cultura de embriões zigóticos - aula teórica 5 - 2023

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Cultura de embriões zigóticos
Profa. Dra. Cláudia Roberta Damiani
Cultura de embriões
• Definição:
“Isolamento estéril e crescimento de um 
embrião imaturo ou maturo in vitro, com o 
objetivo de se obter uma planta viável”.
Tipos de cultura de embriões
a) Cultura de embrião imaturo:
Originado de sementes imaturas, é usado 
para evitar o abortamento natural. É mais 
difícil, devido a excisão e meio de cultura 
mais complexo.
b) Cultura de embriões maturos:
Originado de sementes maturas, é usado 
para evitar a inibição de germinação na 
semente.
Desenvolvimento do embrião em angiospermas
Ao atingir o 
saco 
embrionário, o 
tubo polínico 
se rompe 
liberando os 2 
núcleos 
espermáticos, 
sendo que um 
fecundará a 
oosfera, 
originando o 
zigoto e o 
outro se unirá 
aos 2 núcleos 
polares, 
originando o 
endosperma 
(3n). 
Formam-se 4 
células, das quais 
3 degeneram-se.
A única célula 
(megáspora) 
passa por 
divisões 
mitóticas de seu 
núcleo, 
originando o 
saco 
embrionário, 
dentro de um 
óvulo agora 
maduro. 
O saco embrionário é formado 1 célula, 
contendo 8 núcleos n: 3 antípodas, 2 
sinérgides, 2 núcleos polares e o 
gameta feminino –oosfera.
Globular
Triangular Torpedo
Cotiledonar
Cordiforme
O desenvolvimento do embrião zigótico tem início com a
diferenciação de uma estrutura bipolar, constituída de ápice
caulinar e radicular, passando pelos estágios de
desenvolvimento pró-embrionários e embrionários
propriamente ditos: globular, cordiforme, torpedo e
cotiledonar.
Fisiologia e estágios do desenvolvimento do 
embrião zigótico
• Na medida em que o embrião zigótico se desenvolve, ocorrem
mudanças progressivas na sua exigência nutricional, passando de
heterotrófico a autotrófico;
• A distinção entre essas duas fases se baseia na dependência do
embrião pelas substâncias nutritivas armazenadas no endosperma;
• No estágio globular o embrião é heterotrófico;
• A partir do estágio cordiforme, com início do desenvolvimento dos
cotilédones, o embrião começa a se tornar independente e
autotrófico.
Fatores que afetam a cultura de embrião
1) Maturidade fisiológica da semente; 
2) Desinfestação da semente; 
3) Remoção inadequada do embrião; 
4) Meio nutritivo adequado: 
a) Sais inorgânicos, 
b) Carboidratos, 
c) Nitrogênio,
d) pH do meio de cultura,
e) Reguladores de crescimento,
f) Condições ambientais de cultivo.
1) Maturidade fisiológica da semente
• Embriões retirados de sementes fisiologicamente
maduras requerem apenas sais inorgânicos e sacarose
no meio de cultura.
– Devido a estrutura bipolar desenvolvida passam
rapidamente para o estado autotrófico.
• Embriões muito pequenos são difíceis de desenvolver
in vitro.
2) Desinfestação da semente
• As sementes e frutos devem ter a superfície
desinfestada e os embriões excisados assepticamente
dos tecidos que o cercam, razão por que a
contaminação em cultura de embrião é mínima.
• Desinfestantes de uso mais freqüente:
– Hipoclorito de sódio e etanol;
• Detergentes:
– Tween 20 ou 80 (0,01 a 0,1%).
Embora não seja essencial devido a excisão do embrião de
dentro da semente, o resíduo do desinfestante na
superfície da semente ou fruto pode ser eliminado por
lavagens com água estéril.
3) Remoção inadequada do embrião
• Excisão do embrião imaturo
– A remoção dos embriões pequenos é realizada em câmara 
asséptica, com o auxílio do microscópio estereoscópico, para 
melhor visualização dos embriões imaturos.
Hilo: cicatriz deixada pelo funículo
Micrópila: pequenos orifício no 
tegumento dos óvulos dos vegetais 
fanerógamos, cuja finalidade é permitir 
a fecundação (por onde entra o tubo 
polínico levando o pólen).
Cicatriz da 
micrópila
• Quando o endosperma ainda está líquido, a excisão do embrião
imaturo, pode ser feita por meio de uma incisão na porção terminal
do saco embrionário, junto à micrópila, seguido da aplicação de
pressão na outra extremidade para forçar a expulsão do embrião.
• Quando o embrião é excisado no estádio globular é necessário
manter o suspensor, que é a conexão entre o tecido materno e o
embrião, e por onde este se nutre.
Suspensor
Suspensor
EmbriãoEndosperma
tegumento
O suspensor é um local ativo de biossíntese de 
substâncias de crescimento, imprescindíveis para o 
desenvolvimento dos embriões zigóticos excisados.
http://www.amjbot.org/content/89/5/766/F4.large.jpg
4) Meio de cultivo adequado
• Quanto mais jovem for o embrião, mais complexa será a exigência 
nutricional para o seu desenvolvimento.
– Embriões no estágio de torpedo:
• Exigem sais minerais, sacarose e vitaminas; 
– Embriões no estágio cordiforme:
• Exigem além dos sais minerais, sacarose e vitaminas, a adição 
misturas orgânicas complexas (ex. ácido cítrico, água de coco) e 
hormônios como gibererlinas, citocininas e auxinas; 
– Embriões no estádio globular inicial:
• As exigências são desconhecidas.
Globular
Triangular
Torpedo
Cotiledonar
Cordiforme
a) Sais inorgânicos
• Meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) - alto conteúdo
de sais.
• Meio de cultura WPM (Wood Plant Media – Loyd & McCown, 1980),
e Knudson (KNUDSON, 1922) - aproximadamente ¼ da
concentração de íons nitrato e amônio do meio de cultura MS.
b) Carboidratos
• Por não disporem de condições adequadas para a realização da
fotossíntese in vitro, requerem uma fonte de carboidratos exógena.
– Principal fonte de carboidratos utilizada: sacarose
– Concentrações: variam de 20 a 40 g.L-¹
• Em geral, quanto mais jovem for o embrião excisado, mais alta
será a osmolaridade requerida no meio, ou seja, mais
carboidrato é requerido.
• Em alguns casos, especialmente para gramíneas, outros açúcares,
como a maltose ou frutose são mais eficientes.
c) Nitrogênio
• Nitratos de potássio e de amônio são as fontes de nitrogênio
inorgânico mais frequentemente usadas.
• Adição de aminoácidos e suas amidas:
– Glutamina: é a substância mais efetiva no estímulo ao
crescimento de embriões in vitro;
– Asparigina: bastante efetiva em alguns gêneros como, por ex.
Datura, mas inibitória em outros gêneros, como Arabidopsis;
– Caseína hidrolisada (mistura complexa de aminoácidos): é
comumente usada no meio de cultura para estimular o
crescimento e o amadurecimento do embrião.
d) pH do meio de cultura
• O pH influencia diretamente a disponibilidade de nutrientes, e
fitorreguladores.
– pH baixos (muito ácidos) dificultam a absorção do amônio;
– pH altos (muito básicos) diminuem a absorção do nitrato.
• Crescimento adequado para a maioria das espécies: pH entre 5 a 6,5.
• pH inferiores a 4,5 e superiores a 7,8 causam paralisação do crescimento e
do desenvolvimento in vitro.
e) Reguladores de crescimento
• Na cultura de embriões imaturos, reguladores de crescimento são
muitas vezes usados para evitar a germinação precoce ou para
estimular o crescimento embrionário.
• O regulador efetivo para evitar a germinação precoce é o ácido
abscísico (ABA), que está normalmente presente no saco
embrionário.
• Dependendo da espécie, o embrião jovem pode ser estimulado a
crescer por citocininas, auxinas ou por giberelinas (as
giberelinas, como o GA3 ou ácido giberélico é um dos mais
efetivos para estimular a germinação).
f) Condições ambientais de cultivo
Luz
• Os efeitos da luz sobre o desenvolvimento embrionário são pouco
estudados.
• Usualmente, nas câmaras de cultivo a intensidade luminosa é de 3 a
5 W.m-².
Temperatura
• A temperatura mais utilizada para incubação é de 25 ºC, não 
importando o tipo de planta.
Aplicações práticas da cultura de 
embriões
a) Superação da dormência das sementes
• Em algumas sementes ocorrem inibidores químicos 
endógenos ou há requerimentos específicos de luz e 
temperatura ou ainda a resistência física presente nas 
estruturas que recobrem o embrião. 
• A cultura de embriões é uma alternativa para superar 
estes problemas.
Ilex opaca
a) Superação da dormência das sementes
• Ex.:Ilex opaca - a maior dificuldade do melhoramento
em Ilex é a demora da germinação das sementes,
causada pela natureza rudimentar dos embriões que
permanecem imaturos, no estádio cordiforme, durante
longo período, depois do amadurecimento do fruto.
• As sementes de I. opaca exigem 3 anos, sob condições
apropriadas para germinarem.
a) Superação da dormência das sementes
b) Recuperação de híbridos de cruzamentos
incompatíveis
• No melhoramento, cruzamentos interespecíficos e
intergenéricos, com o objetivo de transferir genes de
interesse da espécie selvagem para a cultivada
(aumentando a variabilidade genética), podem produzir
embriões abortivos devido a incompatibilidade.
• Isto ocorre também em cruzamentos onde existem
barreiras pré ou pós-zigóticas (sementes murchas e
embriões abortivos).
• Nestes casos, os embriões híbridos são salvos e
removidos antes que ocorra o aborto e, posteriormente
cultivados in vitro.
b) Recuperação de híbridos de cruzamentos
incompatíveis
b) Recuperação de 
híbridos de 
cruzamentos 
incompatíveis
Ovule culture is used to support interspecific hybridizations, in this case 
between Brassica rapa × Brassica oleracea.
Embryos derived from 3 pollinations germinate and develop into normal 
plantlets.
Interspecific transfer of resistance into Brassica napus
b) Recuperação de híbridos de cruzamentos incompatíveis
Neste caso, utilizou-se a cultura de 
óvulos primeiro para realizar a 
hibridização e posteriormente o 
resgate dos embriões por cultura 
in vitro.
c) Superação da esterilidade das sementes
• As causas de ocorrência de sementes estéreis em
algumas espécies podem ser devido ao
desenvolvimento incompleto do embrião, mutações das
estruturas que cobrem o embrião ou algum tipo de
dormência recalcitrante para a qual nenhum método tem
sido desenvolvido.
Sementes recalcitrantes são àquelas que não sobrevivem a secagem e 
congelamento durante a conservação ex situ.
c) Superação da esterilidade das sementes
Neste caso também foi 
utilizado para a 
eliminação de 
microrganismos 
causadores de 
doenças (bactérias)
d) Prevenção do embrião abortivo por meio de resgate
• Ocorre principalmente com o amadurecimento precoce 
de frutos carnosos. 
• Em cruzamento dos frutos (pêssego, ameixa, cereja) o 
transporte de água e nutrientes para o embrião imaturo 
é algumas vezes cortado muito cedo, ocorrendo o 
aborto.
d) Prevenção do embrião abortivo
e) Germinação de sementes infectadas com 
microrganismos
f) Propagação vegetativa
• Devido a sua natureza juvenil com alto potencial 
regenerativo, embriões são excelentes explantes para 
propagação in vitro, especialmente para coníferas e 
gramíneas.