Fluorescência Molecular e Aplicações

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Luminescência molecular
Bioluminescência
2
Quimiluminescência
3
Luminescência 
molecular
fotoluminescência
quimiluminescência
fluorescência
fosforescência
M* → M + hν’
4
Fluorescência molecular
Características:
- alta sensibilidade 
- amplo intervalo de resposta linear
F α C, soluções diluídas, A < 0,05
- interferências de matriz são relevantes
- poucas substâncias exibem fluorescência (derivação)
- cromatografia a líquido e eletroforese capilar
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Fluorescência molecular
Características:
- alta sensibilidade 
- amplo intervalo de resposta linear
F α C, soluções diluídas, A < 0,05
- interferências de matriz são relevantes
- poucas substâncias exibem fluorescência (derivação)
- cromatografia a líquido e eletroforese capilar
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E2
E0
E1
E2
E0
E1
E2
E0
E1
absorção relaxação fluorescência
Fluorescência molecular
NIR Vis UV
7
Espectros de excitação, fluorescência e fosforescência
excitação fluorescência fosforescência
S0
S2
S1
en
er
gi
a
T1
estados excitados 
singlete
estado fundamental
estado excitado 
triplete
8
S0
S2
S1
en
er
gi
a
T1
estados excitados 
singlete estado excitado 
triplete
estado fundamental
λλλλ2 λλλλ1
ABSORÇÃO
relaxação 
vibracional
conversão 
externa
conversão 
interna
FL
U
O
RE
SC
ÊN
CI
A
λλλλ3
cruzamento 
intersistema
FO
SF
O
RE
SC
ÊN
CI
A
Espectros de excitação e emissão do quinino
Excitação Emissão
IN
T
EN
S
ID
A
D
E 
R
EL
A
T
IV
A
COMPRIMENTO DE ONDA, nm
200 250 300 350 400 450 500 550 600 
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Fluorescência molecular
Substâncias que exibem fluorescência:
Aromáticos
compostos contendo carbonila ou duplas ligações 
conjugadas
espécies com estruturas rígidas
�
�
�
Fluorescência e estrutura molecular
piridina
pirrol
10
Fluorescência e estrutura molecular
Fenolftaleína
Fluoresceína
C
H2
bifenila – φ ≅ 0,2
fluoreno – φ ≅ 1,0
OH
N
O
N
Zn
2
Efeito de substituintes
11
F = (K´øebP0) c
K
F = K c
auto-absorção
F
c
� T
� viscosidade
� F espécies absorventes!!
Análises quantitativas
Espectrofotômetros
amostra 
fonte de
radiação monocromador detector
amplificador
sinal
referênciaamostra 
12
fonte de
radiação
fitro ou
monocromador
amostra
fitro ou
monocromador
detector
Fluorímetros
fonte de
radiação
fitro ou
monocromador
amostra
amplificador
atenuador
sinal
fitro ou
monocromador
detectordetector
Fluorímetros
13
Fluorímetros
fonte de 
radiação
detector
fenda de
entrada
fenda de
saída
Componentes - Fluorímetro
� Fontes de radiação
• lâmpadas de vapor de mercúrio
(254, 302, 313, 546, 578, 691, 773 nm)
• lâmpadas de xenônio – 75-450W
(emissão contínua 300-1300nm)
• lasers
•volume de amostra
•feixes colimados
•monocromáticos
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Componentes - Fluorímetro
� Sistema óptico
• filtros (absorção e interferência)
• monocromadores
Componentes - Fluorímetro
� Células de medida
• cilíndricas/retangulares
• vidro/sílica/quartzo
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Componentes - Fluorímetro
� Detectores
• fotomultiplicadoras
• arranjos de sensores
Detectores
fotomultiplicadoras
anodo
~ 107 e- / fóton
radiação
catodo
quartzo
(n1 x n2) e- / fóton
n1 e- / fóton
arranjos de sensores
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Espelho
Fluorímetro
Fotomultiplicadora 
da amostra
Filtro 
secundário
Obturador
Disco com 
abertura de 
referência
Lâmpada
Filtro 
primário
Disco com 
abertura para 
amostra
Fotomultiplicadora 
de referência
Amostra
F
D
C
B
A
E
Espectrofluorímetro
Monocromador de emissão Monocromador de excitação
Rede Rede
Fotomultiplicadora 
da amostra espelho
atenuador
Compartimento 
da amostra
Divisor de 
feixes
Lâmpada de 
xenônio
Fotomultiplicadora 
de referência
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Espectros de excitação e emissão do quinino
Excitação Emissão
IN
T
EN
S
ID
A
D
E 
R
EL
A
T
IV
A
COMPRIMENTO DE ONDA, nm
200 250 300 350 400 450 500 550 600 
Espectros de excitação, fluorescência e fosforescência
excitação fluorescência fosforescência
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Dispositivo para medida de fosforescência
amostra
nitrogênio
líquido
obturador
de excitação
obturador
de emissão
Feixe de
excitação
monocromador
de emissão
Equipamentos
19
Fluorescência - aplicações
• enzimas e co-enzimas; esteróides; vitaminas
produtos naturais; poluentes ambientais
� substâncias fluorescentes
• vitaminas, espécies de interesse farmacêutico, 
íons metálicos
� derivação química
Fluorescência - aplicações
Excitação: λ = 360 nm Emissão: λ = 475 nm
H3C
+
NH3
N
CH2
N
S
+ CH3
CH2 CH2 OH
2 Cl-
H3C
N
CH3
CH2 CH2 OHN N
N
SH3C
+
NH3
N
CH2
N
S
+ CH3
CH2 CH2 OH
2 Cl-
H3C
+
NH3
N
CH2
N
S
+ CH3
CH2 CH2 OH
H3C
+
NH3
NN
CH2
N
S
+ CH3
CH2 CH2 OH
NN
S
+ CH3
CH2 CH2 OH
2 Cl-
K3[Fe(CN)6]
NaOH
tiamina tiocromo
espécie reagente λ / nm concentração
excitação emissão
dipirona 260 360 0,5 – 4,0 mg L-1
histamina o-phtalaldeído 360 450 < 5,0 mg L-1
cianeto o-phtalaldeído 331 379 > 0,25 µg L-1
Al3+, F- alizarina 470 500 7,0; 1,0 µg L-1
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Fluorescência - aplicações
• enzimas e co-enzimas; esteróides; vitaminas
produtos naturais; poluentes ambientais
� substâncias fluorescentes
• vitaminas, espécies de interesse farmacêutico, 
íons metálicos
� derivação química
• Ex.: oxigênio
� supressão de fluorescência
5 µmol L-1 Ru(bipy)3Cl2 em metanol após
(a) borbulhar CO2 e (b) borbulhar O2 (30s)
Efeito da presença de oxigênio
21
8
300 350 400 450
0
100
200
300
400
500
6 mg L
-1
0
 
 
In
te
n
s
id
a
d
e
 d
e
 F
lu
o
re
s
c
ê
n
c
ia
Comprimento de onda (nm)
1 2 3 4 5 6
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
 
 
F
0
/F
Melamina (mg L
-1
)
Supressão de fluorescência
Fo/F = (0,999±0,002)+(0,0165±0,004)CMEL (r=0,999)
τ(M*)
10,8 � 5,5 ns
22
8
Supressão de fluorescência
τ(M*)
10,8 � 5,5 ns0,0589 L mg-1
0,0610 L mg-1
Fosforescência - aplicações
� aromáticos contendo átomos de enxofre ou
halogênios
• ácidos nucleicos, aminoácidos, enzimas, pesticidas, 
hidrocarbonetos em petróleo
� complexos com metais de transição
� fosforescência a temperatura ambiente
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Quimiluminescência
A + B C* + D
C* C + hν
� Bioluminescência
� bactérias, fungos, plantas e animais
� Ex: vaga-lumes - luciferinas (φ ≅ 0,88)
� Sistemas não biológicos
� peroxioxalatos – φ ≅ 0,50
� lucigenina e luminol – φ ≅ 0,01
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fonte de
radiação
fitro ou
monocromador
amostra
amplificador
atenuador
sinal
fitro ou
monocromador
detectordetector
Equipamentos
Medidas em batelada
Equipamentos
25
Medidas em fluxo
Equipamentos
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luminol 3-aminoftalato
• catalisadores: Co2+, Cu2+, Cr3+, Fe2+, Fe3+, Ni2+
• oxidantes: H2O2, MnO4
-, Cr2O7
2-, HOCl 
• redutores: ácido úrico, cortisona, ácido ascórbico,
cisteína, creatinina, frutose, glicose 
Quimiluminescência - aplicações
λMAX = 425 nm
Quimiluminescência - aplicações
ácido úrico + O2 alantoína + H2O2
uricase
D-glicose + O2 + H2O ácido D-glicônico + H2O2
GOD
colesterol + O2 + 2 H2O colestenona + 2 H2O2
COD
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NO + O3 NO2* + O2
NO2* NO2 + hν ( λ = 600 – 2800 nm)
NO2 NO + O (T = 700 oC)
NOx
Quimiluminescência - aplicações
SO2, H2S, mercaptanas
2 SO2 + 4H2 S2* + 4H2O
S2* S2 + hν (384 – 394 nm)
∆
O3 + rodamina-B
∆