2024 SLIDES - CONTROLE MICROBIOLÓGICO - UNIDADE 3 e 4

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<p>CONTROLE DE QUALIDADE</p><p>MICROBIOLÓGICO</p><p>Prof. Msc. Luiza Carolina França Opretzka</p><p>CONTEÚDO</p><p>Aspectos gerais do controle de</p><p>qualidade de produtos</p><p>farmacêuticos</p><p>Análise</p><p>microbiana de</p><p>produtos</p><p>farmacêuticos</p><p>Pirogênios e toxicidade de</p><p>microrganismos</p><p>Métodos de irritação</p><p>ocular e dérmica</p><p>1 2 3 4</p><p>UNIDADE 3</p><p>Pirogênios e toxicidade de microrganismos</p><p>Pirogênios in vitro</p><p>Pirogênios in vivo</p><p>Toxicidade</p><p>Toxicidade → “a capacidade de certas substâncias causarem danos</p><p>a seres vivos.” Ou seja, o potencial de dano.</p><p>TOXICIDADE</p><p>Medicamentos biológicos</p><p>Medicamentos sintéticos</p><p>Cosméticos e produtos de higiene</p><p>Riscos após a exposição</p><p>Forma de exposição</p><p>Tempo de exposição</p><p>Toxicidade → “a capacidade de certas substâncias causarem danos</p><p>a seres vivos.” Ou seja, o potencial de dano.</p><p>TOXICIDADE</p><p>“Todas as substâncias são tóxicas. Não há nenhuma que não seja</p><p>tóxica. A dose estabelece a diferença entre um tóxico e um</p><p>medicamento”.</p><p>- Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim. (Paracelso)</p><p>LOAEL</p><p>NOAEL</p><p>DL50</p><p>CL50 https://doi.org/10.1590/S0100-40422009000700036</p><p>https://doi.org/10.1590/S0100-40422009000700036</p><p>TOXICIDADE</p><p>LOAEL</p><p>(lowest-observed-adverse-effect-</p><p>level)</p><p>“menor dose em que é observado um</p><p>efeito adverso”</p><p>NOAEL</p><p>(no-observed-adverse-effect-level)</p><p>“maior dose em que não são</p><p>observados efeitos tóxicos”</p><p>TOXICIDADE</p><p>DL50 (Dose Letal 50%)</p><p>é a dose na qual se espera que 50%</p><p>dos animais morram.</p><p>CL50 (Concentração Letal 50%)</p><p>é a concentração (no ar) na qual se</p><p>espera que 50% dos animais morram.</p><p>(para a toxicidade por inalação)</p><p>TOXICIDADE</p><p>Substância química LD50 (ratos, via oral)</p><p>(mg/kg massa corporal)</p><p>Sacarose (açúcar de mesa) 29700</p><p>Ácido ascórbico (vitamina C) 11900</p><p>Cloreto de sódio (sal de mesa) 3000</p><p>Paracetamol 1944</p><p>Arsénico 763</p><p>Cafeína (princípio ativo do café) 192</p><p>Nicotina (princípio ativo do tabaco) 50</p><p>Estricnina 16</p><p>Fósforo branco 3,03</p><p>Aflatoxina B1 (micotoxina do fungo Aspergillus) 0,48</p><p>TCDD (dioxina) 0,02</p><p>Testes de toxicidade</p><p>▪Avaliação da toxicidade inerente → valor de</p><p>dose letal 50% (DL50).</p><p>▪Formação de substâncias tóxicas.</p><p>▪Produtos biológicos → componente do meio</p><p>de cultura ou metabolismo celular</p><p>▪Exposição e biodisponibilidade da substância.</p><p>TOXICIDADE</p><p>Testes realizados em:</p><p>Formulações em</p><p>desenvolvimento</p><p>Qualidade/</p><p>conformidade</p><p>▪ TOXICIDADE INERENTE:</p><p>▪ Administração: Efeito local x Efeito sistêmico</p><p>▪ Tempo de resposta: Aguda x Subaguda x Crônica</p><p>TOXICIDADE</p><p>Por que submeter os produtos a ensaios de toxicidade aguda?</p><p>▪ Obter dados para estimar o potencial de dano ao usuário (DL50, CL50);</p><p>▪ Obter informações sobre o mecanismo pelo qual se manifesta a toxicidade;</p><p>▪ Estabelecer dose para testes subsequentes de toxicidade a longo prazo, caso</p><p>se façam necessários;</p><p>▪ Garantir a segurança do consumidor, em ensaios lote a lote, ou periódicos.</p><p>24 horas</p><p>para DL50</p><p>96 horas</p><p>para CL50</p><p>Observação por</p><p>período de 14 dias</p><p>(confirmatório)</p><p>Estudos crônicos:</p><p>1a 2 anos</p><p>Estudos subcrônicos:</p><p>21 a 90 dias</p><p>▪ TOXICIDADE INERENTE:</p><p>▪ Administração: Efeito local | Tempo de resposta: Aguda x Subaguda x Crônica</p><p>TOXICIDADE</p><p>SUBSTÂNCIAS DE USO TÓPICO</p><p>Período de aplicação</p><p>▪ Transitório: até 60 minutos;</p><p>▪ Curto prazo: 60 minutos até 30 dias;</p><p>▪ Longo prazo: > 30 dias.</p><p>Contato com superfície corpórea</p><p>▪ Tempo limitado (menor que 24 h);</p><p>▪ prolongado (24 horas a 30 dias);</p><p>▪ Permanente (acima de 30 dias).</p><p>▪ TOXICIDADE INERENTE:</p><p>▪ Administração: Efeito sistêmico</p><p>TOXICIDADE</p><p>O indicador mais</p><p>usado: DL50</p><p>Ponto final crítico →</p><p>MORTE</p><p>Outros sinais de toxicidade:</p><p>alteração de peso, consumo de</p><p>alimentos, aparência,</p><p>comportamento e tecidos</p><p>anormais, avaliação</p><p>histopatológica.</p><p>Via</p><p>sistêmica</p><p>Adm:</p><p>geralment</p><p>e oral</p><p>Grupos:</p><p>5 machos</p><p>5 fêmeas</p><p>Doses</p><p>variadas</p><p>Animais:</p><p>frequente</p><p>mente</p><p>ratos</p><p>Registrar sinais de</p><p>efeitos tóxicos</p><p>(início/intensidade</p><p>/duração)</p><p>▪ TOXICIDADE INERENTE:</p><p>▪ Administração: Efeito sistêmico | Tempo de resposta: Aguda x Subaguda x Crônica</p><p>TOXICIDADE</p><p>Vias de administração</p><p>Oral, inalação e injeções.</p><p>Testado por mais de uma via de</p><p>administração</p><p>Verificação por qual via a toxicidade</p><p>mais baixa</p><p>Estudo agudos:</p><p>14 dias após administração</p><p>única.</p><p>Estudo subcrônicas:</p><p>de 30 dias a 10% da vida média</p><p>da espécie animal.</p><p>Estudos crônicos:</p><p>Estudos de longo prazo, ou</p><p>tempo de vida</p><p>SUBSTÂNCIAS DE USO SISTÊMICO</p><p>Tempo médio de vida: Camundongos → 18 a 24 meses | Ratos → de 24 a 30 meses | Cachorros e macacos → 5 a 7 anos.</p><p>Estudo de oncogenicidade</p><p>▪ TOXICIDADE INERENTE: Avaliação de toxicidade aguda com efeito</p><p>local</p><p>→ Substância de uso tópico</p><p>TOXICIDADE</p><p>QUAIS TESTES AVALIAM</p><p>TOXICIDADE AGUDA COM</p><p>EFEITO LOCAL??</p><p>UNIDADE 4</p><p>Métodos de irritação ocular e dérmica</p><p>Métodos de irritação ocular</p><p>• Procedimento de Draize</p><p>• Métodos alternativos</p><p>Métodos de irritação dérmica</p><p>• Procedimento de Draize</p><p>• Métodos alternativos</p><p>▪O que é o procedimento de Draize?</p><p>▪Criado na década de 40, o teste Draize tem</p><p>como intuito medir possíveis danos causados</p><p>por substâncias químicas em seres humanos</p><p>através da observação de seus efeitos na</p><p>pele e nos olhos de animais.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO</p><p>LASH LURE continha parafenilenodiamina (PPD), um corante de anilina (alcatrão</p><p>de carvão) que pode causar reação alérgica grave ao redor dos olhos.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>▪Produtos positivos no teste de irritação primária de pele não devem</p><p>ser testados no teste de Draize.</p><p>▪Outros produtos com pH próximo da neutralidade:</p><p>▪ sabonetes levemente ácidos ou básicos, xampus, soluções de limpeza, cremes</p><p>e loções, delineadores, máscaras, desinfetantes, líquidos para enxágue bucal,</p><p>substâncias químicas, pesticidas e muitos outros com potencial considerável de</p><p>contato acidental com os olhos.</p><p>▪Há substâncias químicas que produzem reações severas nos olhos,</p><p>mas não afetam a pele, e vice versa.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>▪ PROCEDIMENTO DE DRAIZE:</p><p>▪ 6 animais</p><p>▪ 0,1 mL de líquido ou 100 mg de sólido instilados no saco conjuntival inferior de um olho</p><p>de cada animal</p><p>▪ Pálpebras mantidas fechadas por um segundo, e a seguir liberadas (o lacrimejamento</p><p>promove a remoção)</p><p>▪ Os olhos não tratados → CONTROLE</p><p>▪ Exame: 1h, 24h (lavagem dos olhos tratados com soro fisiológico), 48h e 72 h após a</p><p>instilação.</p><p>▪ No caso de persistirem reações positivas, as avaliações poderão prosseguir, a critério do</p><p>técnico, no geral até 7 dias.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>▪PARÂMETROS OBSERVADOS</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>▪PARÂMETROS OBSERVADOS</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>Quemose é o inchaço da</p><p>conjuntiva</p><p>Hiperemia é a vermelhidão</p><p>causada por algum agente</p><p>agressor</p><p>▪PARÂMETROS OBSERVADOS</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>▪PARÂMETROS OBSERVADOS</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>Teste de irritação ocular</p><p>com NaOH 1M: Tempo</p><p>zero, 24h, 48 h, 72h e 7</p><p>dias após a aplicação.</p><p>OLHO NORMAL 24h 48h</p><p>72h 7 DIAS</p><p>▪ INTERPRETAÇÃO</p><p>▪Reação positiva: quando um</p><p>animal apresentar qualquer nível</p><p>de:</p><p>▪ ulceração ou opacidade da córnea;</p><p>▪ inflamação da íris</p><p>▪ vasos sanguíneos levemente entumecidos</p><p>▪ quemose / reversão parcial das pálpebras.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>Teste positivo: reação positiva  4 animais</p><p>Teste negativo: reação positiva  1 animal.</p><p>Reteste: reação positiva = 2 – 3 animais.</p><p>▪ INTERPRETAÇÃO</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>1º Reteste</p><p>reação positiva = 2 – 3</p><p>animais.</p><p>2º grupo de 6 animais.</p><p>Teste positivo: reação positiva  4 animais</p><p>Teste negativo: reação positiva  1 animal.</p><p>Reteste: reação positiva = 2 – 3 animais.</p><p>▪ INTERPRETAÇÃO</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>2º Reteste</p><p>reação positiva = 2 – 3</p><p>animais.</p><p>3º grupo de 6 animais.</p><p>Teste positivo: reação positiva em qualquer dos</p><p>animais.</p><p>▪Embora a ampla aceitação mundial, muitos questionamentos foram</p><p>atribuídos ao teste:</p><p>▪Avaliação subjetiva dos resultados</p><p>▪Limitada reprodutibilidade inter-laboratorial</p><p>▪Tempo de duração do ensaio</p><p>▪Super-predição do efeito irritante</p><p>▪Questões</p><p>relacionadas ao bem estar-animal</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>Métodos</p><p>alternativos</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS</p><p>▪VALIDADOS PELO CONCEA:</p><p>▪ II - Para avaliação do potencial de irritação e corrosão ocular:</p><p>▪ Método OECD TG 437 - Teste de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina;</p><p>▪ Método OECD TG 438 - Teste de Olho Isolado de Galinha;</p><p>▪ Método OECD TG 460 - Teste de Permeação de Fluoresceína.</p><p>▪ Método OECD TG 491 - Teste in vitro de curta duração para danos oculares;</p><p>▪ Método OECD TG 492 - Epitélio corneal humano reconstruído;</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS - Método OECD TG 437 - Teste de Permeabilidade e</p><p>Opacidade de Córnea Bovina;</p><p>Avalia-se:</p><p>▪ Opacidade</p><p>▪ Opacitômetro</p><p>▪ Transmissão do Fluxo de luz</p><p>▪ Permeabilidade</p><p>▪ Tempo de contato</p><p>▪ Adiciona-se fluoresceína</p><p>→ densidade óptica medida a 490nm.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>córnea de olhos de bovinos</p><p>(que seriam descartados)</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS - Método OECD TG 492 - Epitélio corneal humano reconstruído;</p><p>▪ Modelo de epitélio estratificado altamente diferenciado, semelhante à epiderme da</p><p>córnea → Citotoxicidade por MTT - subst. puras e misturas</p><p>▪ Permite a classificação de substância não irritantes → viabilidade > 60%</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS - HET-CAM Ensaio da membrana cório-alantoide de ovo</p><p>embrionado de galinha;</p><p>▪ A membrana cório-alantóide (CAM) do ovo embrionado de galinha (10º dia)</p><p>apresenta tecido altamente vascularizado com características estruturais semelhantes</p><p>a conjuntiva ocular que possibilita avaliar o efeito irritante.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>Os efeitos observados são:</p><p>→ Hemorragia (sangramento dos vasos)</p><p>→ Lise vascular (desintegração dos vasos)</p><p>→ Coagulação (desnaturação proteica intra e extra vascular)</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS - HET-CAM Ensaio da membrana cório-alantoide de ovo</p><p>embrionado de galinha;</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO OCULAR</p><p>▪Avaliam:</p><p>▪ IRRITAÇÃO CUTÂNEA</p><p>▪CORROSÃO CUTÂNEA</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>• Produção de danos reversíveis na pele após a aplicação de uma</p><p>substância química teste por até 4 horas.</p><p>• É causada por uma reação inflamatória local envolvendo o sistema</p><p>imunológico inato (não específico) do tecido da pele.</p><p>• Sinais clínicos característicos: eritema, edema, prurido e dor.</p><p>• Produção de danos irreversíveis da pele; isto é, necrose visível</p><p>através da epiderme e na derme, após a aplicação de uma substância</p><p>química teste por até 4 horas.</p><p>• Reações caracterizadas por: úlceras, sangramento, feridas sangrentas</p><p>e, ao final da observação, aos 14 dias, por descoloração devido ao</p><p>branqueamento da pele, áreas completas de alopecia e cicatrizes.</p><p>▪PROCEDIMENTO DE DRAIZE:</p><p>▪ No mínimo seis coelhos para cada condição de pele.</p><p>▪ Área de aproximadamente 6,0 cm2 (1 polegada quadrada) → depilar</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>Abrasão em 2</p><p>dos 4 sítios</p><p>Abrasão → promover o efeito máximo de um agente irritante (absorção percutânea como fator limitante)</p><p>▪PROCEDIMENTO DE DRAIZE:</p><p>▪ Substância-teste: 0,5 mL para líquidos ou 0,5 g para sólidos (semissólidos são</p><p>dissolvidos)</p><p>▪ Cobrir com duas camadas de gaze cirúrgica, fixas por fita adesiva.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>AMOSTRA AMOSTRA</p><p>CONTROLE CONTROLE</p><p>▪PROCEDIMENTO DE DRAIZE:</p><p>▪ Envolver em material impermeável por</p><p>24 horas</p><p>▪ Manter a amostra aplicada no local</p><p>▪ Retardar a evaporação de</p><p>substâncias voláteis.</p><p>▪ Após 24h → Analisar as reações</p><p>resultantes (1ª leitura)</p><p>▪ Após 72 horas → 2ª leitura</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>REAÇÕES DÉRMICAS</p><p>ERITEMA | EDEMA |ESCARA</p><p>▪PROCEDIMENTO DE DRAIZE:</p><p>▪ Envolver em material impermeável por</p><p>24 horas</p><p>▪ Manter a amostra aplicada no local</p><p>▪ Retardar a evaporação de</p><p>substâncias voláteis.</p><p>▪ Após 24h → Analisar as reações</p><p>resultantes (1ª leitura)</p><p>▪ Após 72 horas → 2ª leitura</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>REAÇÕES DÉRMICAS</p><p>ERITEMA | EDEMA |ESCARA</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS</p><p>▪VALIDADOS PELO CONCEA:</p><p>▪ I - Para avaliação do potencial de irritação e corrosão da pele:</p><p>▪ Método OECD TG 430 - Corrosão dérmica in vitro: Teste de Resistência Elétrica Transcutânea;</p><p>▪ Método OECD TG 431 - Corrosão dérmica in vitro: Teste da Epiderme Humana Reconstituída;</p><p>▪ Método OECD TG 435 - Teste de Barreira de Membrana in vitro; e</p><p>▪ Método OECD TG 439 - Teste de irritação Cutânea in vitro.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS - Método OECD TG 431 - Corrosão dérmica in vitro: Teste da</p><p>Epiderme Humana Reconstituída;</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS</p><p>Teste de Barreira de Membrana in vitro;</p><p>▪O sistema de teste compreende dois</p><p>componentes:</p><p>▪ Biobarreira macromolecular sintética</p><p>(Gel proteico)</p><p>▪ Sistema de detecção química</p><p>▪ Detecta, através da membrana de</p><p>barreira, os danos causados por</p><p>substâncias químicas em teste de maneira</p><p>similar à da pele do animal.</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>▪MÉTODOS ALTERNATIVOS - Teste de Barreira de Membrana in vitro;</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO DÉRMICA</p><p>Utilizado para tomar</p><p>decisões sobre a</p><p>corrosividade e a não-</p><p>corrosividade de classes</p><p>específicas de produtos</p><p>químicos</p><p>▪Leitura recomendada:</p><p>TESTES DE IRRITAÇÃO</p><p>OBRIGADA!!</p><p>NOME DO</p><p>APRESENTADOR</p><p>CONTATOSCARGO</p><p>Slide 1</p><p>Slide 2</p><p>Slide 3</p><p>Slide 4</p><p>Slide 5</p><p>Slide 6</p><p>Slide 7</p><p>Slide 8</p><p>Slide 9</p><p>Slide 10</p><p>Slide 11</p><p>Slide 12</p><p>Slide 13</p><p>Slide 14</p><p>Slide 15</p><p>Slide 16</p><p>Slide 17</p><p>Slide 18</p><p>Slide 19</p><p>Slide 20</p><p>Slide 21</p><p>Slide 22</p><p>Slide 23</p><p>Slide 24</p><p>Slide 25</p><p>Slide 26</p><p>Slide 27</p><p>Slide 28</p><p>Slide 29</p><p>Slide 30</p><p>Slide 31</p><p>Slide 32</p><p>Slide 33</p><p>Slide 34</p><p>Slide 35</p><p>Slide 36</p><p>Slide 37</p><p>Slide 38</p><p>Slide 39</p><p>Slide 40</p><p>Slide 41</p><p>Slide 42</p>