Imunologia Clinica

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Imunologia Clínica
IMUNOENSAIOS
Diagnóstico imunológico
1. Consulta clínica: anamnese + 
queixas do paciente.
2. Indicação para efetuar exames: 
apoio ao diagnóstico.
3. Procedimento: instruções ao 
paciente, coleta de material.
4. Resultados de exames.
5. Retorno: avaliação do paciente e 
dos exames.
Exames
Servem para auxiliar o diagnóstico clínico, 
efetuar intervenções: instalação 
terapêutica, procedimentos cirúrgicos, 
avaliar prognóstico, suprir necessidades do 
paciente e do clínico.
Como solicitar exames:
Sempre por escrito, preenchimento de 
guias padronizadas ou receituários médicos: 
informar, no mínimo nome completo, idade, 
sexo e gipótese diagnóstica. De preferência 
por extenso = evitar novas abreviações ou 
novas terminologias. Sempre datar a 
solicitação, carimbar e assinar.
Quem pode solicitar:
- Médico;
- Cirurgião dentista;
- Nutricionista
- Médico veterinário.
Reações sorológicas
O diagnóstico de certeza de um processo 
infeccioso é a demonstração do patógeno 
ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos 
biológicos do hospedeiro. 
Clínica -> Epidemiologia -> Laboratório
Pesquisa de anticorpos:
1. Diagnóstico Individual
- Elucidar processos patológicos com 
sintomas e sinais clínicos 
confundíveis. 
- Diferenciar a fase da doença.
- Diagnosticar doenças congênitas.
- Selecionar doadores de sangue, 
doadores e receptores de órgãos.
- Avaliar o prognóstico de doença e 
verificar o agravamento da 
patologia.
- Avaliar a eficácia terapêutica e sua 
suspensão.
- Avaliar a imunidade específica 
(naturalmente adquirida ou 
artificialmente induzida)
2. Inquéritos Soroepidemiológicos
- Estabelecer a prevalência da 
doença.
- Verificar a erradicação/controle da 
doença.
- Verificar a reintrodução de novos 
casos em áreas consolidadas
- Como critério de cura
- Na definição de etiologia da doença.
- Na seleção de doadores de sangue.
- Em inquéritos epidemiológicos.
1. PATÓGENO
2. CÉLULA FAGOCÍTICA 
3. LINFONODO E BAÇO
4. APRESENTAÇÃO 
5. ATIVAÇÃO DE LINFÓCITOS T 
E B -> (PRODUÇÃO DE 
CITOCINAS) - Linfócitos de 
memória) 
6. LINFÓCITOS B ATIVADOS 
7. ANTICORPOS 
Janela imunológica
“ É o tempo existente entre a aquisição da 
infecção e a detecção de anticorpos 
circulantes 
(soroconversão/soropositividade ) “
“ É o tempo existente entre a aquisição da 
infecção e a detecção de DNA/RNA 
circulantes”
Imunoensaios não marcados
- Imunoprecipitação;
- Aglutinação;
- Ensaios líticos;
- Floculação: VDRL.
 Imunodifusão
Hemaglutinação
Aglutinação do látex
Ensaios líticos
Floculação - VDRL
Imunoensaios marcados
- Imunofluorescência;
- Imunoenzimáticos;
- Quimioluminescência;
- Cultura de leucócitos;
- Citometria de fluxo.
Imunofluorescência
Imunoenzimáticos - ELISA
Imunoenzimático - Western blotting
Quimioluminescência
Separação de mononucleares
Cultura de leucócitos
Citometria de fluxo
PARÂMETROS SOROLÓGICOS
Validação de testes sorológicos
-> Validade intrínseca de um teste: 
desempenho do teste quando comparado 
com teste de referência. 
-> Uso de populações sabidamente 
positivas e negativas para o parâmetro que 
está sendo avaliado.
Parâmetros
- Sensibilidade
- Especificidade
- Valor preditivo positivo e negativo
- Eficiência
- Limiar de reatividade
- Exatidão
- Precisão
- Reprodutibilidade
Sensibilidade
 É a porcentagem de resultados positivos 
na população doente ISTO É proporção de 
resultados verdadeiros positivos. 
Especificidade
É a porcentagem de resultados negativos 
na população não doente ISTO É 
proporção de resultados verdadeiros 
negativos.
Eficiência
Relação entre a somatória dos verdadeiros 
resultados positivos e verdadeiros 
resultados negativos com a população 
estudada.
*QUANTO MAIS PRÓXIMO DE 1, 
MELHOR O TESTE*
Valor preditivo
>< Positivo: probabilidade de doença 
quando o teste for positivo
>< Negativo: probabilidade de não-doença 
quando o teste for negativo.
PARA UMA DOENÇA QUE TEM: 
Valores preditivos
Dependem de:
- Sensibilidade do teste intrínseco
- Especificidade
- Prevalência da doença na população 
em estudo.
Prevalência
Prevalência = porcentagem de indivíduos 
doentes em uma população.
Prevalência sorológica = porcentagem de 
casos positivos pelo teste. 
Prevalência verdadeira =
Limiar de reatividade 
 É o valor do teste: 
>< Acima do qual os resultados são 
considerados positivos e indicam doentes 
ou reagentes. 
>< Abaixo do qual os resultados são dados 
como negativos e indicam os não doentes 
ou não reagentes.
Escolha do limiar de reatividade
Precisão
Determina a concordância dos resultados 
obtidos quando o teste é feito várias vezes 
- mede erro acidental 
Exatidão
Determina a capacidade do teste em 
fornecer resultados muito próximos ao 
verdadeiro - detecta erros sistemáticos.
Reprodutibilidade 
Refere-se à obtenção de resultados iguais, 
em testes com a mesma amostra, feitos por 
pessoas diferentes em locais diferentes - 
associada a erros acidentais e sistemáticos
IMUNOENSAIOS NÃO MARCADOS
Imunoensaios
São técnicas para detectar e quantificar 
antígenos e anticorpos, ou qualquer 
substância que exerça papel de antígeno no 
ensaio (fármacos, hormônios, ácidos 
nucleicos, citocinas, receptores de células). 
Podem utilizar reagentes não marcados 
(imunoensaios não marcados) ou marcados 
(imunoensaios marcados).
Imunoensaio não marcados 
>< Ensaios clássicos que tem como base a 
precipitação: sensibilidade baixa pois é 
necessária a formação de grandes 
complexos antígeno-anticorpo.
>< Sistemas automatizados: nefelometria e 
turbidimetria (sensibilidade maior).
Aglutinação
>< Ocorre quando há a formação de 
agregados suficientemente grandes de 
micropartículas ou células com múltiplos 
determinantes antigênicos ou anticorpos, 
interligados por pontes moleculares de 
anticorpos ou antígenos. 
>< Principal característica da 
hemaglutinação é que um dos componentes 
é apresentado na forma insolúvel em 
suspensão, de forma natural em células, ou 
absorvido artificialmente em 
micropartículas ou células.
>< Aglutinação específica apresenta um 
processo dinâmico que ocorre em dois 
estágios:
1º : início logo após a mistura das partículas 
recobertas pelo antígeno com anticorpos e 
consiste na ligação Ag-Ac por meio de 
ligações não covalentes, de acordo com a lei 
de ação das massas. 
2º : começa enquanto o 1º continua e, 
resulta das colisões que ocorrem entre as 
partículas, de modo que os anticorpos 
ligados a uma partícula se ligam a 
determinantes antigênicos de outra, 
formando agregados visíveis a olho nu.
Desvantagens das técnicas de 
imunoaglutinação
- Reprodutibilidade dos lotes de 
reagentes;
- Acessibilidade molecular para a interação 
antígeno-anticorpo;
- Estabilidade da ligação do 
antígeno-anticorpo no suporte;
- Proporção equivalente de 
antígenos-anticorpos. Proporções não 
equivalentes geram resultados 
falsos-negativos (não há formação de 
agregados visíveis). 
Aglutinação direta
- O antígeno faz parte naturalmente da 
célula, e haverá aglutinação dessas células 
promovida por anticorpos contra esses 
antígenos;
- Identificação de antígenos eritrocitários 
na tipagem sanguínea;
- Sorotipagem de bactérias utilizando 
anticorpos específicos;
- Aglutinação de hemácias revestidas de 
auto-anticorpos (anemias auto-imunes) por 
anticorpos anti-Ig (soro de Coombs);
- Pesquisa de crioaglutininas (marcador de 
mieloma e/ou doenças auto-imunes) 
utilizando hemácias como antígenos. O 
teste é feito a baixas temperaturas (4-8ºC), 
e apenas a aglutinação que ocorre a frio e 
se desfaz a 37ºC é indicativa de presença 
de crioaglutininas. 
Inibição da aglutinação indireta
>< Teste consiste na adição de antígeno 
solúvel à amostra contendo anticorpos 
visando o bloqueio dos respectivos sítios de 
ligação. Quando essa mistura é colocada em 
contato com partículas sensibilizadas com o 
mesmoantígeno, a aglutinação não é 
observada.
>< O grau de inibição está relacionado à 
quantidade de antígeno presente na 
amostra e à afinidade do anticorpo.
Floculação
>< Variante da aglutinação indireta, ocorre 
quando a interação direta de anticorpos 
específicos com o antígeno leva à formação 
de imunocomplexos em meio líquido, 
detectáveis com lupa ou microscopia óptica.
>< VDRL (Veneral Disease Research 
Laboratories): suspensão antigênica 
alcoólica de cardiolipina, cristais de 
colesterol e lecitina preparada para a 
pesquisa de anticorpos anti-cardiolipina 
(reagininas).
Ensaios líticos
Permitem a detecção de antígenos ou 
anticorpos, apresentando como produto 
final, presença ou ausência de hemólise.
- Proteínas do complemento para 
causar a citotoxicidade de hemácias 
sensibilizadas.
- Ensaios de CH50 e AP50.
Imunidade mediada por complemento
IMUNOENSAIOS MARCADOS
>< 1950- identificação de antígenos ou 
anticorpos, em testes altamente sensíveis, 
empregando moléculas marcadas com 
compostos químicos definidos e detectáveis 
e que podem ser mensurados. 
>< Conjugados: moléculas ligadas 
covalentemente aos compostos ligantes 
sem perder suas propriedades funcionais 
(antígenos ou anticorpos marcados).
>< Fatores que diferem nas técnicas: 
- Ligante ou marcador;
- Sistema de revelação do ligante;
- Molécula conjugada ao ligante;
- Origem dessa molécula ;
- Meio onde ocorre o ensaio 
imunológico.
Ligantes e sistemas de revelação
- Radioisótopos - radiação
- Fluorocromos - fluorescência
- Substâncias luminescentes, 
biológicas ou químicas - 
luminescência ou glow (brilho de luz)
- Enzimas com substratos 
cromogênicos - imunoenzimáticos
- Enzimas com substratos 
fluorogênicos - fluorimetria
- Enzimas com substratos 
luminescentes-quimioluminescência
Marcados 
>< Molécula conjugada pode ser: proteína, 
antígenos, imunoglobulinas, haptenos.
>< Anticorpos monoclonais e policlonais.
Anticorpos policlonais
- Imunização artificial;
- Pool de soros;
- Produzidos IN VIVO.
Anticorpos monoclonais
- Imunização artificial;
- Produzidos: 
● “in vivo”: modelos animais
● “in vitro”: cultura celular 
Biologia molecular e Antígenos 
recombinantes
Técnicas de biologia molecular e moléculas 
recombinantes estão contribuindo para o 
aperfeiçoamento dos métodos de pesquisa 
de marcadores biológicos específicos para o 
diagnóstico das doenças infecciosas.
Histórico
>< Endonucleases de restrição: enzimas 
que reconhecem sequências específicas de 
nucleotídeos clivando as moléculas de DNA 
nestes determinados pontos. 
>< Moléculas de DNA recombinantes: 
(clonagem, construção de genotecas): 
fragmentos de DNA são inseridos no DNA 
de um vetor (bacteriófago ou plasmídeo) e 
expandidos em bactérias.
Proteínas recombinantes para fins 
diagnósticos
- Produção de antígenos naturais: rápida, 
simples e bom custo benefício, menor 
sensibilidade, menor especificidade e 
procedimentos de purificação trabalhosos. 
- Produção de proteínas recombinantes: 
produção em grande quantidade, rápida, 
menos trabalhosa e mais econômica. Maior 
sensibilidade e especificidade. 
- Produção de grande variedade de 
antígenos recombinantes aliada à tecnologia 
de microarranjos (microarray): único 
ensaio- complexo de antígenos.
Produção de anticorpos recombinantes
- Sistema em linhagens de células de 
mieloma: produção de anticorpos 
recombinantes – diagnóstico e terapêutico. 
- Anticorpos humanizados: sequências 
ligantes de antígenos de roedores em 
sequências humanas.
- Anticorpos quiméricos: resultam da fusão 
de regiões variáveis de imunoglobulinas de 
camundongos a regiões constantes de 
imunoglobulinas humanas.
Proteínas recombinantes para fins 
terapêuticos e vacinas
❖ Hormônios: insulina, hormônio de 
crescimento bovino e eritropoietina.
❖ Proteínas plasmáticas: fator VIII, 
ativador de plasminogênio tecidual.
❖ Citocinas: interferons, 
interleucinas, fator estimulador de 
colônias.
❖ Anticorpos e vacinas recombinantes
Imunofluorescência (IF)
- São empregados conjugados constituídos 
de anticorpos ou antígenos ligados 
covalentemente a moléculas reveladoras 
denominadas Fluorocromos.
- Fluorocromos: absorvem luz em 
comprimento de onda baixo e elevada 
energia e emitem luz em comprimento de 
onda maior, de menor energia 
(fluorescência).
- Isotiocianato de fluorescência, 
lissamina-rodamina B, vermelho de Texas, 
fisioeritrina.
- Imunofenotipagem: identificação 
simultânea de marcadores celulares.
Aplicação
- Imunofenotipagem de células, por 
métodos diretos e indiretos (anticorpos 
monoclonais ou análise de DNA e RNA). 
- Avaliar propriedades biológicas: 
viabilidade e fase do ciclo celular.
- Avaliar propriedades químicas: pH 
intracelular.
- Avaliar propriedades físicas.
Imunoenzimáticos
>< São técnicas que permitem medidas 
quantitativas diretas da interação 
antígeno-anticorpo por medida de atividade 
enzimática sobre um substrato.
>< Substitui o radioimunoensaio devido à 
comparável sensibilidade, estabilidade dos 
reagentes, possibilidade de utilização em 
grande variedade de sistemas de detecção.
>< Substratos cromogênicos: sob ação 
enzimática originam produtos coloridos, 
solúveis ou insolúveis cuja quantificação é 
feita pela medida da densidade óptica (DO).
>< Substratos fluorogênicos: substratos 
que após ação da enzima formam 
compostos que emitem luz fluorescente 
(fluoróforo).
>< Substrato Quimioluminescente: ensaios 
imunoenzimáticos que necessitem de 
amplificação do sinal (hormônios, 
marcadores tumorais). A enzima fosfatase 
alcalina age sobre o substrato adamantis 
dioxetano-fosfato, formando um ânion que é 
instável e emite brilho (glow) prolongado de 
luz, e que é medido em luminômetro.
ELISA direto ou Sanduiche
ELISA indireto
Índice de avidez IgG
- Força de ligação do epítopo pelo sítio 
combinatório: afinidade.
- Avidez: Medida da estabilidade geral dos 
complexos entre antígeno e anticorpo e 
depende de 3 fatores: afinidade intrínseca 
do anticorpo pelo epítopo, valência do 
anticorpo e do antígeno e, o arranjo 
geométrico dos componentes interagindo.
- Baixa avidez: fase aguda ou recente.
- Alta avidez: resposta de memória ou 
secundária.
- IA= (DO amostra tratada/ DO amostra 
não tratada) x 100.
ELISA captura de IgM
ELISA - resultado final
Resultados
>> Determinar o limite de reatividade do 
teste ou cut off.
>> Razão entre os valores da amostra e um 
valor médio do grupo controle.
>> Título.
>> Concentração.
ELISA
Resultado qualitativo:
-> Resultado da amostra é 14,5 vezes 
maior que o cut off da placa: Positivo.
ELISA - quantitativo
Dot - ELISA ou Immunodot
Substrato cromogênico deve formar um 
produto estável e insolúvel, na forma de 
“mancha” colorida.
SDS- PAGE LAEMMLI, 1970
>> Detergente aniônico sódio dodecil 
sulfato (SDS)- confere carga negativa às 
proteínas, facilitando a separação por PM. 
>> Agentes dissociantes quebram as 
proteínas: uréia, EDTA e 2 
b-mercaptoetanol.
>> Gel de empilhamento (pH=6,8) = 
proteínas lineares
Após separação eletroforética as proteínas 
são transferidas para membrana de 
nitrocelulose.
Aplicações
>> Determinar a pureza do antígeno.
>> Determinar quais proteínas estão sendo 
reconhecidas por um anticorpo.
>> Distinguir diferentes perfis de 
anticorpos, de acordo com a fase da 
doença.
>> É empregado na pesquisa de antígenos e 
anticorpos auxiliando no diagnóstico de 
doenças infecciosas.