Aula 1 - Introdução à Microbiologia Clínica

Prévia do material em texto

<p>DESCRIÇÃO</p><p>Conceitos gerais de bacteriologia, testes de sensibilidade e métodos de coloração.</p><p>PROPÓSITO</p><p>Compreender as características gerais das bactérias, reconhecer os tipos de testes de</p><p>sensibilidade e distinguir as principais técnicas de coloração bacteriana é importante, pois</p><p>facilitará a execução de procedimentos na microbiologia clínica.</p><p>OBJETIVOS</p><p>MÓDULO 1</p><p>Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que afetam o</p><p>crescimento bacteriano</p><p>MÓDULO 2</p><p>Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de sensibilidade aos</p><p>antimicrobianos</p><p>MÓDULO 3</p><p>Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática laboratorial</p><p>INTRODUÇÃO</p><p>A Microbiologia é a ciência que estuda os organismos microscópicos, suas características e</p><p>atividades, sendo as bactérias, os fungos, as algas e os protozoários os principais organismos</p><p>estudados. Muitas bactérias são agentes infecciosos responsáveis por uma série de doenças</p><p>nos seres humanos, podendo levar ao óbito dos indivíduos. Além disso, existe um grupo de</p><p>bactérias multirresistentes aos antimicrobianos, não apresentando nenhum tipo de opção</p><p>terapêutica.</p><p>A análise da morfologia, estrutura e metabolismo das bactérias é essencial para a</p><p>compreensão e a identificação correta do tipo bacteriano, seja através do crescimento</p><p>microbiano em meio de cultura adequado, ou através das técnicas de coloração, ou para</p><p>investigar resistência a um ou mais antibióticos utilizados na clínica por meio dos testes de</p><p>sensibilidade.</p><p>Você sabe por que algumas bactérias são classificadas como cocos gram-positivos e outras</p><p>gram-negativas? Você sabe a diferença entre meios de culturas enriquecidos e seletivos?</p><p>Como verifica-se a resistência aos antimicrobianos? Vamos juntos decifrar e explorar mais</p><p>sobre a microbiologia clínica?</p><p>MÓDULO 1</p><p> Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que afetam o</p><p>crescimento bacteriano</p><p>MORFOLOGIA BACTERIANA</p><p>As bactérias podem apresentar diferentes morfologias, que caracterizam determinados gêneros</p><p>ou grupos de bactérias. A análise da morfologia bacteriana auxilia na identificação e condução</p><p>da escolha dos testes de identificação do tipo de bactéria, isolada a partir de espécimes</p><p>clínicos.</p><p>As bactérias são classificadas morfologicamente de acordo com o tamanho, forma e arranjo e</p><p>consistem nos menores seres vivos, da ordem de milésimos de milímetro e, portanto, visíveis</p><p>apenas com a ajuda de um microscópio.</p><p>Enquanto células animais e vegetais podem ter até dezenas de micrômetros, a maioria das</p><p>bactérias estudadas nos laboratórios de microbiologia medem em torno 1,0 µm de diâmetro.</p><p>Fonte: angellodeco/Shutterstock</p><p>javascript:void(0)</p><p>ΜM</p><p>Micrômetro: Unidade de comprimento onde 1,0 µm equivale a 1000 mm, ou seja, igual a</p><p>1 x 10-6 m).</p><p>Você sabe quais são os formatos que as bactérias podem se apresentar?</p><p>As bactérias podem se apresentar em três morfologias (Figura 1):</p><p>Fonte: Sakurra/Shutterstock</p><p> Figura 1 - Morfologia das bactérias: cocos, bacilos e espiraladas.</p><p>COCOS</p><p>Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock</p><p> Bactérias em formas de cocos.</p><p>Bactérias com formato esférico ou oval e que, de acordo com a sua divisão celular, são</p><p>exemplos de cocos de importância médica, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp,</p><p>Streptococcus sp., Neisseria sp. Esses cocos podem se apresentar em diferentes arranjos:</p><p>DIPLOCOCOS</p><p>Agrupamento de dois cocos. Os Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são diplococos que</p><p>podem causar pneumonia, meningite, sinusite e infecção do ouvido médio. Outro exemplo é a</p><p>Neisseria gonorrhoeae agente etiológico da gonorreia.</p><p>ESTREPTOCOCOS</p><p>Vários cocos agrupados em cadeia, lembrando um colar de pérolas. As infecções</p><p>estreptocócicas, causadas por várias espécies de Streptococcus, podem desencadear diversos</p><p>sintomas, como: pneumonia, faringite, febre escarlatina, impetigo e celulite.</p><p>TÉTRADES</p><p>Agrupamento de 4 cocos de forma semelhante a um quadrado.</p><p>Exemplo: Micrococcus spp., normalmente, não são patogênicos e integram a microbiota.</p><p>O aparecimento em uma cultura de sangue (hemocultura) desse tipo de bactéria é sugestivo de</p><p>contaminação, que pode ter ocorrido no momento da coleta.</p><p>SARCINAS</p><p>Agrupamento de 8 cocos unidos de forma semelhante a um cubo. Exemplo: Sarcina ventriculi,</p><p>um importante patógeno em gatos, cachorros e bovinos. Em humanos, o potencial patogênico</p><p>ainda não é muito bem elucidado, mas tem sido isolado em biopsias gástricas e relacionados</p><p>com algumas doenças, como gastrite enfisematosa e perfuração gástrica.</p><p>Essa bactéria não é fácil de isolar e cultivar em laboratório de microbiologia. Assim, para o</p><p>diagnóstico de gastrite provocada por essa bactéria recomenda-se o exame histopatológico</p><p>com colorações de Hematoxilina e eosina.</p><p>ESTAFILOCOCOS</p><p>Cocos agrupados de forma semelhante ao cacho de uvas. Como exemplo, temos as infecções</p><p>por bactérias do gênero Staphylococcus aureus, que causam infecções cutâneas (foliculite,</p><p>impetigo, abcessos, celulite), pneumonia, infecções na corrente sanguínea e osteomielite.</p><p>BASTONETES OU BACILOS</p><p>Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock</p><p> Bastonetes.</p><p>São bactérias que apresentam um formato cilíndrico ou de bastão (bastonete), podendo ser</p><p>curtas ou longas e apresentar extremidade reta ou de ponta arredondada. Normalmente, os</p><p>bacilos não se agrupam em tantos arranjos como os cocos, apresentando-se, na maioria das</p><p>vezes, de forma isolada. Entretanto, podem apresentar-se, eventualmente, como diplobacilos</p><p>ou estreptobacilos.</p><p>DIPLOBACILOS</p><p>Agrupamento de dois bacilos.</p><p>Em alguns casos, como o da Corynebacterium diphtheriae causadora da difteria, os</p><p>bastonetes podem também apresentar arranjos diferenciados, como crescimento em</p><p>paliçada ou letras chinesas.</p><p>ESTREPTOBACILOS</p><p>Agrupamento em cadeia.</p><p>Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p> C. diphteriae.</p><p>Fonte: SIRIKWAN DOKUTA/Shutterstock</p><p> Bacilos gram-positivos com agrupamento de letras chinesas.</p><p>Algumas doenças causadas por bactérias em formato de bastonete ou bacilos, são:</p><p>Tétano - Clostridium tetani</p><p>Tuberculose - Mycobacterium tuberculosis</p><p>Difteria - Bacilo diftérico</p><p>Hanseníase (lepra) - Mycobacterium leprae</p><p>É importante destacar que, durante a análise microscópica, alguns bacilos podem ser</p><p>confundidos com cocos, isso ocorre pois são bacilos muito curtos. Esses bacilos curtos são</p><p>chamados de cocobacilos.</p><p>ESPIRALADAS</p><p>Fonte: Tatiana Shepeleva/Shutterstock</p><p> Bactérias espiraladas.</p><p>Bactérias com formato espiralado ou helicoidal e que ocorrem, predominantemente, como</p><p>células isoladas. Elas podem ser divididas em espirilos, espiroquetas e vibriões, conforme</p><p>observado na Figura 2.</p><p>Fonte: Olga Bolbot/Shutterstock</p><p> Figura 2 - Formas de bactérias espiraladas.</p><p>ESPIRILOS</p><p>São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos), apresentam formato espiral e corpo rígido.</p><p>Ex: Spirillum minus, que causa Febre da mordedura do rato em humanos e macacos.</p><p>ESPIROQUETAS</p><p>São móveis, mas se locomovem por contrações citoplasmáticas, apresentam formato em</p><p>espiral e são mais flexíveis; Ex: Treponema pallidum.</p><p>O T. pallium é o agente etiológico da sífilis, uma infecção bacteriana de transmissão sexual e</p><p>vertical. Quando não tratada, pode evoluir para formas mais graves, comprometendo</p><p>especialmente os sistemas nervoso e cardiovascular. Para o diagnóstico da sífilis, podemos</p><p>utilizar:</p><p>Métodos diretos a partir de materiais coletados das lesões primárias causadas por essa</p><p>bactéria, que permite a visualização do treponema vivo e móvel.</p><p>Pode ser feito com material fixado seguido de coloração (pelo método de Fontana de</p><p>Tribondeau), mas é de difícil visualização.</p><p>Pelos testes imunológicos para detecção de anticorpos-antitreponêmicos (mais</p><p>empregado).</p><p>VIBRIÕES</p><p>São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos) apresentam formato de vírgula. Ex: Vibrio</p><p>cholerae, também conhecido como vibrião colérico, é o agente causador da cólera.</p><p>CITOLOGIA BACTERIANA</p><p>As bactérias pertencem</p><p>pelo calor,</p><p>amplamente utilizado para as outras colorações, pode levar a contração da célula e a formação</p><p>de um halo ao redor do microrganismo, que pode ser facilmente confundido com a cápsula.</p><p>Entretanto, é possível visualizar bactérias produtoras de cápsula a partir da coloração pela tinta</p><p>da china. Essa coloração é conhecida como coloração negativa, pois a cápsula rejeita as</p><p>partículas do corante. Se as bactérias apresentarem cápsula, será possível verificar</p><p>microrganismos descoradas envoltas por um halo (cápsula) sobre um fundo negro.</p><p>Vamos conhecer um pouco mais a coloração da tinta da China?</p><p>A seguir, o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):</p><p>Método da tinta da China (coloração negativa)</p><p>As colônias suspeitas devem ser cultivadas em caldo rico (BHI).</p><p>Colocar 1 ou 2 gotas de cultura em uma lâmina.</p><p>Depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas de cultura.</p><p>Cobrir com uma lamínula, comprimindo-a entre folhas de papel de filtro, para se obter</p><p>uma quantidade bem tênue de corante e material.</p><p>Observar ao microscópio óptico (40X).</p><p> Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal</p><p>VERIFICANDO O APRENDIZADO</p><p>1. VERIFICAMOS QUE A COLORAÇÃO DE GRAM É UMA TÉCNICA</p><p>SIMPLES, RÁPIDA E SE BASEIA NA COMPOSIÇÃO DA PAREDE</p><p>CELULAR DAS BACTÉRIAS. A RESPEITO DESTA TÉCNICA, ASSINALE A</p><p>AFIRMATIVA CORRETA:</p><p>A) As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona permanecem roxas.</p><p>B) As bactérias gram-negativas apresentam uma parede celular constituída por uma fina</p><p>camada de peptideoglicanos revestida por ácido micólico e uma membrana externa.</p><p>C) Os bacilos álcool ácido resistentes são preferencialmente corados pela técnica de Gram.</p><p>D) O lugol aumenta a afinidade da bactéria para o corante cristal violeta induzindo a formação</p><p>de um composto roxo nas bactérias gram-positivas.</p><p>2. ESTUDAMOS QUE A COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN É UMA</p><p>TÉCNICA QUE PERMITE A COLORAÇÃO DE UM GRUPO DE BACTÉRIAS</p><p>QUE POSSUEM PAREDE CELULAR CONSTITUÍDA POR</p><p>PEPTIDEOGLICANOS, SEGUIDA DE UMA CAMADA FORMADA POR</p><p>POLÍMEROS DE ARABINOGALACTANO E REVESTIDA POR UMA</p><p>PORÇÃO LIPÍDICA DE ÁCIDOS MICÓLICOS. A RESPEITO DESTA</p><p>TÉCNICA, QUAL MICRORGANISMO É CORADO POR ESTE MÉTODO DE</p><p>COLORAÇÃO?</p><p>A) Streptococcus sp.</p><p>B) Treponema sp.</p><p>C) Mycobacterium tuberculosis</p><p>D) Corynebacterium diphtheria</p><p>GABARITO</p><p>1. Verificamos que a coloração de Gram é uma técnica simples, rápida e se baseia na</p><p>composição da parede celular das bactérias. A respeito desta técnica, assinale a</p><p>afirmativa CORRETA:</p><p>A alternativa "D " está correta.</p><p>As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona perdem a cor corando com</p><p>o corante de fundo (Safranina ou fucsina de Gram). As bactérias gram-negativas apresentam</p><p>parede celular constituída por uma fina camada de peptideoglicanos, uma membrana externa e</p><p>lipopolissacarídeos. Os bacilos álcool ácido resistentes são corados pela técnica de ZIEHL-</p><p>NEELSEN.</p><p>2. Estudamos que a coloração de Ziehl-Neelsen é uma técnica que permite a coloração</p><p>de um grupo de bactérias que possuem parede celular constituída por peptideoglicanos,</p><p>seguida de uma camada formada por polímeros de arabinogalactano e revestida por uma</p><p>porção lipídica de ácidos micólicos. A respeito desta técnica, qual microrganismo é</p><p>corado por este método de coloração?</p><p>A alternativa "C " está correta.</p><p>Os Bacilos-Álcool-Ácido-Resistente (BAAR) possuem a capacidade de álcool-ácido-resistência</p><p>relacionada à hidrofobicidade da parede celular, assegurada pela presença de lipídeos como o</p><p>ácido micólico e podem ser visualizadas pela coloração de Ziehl-Neelsen. Um exemplo de</p><p>BAARs são o grupo das micobactérias, como M. tuberculosis.</p><p>CONCLUSÃO</p><p>CONSIDERAÇÕES FINAIS</p><p>Ao longo desta jornada, compreendemos as características gerais das bactérias e</p><p>relacionamos a sua morfologia e estruturas celulares com as diferentes técnicas de coloração,</p><p>importantes e muito utilizadas nos laboratórios clínicos para identificação ou distinção de</p><p>grupos bacterianos. Além disso, entendemos como os diferentes meios de cultura são úteis</p><p>para identificação e crescimento bacteriano, bem como as vantagens e desvantagens de cada</p><p>tipo de teste de sensibilidade a antimicrobianos, os quais permitem investigar resistência a um</p><p>ou mais antibióticos utilizados na clínica.</p><p>AVALIAÇÃO DO TEMA:</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>JORGENSEN, J. H.; FERRARO, M. J. Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General</p><p>Principles and Contemporary Practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 2009. p. 1749–</p><p>1755.</p><p>MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M. & PARKER, J. Microbiologia de Brock. 10 ed. São Paulo:</p><p>Pearson Education, 2008.</p><p>MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e Estrutura e Síntese</p><p>da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5. ed. Elsevier, 2006. cap. 3, p. 11-24.</p><p>MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e Estrutura e Síntese</p><p>da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5 ed. Elsevier, 2006. cap. 4, p. 25-34.</p><p>NCCLS. M2-A8—Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved</p><p>Standard—Eighth Edition (ISBN 1-56238-485-6).</p><p>OPLUSTIL, C.P.; ZOCCOLI, C.M.; TOBOUTI, N.R.; SINTO, I.S. Procedimentos básicos em</p><p>microbiologia clínica. 2 ed. São Paulo: Sarvier, 2004.</p><p>TEVA, A.; MORAES, A.M.L.; RIBEIRO, F.C.; et al. Bacteriologia. In: MOLINARO, E.M.;</p><p>CAPUTO, L.F.G.; AMENDOEIRA, M.R.R. (Orgs). Conceitos e Métodos para formação de</p><p>profissionais em laboratórios de saúde: v 4. Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2009. cap.3,</p><p>p.221-398.</p><p>TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R. & CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. São Paulo: Artmed,</p><p>2017.</p><p>ROSSI, F. Cocos Gram-positivos: Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. e Streptococcus</p><p>pneumoniae e os principais mecanismos de resistência. In: Rossi F. & Andreazzi D.B. (Orgs).</p><p>Interpretando o antibiograma. São Paulo: Atheneu, 2005. p. 27-63.</p><p>EXPLORE+</p><p>Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:</p><p>Pesquise:</p><p>Como o Dr. Alvin Fox, Professor da University of South Carolina School of Medicine</p><p>aborda as características bacterianas no artigo A célula bacteriana.</p><p>Como Denise Spolidorio, Cristiane Duque e Helvécio Póvoa abordam as características</p><p>da morfologia e citologia bacteriana no capítulo 1 - Morfologia microbiana, do livro</p><p>Microbiologia e Imunologia Geral e Odontológica.</p><p>Como Ana Cristina Gales, Eliete Aguiar de Miranda Frigatto e Soraya Sgambatti de</p><p>Andrade abordam os Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos – módulo 5.</p><p>Visite o site do Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BrCast) que</p><p>tem como missão determinar e rever os pontos de corte para interpretação dos testes de</p><p>sensibilidades no Brasil. Além disso, ele disponibiliza os pontos de cortes dos</p><p>antimicrobianos e manuais de forma gratuita.</p><p>Assista:</p><p>Reino Monera - O crescimento bacteriano e a função exponencial, vídeo que aborda as</p><p>fases do crescimento microbiano.</p><p>Cultivando microrganismos, vídeo que aborda condições do crescimento bacteriano.</p><p>Exigências nutricionais – Microbiologia, vídeo que aborda os principais meios de cultura e</p><p>sua preparação em laboratório.</p><p>Coloração de Gram, animação que explica todo o passo a passo da coloração.</p><p>Coloração de Ziehl Neelsen: Baciloscopia (Microbiologia) - Bio Aulas, vídeo que aborda</p><p>as principais características da coloração de BAAR.</p><p>Coloração de Ziehl-Neelsen, vídeo produzido pelo CONECTAMICRO da UFF que aborda</p><p>a fundamentação teórica e como realizar esta técnica de coloração utilizada para</p><p>visualização de bacilos álcool-ácido resistentes.</p><p>Leia:</p><p>A notícia Qual a finalidade dos meios de cultura em microbiologia? Publicado por KASVI</p><p>distribuidora.</p><p>O capítulo 3 do manual da Anvisa: Descrição dos meios de cultura empregados nos</p><p>exames microbiológicos.</p><p>O artigo científico escrito por Angelo Trento intitulado Colorações usadas em</p><p>Microbiologia.</p><p>CONTEUDISTA</p><p>Alice Maria de Magalhães Ornelas</p><p> CURRÍCULO LATTES</p><p>javascript:void(0);</p><p>ao grupo dos procariotos e, portanto, não possuem membrana nuclear</p><p>(carioteca), bem como não possuem todo o conjunto de organelas das células eucarióticas.</p><p>Entretanto, possuem elementos estruturais de grande importância, como a parede celular, que</p><p>pode ser corada, permitindo o profissional da saúde identificar e diferenciar os principais</p><p>grupos de bactérias.</p><p>PAREDE CELULAR</p><p>Você sabe por que a parede celular é uma estrutura tão relevante para as bactérias?</p><p>Ela é importante na divisão celular, é responsável pela forma, rigidez da bactéria e confere</p><p>proteção osmótica entre os meios externo e interno.</p><p>A parede celular possui uma espessura de, aproximadamente, 10 a 20 µm, é porosa,</p><p>permitindo a passagem de metabólitos para a membrana plasmática, é formada por camadas</p><p>rígidas de peptidoglicanos (mureína), e envolve a membrana citoplasmática da maioria dos</p><p>procariotos.</p><p>As bactérias são classificadas em gram-positivas ou em gram-negativas, de acordo com a cor</p><p>de sua parede celular após a realização da coloração de Gram.</p><p>A divisão desses dois grupos de bactérias é essencial em um laboratório de microbiologia</p><p>clínica. A identificação microscópica de bactérias gram-positivas ou gram-negativas, além de</p><p>direcionar os testes de identificação, também permitem que o médico inicie o tratamento</p><p>empiricamente, antes mesmo de sair o resultado da cultura e do antibiograma, que demora, no</p><p>mínimo, 48 horas.</p><p>BACTÉRIA GRAM-POSITIVA</p><p>Possui uma parede celular mais espessa, com múltiplas camadas de peptideoglicanos (Figura</p><p>3), revestindo a membrana citoplasmática. Além disso, possui outros componentes, como os:</p><p>ÁCIDOS TEICOICOS</p><p>ÁCIDOS LIPOTEICOICOS</p><p>ÁCIDOS TEICOICOS</p><p>Polímeros de fosfato de poliol, ligados covalentemente ao peptideoglicano, essenciais para a</p><p>viabilidade da célula e considerados fatores importantes na virulência.</p><p>ÁCIDOS LIPOTEICOICOS</p><p>Possuem um ácido graxo e estão ancorados na membrana plasmática. São considerados</p><p>antígenos de superfície, permitem a distinção dos sorotipos bacterianos e a aderência nas</p><p>superfícies das células hospedeiras.</p><p>javascript:void(0)</p><p>VIRULÊNCIA</p><p>A capacidade de um microrganismo de produzir danos que são fatais ou graves, podendo</p><p>levar ao óbito (diferente de Patogenicidade que é a capacidade de uma bactéria de</p><p>desenvolver uma doença (dano) em um determinado organismo). São exemplos de</p><p>fatores de virulências: capacidade de multiplicar, produção de toxinas, produção de</p><p>proteínas e enzimas que auxiliam a fuga dos mecanismos de defesa do organismo,</p><p>dentre outros.</p><p>Dentre as bactérias gram-positivas, temos as que são partes da microbiota normal do</p><p>organismo e que, geralmente, não causam doenças e temos aquelas que são patogênicas,</p><p>causando difteria, carbúnculo, listeriose, septicemia, pneumonia, entre outros tipos de infecção.</p><p>Fonte: Designua/Shutterstock</p><p> Figura 3 - Estrutura básica da parede celular gram-positiva.</p><p>BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA</p><p>Apresenta a parede celular com uma estrutura mais complexa e, quimicamente, diferente</p><p>quando comparada à parede celular de gram-positiva (ver Figura 4). Esta parede celular é</p><p>composta de uma fina camada de peptideoglicanos (5-10% do peso da parede celular) e</p><p>externamente a esta fina camada, encontramos uma membrana externa.</p><p> ATENÇÃO</p><p>1) O espaço entre membranas é conhecido como espaço periplasmático.</p><p>2) A membrana externa está presente apenas nas bactérias gram-negativas.</p><p>MEMBRANA EXTERNA</p><p>A membrana externa além de manter a estrutura bacteriana é uma barreira de permeabilidade,</p><p>confere proteção contra condições ambientais adversas, como as do sistema digestivo do</p><p>hospedeiro e resistência a alguns antimicrobianos como a penicilina. Essa membrana é</p><p>formada por uma dupla camada lipídica, onde a camada interna é constituída basicamente de</p><p>fosfolipídios e a camada externa possui uma molécula anfipática, o lipopolissacarídeo (LPS) ou</p><p>endotoxina e proteínas.</p><p>O LPS é essencial para a viabilidade das bactérias, funciona como um potente indutor de</p><p>respostas imunológicas, ativando linfócitos B e induzindo a produção de citocinas por</p><p>macrófagos, células dendríticas e outras células. Por outro lado, provoca febre e pode causar</p><p>choque endotoxêmico, sendo chamado também de endotoxina. As proteínas permitem a</p><p>difusão de metabolitos pequenos, antibióticos hidrofílicos, têm função estrutural e atuam como</p><p>receptoras para bacteriófagos e outros ligantes.</p><p>LPS</p><p>O LPS é composto de três secções estruturais: o Lipídeo A, o núcleo polissacarídeo e o</p><p>antígeno O. O lipídeo A é responsável pelos efeitos tóxicos do LPS.</p><p>As bactérias gram-negativas podem causar uma série de infecções graves nos seres humanos,</p><p>como peritonite, pneumonia, infecções urinárias, meningite, dentre outras. É importante</p><p>ressaltar que essas bactérias estão cada vez mais resistentes aos antimicrobianos disponíveis</p><p>para utilização terapêutica.</p><p>javascript:void(0)</p><p>Fonte: Designua/Shutterstock</p><p> Figura 4 - Estrutura básica da parede celular Gram-negativa.</p><p> ATENÇÃO</p><p>Exceções bacterianas</p><p>1) Micobactérias: Bacilos que apresentam a camada de peptideoglicanos da parede celular</p><p>com estrutura um pouco diferente, pois é formada por polímeros de arabinogalactano e</p><p>revestida por uma capa lipídica cerosa de ácidos micólicos. Devido ao caráter hidrofóbico da</p><p>parede celular destas bactérias, a coloração pelo método de Gram não é a de escolha quando</p><p>se deseja pesquisar esse tipo de bactéria. No entanto, elas poderão ser diferenciadas pela</p><p>característica de álcool-ácido resistência (coloração de Ziehl Neelsen). Exemplo.</p><p>Mycobacterium tuberculosis (bacilo da tuberculose). (Figura 5).</p><p>Fonte: Wikimedia</p><p> Figura 5 - Estrutura da parede celular de micobactérias.</p><p>2) Micoplasmas: São as menores bactérias encontradas na natureza (cerca de 0,3 µm), não</p><p>apresentam parede celular e incorporam esteróis do hospedeiro em sua membrana (Figura 6).</p><p>O Mycoplasma pneumoniae é um agente causador comum de pneumonia.</p><p>ESTERÓIS</p><p>Esteróis conferem a membrana celular fluidez e permeabilidade. Essas moléculas estão</p><p>presentes na maioria das células eucariotas, na forma de colesterol.</p><p>Fonte: Designua/Shutterstock</p><p> Figura 6: Citologia do Micoplasma.</p><p>javascript:void(0)</p><p>MEMBRANA CELULAR OU MEMBRANA</p><p>CITOPLASMÁTICA BACTERIANA</p><p>A membrana citoplasmática das bactérias é semipermeável, seletiva, contém várias enzimas,</p><p>limita o citoplasma, é constituída de fosfolipídios e proteínas e, portanto, considerada</p><p>semelhante à membrana plasmática dos organismos eucarióticos, exceto pelo fato de não</p><p>possuírem esteróis.</p><p>Citoplasma: O citoplasma da célula bacteriana pode ser dividido em diferentes regiões:</p><p>Citoplasmática: rica em RNA; partículas proteicas e ribossomos (responsáveis pela</p><p>síntese proteica).</p><p>Cromatínica: rica em DNA circular dupla fita.</p><p>Porção fluída, com nutrientes dissolvidos.</p><p> ATENÇÃO</p><p>Algumas bactérias, como o Vibrio cholerae, podem possuir mais de um DNA; e outras, como a</p><p>Borrelia burgdorferi, possuem um DNA linear).</p><p>ELEMENTOS ACESSÓRIOS</p><p>São estruturas que podem estar ou não presentes em determinadas bactérias. Vários desses</p><p>elementos acessórios são importantes na virulência, patogenicidade e resistência bacteriana.</p><p>Fonte: Wikipedia</p><p> Estrutura celular bacteriana.</p><p>GLICOCÁLICE</p><p>O glicocálice consiste em um revestimento de polissacarídeos. Quando o glicocálice apresenta</p><p>estrutura uniforme e encontra-se firmemente aderido à parede celular é denominado de</p><p>cápsula. Quando as camadas de polissacarídeos possuem pouca aderência e apresentam</p><p>espessura não uniforme, são chamadas de camada viscosa. Essa estrutura, além de fornecer</p><p>um envoltório protetor, evita a fagocitose pelas células de defesa do organismo, atua como</p><p>reservatório de nutrientes e, principalmente, auxilia na aderência bacteriana a algumas</p><p>superfícies. Exemplo: o Streptococcus mutans, que através da cápsula fixa e perfura o esmalte</p><p>dentário.</p><p>A determinação dos constituintes da cápsula é fundamental na identificação de certas bactérias</p><p>patogênicas, uma vez que algumas</p><p>cápsulas são compostas de polipeptídios, ao invés de</p><p>polissacarídeos, como ocorre com o Bacillus anthracis (agente do carbúnculo/ antrax).</p><p>PLASMÍDEO</p><p>Corresponde a um DNA circular extracromossomal, capaz de se replicar de forma autônoma,</p><p>localizado no citoplasma da célula bacteriana e que não é responsável por características</p><p>essenciais da bactéria. Podem se apresentar em várias cópias, além de possuir a capacidade</p><p>de conferir vantagens adaptativas (por exemplo, resistência a antibióticos), podendo, inclusive,</p><p>ser transferidos para outras bactérias.</p><p>GRÂNULOS OU INCLUSÕES CITOPLASMÁTICAS</p><p>São grânulos cuja função é de armazenamento, podendo ser de glicogênio, amido, fosfatos,</p><p>enxofre etc. e podem ser visualizados através de colorações especiais, pois, geralmente, são</p><p>refringentes.</p><p>FLAGELOS</p><p>São estruturas de locomoção presentes em algumas bactérias, formadas por subunidades</p><p>proteicas acopladas na forma helicoidal (flagelina) e que permitem às bactérias “irem” em</p><p>busca de nutrientes ou fugir de substâncias tóxicas. O flagelo fica ancorado na membrana</p><p>citoplasmática através do seu corpo basal (similar a um gancho), possui um comprimento</p><p>geralmente muito maior que o da célula, e podem ser únicos ou múltiplos, polares (apenas nas</p><p>extremidades) ou peritríquios (em todo corpo bacteriano). Embora os flagelos não possam ser</p><p>visualizados, normalmente, no microscópio óptico, existem técnicas de coloração que os</p><p>tornam visíveis no microscópio óptico e os microbiologistas usam como auxílio no diagnóstico.</p><p>Durante a identificação de uma bactéria, a avaliação da motilidade pode ser utilizada para</p><p>diferenciar espécies de bactérias. Exemplo: Em uma cultura de fezes (coprocultura), a</p><p>presença de bactérias gram-negativas imóveis é indicativa de Shigella sp. e móveis de</p><p>Salmonella sp.</p><p>PILI E FÍMBRIAS</p><p>As fímbrias são estruturas filamentosas, que lembram fios de cabelo no lado de fora da</p><p>bactéria, compostas por subunidades proteicas (pilina), que se projetam a partir da superfície</p><p>de uma célula e, geralmente, estão em maior quantidade do que os flagelos. As fímbrias</p><p>auxiliam na colonização das membranas de mucosas como ocorre no caso da Neisseria</p><p>gonorrhoeae, agente causador da gonorreia e, no caso da E. coli, nas células do trato urinário.</p><p>Os pili sexuais de uma bactéria se ligam a outras bactérias permitindo a transferência de</p><p>material genético na conjugação bacteriana. Esse pili sexuais são codificados por um</p><p>plasmídeo.</p><p>ESPOROS (ENDOSPOROS)</p><p>Produzidos por alguns gêneros de bactérias, como Bacillus e Clostridium, os esporos são uma</p><p>estrutura resistente a agentes físicos e químicos, que é formada em resposta ao meio</p><p>ambiente, quando este se torna inadequado para a sobrevivência da bactéria (ex.: escassez de</p><p>água ou nutrientes). A resistência da forma esporulada possibilita que a bactéria sobreviva por</p><p>longos anos em ambientes desfavoráveis, podendo reverter à forma vegetativa quando o local</p><p>se tornar viável novamente para sua sobrevida. Cada célula forma um único esporo, que é</p><p>liberado quando a bactéria morre.</p><p>FATORES DE VIRULÊNCIA E</p><p>PATOGENICIDADE DE BACTÉRIAS</p><p>FASES DE CRESCIMENTO E FATORES QUE</p><p>AFETAM O CRESCIMENTO BACTERIANO</p><p>As bactérias, quando inoculadas em meio de cultura adequado e em condições apropriadas,</p><p>iniciam processo de duplicação bacteriana, no qual por divisão binária, ocorre aumento da</p><p>população de forma logarítmica. O tempo de geração, ou seja, o tempo necessário para que</p><p>uma bactéria se duplique varia de acordo com a espécie bacteriana, podendo ser</p><p>extremamente curto (E. coli ± 15 minutos) ou bastante longo (M. tuberculosis ± 932 minutos).</p><p> SAIBA MAIS</p><p>Para uma cultura de micobactéria ser considerada negativa, temos que esperar, no mínimo, 45</p><p>dias de incubação e não ser visualizado nenhum crescimento.</p><p>Compreender que o crescimento bacteriano em um meio de cultura apresenta 4 fases, cada</p><p>uma com suas características peculiares, é de extrema importância para a escolha do meio de</p><p>cultura ideal e das técnicas para isolar e identificar as bactérias em uma rotina laboratorial.</p><p>Vamos conhecer essas fases?</p><p>Fonte: Wikimedia</p><p>FASE LAG</p><p>FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU EXPONENCIAL)</p><p>FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ</p><p>FASE DE DECLÍNIO OU MORTE</p><p>FASE LAG</p><p>Quando bactérias são adicionadas a um meio de cultura (semeadas), elas necessitam de um</p><p>tempo para se adaptar ao novo ambiente antes de começar a se dividir. Neste momento, não</p><p>há reprodução e a população permanece temporariamente inalterada. É importante ressaltar</p><p>que, nesta fase, as células não estão em latência, uma vez que aumentam no tamanho e</p><p>fisiologicamente estão muito ativas.</p><p>FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU EXPONENCIAL)</p><p>Nesta fase, as células iniciam a divisão que ocorre de forma exponencial, regular e constante.</p><p>A velocidade de crescimento é máxima nesta fase, e varia de acordo com a cepa e com as</p><p>condições ambientais.</p><p>FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ</p><p>Em determinando momento do crescimento bacteriano, haverá carência de nutrientes e</p><p>produção de substâncias tóxicas no meio, dessa forma, o número absoluto de bactérias no</p><p>meio de cultura permanecerá constante, resultado do equilíbrio entre bactérias que ainda estão</p><p>se duplicando e bactérias que estão morrendo.</p><p>FASE DE DECLÍNIO OU MORTE</p><p>Etapa que ocorre morte bacteriana, pois há falta de nutrientes e de espaço, aliada à toxidez do</p><p>ambiente que levam os microrganismos a morrerem mais rápido do que produzirem novas</p><p>células (a morte bacteriana nesta fase se dará de forma exponencial ou logarítmica). Sendo</p><p>assim, há uma progressiva morte celular até a cultura se tornar estéril.</p><p>FATORES AMBIENTAIS QUE AFETAM O</p><p>CRESCIMENTO BACTERIANO</p><p>Além de nutrientes apropriados, é necessário conhecer as condições físicas ambientais ideais</p><p>para o crescimento bacteriano em meio de cultura. Dentre estes, os principais fatores são:</p><p>TEMPERATURA</p><p>A temperatura ótima de crescimento é aquela que possibilita o maior crescimento, durante o</p><p>menor tempo e varia para cada gênero. As bactérias, no geral, são classificadas de acordo</p><p>com sua temperatura ótima de crescimento em:</p><p>BACTÉRIAS PSICRÓFILAS</p><p>Crescem melhor de 12°C e 20°C.</p><p>BACTÉRIAS MESÓFILAS</p><p>Crescem melhor de 25°C a 40°C. Neste grupo, está a maioria dos patógenos bacterianos de</p><p>importância clínica, já que nesta faixa encontra-se a temperatura do corpo humano.</p><p>BACTÉRIAS TERMÓFILAS</p><p>Crescem melhor de 45°C a 60°C.</p><p> SAIBA MAIS</p><p>A temperatura de crescimento também pode ser usada durante a identificação bacteriana.</p><p>Exemplo: A N. gonorrhoeae e N. Meningitis não crescem na temperatura de 22°C, mas as</p><p>outras espécies de Neisseria sp. são capazes de crescer.</p><p>OXIGÊNIO</p><p>As bactérias podem ser divididas de acordo com a necessidade e a tolerância ao oxigênio:</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p>BACTÉRIAS AERÓBIAS ESTRITAS</p><p>Só crescem na presença de oxigênio. Ex.: Acinetobacter sp.</p><p>BACTÉRIAS ANAERÓBIAS FACULTATIVAS</p><p>Crescem tanto na presença quanto na ausência de oxigênio. Ex.: E. coli.</p><p>BACTÉRIAS MICROAERÓFILAS</p><p>Só crescem em ambiente contendo baixas concentrações de oxigênio (menores que as</p><p>encontradas no ar atmosférico). Ex.: Campylobacter sp.</p><p>BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ESTRITAS</p><p>Só conseguem crescer na ausência de oxigênio. Em contato com O2, o crescimento dessas</p><p>bactérias é inibido ou ocorre morte bacteriana. Ex.: Clostridium botulinum e Neisseria sp.</p><p> SAIBA MAIS</p><p>Quanto às espécies de Neisseria, o ideal é semear imediatamente após a coleta em meio</p><p>sólido, levar para a estufa 36 °C em jarra com vela ou com gerador de CO2 e umidade.</p><p>PH</p><p>Normalmente, a grande maioria das bactérias cresce bem em meios com pH neutro, em torno</p><p>de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espécies tolerarem variações de pH entre 4,0 e 9,0. Os meios</p><p>de cultura geralmente são tamponados para impedir mudanças bruscas de pH, decorrentes do</p><p>próprio metabolismo das bactérias.</p><p>PRESSÃO OSMÓTICA</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p>A pressão osmótica é a pressão que deve ser exercida</p><p>sobre um sistema para evitar que a</p><p>passagem de água por osmose, ou seja, para o meio mais concentrado ocorra. A parede</p><p>celular, além da rigidez, impede a entrada excessiva de água. Dessa forma, a pressão</p><p>osmótica dos meios de cultura pode afetar diretamente a viabilidade das bactérias. Meios de</p><p>cultura com pressões osmóticas menores comparado ao interior da bactéria, normalmente, não</p><p>afetam sua viabilidade. De forma diferente, meios de cultura com pressões osmóticas maiores</p><p>causam perda de água intracelular, trazendo efeito bacteriostático ou bactericida.</p><p>BACTERIOSTÁTICO</p><p>Bacteriostáticos são substâncias que inibem o crescimento e a reprodução bacteriana</p><p>sem provocar sua morte imediata, sendo reversível o efeito, uma vez retirada a droga.</p><p>BACTERICIDA</p><p>Bactericidas são substâncias capazes de matar ou lesar irreversivelmente as bactérias.</p><p> SAIBA MAIS</p><p>Halofismo - Certas bactérias isoladas de salmouras, pacotes de sal, alimentos e água do mar,</p><p>chamadas bactérias halofílicas ou halófitas obrigatórias, crescem apenas quando o meio</p><p>contém uma concentração inusitadamente elevada de sal (10% a 15%). Isto representa uma</p><p>resposta especial do microrganismo à pressão osmótica.</p><p>VERIFICANDO O APRENDIZADO</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p>1. (ADAPTADA DE IF RS -2018). AS POPULAÇÕES BACTERIANAS</p><p>SEGUEM UMA SÉRIE DE FASES DE CRESCIMENTO: LAG, LOGARÍTMICA</p><p>OU EXPONENCIAL, ESTACIONÁRIA E DE DECLÍNIO OU MORTE</p><p>CELULAR. ANALISE AS ASSERTIVAS ABAIXO:</p><p>I. A POPULAÇÃO REDUZ SEGUINDO TAXA LOGARÍTMICA.</p><p>II. OCORRE AUMENTO EXPONENCIAL DA POPULAÇÃO.</p><p>III. HÁ INTENSA ATIVIDADE DE PREPARAÇÃO PARA O CRESCIMENTO</p><p>POPULACIONAL, MAS SEM AUMENTO DA POPULAÇÃO BACTERIANA.</p><p>IV. AS MORTES MICROBIANAS SÃO EQUILIBRADAS PELA PRODUÇÃO</p><p>DE NOVAS CÉLULAS.</p><p>ASSINALE ÚNICA ALTERNATIVA CORRETA QUE RELACIONA</p><p>CORRETAMENTE AS ASSERTIVAS I, II, III E IV. COM AS FASES LAG, LOG,</p><p>ESTACIONÁRIA E DE MORTE CELULAR:</p><p>A) Declínio (I), Log (II), Lag (III), Estacionária (IV)</p><p>B) Estacionária (I), Lag (II), Log (III), Declínio (IV)</p><p>C) Estacionária (I), Log (II, Lag (III), Declínio (IV)</p><p>D) Declínio (I), Lag (II), Log (III), Estacionária (IV)</p><p>2. APRENDEMOS QUE A CITOLOGIA BACTERIANA PREVÊ ALGUNS</p><p>COMPONENTES BACTERIANOS COMO OBRIGATÓRIOS E OUTROS</p><p>COMO ELEMENTOS ACESSÓRIOS, PODENDO OU NÃO ESTAR</p><p>PRESENTES EM ALGUNS GRUPOS DE BACTÉRIAS E QUE,</p><p>FREQUENTEMENTE, ESTÃO ASSOCIADOS À VIRULÊNCIA,</p><p>PATOGENICIDADE, MOTILIDADE, ENTRE OUTRAS FUNÇÕES. ASSINALE</p><p>A AFIRMATIVA ABAIXO QUE CONTENHA APENAS EXEMPLOS DE</p><p>ELEMENTOS ACESSÓRIOS BACTERIANOS.</p><p>A) Parede Celular, Ribossomos, Glicocálice e Fímbrias sexuais.</p><p>B) Glicocálice, Plasmídeos, Flagelos e Ribossomos.</p><p>C) Plasmídeos, Grânulos citoplasmáticos, Citoplasma e Endosporos.</p><p>D) Pili, endósporos, Plasmídeos e Glicocálice.</p><p>GABARITO</p><p>1. (Adaptada de IF RS -2018). As populações bacterianas seguem uma série de fases de</p><p>crescimento: lag, logarítmica ou exponencial, estacionária e de declínio ou morte celular.</p><p>Analise as assertivas abaixo:</p><p>I. A população reduz seguindo taxa logarítmica.</p><p>II. Ocorre aumento exponencial da população.</p><p>III. Há intensa atividade de preparação para o crescimento populacional, mas sem</p><p>aumento da população bacteriana.</p><p>IV. As mortes microbianas são equilibradas pela produção de novas células.</p><p>Assinale única alternativa CORRETA que relaciona corretamente as assertivas I, II, III e</p><p>IV. com as fases lag, log, estacionária e de morte celular:</p><p>A alternativa "A " está correta.</p><p>A fase em que a população é reduzida de forma logarítmica – declínio. A fase de aumento</p><p>exponencial da população – log. A fase de preparação para o crescimento populacional, mas</p><p>sem aumento da população é a lag. A fase onde ocorre equilíbrio entre as mortes microbianas</p><p>e a produção de novas células é a estacionária.</p><p>2. Aprendemos que a citologia bacteriana prevê alguns componentes bacterianos como</p><p>obrigatórios e outros como elementos acessórios, podendo ou não estar presentes em</p><p>alguns grupos de bactérias e que, frequentemente, estão associados à virulência,</p><p>patogenicidade, motilidade, entre outras funções. Assinale a afirmativa abaixo que</p><p>contenha apenas exemplos de elementos acessórios bacterianos.</p><p>A alternativa "D " está correta.</p><p>Dentre os elementos acessórios estudados neste módulo, temos: plasmídeos, grânulos</p><p>citoplasmáticos, fímbrias, glicocálice, esporos e flagelos. Já os componentes obrigatórios,</p><p>temos: as membranas celulares, a parede celular (exceção dos micoplasmas), material</p><p>genético e ribossomos.</p><p>MÓDULO 2</p><p> Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de sensibilidade aos</p><p>antimicrobianos</p><p>MEIOS DE CULTURA: COMPOSIÇÃO E</p><p>CLASSIFICAÇÃO</p><p>Os meios de cultura são capazes de fornecer os nutrientes necessários para o crescimento e</p><p>desenvolvimento de microrganismos fora do seu habitat natural. Os meios de cultura</p><p>apresentam em sua composição diferentes macronutrientes (carbono, oxigênio, nitrogênio,</p><p>enxofre, fósforo e hidrogênio) e micronutrientes (ferro, zinco, manganês, cálcio, potássio, sódio,</p><p>cobre, cloro, cobalto, molibdênio, selênio, magnésio, entre tantos outros), necessários à síntese</p><p>biológica de novos organismos. Nos laboratórios clínicos, os meios de cultivo podem ser</p><p>comprados totalmente prontos ou então serem preparados.</p><p>javascript:void(0)</p><p>Fonte: angellodeco/Shutterstock</p><p>MEIO DE CULTURA</p><p>É qualquer substância, sólida, semissólida ou líquida que possua um conjunto de fontes</p><p>de nutrientes e que seja utilizada para o cultivo de microrganismos.</p><p>Após a coleta de uma amostra biológica, destinada para a cultura e/ou antibiograma, essa será</p><p>semeada em meios de culturas capazes de suprir as bactérias com as exigências nutricionais</p><p>mínimas, dentro das condições ambientais necessárias para o cultivo, possibilitando o</p><p>crescimento microbiano e a formação e visualização de colônias.</p><p>Durante a semeadura de uma amostra biológica, por exemplo, o líquor, em casos de suspeita</p><p>de meningite, deve-se conhecer os principais agente etiológicos dessa doença para escolher</p><p>os meios apropriados (com nutrientes específicos e pH), as condições ideais de crescimento,</p><p>como a presença e quantidade de oxigênio ou até mesmo a sua ausência. Todos esses</p><p>aspectos são essenciais para auxiliar na identificação bacteriana e na conclusão diagnóstica.</p><p>Vamos juntos conhecer um pouco mais sobre a classificação dos meios de culturas.</p><p>CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA</p><p>Os meios de cultura são classificados a partir do seu estado físico, da sua composição e do</p><p>seu objetivo de utilização.</p><p>Fonte: SomprasongWittayanupakorn/Shutterstock</p><p> Microbiologista cultivando bactéria em uma placa de Petri contendo meio de cultura.</p><p>1) DE ACORDO COM O SEU ESTADO FÍSICO:</p><p>Você provavelmente já preparou gelatina na sua casa, correto? Lembra da sua consistência?</p><p>Para obtermos diferentes consistências nos meios de cultura, adicionamos ágar-ágar, um</p><p>polissacarídeo complexo obtido de alga marinha vermelha e que atua como agente</p><p>solidificante, muito semelhante à maneira como a gelatina é utilizada na sua cozinha.</p><p>É válido lembrar que, para obtenção de um meio de cultura ideal contendo ágar, deve-se, após</p><p>sua adição, aquecer a solução para dissolver o ágar em água fervente até a solução ficar</p><p>homogênea. Entretanto, não devemos ferver ou aquecer a solução diversas vezes, pois</p><p>podemos provocar alteração no valor nutritivo, no percentual de água e outros parâmetros que</p><p>interferiam no crescimento.</p><p>Fonte: Yayah_Ai/Shutterstock</p><p>MEIOS SÓLIDOS</p><p>Obtidos a partir da adição de 1,0 g a 3,0 g % de ágar. A maioria dos microrganismos crescem</p><p>formando colônias. Ex: Ágar nutritivo.</p><p> Exemplo de preparação de meio de cultivo sólido. Após preparo, autoclavagem, o meio é</p><p>depositado nas placas para solidificar, em ambiente estéril.</p><p>Fonte: MyFavoriteTime/Shutterstock</p><p>MEIOS SEMISSÓLIDOS</p><p>Obtidos, na maioria das vezes, após adição de 0,1 g a 0,7 g %”, separando o 0,7 de g. Dentre</p><p>as finalidades, temos a visualização da motilidade bacteriana ou, muitas vezes, servir como</p><p>base de meio de transporte. Ex: Meio SIM (meio de detecção da produção de enxofre,</p><p>motilidade e produção de indol) e Cary & Blair.</p><p> Exemplo de Meio semi-sólido (SIM) mostrando uma bactéria que não apresenta motilidade.</p><p>Fonte: NonSitth/Shutterstock</p><p>MEIOS LÍQUIDOS</p><p>Não apresentam ágar, são conhecidos como “caldos” e utilizados para ativação das culturas,</p><p>repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros. Ex: caldo tetrationato e</p><p>selenito-cistina para cultivo de salmonelas, caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.</p><p> Meios de culturas líquidos</p><p>2) DE ACORDO COM A COMPOSIÇÃO QUÍMICA</p><p>MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS</p><p>MEIOS COMPLEXOS</p><p>MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS</p><p>A composição química de todos os seus constituintes é conhecida (definidos). Ex: Meio AR-</p><p>103.</p><p>MEIOS COMPLEXOS</p><p>A exata constituição do meio de cultura não é conhecida. Esses meios apresentam em sua</p><p>composição soro, sangue, extratos moídos ou digeridos de órgãos animais (corações, fígados,</p><p>cérebros), peixes, leveduras, e vegetais ou outro componente que não se tem total</p><p>conhecimento da composição química. Ex: Ágar sangue.</p><p>3) DE ACORDO COM O OBJETIVO DA UTILIZAÇÃO</p><p>MEIOS ENRIQUECIDOS OU RICOS</p><p>São os meios que contêm um grande suprimento de nutrientes pela adição de diversas</p><p>substâncias como sangue, soro, extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo ou até</p><p>mesmo ágar nutritivos, para permitir o crescimento de bactérias fastidiosas (nutricionalmente</p><p>exigentes), como Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.</p><p> EXEMPLO</p><p>O ágar-sangue (ágar nutriente com 5% de eritrócitos de carneiro) e o ágar-chocolate (ágar</p><p>nutriente com hemoglobina em pó) são exemplos de meios enriquecidos utilizados de forma</p><p>rotineira nos laboratórios de bacteriologia clínica.</p><p>Fonte: Jarun Ontakrai/Shutterstock</p><p> Colônias de bactérias crescidas em meio ágar sangue</p><p>MEIOS SELETIVOS</p><p>São meios que apresentam em sua composição substâncias químicas específicas (inibidores)</p><p>adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o crescimento de um determinado</p><p>grupo de bactérias. É importante ressaltar que os inibidores atuam em um grupo específico de</p><p>bactéria, favorecendo apenas o crescimento da bactéria de interesse.</p><p> EXEMPLO</p><p>O ágar MacConkey é um meio seletivo pois tem em sua composição sais biliares e cristais</p><p>violeta que inibe o crescimento da maioria das bactérias gram-positivas, permitindo o</p><p>crescimento apenas das bactérias gram-negativas.</p><p>MEIOS DIFERENCIAIS OU INDICADORES</p><p>Contêm certos reagentes ou substâncias no meio que permitem a distinção de diferentes tipos</p><p>de bactérias.</p><p> EXEMPLO</p><p>O Ágar MacConkey, além de um meio de cultura seletivo, é, frequentemente, utilizado para</p><p>diferenciar bacilos gram-negativos isolados de amostras fecais. As bactérias gram-negativas</p><p>que fermentam a lactose (um ingrediente do ágar MacConkey) produzem colônias rosas</p><p>(Figura 7A), como E. coli, enquanto aquelas incapazes de fermentar a lactose produzem</p><p>colônias incolores e amarelas (Figura 7B), como Acinetobacter baumanii.</p><p>COLÔNIAS ROSAS</p><p>Bactérias gram-negativas que fermentam a lactose crescem produzindo colônias rosas.</p><p>Fonte: NonSitth/Shutterstock</p><p>javascript:void(0)</p><p>Fonte: REJO JACOB JOSEPH/Shutterstock</p><p> Figura 7 - Diferença da coloração das colônias de bactérias gram-negativas fermentadoras</p><p>e não fermentadoras de lactose em Agar MacConkey.</p><p>Agora que você conheceu esse meio de cultura, imagina por que temos essa diferença?</p><p>Como mencionado anteriormente, a lactose é um nutriente presente no Ágar MacConkey e,</p><p>além desse nutriente, o meio apresenta um indicador de pH (que permite a alteração da</p><p>coloração do meio de acordo com o pH). Bactérias que são capazes de metabolizar a lactose</p><p>produzem ácidos mistos que alteram o pH do meio que fica com uma cor rosa/ avermelhado.</p><p>De forma diferente, as bactérias que não fermentam a lactose, utilizam como fonte de energia a</p><p>peptona. A peptona, ao ser metabolizada, produz amônia, que eleva o pH do meio e torna as</p><p>colônias e o meio amarelados/ sem cor.</p><p> EXEMPLO</p><p>Outro exemplo de meio seletivo é o ágar manitol salgado. Esse meio de cultivo é composto de</p><p>manitol e alta concentração de sal (7,5% de NaCL). Na rotina laboratorial ele é utilizado para o</p><p>isolamento de Staphylococcus aureus a partir de diferentes amostras biológicas. Todas as</p><p>espécies de Staphylococcus são capazes de crescer nesse meio, mas o S. aureus é capaz de</p><p>fermentar o manitol presente no meio, produzindo ácido, que torna o meio e as colônias</p><p>amareladas. As outras espécies de estafilococos, como os Staphylococcus epidermidis e o</p><p>Bacillus subtillis não metabolizam o manitol, apresentando assim colônias brancas.</p><p>Fonte: OneMashi/Shutterstock</p><p> S.aureus e S.epidermidis cultivadas em ágar manitol.</p><p>MEIOS DE TRANSPORTE</p><p>Geralmente, são semissólidos e possuem o mínimo de nutrientes para a manutenção das</p><p>bactérias, durante o tempo de transporte, sem que estas se reproduzam ou acidifiquem o meio.</p><p>Atualmente, para auxiliar na coleta de algumas amostras biológicas destinadas à cultura e à</p><p>antibiograma, como secreções vaginais, é utilizado um Swab. Após a coleta, eles são</p><p>armazenados em um tubo que contém o meio de transporte (ex: meio Stuart – permite uma</p><p>boa conservação de bactérias patogênicas como Salmonella spp. e Shigella spp.)</p><p>SWAB</p><p>javascript:void(0)</p><p>Fonte: MedstockPhotos/Shutterstock</p><p> Swab com meio de transporte que pode ser usado para coleta de amostras de</p><p>secreção vaginal.</p><p>TESTE DE SENSIBILIDADE AOS</p><p>ANTIMICROBIANOS (TSA)</p><p>Uma tarefa importante do laboratório de microbiologia clínica é a realização de testes de</p><p>sensibilidade aos antimicrobianos a partir de isolados bacterianos. Os objetivos dos testes são</p><p>detectar uma possível resistência aos antibióticos em patógenos comuns, nortear a escolha do</p><p>antibiótico mais adequado a fim de predizer o sucesso do esquema terapêutico para infecções</p><p>específicas.</p><p>Os testes usados incluem macrodiluição em tubos, microdiluição em caldo e o método de disco</p><p>difusão. O método de disco difusão fornece flexibilidade e apresenta baixo custo. Cada método</p><p>tem pontos fortes e fracos, incluindo organismos que podem ser testados com precisão pelo</p><p>método. Alguns métodos fornecem resultados quantitativos (por exemplo, concentração</p><p>inibitória mínima) e todos fornecem avaliações qualitativas usando as categorias de suscetível,</p><p>intermediário ou resistente.</p><p>Fonte: aslysun/Shutterstock</p><p>Em geral esses métodos são recomendados para ajudar a direcionar o tratamento do paciente.</p><p>É importante ressaltar que a detecção precisa dos mecanismos de resistências das bactérias</p><p>são utilizados para fins epidemiológicos e medidas de contenção destas bactérias resistentes.</p><p>Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2008): o TSA é sempre realizado na</p><p>avaliação das seguintes bactérias:</p><p>Enterobactérias</p><p>Pseudomonas spp.</p><p>Acinetobacter spp.</p><p>Staphylococcus spp.</p><p>Enterococcus spp.</p><p>Streptococcus pneumoniae</p><p>Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico</p><p>Haemophilus influenzae</p><p>Complexo Burkholderia cepacia</p><p>Stenotrophomonas maltophilia</p><p>Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis</p><p> ATENÇÃO</p><p>A padronização das etapas relacionadas à realização dos TSA (da escolha dos antibióticos até</p><p>a interpretação dos resultados) é feita por organizações especializadas, que elaboram</p><p>documentos, os quais apresentam com riqueza de detalhes como realizar e interpretar os</p><p>testes de sensibilidade. Tais organizações são:</p><p>Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA)</p><p>European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, Europa)</p><p>Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (BrCAST, Brasil)</p><p>British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido)</p><p>Comité de L’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM, França)</p><p>A seguir, verificaremos as diferentes técnicas empregadas na realização dos TSA, trazendo</p><p>algumas de suas vantagens e desvantagens.</p><p>Independentemente</p><p>da técnica escolhida pelo laboratório de microbiologia, todas as etapas</p><p>devem ser rigorosamente controladas. O bom emprego do controle de qualidade é a melhor</p><p>forma de garantir a confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados. Além disso, deve ser feito</p><p>seguindo as normas de biossegurança.</p><p>MACRODILUIÇÃO EM TUBOS</p><p>Um dos primeiros testes de susceptibilidade antimicrobiana desenvolvido foi a macrodiluição</p><p>em tubos. Este procedimento envolve:</p><p>Preparar diluições seriadas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4, 8 e 16</p><p>microgramas/mL) em meio de cultura líquido.</p><p>Inocular os tubos contendo antimicrobianos com uma suspensão bacteriana padronizada</p><p>em torno de 5 X 105 UFC (Unidade Formadora de Colônia ) /mL.</p><p>Incubar por de 18 a 24 horas, a 35°C.</p><p>Examinar a presença de turbidez, que evidencia o crescimento microbiano. O primeiro</p><p>tubo da série que apresentar aparência límpida (sem turbidez) representa a concentração</p><p>inibitória mínima (CIM ou MIC).</p><p>CIM OU MIC</p><p>A sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos é representada pela</p><p>concentração inibitória mínima (CIM ou MIC) de cada microrganismo para cada</p><p>antimicrobiano, que corresponde à menor concentração do antimicrobiano capaz de inibir</p><p>o desenvolvimento visível do microrganismo.</p><p>javascript:void(0)</p><p>Fonte: ANVISA</p><p> Macrodiluição em tubos. Nesse exemplo está ilustrado um antibiótico testado nas</p><p>concentrações 0, 0,25, ,0,5, 1, 2 4 e 8 µg/mL.</p><p>A vantagem da macrodiluição em tubo é a geração de um resultado quantitativo (CIM ou MIC).</p><p>As desvantagens correspondem ao trabalho manual que leva a possibilidade de erros durante</p><p>o preparo de soluções de antibióticos para cada antibiótico testado, a quantidade relativamente</p><p>grande de reagentes e o espaço necessário para cada teste.</p><p>MICRODILUIÇÃO EM CALDO</p><p>A técnica de microdiluição em caldo é a técnica de macrodiluição, realizada em placas estéreis</p><p>de 96 poços. Essa adaptação tornou esse teste mais prático e popular. A seguir, o passo a</p><p>passo desta técnica:</p><p>PASSO 1</p><p>PASSO 2</p><p>PASSO 3</p><p>PASSO 4</p><p>PASSO 1</p><p>Preparar diluições seriadas de antimicrobianos (até 8 diluições logarítmicas) de até 12</p><p>antimicrobianos.</p><p>PASSO 2</p><p>Inocular as bactérias a serem testadas obtendo-se uma concentração bacteriana final de</p><p>aproximadamente 5 x 104 - 105 UFC/mL por poço.</p><p>PASSO 3</p><p>Incubar as placas (também chamadas de painéis) de microdiluição a 35 ± 2ºC por 18 a 24</p><p>horas (dependendo do gênero bacteriano e do antimicrobiano testado).</p><p>PASSO 4</p><p>Realizar a leitura da placa visualmente e, de preferência, com luminosidade ambiente, para</p><p>facilitar a leitura, observando a turbidez.</p><p> SAIBA MAIS</p><p>Poucos laboratórios de microbiologia clínica preparam suas próprias placas. Normalmente, os</p><p>laboratórios compram painéis, com os antibióticos já liofilizados ou congelados nas diluições</p><p>necessárias, de fornecedores comerciais. Além disso, alguns laboratórios clínicos utilizam a</p><p>metodologia automatizada, que realiza essa análise através do MIC.</p><p>Vantagens do procedimento de microdiluição incluem a geração de um resultado quantitativo</p><p>(CIM ou MIC), a reprodutibilidade dos resultados, a conveniência de poder utilizar painéis pré-</p><p>preparados, e a economia de reagentes e espaço que ocorre devido à miniaturização do teste.</p><p>A geração de relatórios computadorizados também é possível se um leitor de painel for</p><p>utilizado. A principal desvantagem do método de microdiluição é a inflexibilidade das seleções</p><p>de drogas disponíveis em painéis comerciais padrão, além do custo de cada placa de</p><p>microdiluição.</p><p>PROVA DE SENSIBILIDADE COM DISCOS DE</p><p>PAPEL EM MEIO SÓLIDO</p><p>O teste de disco-difusão em ágar, também chamado de técnica de Kirby-Bauer em</p><p>homenagem aos microbiologistas que descreveram este teste em 1966, é um dos métodos de</p><p>sensibilidade mais simples, prático, confiável e mais utilizado nos laboratórios de microbiologia,</p><p>fornecendo resultados qualitativos. A seguir, o passo a passo desta técnica.</p><p>Fonte: eczserapyilmaz/Shutterstock</p><p> Teste de disco-difusão em ágar.</p><p>TÉCNICA</p><p>javascript:void(0)</p><p>Toda a etapa deve ser realizada de forma estéril, seguindo as normas de biossegurança</p><p>do laboratório.</p><p>Fonte do protocolo da técnica: (adaptado do NCCLS ‘M2-A8—Performance Standards for</p><p>Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Eighth Edition (ISBN 1-</p><p>56238-485-6). Cópias da atual edição podem ser obtidas no seguinte endereço: NCCLS,</p><p>940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA):</p><p>Vamos ao passo a passo:</p><p>Método do crescimento</p><p>PASSO 1</p><p>Após crescimento em placa de ágar (24 horas), selecionar de três a cinco colônias, bem</p><p>isoladas, do mesmo tipo morfológico. A superfície de cada colônia é tocada com uma alça, e os</p><p>microrganismos são transferidos para um tubo contendo 4-5 mL de NaCL 0,9% (salina) estéril.</p><p>PASSO 2</p><p>Incuba-se a cultura na salina até alcançar a turbidez de uma solução padrão de McFarland</p><p>0,5.</p><p>DEFINIÇÃO DE ESCALA DE MACFARLAND:</p><p>Escala de nefelométrica de turvação. Essa é uma escala que possibilita verificar a</p><p>concentração bacteriana pela intensidade de turvação do meio. Quanto maior a turvação</p><p>do meio, maior a concentração bacteriana, maior opacidade e mais difícil é a passagem</p><p>de luz.</p><p>Essa escala é composta de 11 tubos numerados de 0,5 a 10, onde o tubo 0,5 (indica uma</p><p>concentração bacteriana de 1,0 a 2,0 x 108 colônias/mL. e o tubo 10 -30 x 108</p><p>colônias/mL). Ao preparar uma suspensão de bactérias para realização do antibiograma é</p><p>feito a comparação visual com os tubos padrão da escala. A leitura é feita a olho nu</p><p>utilizando um cartão de fundo branco com linhas pretas no fundo, ou então através de um</p><p>espectrofotômetro.</p><p>javascript:void(0)</p><p>Fonte: Imagem adaptada</p><p> Escala de MacFarland. Imagem adaptada.</p><p>Inoculação das placas de teste</p><p>PASSO 1</p><p>Após a preparação da suspensão bacteriana, mergulha-se um swab de algodão estéril na</p><p>suspensão. Essa etapa deve ser realizada em até 15 minutos após ajustar a turbidez da</p><p>suspensão. O swab deve ser girado várias vezes e apertado firmemente contra a parede</p><p>interna do tubo, acima do nível do líquido, o que ajuda a retirar qualquer excesso de inóculo no</p><p>swab.</p><p>PASSO 2</p><p>A superfície da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando o swab em toda a</p><p>superfície estéril do ágar. Repete-se o procedimento esfregando outras duas vezes, girando a</p><p>placa aproximadamente 60° cada vez, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo.</p><p>Após a distribuição, passa-se um swab na margem de toda a placa de ágar, completando pelo</p><p>menos uma volta completa.</p><p>PASSO 3</p><p>A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de maneira a permitir que</p><p>qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se aplicar os discos impregnados de</p><p>droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar 15 minutos aberta.</p><p>javascript:void(0)</p><p>Devemos evitar inóculos com alta concentração de bactérias. Nunca devemos usar culturas em</p><p>caldo, não diluídas, do dia anterior, ou outros inóculos não padronizados para semear nessas</p><p>placas.</p><p>ÁGAR MÜELLER-HINTON</p><p>Meio de cultura preconizado para os testes de sensibilidade da maioria das bactérias de</p><p>interesse médico.</p><p>Aplicação de discos a placas de ágar inoculadas</p><p>PASSO 1</p><p>O conjunto de antibióticos é previamente definido. Esses são discos de papeis de filtros</p><p>impregnados com concentrações definidas de antibióticos. Os discos de antibióticos são</p><p>colocados na superfície de placa de ágar anteriormente semeada, com auxílio de uma pinça ou</p><p>com um dispensador. Ao ser colocado, cada disco deve ser pressionado de maneira a</p><p>assegurar o contato completo do disco com a superfície de ágar. Os discos devem ser</p><p>distribuídos mantendo a distância entre os centros de pelo menos 24 mm. Em geral, deve-se</p><p>colocar 12 discos, no máximo, em uma placa de 150 mm, ou cinco discos em uma placa de</p><p>100 mm.</p><p>Algumas drogas difundem-se quase instantaneamente quando em contato com o meio. O disco</p><p>não deve ser reaplicado após ter entrado em contato com a superfície de ágar. Em vez disso,</p><p>coloque um novo</p><p>disco em outra parte da placa.</p><p>PASSO 2</p><p>As placas devem ser invertidas e colocadas em uma estufa, a 35° C, até 15 minutos após a</p><p>aplicação dos discos. No entanto, no caso das cepas de Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e</p><p>dos estreptococos, as placas não devem ser incubadas em atmosfera enriquecida com CO2,</p><p>porque os padrões de interpretação foram estabelecidos usando incubação em ar ambiente, e</p><p>o CO2 irá alterar significativamente o tamanho dos halos de inibição de alguns antibióticos.</p><p>Leitura das placas e interpretação dos resultados</p><p>PASSO 1</p><p>A leitura é realizada após 18 a 24 horas de incubação. Inicialmente, analisamos a superfície da</p><p>placa para verificar se a semeadura foi satisfatória. Em seguida, os halos (diâmetros) devem</p><p>ser medidos, em milímetros, com auxílio de paquímetro ou uma régua. Para isso, a placa deve</p><p>ser invertida, e a régua ou o paquímetro apoiado na parte de trás da placa. As medidas devem</p><p>ser feitas contra uma fonte luminosa.</p><p>FONTE LUMINOSA</p><p>Normalmente, o teste de sensibilidade das espécies de estreptococos é feito adicionando</p><p>sangue à base de ágar Müeller-Hinton . Nesse caso, os halos deverão ser medidos a</p><p>partir da superfície superior do ágar iluminada com luz refletida, uma vez retirada a</p><p>tampa. E não confundir o halo de hemólise, característico nessas bactérias com halo de</p><p>inibição.</p><p>Se a placa foi satisfatoriamente semeada, e o inóculo era correto, os halos de inibição</p><p>resultantes serão uniformemente circulares e haverá um tapete confluente de</p><p>crescimento. Se colônias individuais forem aparentes, o inóculo era demasiado leve e o</p><p>teste deverá ser repetido.</p><p>O halo de inibição é a área sem crescimento detectável a olho nu.</p><p>Cuidado:</p><p>O crescimento de pequenas colônias, detectável apenas com lente de aumento, na</p><p>margem do halo de inibição do crescimento deve ser ignorado.</p><p>Crescimento discreto de colônias dentro de um halo de inibição, o teste deverá ser</p><p>repetido com uma cultura ou subcultura pura de uma única colônia, isolada da placa de</p><p>cultura primária. Se pequenas colônias continuarem a crescer no halo de inibição, o halo</p><p>de inibição livre de colônias deve ser medido.</p><p>PASSO 2</p><p>javascript:void(0)</p><p>Com a medida de cada halo (diâmetro) a bactéria testada é classificada, como sensível,</p><p>intermediário, ou resistente em relação aos agentes antimicrobianos testados, usando como</p><p>comparação o tamanho dos halos preconizados pelas organizações internacionais (CLSI,</p><p>BSAC e BrCAST).</p><p>Vantagens desse método: Simplicidade do teste; não requer nenhum equipamento especial;</p><p>os resultados categóricos facilmente interpretados; flexibilidade na seleção de discos para</p><p>teste; baixo custo e de fácil execução.</p><p>Desvantagens: Teste manual, sem automação; não pode ser utilizado para verificar a</p><p>resistência a alguns microrganismos, pois falta padronização do método.</p><p>Exemplo: Para avaliar o perfil de sensibilidade do S. pneumoniae versus ceftriaxona, deve ser</p><p>feito o teste do MIC (quantitativo). De acordo com o CLSI (2018), esse método não pode ser</p><p>mais utilizado para verificar o perfil de sensibilidade da polimixina B nas bactérias gram</p><p>negativas, pois a polimixina apresenta baixa difusão no Agar, sendo preconizado a</p><p>microdiluição.</p><p>Qual é a acurácia aceitável de um teste de suscetibilidade?</p><p>Quando desejamos mediar a acurácia de um novo método de suscetibilidade, é importante</p><p>testar um número representativo de cepas bacterianas resistentes a diferentes antibióticos e de</p><p>cepas suscetíveis no novo método de suscetibilidade e no método padronizado. A partir desses</p><p>resultados, conseguimos comparar e verificar se o método em estudo é capaz de detectar as</p><p>bactérias que são verdadeiramente resistentes e sensíveis e determinar a taxa de erros que</p><p>podem ser esperados em um ambiente de laboratório clínico.</p><p>O surgimento de novos mecanismos de resistências antimicrobianas, incluindo alguns que</p><p>podem ser difíceis de detectar (por exemplo, susceptibilidade intermediária à vancomicina em</p><p>S. aureus e produção de carbapenemase em alguns organismos gram-negativos) requer que</p><p>o desempenho dos dispositivos de susceptibilidade seja constantemente reavaliado e</p><p>atualizado quando necessário.</p><p>ACURÁCIA</p><p>Refere-se ao grau em que o teste é capaz de determinar o verdadeiro valor do que está</p><p>sendo medido.</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p>CARBAPENEMASE</p><p>Enzimas capazes de clivar os antibióticos da classe carbapenêmicos. Em infecções por</p><p>bactérias gram-negativas resistentes à grande maioria dos antibióticos, os antibióticos</p><p>carbapenêmicos (Imipinem e Meropenem) representam a única escolha para o</p><p>tratamento eficaz. No entanto, nos últimos anos, algumas bactérias adquiriram resistência</p><p>a esses antibióticos, diminuindo assim a possibilidade terapêutica e a necessidade de</p><p>busca de novas drogas e métodos rápidos de confirmação da resistência bacteriana.</p><p>TESTE DE SENSIBILIDADE NA PRÁTICA</p><p>VERIFICANDO O APRENDIZADO</p><p>1. APRENDEMOS QUE OS MEIOS DE CULTURA SÃO COMPOSTOS DE</p><p>NUTRIENTES NECESSÁRIOS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS E</p><p>PODEM SER CLASSIFICADOS COMO SÓLIDOS, SEMISSÓLIDOS OU</p><p>LÍQUIDOS. ALÉM DISSO, ALGUNS MEIOS CONTÊM SUBSTÂNCIAS</p><p>QUÍMICAS ESPECÍFICAS ADICIONADAS AO CALDO OU AO ÁGAR</p><p>NUTRITIVO QUE PREVINEM O CRESCIMENTO DE UM DETERMINADO</p><p>GRUPO DE BACTÉRIAS SEM AGIR SOBRE OUTRO. ESSES MEIOS DE</p><p>CULTURA SÃO CHAMADOS DE:</p><p>A) Diferenciais</p><p>B) Seletivos</p><p>C) Enriquecidos</p><p>D) De transporte</p><p>2. ESTUDAMOS QUE O ANTIBIOGRAMA PERMITE A IDENTIFICAÇÃO DA</p><p>SENSIBILIDADE DE BACTÉRIAS ISOLADAS A UM PAINEL DE</p><p>ANTIBIÓTICOS. EM RELAÇÃO AO TESTE DE SENSIBILIDADE DE DISCO-</p><p>DIFUSÃO EM ÁGAR, ASSINALE A AFIRMATIVA QUE CONTENHA UMA</p><p>VANTAGEM DESTE TESTE:</p><p>A) Pode ser feito de forma automatizada.</p><p>B) É um método quantitativo.</p><p>C) Flexibilidade quanto à escolha dos antimicrobianos.</p><p>D) Requer utilização de equipamentos especiais.</p><p>GABARITO</p><p>1. Aprendemos que os meios de cultura são compostos de nutrientes necessários para o</p><p>cultivo de microrganismos e podem ser classificados como sólidos, semissólidos ou</p><p>líquidos. Além disso, alguns meios contêm substâncias químicas específicas</p><p>adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o crescimento de um</p><p>determinado grupo de bactérias sem agir sobre outro. Esses meios de cultura são</p><p>chamados de:</p><p>A alternativa "B " está correta.</p><p>Meios seletivos são os que contém substâncias que inibem o desenvolvimento de</p><p>determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros.</p><p>2. Estudamos que o antibiograma permite a identificação da sensibilidade de bactérias</p><p>isoladas a um painel de antibióticos. Em relação ao teste de sensibilidade de disco-</p><p>difusão em ágar, assinale a afirmativa que contenha uma vantagem deste teste:</p><p>A alternativa "C " está correta.</p><p>O teste de sensibilidade de disco-difusão em ágar não pode ser feito de forma automatizada, é</p><p>um método qualitativo e não requer utilização de equipamentos especiais. Entretanto, permite</p><p>ao microbiologista uma ampla escolha de antibióticos a serem utilizados, proporcionando,</p><p>portanto, flexibilidade quanto à escolha.</p><p>MÓDULO 3</p><p> Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática laboratorial</p><p>INTRODUÇÃO</p><p>Vimos no módulo 1 que as características das células bacterianas, bem como sua morfologia,</p><p>são essenciais para entendermos e aplicarmos as técnicas de coloração bacterianas. No</p><p>entanto, uma vez que as bactérias são seres microscópios, não podemos enxergá-las a olho</p><p>nu, e necessitamos do auxílio dos microscópios:</p><p>Óptico – permitem aumentos de até 1000 vezes.</p><p>Eletrônicos – permitem aumentos de 10.000 vezes (varredura) e 1.000.000 vezes</p><p>(transmissão).</p><p>No dia a dia dos microbiologistas, a forma mais comum de se examinar os microrganismos é</p><p>utilizando técnicas associadas ao microscópio óptico.</p><p>Fonte: Konstantin Kolosov/Shutterstock</p><p>TODA BACTÉRIA PRECISA SER CORADA PARA</p><p>SER VISUALIZADA?</p><p>SIM NÃO</p><p>A RESPOSTA CORRETA É “NÃO”!</p><p>De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas quanto à forma e</p><p>movimentos, a partir de material biológico em suspensão</p><p>(uma gota) entre lâmina e</p><p>lamínula (sem formar bolha). Esta preparação é conhecida como a fresco e exige um</p><p>bom manuseio do microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário</p><p>fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se possível empregar</p><p>filtros para uma melhora na qualidade da imagem a ser visualizada e, geralmente, utilizar</p><p>um microscópio de campo escuro.</p><p>CORRETO!</p><p>De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas quanto à forma e</p><p>movimentos, a partir de material biológico em suspensão (uma gota) entre lâmina e</p><p>lamínula (sem formar bolha). Esta preparação é conhecida como a fresco e exige um</p><p>bom manuseio do microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário</p><p>fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se possível empregar</p><p>filtros para uma melhora na qualidade da imagem a ser visualizada e, geralmente, utilizar</p><p>um microscópio de campo escuro.</p><p>E quando preferimos este tipo de preparo?</p><p>Quando nossa intenção é visualizar a mobilidade e a morfologia de bactérias espiraladas, as</p><p>quais sob fixação ficam distorcidas, ou até mesmo observar alterações na divisão celular e</p><p>formação de esporos.</p><p>Como é de se esperar, na preparação a fresco, por não utilizar corantes, as bactérias são</p><p>vistas sem cor (incolores), mesmos que estas sejam capazes de produzir cor quando</p><p>javascript:void(0)</p><p>javascript:void(0)</p><p>cultivadas em meios de cultura específicos. Para uma melhor visualização da morfologia e</p><p>citologia bacteriana, vários corantes passaram a ser utilizados e os microrganismos são</p><p>corados após os microrganismos serem fixados na lâmina (mortos), na maioria das vezes, pelo</p><p>calor, etapa chamada de fixação. A fixação permite que a bactéria fique aderida à lâmina e</p><p>evita que as bactérias sejam lavadas e perdidas durante a coloração. No entanto, antes da</p><p>etapa de fixação e coloração, devemos lembrar da importância da realização de um bom</p><p>esfregaço, que deve ser:</p><p>Pouco espesso</p><p>Bem homogêneo</p><p>Realizado em área de segurança biológica, a partir de um caldo ou material diluído em</p><p>solução salina, espalhado com alça bacteriológica em lâmina limpa e seca</p><p> ATENÇÃO</p><p>Todas as manipulações devem ser feitas seguindo as normas de biossegurança e, de forma</p><p>estéril, para não haver contaminação das amostras e resultados falso positivos. Ao final, todos</p><p>os resíduos produzidos devem ser autoclavados antes de descartados.</p><p>As técnicas de coloração podem ser classificadas de acordo com o número de corantes</p><p>utilizados em:</p><p>Coloração simples: Quando utilizamos apenas um único corante para observar a</p><p>morfologia bacteriana;</p><p>Coloração diferencial: Quando utilizamos mais de um corante, além de mordentes e do</p><p>diferenciador para identificar diferenças entre grupos de bactérias. Dentre os métodos</p><p>(colorações) diferenciais, também chamados de seletivos, de maior importância dentro de</p><p>laboratórios de Microbiologia Clínica, temos os de Gram, de Ziehl-Neelsen e de Albert-</p><p>Laybourn. Além destes, destaca-se ainda o método de Fontana-Tribondeau, que,</p><p>embora não seja diferencial, ainda é utilizado por alguns microbiologistas. Também</p><p>existem métodos de coloração pouco utilizados, mas que podem ser úteis quando há</p><p>javascript:void(0)</p><p>necessidade de evidenciar algumas estruturas bacterianas, como a coloração de flagelos,</p><p>esporos e cápsula.</p><p>MORDENTE</p><p>Substância utilizada durante a fixação que tem a função de manter a durabilidade da</p><p>coloração.</p><p>COLORAÇÃO DE GRAM</p><p>Esta técnica foi desenvolvida em 1884, pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim</p><p>Gram, e é a mais utilizada em bacteriologia por permitir distinguir bactérias gram-positivas de</p><p>bactérias gram-negativas. Diferenças nas características químicas e estruturais das paredes</p><p>celulares, bem como na permeabilidade aos reagentes químicos nestes dois grupos de</p><p>bactérias levam a diferenças de coloração.</p><p>Fonte: Schira/Shutterstock</p><p> Coloração de GRAM. À esquerda, bactérias gram-negativas. Á direita, bactérias gram-</p><p>positivas.</p><p>Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?</p><p>Na técnica de Gram, utilizamos:</p><p>Corante básico (violeta genciana, cristal-violeta, metilvioleta).</p><p>Mordente (solução iodo-iodetada, conhecida como lugol) que aumenta a afinidade da</p><p>célula pelo primeiro corante utilizado (corante básico). Ocorre assim a ligação do corante</p><p>com o lugol e a formação de um composto roxo, insolúvel que cora o espaço</p><p>protoplasmático e a parede celular de roxo.</p><p>Agente descolorante (álcool a 95% ou álcool-acetona).</p><p>Nas bactérias gram-positivas, as quais o corante está fortemente retido devido à</p><p>espessa camada de peptideoglicanos, este não é facilmente removido pela ação</p><p>do agente descolorante.</p><p>Nas bactérias gram-negativas, nas quais o agente descolorante remove a</p><p>membrana externa da parede destas bactérias, e devido à fina camada de</p><p>peptideoglicanos, estas bactérias não conseguem reter o corante.</p><p>Segundo corante básico (safranina ou fucsina) que cora as bactérias gram-negativas,</p><p>recentemente descoradas, de vermelhas. As gram-positivas permanecem roxas.</p><p> Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal</p><p>Dessa forma, ao final da coloração de gram, as bactérias gram-positivas serão visualizadas no</p><p>microscópio com cor roxa e as gram-negativas com cor vermelha. De uma forma geral, a</p><p>literatura científica evidencia que, geralmente, os cocos de importância médica são gram-</p><p>positivos (exceção do gênero Neisseria), e os bastonetes gram-negativos (exceção dos</p><p>gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus e Clostridium).</p><p> ATENÇÃO</p><p>É muito importante a utilização de culturas jovens para evitar resultados falsos.</p><p>A COLORAÇÃO DE GRAM NA PRÁTICA</p><p>COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN</p><p>No módulo 1, você aprendeu que existem bactérias cuja parede celular fogem da classificação</p><p>como gram-positivas e gram-negativas, pois possuem acima da camada de peptideoglicanos,</p><p>uma camada denominada Micolato Arabinogalactano, formada por polímeros de</p><p>arabinogalactano (açúcares) e revestida por uma porção lipídica de ácidos micólicos. Esta</p><p>constituição torna a parede celular hidrofóbica, dificultando a penetração de corantes aquosos,</p><p>bem como a ação do lugol e, portanto, impedindo a identificação e a diferenciação desse tipo</p><p>de bactéria através da coloração de Gram.</p><p>Entretanto, em 1882, um bacteriologista chamado Franz Ziehl e um patologista alemão</p><p>Friedrich Carl Adolf Neelsen, evidenciaram que alguns gêneros bacterianos, como</p><p>Micobacterium e Nocardia são capazes de resistir a descoloração com uma solução de álcool-</p><p>ácido, após tratamento com fucsina fenicada aquecida, de forma que permanecem vermelhas,</p><p>diferentemente de outras bactérias, que, por não possuírem esta propriedade, apresentam a</p><p>cor do corante de fundo, normalmente, feita com azul de metileno.</p><p>Fonte: Wikipedia</p><p> Friedrich Carl Adolf Neelsen</p><p>Sendo assim, estes gêneros receberam a denominação de BAAR (Bacilos-Álcool-Ácido-</p><p>Resistente), e esta capacidade de álcool-ácido-resistência está relacionada à hidrofobicidade</p><p>da parede celular, assegurada pela presença de lipídeos como o ácido micólico. Quanto à</p><p>coloração, esta ficou conhecida como coloração de Ziehl-Neelsen.</p><p>Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?</p><p>Na técnica de Ziehl-Neelsen, após a confecção do esfregaço, fixamos os esfregaços no calor.</p><p>Após este passo, é depositado a solução de fucsina de Zieel e aquecemos o corante até a</p><p>emissão de vapores (sem ferver), esse procedimento deve ser feito 3 vezes e deve durar até 5</p><p>minutos. Em seguida, lavamos a lâmina com água e realizamos a descoloração com solução</p><p>de álcool-ácido clorídrico a 1%. Na sequência, o esfregaço deve ser coberto com azul de</p><p>metileno, por meio minuto, a lâmina é lavada com água corrente e, após secar, está pronta</p><p>para ser observada no microscópio óptico (objetiva 100 X). Os BAAR serão visualizados como</p><p>bastonetes finos, vermelhos, sobre fundo corado em azul.</p><p>Fonte: Douglas Olivares/Shutterstock</p><p> Bacilos (rosa) evidenciados pela coloração</p><p>de Ziehl-Neelsen</p><p>em um paciente com tuberculose pulmonar avançada e AIDS, amostra escarro.</p><p> SAIBA MAIS</p><p>A análise do escarro pela coloração de BAAR é um método simples, barato e muito importante</p><p>para o diagnóstico da tuberculose, pois confere um resultado precoce (quando realizado de</p><p>forma correta). Além disso, permite o acompanhamento a evolução do tratamento de pacientes</p><p>com essa doença. Pacientes com sinais e sintomas (febre vespertina, tosse persistente por</p><p>mais de 3 semanas, emagrecimento, com imagem no raio x) que apresentam bacilos gram-</p><p>negativos no escarro em amostras coradas pela ZH indicam a presença do M. tuberculosis. No</p><p>entanto, é importante destacar que outras micobactérias se coram por essa técnica e esse</p><p>método. Para diferenciar as espécies, é necessário cultura.</p><p>Essa técnica pode ser realizada em outras amostras, como: urina, líquidos pleurais, lavado</p><p>bronco alveolar, aspirado traqueal, biópsias e líquor.</p><p>COLORAÇÃO DE ALBERT-LAYBOURN</p><p>Algumas bactérias apresentam corpúsculos citoplasmáticos (corpúsculos metacromáticos ou</p><p>corpúsculos de Babes Ernst) nas suas extremidades e que podem ser corados pelo Lugol forte</p><p>(com cor marrom), em contraste com o corpo do bacilo, que se cora em esverdeado/azulado</p><p>pela solução de Laybourn. Esta técnica é uma técnica simples que foi sugerida em 1920 por</p><p>Henry Albert e, posteriormente, foi modificada por Ross Laybourn, em 1924.</p><p>Os corpúsculos citoplasmáticos são encontrados no gênero Corynebacterium diphtheriae,</p><p>agente causador de sintomas clínicos característicos da difteria. Desta forma, a pesquisa por</p><p>bacilos metacromáticos cuidadosamente coletados da oro e nasofaringe serve como um</p><p>método auxiliar no diagnóstico da difteria.</p><p>DIFTERIA</p><p>A difteria (ou crupe) é uma doença de origem bacterina, que acomete as amígdalas,</p><p>laringe, faringe, nariz, conjuntiva e pele, causando amidalite com o aparecimento de</p><p>placas bacterianas bem amareladas, dificuldades respiratórias e até mesmo parada</p><p>respiratória com óbito. Essa doença é causada pela bactéria Corynebacterium diphtheriae</p><p>e pode ser transmitida por meio das vias respiratórias ou então através de contato físico.</p><p>javascript:void(0)</p><p>Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock</p><p> Ilustração microscópica de Corynebacterium diphtheria.</p><p>Como é feita essa coloração?</p><p>Após a obtenção do esfregaço, este é corado com a solução de Albert-Layborn durante 5</p><p>minutos. Após esse período, o corante deve ser retirado e a lâmina coberta com a solução de</p><p>Lugol forte, por 2 minutos. Em seguida, com as lâminas secas, elas podem ser analisadas no</p><p>microscópio. O resultado é considerado positivo quando há presença de grânulos</p><p>metacromáticos no citoplasma de bacilos com morfologia em paliçada/letras chinesas. Tais</p><p>achados sugerem bacilo diftérico e devem ser comunicados imediatamente ao médico.</p><p>COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU</p><p>O método foi desenvolvido em 1920, com objetivo de auxiliar a visualização de bactérias</p><p>espiraladas (Leptospira interrogans e treponemas). Essas bactérias são muito delgadas e não</p><p>coram completamente pela coloração de Gram. Esta coloração não é considerada verdadeira,</p><p>pois consiste em uma técnica de impregnação pela prata. Atualmente, os laboratórios têm</p><p>utilizado mais a microscopia de campo escuro a fresco para visualizá-las.</p><p>Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?</p><p>A partir de esfregaços finos, derramar sobre a lâmina algumas gotas da solução fixadora</p><p>(renová-la 3 vezes, por 30 segundos). Em seguida, cobrir com solução mordente, aquecendo a</p><p>lâmina até emitir vapores. Após 30 segundos, lavar em água corrente, acrescentar o nitrato de</p><p>prata amoniacal, aquecendo rapidamente a lâmina até ocorrer novamente a emissão de</p><p>vapores, deixando agir por 30 segundos (a preparação toma a cor marrom). Lavar bem em</p><p>água corrente, secar com papel de filtro e examinar a lâmina ao microscópio com a objetiva de</p><p>imersão (x100). As espiroquetas aparecem amarronzadas/negras, sobre um fundo amarelo-</p><p>castanho ou marrom claro.</p><p>COLORAÇÃO PARA FLAGELOS</p><p>Como visto no módulo 1, os flagelos são estruturas bacterianas responsáveis pela locomoção e</p><p>são constituídos por moléculas proteicas denominadas flagelinas. Entretanto, como são finos,</p><p>delicados e se despolimerizam com facilidade, é necessário aplicar algumas técnicas para</p><p>aumentar o diâmetro dos flagelos, de forma a torná-los visíveis pela microscopia. A</p><p>demonstração do flagelo ocorre devido à ligação do corante ao ácido tânico, tornando-o mais</p><p>espesso.</p><p>Fonte: microbiologybook.org</p><p> Flagelos.</p><p>Como é feita a coloração? Vamos entender?</p><p>Segundo o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):</p><p>Cultivar a bactéria em estudo, de acordo com suas preferências físicas, em uma placa de</p><p>ágar infusão de cérebro-coração (BHI) ou em ágar tríptico de soja (com ou sem sangue).</p><p>Coletar delicadamente uma alíquota do crescimento com uma alça de platina e transferi-</p><p>la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de água destilada. Inverter o tubo uma vez</p><p>para homogeneizar a suspensão. Colocar uma gota desta suspensão sobre uma lâmina</p><p>inclinada a 45o e deixar secar ao ar.</p><p>Cobrir a lâmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e ácido tânico (fórmula</p><p>abaixo), e deixar por 5 minutos, até que um brilho metálico esverdeado cubra metade da</p><p>área. Não deixar o corante secar sobre a lâmina.</p><p>Retirar o corante, enxaguando com água. Secar e observar ao microscópio, com objetiva</p><p>de imersão.</p><p> Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal</p><p>COLORAÇÃO PARA ESPOROS COM VERDE</p><p>MALAQUITA (WIRTZ-CONKLIN)</p><p>Os esporos ou endósporos bacterianos consistem em uma parede espessa formada por vários</p><p>envoltórios, no interior de algumas bactérias, altamente resistente ao calor, à dessecação e a</p><p>outros agentes químicos e físicos, permitindo que a bactéria entre em um estado de latência</p><p>por longos períodos. Este processo ocorre quando a bactéria está em condições adversas à</p><p>sua sobrevivência.</p><p>Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock</p><p> Bactéria C. difficile. Bactéria formadora de esporos.</p><p>A parede do esporo é impermeável, mas pode ser atravessada por corantes (como o verde de</p><p>malaquita) quando submetidos ao aquecimento, o que confere aos esporos uma cor verde</p><p>intensa. Associado a isso, essa estrutura não consegue ser descorada pela ação do álcool,</p><p>mas as outras estruturas podem ser descoradas. Para melhorar a visualização e como</p><p>contraste (contracorante), utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em vermelho,</p><p>facilitando a diferenciação dos esporos.</p><p>Como é feita a coloração? Vamos entender?</p><p>Segundo o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):</p><p>Técnica para coloração de esporos</p><p>Preparar esfregaço e fixar pelo calor.</p><p>Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita.</p><p>Aquecer água em um béquer, até a emissão de vapores. Colocar a lâmina sobre este</p><p>béquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos. Alternativamente, cobrir a lâmina</p><p>com verde malaquita e aproximar de uma chama até que desprenda vapor, sem deixar</p><p>que o corante ferva. Afastar do fogo e, após 1 a 2 minutos, repetir a operação por 3 a 4</p><p>vezes.</p><p>Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá quebrar a lâmina.</p><p>Adicionar a solução de safranina por 30 segundos.</p><p>Lavar e secar.</p><p>Observar ao microscópio com objetiva de imersão.</p><p> Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal</p><p>COLORAÇÃO DE CÁPSULA</p><p>Como aprendemos, a cápsula envolve a parede celular, é produzida por algumas espécies</p><p>bactérias e representa uma estrutura muito importante para a patogenicidade da bactéria. Isso</p><p>porque, confere a ação antifagocitária, ou seja, funciona como um mecanismo de fuga da ação</p><p>da fagocitose pelas células do sistema imunológico do indivíduo.</p><p>A cápsula é uma camada gelatinosa composta de açúcares ou polipeptídeos, com caráter</p><p>hidrossolúvel, que pode ser facilmente removida durante as etapas de lavagem durante a</p><p>coloração, o que dificulta a sua coloração. Além disso, a fixação dos esfregaços</p>