bens de capital. Observações: ****Espaço livre para outras informações importantes. PROJETO DE PESQUISA 1 - IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO TÍTULO DO PROJETO: Impacto do Hiperandrogenismo Gestacional no Sistema Urogenital de Ratos Wistar Durante o Processo de Envelhecimento GRANDE ÁREA DE CONHECIMENTO: (Ciências da Saúde ÁREA DE CONHECIMENTO: Fisioterapia SUB ÁREA: Morfologia e Histologia INSTITUIÇÃO: Universidade Federal do Pará (UFPA) CENTRO / DEPARTAMENTO: Instituto de Ciências da Saúde (ICS) UNIDADE EXECUTORA: Unidade de Pesquisa Clínica e Experimental do Sistema Urogenital ENDEREÇO: R. Augusto Corrêa, 01 - Guamá, Belém - PA, 66075-110 MUNICÍPIO Belém CEP 66.075-110 U.F. PA TEL/FAX +5591 3201 8892 E-MAIL jsmeloneto@ufpa.br DEPARTAMENTO: Instituto de Ciências da Saúde (ICS) COORDENADOR DO PROJETO: João Simão de Melo Neto OUTRAS INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES Faculdade de Medicina Ceres (FACERES) 2 – EQUIPE DO PROJETO Matrícula Nome completo Tipo* Titulação máxima Unidade/Departamento Função no projeto** Carga horária no projeto 2390797 João Simão de Melo Neto PE DR FFTO CD c * TA: Técnico Administrativo ** CD: Coordenador PV: Professor Visitante CL: Colaborador PE: Professor Permanente (lotado no centro em que pertence o projeto) CS: Consultor PP: Professor Participante (lotado em outro centro) PPE: Professor Participante Externo TE: Técnico Administrativo Externo PB: Professor Bolsista de Agência de Fomento (CAPES, CNPQ, DAAD, etc.…) PROJETO DE PESQUISA 3 – RESUMO O quadro de hiperandrogenismo ou excesso de hormônios andrógenos, de origem ovariana ou suprarrenal, configura-se como uma endocrinopatia frequente em mulheres em idade reprodutiva. A testosterona é a principal substância envolta neste processo e diante do parâmetro do hiperandrogenismo afeta a geração neonatal no que diz respeito ao desenvolvimento do sistema reprodutivo e urinário com repercussões diretas na vida adulta. O presente trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do hiperandrogenismo gestacional induzido em ratas sobre o sistema urinário e genital da prole masculina durante o processo de envelhecimento. Os animais do projeto serão os que nasceram nas ninhadas do projeto, os quais as mães de indução à Síndrome dos Ovários Policísticos. Desse modo, serão utilizados somente a prole masculina, a qual irá ser distribuída em 4 grupos (5/grupo): hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias, não hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias, não hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias e hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias. Os ratos serão obtidos a partir de mães tratadas com 5 mg de testosterona (s.c.) no 20° de prenhez, segundo modelo experimental estabelecido para indução da doença. Os animais serão avaliados de acordo com o ciclo correspondente ao adulto (313 dias) e jovem humanos (153 dias), sendo sacrificados para coleta dos órgãos genitais (testículos, epidídimo e próstata) e urinários (rins, ureteres, bexiga e uretra), bem como direcionamento para processamento histofisiológico. 4 – INTRODUÇÃO Os androgênios são classificados como hormônios sexuais e se configuram como produtos da cascata esteroidegênica. Tal classe de substâncias é representada principalmente pela testosterona, sendo sintetizada nas mulheres, principalmente nos ovários e glândulas adrenais (YE et al., 2021). Em mulheres normoandrogênicas, os hormônios androgênicos séricos possuem níveis de concentração em dihidrotestosterona (DHT), testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona(DHEA) e sulfato de desidroepiandrosterona (DHEA-S) (BIENENFELD et al., 2019). Os andrógenos são sintetizados a partir do estímulo do hormônio liberador de gonadotrofina – GnRH (gonadotropin releasing hormone) através de um ciclo de feedback positivo no eixo hipotalâmico, o qual contribui para a liberação de hormônio luteinizante – LH (luteinizing hormone) e hormônio folículo estimulante – FSH (follicle stimulating hormone), desenvolvendo a anovulação e potencializando a indução de andrógenos (HOLESH; BASS; LORD, 2022). Além disso, esse ciclo tem impacto direto no ovário, pois dificulta o crescimento folicular e impede a seleção de um único folículo para a fecundação (HAMMES; LEVIN, 2019), direcionando uma via que promove a infertilidade feminina. Nesse sentido, o quadro de hiperandrogenismo ou excesso de hormônios andrógenos, de origem ovariana ou suprarrenal, configura-se como uma endocrinopatia frequente em mulheres em idade reprodutiva. A apresentação clínica dessa condição envolve hirsutismo, alopecia androgênica, indução de obesidade, pilosidade, acnes e virilização, podendo se manifestar ao longo do ciclo de vida das mulheres em momentos distintos, com tipos de diagnósticos classificados em: gestacional, pré-puberal, na idade fértil e após a menopausa (ESCOBAR-MORREALE et al., 2012; MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2020). Este estudo trará a perspectiva diante do âmbito gestacional, o qual, em sua etiologia, tem o hiperandrogenismo definido de acordo com a presença de luteoma, cisto de teca-luteína, iatrogenia, deficiência placentária de aromatase ou tumores produtores de andrógenos (de origem ovariana ou adrenal) (ESCOBAR-MORREALE, 2018). O diagnóstico de hiperandrogenismo nessa fase pode gerar estímulos prejudiciais, os quais têm propriedade de conferir alterações morfofuncionais permanentes nas mães. Este fenômeno é denominado como programação fetal, que pode ser exemplificado por distúrbios endócrinos que perpassam às barreiras biológicas, inclusive a placentária e, com isso, podem ser determinantes na saúde de sua prole durante a vida adulta (KANEKO et al., 2022; VAISERMAN; LUSHCHAK, 2021). 5 – JUSTIFICATIVA A testosterona é um dos principais hormônios andrógenos que afeta a geração neonatal no que diz respeito ao desenvolvimento do sistema reprodutivo com repercussões diretas na vida adulta (LIZNEVA et al., 2016). No entanto, até o presente momento, não há informações detalhadas sobre os efeitos diretos e indiretos do hiperandrogenismo na formação histofisiológica do sistema urinário e genital da prole masculina de mães com essa condição. Em consonância, no que confere ao parâmetro gestacional sem alterações adversas, a formação da prole masculina quanto à fisiologia e anatomia dos órgãos genitais externos está diretamente relacionada à presença da testosterona. Nesse contexto, a diferenciação do epidídimo, ductos deferentes, ejaculatório e vesículas seminais é influenciada pela presença ou ausência do hormônio antimulleriano (AMH) e androgênios (testosterona) (LIBRETTI; AEDDULA, 2021). De outro modo, a administração de testosterona intrauterina induz a hipertrofia celular, demonstrando influência sobre a diminuição no peso dos rins em camundongos machos, bem como apresentação de efeitos deletérios sobre eles (BAIREY MERZ et al., 2019). Diante do exposto, é de suma relevância evidenciar os efeitos do hiperandrogenismo gestacional na repercussão histomorfológica nos órgãos reprodutores (gônadas masculinas, epidídimo, ductos, glândulas acessórias e escroto) e excretores (rins, ureteres, bexiga e uretra) da prole masculina no que diz respeito ao sistema urogenital. 6 – OBJETIVO O objetivo deste estudo é verificar os efeitos do hiperandrogenismo gestacional induzido em ratas sobre o sistema urinário e genital da prole masculina durante o processo de envelhecimento. 6 – METODOLOGIA Animais Experimentais Os animais a serem avaliados serão obtidos do acasalamento de ratos adultos oriundos do Biotério Central da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus Botucatu. No que se refere ao local mantenedor, os animais serão alocados no Biotério e Laboratório de Pesquisa Experimental da FACERES, conforme estruturação de ambientes padronizados com temperaturas de 22 C e ciclo controlado de claro/escuro, recebendo dieta normoprotéica e água ad libitum. A linhagem de ratos Wistar foi escolhida por ser indicada para pesquisa que envolva metabolismo, farmacologias, toxicologia e oncologia, além da presença de tumores espontâneos, sendo usados em todos os campos de pesquisas biológicas e médicas (“Javier Gordon Ogembo Lab”, 2022). Todo o experimento e os procedimentos cirúrgicos deste trabalho foram submetidos à aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FACERES, sendo Certificado de Aprovação CEUA n° 9583110320 (APENDICE I). A pesquisa foi realizada de acordo com os princípios éticos em pesquisa animal adotado pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL). Verificação do início da puberdade Um dos parâmetros do modelo é a abertura vaginal precoce em ratas androgenizadas no período perinatal, a qual também é o parâmetro utilizado para estimar o início da puberdade (SENGUPTA, 2013). A abertura será verificada diariamente com a inspeção visual da genitália a partir dos 30 dias de idade. Obtenção das fêmeas com hiperandrogenismo Ratas Wistar adultas (n = 8, idade 75-95 dias e peso corporal 170-190 g) serão colocadas para acasalar, de forma que um casal (1 macho e 1 fêmea) será mantido em uma caixa de polipropileno (40 cm × 34 cm × 16 cm) durante a noite. Na manhã seguinte, entre 7 e 8 horas, o macho será retirado da gaiola e a vagina da fêmea inspecionada para a observação da presença de plugue vaginal e coleta da secreção. Esta coleta será realizada por meio da inserção no canal vaginal de um cotonete embebido em soro fisiológico estéril. O cotonete será girado 2 ou três vezes contra a parede vaginal e rolado em uma lâmina histológica, coberta em seguida por soro fisiológico e lamínula para observação ao microscópio óptico. A visualização dos espermatozoides será considerada o primeiro dia de gestação da rata. Indução ao hiperandrogenismo gestacional Neste estudo, para a indução ao quadro de hiperandrogenismo nas ratas fêmeas do grupo experimental (n= 10) receberão tratamento com dose única de testosterona na vida intrauterina, por intermédio de injeção subcutânea, diante da concentração de 5 mg dissolvidas em 500 μL de óleo de milho (veículo) no 20º dia de prenhez segundo protocolo pré-estabelecido (TEHRANI et al., 2014). As ratas prenhes do grupo controle (n = 10) receberão apenas 500μL do veículo. De modo a corroborar tal perspectiva quantitativa e logística, a indução com testosterona na mesma concentração tem como desfecho a Síndrome dos Ovários Policísticos, a qual emprega como um do seu principal sintoma a elevação expressiva do nível de androgênios fisiologicamente (RUTH et al., 2020). Quantitativo de animais experimentais Para este estudo serão utilizados a prole masculina diante do quantitativo de 20 ratos Wistar subdivididos em 4 grupos (5 animais cada), com idades equivalentes às fases de adolescência e adulta correspondentes a faixa etária humana. Ciclos de vida A fase adolescência corresponde a indivíduos com idade aproximadamente entre 10 – 19 anos (1). Adulto jovem é o ciclo de vida na idade entre 18 – 35 anos (2). Para obtenção da faixa etária, foi utilizado a mediana de ambos os ciclos da vida. Portanto, obteve-se a mediana da idade para as fases adolescência (14,5 anos) e adultos jovens (26,5 anos) em humanos para que fizéssemos a correspondência na idade dos ratos. O estabelecimento da idade animal em correspondência aos ciclos de vida humano foi realizado baseado em estudos prévios (BAIREY MERZ et al., 2019; BIENENFELD et al., 2019). Os animais serão sacrificados em dois momentos: • Fase adolescência, com 153 dias de idade. • Fase adulto jovem, com 313 dias de idade. As fêmeas prenhes serão colocadas em caixas individuaise aleatoriamente divididas nos grupos controle e tratados com testosterona (2 ratas/grupo). As fêmeas prenhes dos grupos tratados receberão uma injeção única s.c. de 5 miligramas (mg) de testosterona dissolvida em óleo de milho (veículo) no 20º dia de prenhez, enquanto as fêmeas dos grupos controle receberão somente o veículo. Após o parto, que ocorre no 22º dia de gestação pela manhã, as mães serão retiradas temporariamente da caixa, e após a determinação do sexo pela distância anogenital, a ninhada contará com o número equivalente a 5 ratos machos por grupo (20 ratos no total). A mãe será devolvida em seguida para sua ninhada. A redução da ninhada é necessária para que todos os filhotes tenham condições iguais de nutrição e desenvolvimento durante a amamentação, e os recém-nascidos excedentes serão sacrificados por decapitação por tesoura após anestesia por inalação de isoflurano. Os filhotes serão mantidos com as mães até o desmame, aos 21 dias de idade, quando então serão transferidos para gaiolas coletivas, mantidos em ambiente controlado, conforme descrito anteriormente. A partir do desmame, o peso corporal dos animais será registrado semanalmente. Grupos experimentais Serão estudados os seguintes grupos experimentais: G1: Ratos hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias. G2: Ratos não hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias. G3: Ratos não hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias. G4: Ratos hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias. Eutanásia dos animais Para a eutanásia será administrado 100 mg do anestésico nas ratas que serão sacrificadas por overdose de anestésico por kg de peso, seguido de colocação do animal em decúbito dorsal no campo cirúrgico, fixado pelos membros superiores e inferiores. Após esse momento, será realizada uma incisão mediana abdominal para identificação da cavidade. Coleta de amostras e análise histopatológica dos órgãos A coleta das amostras deste estudo será direcionada para a utilização dos órgãos genitais (testículos, epidídimo e próstata) e urinária (rins, ureteres, bexiga e uretra). No que corresponde à próstata serão avaliados os diferentes segmentos: ventral, lateral, dorsal, anterior ou glândula coaguladora. Processamento do material coletado Dentro deste contexto, os materiais coletados serão direcionados para fixação em paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M (pH 7.4). Na sequência, os tecidos serão submetidos à microtomia com cortes na espessura de 4µm, sendo confeccionadas as lâminas. O tecido foi submetido a coloração de Hematoxilina & Eosina (H&E) para a análise morfométrica, estereológica e histopatológica. No entanto, em especial o hemicorpo direito da próstata será direcionado para fixação em paraformaldeído e o esquerdo para congelamento em nitrogênio líquido, seguido para manutenção em freezer -80º. Análise Histomorfométrico Para análise histomorfológica serão analisados 30 campos/grupo (40x) de modo randomizado, evitando áreas com artefato de preparação, de cada região dos órgãos através do microscópio, modelo Zeiss Primo Star acoplado a uma câmera modelo Zeiss Axiocam 105 color e utilizado o software Zeiss Zen 2.3 Lite. Análise Estereológica Serão obtidos 30 campos/grupo (40x) de forma randomizada, de cada estrutura, evitando áreas com artefato de preparação. As mesmas, feitas através do microscópio modelo Zeiss Primo Star acoplado a uma câmera modelo Zeiss Axiocam 105 color e utilizado o software Zeiss Zen 2.3 Lite. As imagens foram estudadas usando o software ImageJ 1.47, versão windows (National Institutes of Health, USA), seguido de análise estatística. Para a verificação estereológica, será utilizado o método descrito por Weibel; Paumgartner (1978) com uma grade de 418 pontos de análise sobre as imagens fotografadas da coloração de H&E (WEIBEL; PAUMGARTNER, 1978). Análise Histopatológica A análise histopatológica será realizada nas lâminas coradas com H&E comparando a presença de modificações histológicas nos diferentes grupos. O tecido será analisado em objetivas de 20x e 40x. As divergências decorrentes da comparação das lâminas, ao apresentarem aspectos de diferenciação patológica serão planilhadas e analisadas (CREASY et al., 2012). Análise Estatística Os dados serão analisados usando estatística descritiva e inferencial. Os resultados descritivos serão expressos conforme a distribuição de normalidade. Os dados paramétricos serão expressos como média ± desvio padrão, enquanto os não-paramétricos serão descritos como mediana, mínimo, máximo e quartis (Q1, Q3). Para analisar a normalidade dos dados serão utilizados os testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk, de acordo com a análise de cada quantidade amostral. Durante as comparações intergrupos serão aplicados os testes: Análise de Variância (ANOVA) e o pós-teste de Tukey (dados paramétricos); Kruskal-Wallis e o pós-teste de Dunn´s (dados não-paramétricos). Para presença de processos patológicos será utilizado à análise do risco relativo com intervalo de confiança, sendo confirmada associação por meio do teste exato de Fisher. Será considerado significativo p≤0,05. A análise estatística será realizada no software Instat (version 3.0, GraphPad, Inc., San Diego, CA, USA). 7 – METAS Verificar se existe alterações na morfologia nos tecidos do sistema urinário e genital no processo de envelhecimento; Verificar a influência do hiperandrogenismo genital no sistema urinário e genital; Verificar a histopatologia dos tecidos do sistema urinário e genital; Analisar a estrutura dos órgãos do sistema urogenital, através da avaliação do percentual de seus componentes teciduais. 8 – BIBLIOGRAFIA ARENTZ, S. et al. Nutritional supplements and herbal medicines for women with polycystic ovary syndrome; a systematic review and meta-analysis. BMC complementary and alternative medicine, v. 17, n. 1, p. 500–500, 25 nov. 2017. BAIREY MERZ, C. N. et al. 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YE, W. et al. The role of androgen and its related signals in PCOS. Journal of cellular and molecular medicine, v. 25, n. 4, p. 1825–1837, fev. 2021 9 – CRONOGRAMA DE ATIVIDADES ATIVIDADES Período: Agosto, 2022 – Julho, 2023. AGO SET OUT NOV DEZ JAN FEV MAR ABR JUN JUL Levantamento bibliográfico X Acasalamentos e tratamento hormonal das fêmeas prenhes X Estudo da puberdade X Estudo do ciclo estral X Tratamento com testosterona X X Sacrifício e coleta das amostras X X Início da micrometria, preparação de lâminas e Análise dos Resultados X X X Envio de resultados para congresso Nacional e Internacional, escrita dos artigos oriundos do projeto X X Redação do relatório final à CEUA, UFPA e FASCERES X 10 – ORÇAMENTO As despesas do projeto estão apresentadas na lista abaixo, com previsão de gasto total de R$1.689,00. Material Qtde Valor (R$) Total (R$) Ratos para acasalamento 8 13,00 104,00 Testosterona (Androgenol 100mg/10 ml) frasco 1 39,00 39,00 Inclusão em parafina, microtomia e coloração HE 20 60,00 1.200,00 Ração, pacote com 20 kg 2 120,00 240,00 Soro fisiológico estéril, frasco com 250 mL 5 4,00 20,00 Óleo de milho, frasco 500 mL 1 6,00 6,00 Seringa 1 ml com agulha 0,45 x 13 mm 100 0,80 80,00 Total R$1.689,00 11 – APENDICE I : CERTIFICADO DE APROVAÇÃO – CEUA UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA COORDENADORIA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA Plano de Trabalho Nome do Orientador: João Simão de Melo Neto Unidade de Vínculo (campus, núcleo ou instituto): Instituto de Ciências da Saúde Título do Plano de Trabalho: Impacto do Hiperandrogenismo Gestacional no Sistema Urogenital de Ratos Wistar Durante o Processo de Envelhecimento Grande Área/Área/Subárea : Ciências da Saúde/ Fisioterapia/ Morfologia e Histologia Introdução: Os androgênios são classificados como hormônios sexuais e se configuram como produtos da cascata esteroidegênica. Tal classe de substâncias é representada principalmente pela testosterona, sendo sintetizada nas mulheres, principalmente nos ovários e glândulas adrenais (YE et al., 2021). Em mulheres normoandrogênicas, os hormônios androgênicos séricos possuem níveis de concentração em dihidrotestosterona (DHT), testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona (DHEA) e sulfato de desidroepiandrosterona (DHEA-S) (BIENENFELD et al., 2019). Os andrógenos são sintetizados a partir do estímulo do hormônio liberador de gonadotrofina – GnRH (gonadotropin releasing hormone) através de um ciclo de feedback positivo no eixo hipotalâmico, o qual contribui para a liberação de hormônio luteinizante – LH (luteinizing hormone) e hormônio folículo estimulante – FSH (follicle stimulating hormone), desenvolvendo a anovulação e potencializando a indução de andrógenos (HOLESH; BASS; LORD, 2022). Além disso, esse ciclo tem impacto direto no ovário, pois dificulta o crescimento folicular e impede a seleção de um único folículo para a fecundação (HAMMES; LEVIN, 2019), direcionando uma via que promove a infertilidade feminina. Nesse sentido, o quadro de hiperandrogenismo ou excesso de hormônios andrógenos, de origem ovariana ou suprarrenal, configura-se como uma endocrinopatia frequente em mulheres em idade reprodutiva. A apresentação clínica dessa condição envolve hirsutismo, alopecia androgênica, indução de obesidade, pilosidade, acnes e virilização, podendo se manifestar ao longo do ciclo de vida das mulheres em momentos distintos, com tipos de diagnósticos classificados em: gestacional, pré-puberal, na idade fértil e após a menopausa (ESCOBAR-MORREALE et al., 2012; MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2020). Este estudo trará a perspectiva diante do âmbito gestacional, o qual, em sua etiologia, tem o hiperandrogenismo definido de acordo com a presença de luteoma, cisto de teca- luteína, iatrogenia, deficiência placentária de aromatase ou tumores produtores de andrógenos (de origem ovariana ou adrenal) (ESCOBAR-MORREALE, 2018). O diagnóstico de hiperandrogenismo nessa fase pode gerar estímulos prejudiciais, os quais têm propriedade de conferir alterações morfofuncionais permanentes nas mães. Este fenômeno é denominado como programação fetal, que pode ser exemplificado por distúrbios endócrinos que perpassam às barreiras biológicas, inclusive a placentária e, com isso, podem ser determinantes na saúde de suaprole durante a vida adulta (KANEKO et al., 2022; VAISERMAN; LUSHCHAK, 2021). Justificativa: A testosterona é um dos principais hormônios andrógenos que afeta a geração neonatal no que diz respeito ao desenvolvimento do sistema reprodutivo com repercussões diretas na vida adulta (LIZNEVA et al., 2016). No entanto, até o presente momento, não há informações detalhadas sobre os efeitos diretos e indiretos do hiperandrogenismo na formação histofisiológica do sistema urinário e genital da prole masculina de mães com essa condição. Em consonância, no que confere ao parâmetro gestacional sem alterações adversas, a formação da prole masculina quanto à fisiologia e anatomia dos órgãos genitais externos está diretamente relacionada à presença da testosterona. Nesse contexto, a diferenciação do epidídimo, ductos deferentes, ejaculatório e vesículas seminais é influenciada pela presença ou ausência do hormônio antimulleriano (AMH) e androgênios (testosterona) (LIBRETTI; AEDDULA, 2021). De outro modo, a administração de testosterona intrauterina induz a hipertrofia celular, demonstrando influência sobre a diminuição no peso dos rins em camundongos machos, bem como apresentação de efeitos deletérios sobre eles (BAIREY MERZ et al., 2019). Diante do exposto, é de suma relevância evidenciar os efeitos do hiperandrogenismo gestacional na repercussão histomorfológica nos órgãos reprodutores (gônadas masculinas, epidídimo, ductos, glândulas acessórias e escroto) e excretores (rins, ureteres, bexiga e uretra) da prole masculina no que diz respeito ao sistema urogenital. Objetivo: O objetivo deste estudo é verificar os efeitos do hiperandrogenismo gestacional induzido em ratas sobre o sistema urinário e genital da prole masculina durante o processo de envelhecimento. Metodologia: Animais Experimentais Os animais a serem avaliados serão obtidos do acasalamento de ratos adultos oriundos do Biotério Central da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus Botucatu. No que se refere ao local mantenedor, os animais serão alocados no Biotério e Laboratório de Pesquisa Experimental da FACERES, conforme estruturação de ambientes padronizados com temperaturas de 22 C e ciclo controlado de claro/escuro, recebendo dieta normoprotéica e água ad libitum. A linhagem de ratos Wistar foi escolhida por ser indicada para pesquisa que envolva metabolismo, farmacologias, toxicologia e oncologia, além da presença de tumores espontâneos, sendo usados em todos os campos de pesquisas biológicas e médicas (“Javier Gordon Ogembo Lab”, 2022). Todo o experimento e os procedimentos cirúrgicos deste trabalho foram submetidos à aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FACERES, sendo Certificado de Aprovação CEUA n° 9583110320 (APENDICE I). A pesquisa foi realizada de acordo com os princípios éticos em pesquisa animal adotado pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL). Verificação do início da puberdade Um dos parâmetros do modelo é a abertura vaginal precoce em ratas androgenizadas no período perinatal, a qual também é o parâmetro utilizado para estimar o início da puberdade (SENGUPTA, 2013). A abertura será verificada diariamente com a inspeção visual da genitália a partir dos 30 dias de idade. Obtenção das fêmeas com hiperandrogenismo Ratas Wistar adultas (n = 8, idade 75-95 dias e peso corporal 170-190 g) serão colocadas para acasalar, de forma que um casal (1 macho e 1 fêmea) será mantido em uma caixa de polipropileno (40 cm × 34 cm × 16 cm) durante a noite. Na manhã seguinte, entre 7 e 8 horas, o macho será retirado da gaiola e a vagina da fêmea inspecionada para a observação da presença de plugue vaginal e coleta da secreção. Esta coleta será realizada por meio da inserção no canal vaginal de um cotonete embebido em soro fisiológico estéril. O cotonete será girado 2 ou três vezes contra a parede vaginal e rolado em uma lâmina histológica, coberta em seguida por soro fisiológico e lamínula para observação ao microscópio óptico. A visualização dos espermatozoides será considerada o primeiro dia de gestação da rata. Indução ao hiperandrogenismo gestacional Neste estudo, para a indução ao quadro de hiperandrogenismo nas ratas fêmeas do grupo experimental (n= 10) receberão tratamento com dose única de testosterona na vida intrauterina, por intermédio de injeção subcutânea, diante da concentração de 5 mg dissolvidas em 500 μL de óleo de milho (veículo) no 20º dia de prenhez segundo protocolo pré-estabelecido (TEHRANI et al., 2014). As ratas prenhes do grupo controle (n = 10) receberão apenas 500μL do veículo. De modo a corroborar tal perspectiva quantitativa e logística, a indução com testosterona na mesma concentração tem como desfecho a Síndrome dos Ovários Policísticos, a qual emprega como um do seu principal sintoma a elevação expressiva do nível de androgênios fisiologicamente (RUTH et al., 2020). Quantitativo de animais experimentais Para este estudo serão utilizados a prole masculina diante do quantitativo de 20 ratos Wistar subdivididos em 4 grupos (5 animais cada), com idades equivalentes às fases de adolescência e adulta correspondentes a faixa etária humana. Ciclos de vida A fase adolescência corresponde a indivíduos com idade aproximadamente entre 10 – 19 anos (1). Adulto jovem é o ciclo de vida na idade entre 18 – 35 anos (2). Para obtenção da faixa etária, foi utilizado a mediana de ambos os ciclos da vida. Portanto, obteve-se a mediana da idade para as fases adolescência (14,5 anos) e adultos jovens (26,5 anos) em humanos para que fizéssemos a correspondência na idade dos ratos. O estabelecimento da idade animal em correspondência aos ciclos de vida humano foi realizado baseado em estudos prévios (BAIREY MERZ et al., 2019; BIENENFELD et al., 2019). Os animais serão sacrificados em dois momentos: • Fase adolescência, com 153 dias de idade. • Fase adulto jovem, com 313 dias de idade. As fêmeas prenhes serão colocadas em caixas individuais e aleatoriamente divididas nos grupos controle e tratados com testosterona (2 ratas/grupo). As fêmeas prenhes dos grupos tratados receberão uma injeção única s.c. de 5 miligramas (mg) de testosterona dissolvida em óleo de milho (veículo) no 20º dia de prenhez, enquanto as fêmeas dos grupos controle receberão somente o veículo. Após o parto, que ocorre no 22º dia de gestação pela manhã, as mães serão retiradas temporariamente da caixa, e após a determinação do sexo pela distância anogenital, a ninhada contará com o número equivalente a 5 ratos machos por grupo (20 ratos no total). A mãe será devolvida em seguida para sua ninhada. A redução da ninhada é necessária para que todos os filhotes tenham condições iguais de nutrição e desenvolvimento durante a amamentação, e os recém-nascidos excedentes serão sacrificados por decapitação por tesoura após anestesia por inalação de isoflurano. Os filhotes serão mantidos com as mães até o desmame, aos 21 dias de idade, quando então serão transferidos para gaiolas coletivas, mantidos em ambiente controlado, conforme descrito anteriormente. A partir do desmame, o peso corporal dos animais será registrado semanalmente. Grupos experimentais Serão estudados os seguintes grupos experimentais: G1: Ratos hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias. G2: Ratos não hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias. G3: Ratos não hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias. G4: Ratos hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias. Eutanásia dos animais Para a eutanásia será administrado 100 mg do anestésico nas ratas que serão sacrificadas por overdose de anestésico por kg de peso, seguido de colocação do animal em decúbito dorsal no campo cirúrgico, fixado pelos membros superiores e inferiores. Após esse momento, será realizada uma incisão mediana abdominal para identificação da cavidade. Coletade amostras e análise histopatológica dos órgãos A coleta das amostras deste estudo será direcionada para a utilização dos órgãos genitais (testículos, epidídimo e próstata) e urinária (rins, ureteres, bexiga e uretra). No que corresponde à próstata serão avaliados os diferentes segmentos: ventral, lateral, dorsal, anterior ou glândula coaguladora. Processamento do material coletado Dentro deste contexto, os materiais coletados serão direcionados para fixação em paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M (pH 7.4). Na sequência, os tecidos serão submetidos à microtomia com cortes na espessura de 4µm, sendo confeccionadas as lâminas. O tecido foi submetido a coloração de Hematoxilina & Eosina (H&E) para a análise morfométrica, estereológica e histopatológica. No entanto, em especial o hemicorpo direito da próstata será direcionado para fixação em paraformaldeído e o esquerdo para congelamento em nitrogênio líquido, seguido para manutenção em freezer -80º. Análise Histomorfométrico Para análise histomorfológica serão analisados 30 campos/grupo (40x) de modo randomizado, evitando áreas com artefato de preparação, de cada região dos órgãos através do microscópio, modelo Zeiss Primo Star acoplado a uma câmera modelo Zeiss Axiocam 105 color e utilizado o software Zeiss Zen 2.3 Lite. Análise Estereológica Serão obtidos 30 campos/grupo (40x) de forma randomizada, de cada estrutura, evitando áreas com artefato de preparação. As mesmas, feitas através do microscópio modelo Zeiss Primo Star acoplado a uma câmera modelo Zeiss Axiocam 105 color e utilizado o software Zeiss Zen 2.3 Lite. As imagens foram estudadas usando o software ImageJ 1.47, versão windows (National Institutes of Health, USA), seguido de análise estatística. Para a verificação estereológica, será utilizado o método descrito por Weibel; Paumgartner (1978) com uma grade de 418 pontos de análise sobre as imagens fotografadas da coloração de H&E (WEIBEL; PAUMGARTNER, 1978). Análise Histopatológica A análise histopatológica será realizada nas lâminas coradas com H&E comparando a presença de modificações histológicas nos diferentes grupos. O tecido será analisado em objetivas de 20x e 40x. As divergências decorrentes da comparação das lâminas, ao apresentarem aspectos de diferenciação patológica serão planilhadas e analisadas (CREASY et al., 2012). Análise Estatística Os dados serão analisados usando estatística descritiva e inferencial. Os resultados descritivos serão expressos conforme a distribuição de normalidade. Os dados paramétricos serão expressos como média ± desvio padrão, enquanto os não-paramétricos serão descritos como mediana, mínimo, máximo e quartis (Q1, Q3). Para analisar a normalidade dos dados serão utilizados os testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk, de acordo com a análise de cada quantidade amostral. Durante as comparações intergrupos serão aplicados os testes: Análise de Variância (ANOVA) e o pós-teste de Tukey (dados paramétricos); Kruskal-Wallis e o pós-teste de Dunn´s (dados não-paramétricos). Para presença de processos patológicos será utilizado à análise do risco relativo com intervalo de confiança, sendo confirmada associação por meio do teste exato de Fisher. Será considerado significativo p≤0,05. A análise estatística será realizada no software Instat (version 3.0, GraphPad, Inc., San Diego, CA, USA). 7 – METAS Verificar se existe alterações na morfologia nos tecidos do sistema urinário e genital no processo de envelhecimento; Verificar a influência do hiperandrogenismo genital no sistema urinário e genital; Verificar a histopatologia dos tecidos do sistema urinário e genital; Analisar a estrutura dos órgãos do sistema urogenital, através da avaliação do percentual de seus componentes teciduais. Referências: ARENTZ, S. et al. Nutritional supplements and herbal medicines for women with polycystic ovary syndrome; a systematic review and meta-analysis. BMC complementary and alternative medicine, v. 17, n. 1, p. 500–500, 25 nov. 2017. BAIREY MERZ, C. N. et al. 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YE, W. et al. The role of androgen and its related signals in PCOS. Journal of cellular and molecular medicine, v. 25, n. 4, p. 1825–1837, fev. 2021 9 – CRONOGRAMA DE ATIVIDADES ATIVIDADES Período: Agosto, 2022 – Julho, 2023. AGO SET OUT NOV DEZ JAN FEV MAR ABR JUN JUL Levantamento bibliográfico X Acasalamentos e tratamento hormonal das fêmeas prenhes X Estudo da puberdade X Estudo do ciclo estral X Tratamento com testosterona X X Sacrifício e coleta das amostras X X Início da micrometria, preparação de lâminas e Análise dos Resultados X X X Envio de resultados para congresso Nacional e Internacional, escrita dos artigos oriundos do projeto X X Redação do relatório final à CEUA, UFPA e FASCERES X 10 – ORÇAMENTO As despesas do projeto estão apresentadas na lista abaixo, com previsão de gasto total de R$1.689,00. Material Qtde Valor (R$) Total (R$) Ratos para acasalamento 8 13,00 104,00 Testosterona (Androgenol 100mg/10 ml) frasco 1 39,00 39,00 Inclusão em parafina, microtomia e coloração HE 20 60,00 1.200,00 Ração, pacote com 20 kg 2 120,00 240,00 Soro fisiológico estéril, frasco com 250 mL 5 4,00 20,00 Óleo de milho, frasco 500 mL 1 6,00 6,00 Seringa 1 ml com agulha 0,45 x 13 mm 100 0,80 80,00 Total R$1.689,00 11 – APENDICE I : CERTIFICADO DE APROVAÇÃO – CEUA CRONOGRAMA DE ATIVIDADES ATIVIDADES Período: Agosto, 2022 – Julho, 2023. AGO SET OUT NOV DEZ JAN FEV MAR ABR JUN JUL Levantamento bibliográfico X Acasalamentos e tratamento hormonal das fêmeas prenhes X Estudo da puberdade X Estudo do ciclo estral X Tratamento com testosterona X X Sacrifício e coleta das amostras X X Início da micrometria, preparação de lâminas e Análise dos Resultados X X X Envio de resultados para congresso Nacional e Internacional, escrita dos artigos oriundos do projeto X X Redação do relatório final à CEUA, UFPA e FASCERES X ORÇAMENTO DO PROJETO As despesas do projeto estão apresentadas na lista abaixo, com previsão de gasto total de R$1.689,00. Material Qtde Valor (R$) Total (R$) Ratos para acasalamento 8 13,00 104,00 Testosterona (Androgenol 100mg/10 ml) frasco 1 39,00 39,00 Inclusão em parafina, microtomia e coloração HE 20 60,00 1.200,00 Ração, pacote com 20 kg 2 120,00 240,00 Soro fisiológico estéril, frasco com 250 mL 5 4,00 20,00 Óleo de milho, frasco 500 mL 1 6,00 6,00 Seringa 1 ml com agulha 0,45 x 13 mm 100 0,80 80,00 Total R$1.689,00 FINANCIAMENTO DO PROJETO A pesquisa será financiado pelos próprios professores. Av. Anísio Haddad, 6751, Jardim Morumbi, São José do Rio Preto/SP - CEP 15090-310 - tel: 55 (17) 3201-8200 / fax: --- Horário de atendimento: 2ª a 6ª das 8 às 17h : e-mail: sistema.ceua@faceres.com.br CEUA N 9583110320 CERTIFICADO Certificamos que a proposta intitulada "Estudo da ação da melatonina no sistema reprodutor feminino de ratas com síndrome do ovário policístico", protocolada sob o CEUA nº 9583110320, sob a responsabilidade de Carla Patrícia Carlos e equipe; Ana Celina Cavalcante Oliveira; Giovanna Gonçalves de Lima - que envolve a produção, manutenção e/ou utilização de animais pertencentes ao filo Chordata, subfilo Vertebrata (exceto o homem), para fins de pesquisa científica ou ensino - está de acordo com os preceitos da Lei 11.794 de 8 de outubro de 2008, com o Decreto 6.899 de 15 de julho de 2009, bem como com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA), e foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade Ceres - FACERES (CEUA/FACERES) na reunião de 05/11/2020. We certify that the proposal "Study of the action of melatonin in the female reproductive system of rats with polycystic ovary syndrome", utilizing 32 Heterogenics rats (32 females), protocol number CEUA 9583110320, under the responsibility of Carla Patrícia Carlos and team; Ana Celina Cavalcante Oliveira; Giovanna Gonçalves de Lima - which involves the production, maintenance and/or use of animals belonging to the phylum Chordata, subphylum Vertebrata (except human beings), for scientific research purposes or teaching - is in accordance with Law 11.794 of October 8, 2008, Decree 6899 of July 15, 2009, as well as with the rules issued by the National Council for Control of Animal Experimentation (CONCEA), and was approved by the Ethic Committee on Animal Use of the Ceres Colleges - FACERES (CEUA/FACERES) in the meeting of 11/05/2020. Finalidade da Proposta: Pesquisa Vigência da Proposta: de 03/2020 a 02/2021 Área: Laboratório Experimental Origem: Animais provenientes de estabelecimentos comerciais Espécie: Ratos heterogênicos sexo: Fêmeas idade: 75 a 131 dias N: 32 Linhagem: Wistar Peso: 150 a 180 g Local do experimento: Laboratório de Pesquisa Experimental São José do Rio Preto, 09 de novembro de 2020 Profa. Dra. Vanessa Belentani Marques Dra. Ana Letícia Daher Aprígio da Silva Coordenadora da Comissão de Ética no Uso de Animais Vice-Coordenadora da Comissão de Ética no Uso de Animais Faculdade Ceres - FACERES Faculdade Ceres - FACERES MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ POS-GRADUACAO EM SAUDE, AMBIENTE E SOCIEDADE NA AMAZONIA DECLARAÇÃO Nº 5 / 2023 - PGSAS (11.33.21) Nº do Protocolo: 23073.021017/2023-47 Belém-PA, 28 de março de 2023. De: Profa. Dra. Denise da Silva Pinto Para: Dr. Carlomagno Pacheco Bahia Assunto: Informe de pertinência de projeto de pesquisa Eu, Profa. Dra. Denise da Silva Pinto, encaminho este informe para o diretor adjunto do Instituto de Ciências em Saúde (ICS) para declarar, de acordo com devidos fins, que o projeto intitulado ?Impacto do HiperandrogenismoGestacional no Sistema Urogenital de Ratos Wistar Durante o Processo de Envelhecimento?, sob coordenação do Prof. Dr. João Simão de Melo Neto, vinculado ao Programa de Pós-graduação em Saúde, Ambiente e Sociedade na Amazônia (PPGSAS) apresenta pertinência para as linhas de pesquisa do programa. Antecipadamente, agradeço e disponibilizo-me para quaisquer esclarecimentos. Profa. Dra. Denise da Silva Pinto Vice-coordenadora do PPGSAS (Assinado digitalmente em 28/03/2023 13:31 ) DENISE DA SILVA PINTO PROFESSOR DO MAGISTERIO SUPERIOR ICS (11.33) Matrícula: ###045#5 Para verificar a autenticidade deste documento entre em https://sipac.ufpa.br/public/documentos/index.jsp informando seu número: 5, ano: 2023, tipo: DECLARAÇÃO, data de emissão: 28/03/2023 e o código de verificação: 122a82f0d8 https://sipac.ufpa.br/public/jsp/autenticidade/form.jsf