Relatório 10 - Análise Instrumental

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍCA 
PROF.: FÁBIO GRANDIS LEPRI 
 
 
 
 
CROMATOGRAFIA EM FASE LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA (HPLC) 
 
 
 
 
 
PAULO VITOR DA SILVA BRAGA (622028038) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Niterói - RJ 
 2025 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
A cromatografia constitui uma técnica analítica essencial para a separação do analito 
dos demais constituintes presentes em uma amostra, permitindo a eliminação de 
interferentes durante a medição do sinal analítico. No contexto da cromatografia 
líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC - High Performance Liquid 
Chromatography), empregam-se duas fases distintas: a fase móvel e a fase 
estacionária [1]. 
A fase móvel consiste em um líquido que é impulsionado através da coluna 
cromatográfica por meio de pressão gerada por uma bomba. A amostra é 
introduzida via injetor equipado com microseringa, sendo encaminhada para a 
coluna onde ocorre a separação dos seus componentes em bandas distintas. Ao 
final da coluna, essas bandas são detectadas por um detector apropriado, e os 
sinais correspondentes são registrados por um sistema de registro, como demonstra 
a figura 1 [1]. Além da coluna principal, o equipamento dispõe de uma pré-coluna 
cuja função é proteger a coluna principal contra danos. A eficiência da separação é 
favorecida pelo aumento do comprimento da coluna, o que se traduz em maior 
número de pratos teóricos e, consequentemente, em melhor resolução do 
cromatograma. Os detectores empregados em CLAE podem basear-se em absorção 
de radiação ultravioleta ou visível, espectrometria de massas, fluorescência, entre 
outros [2]. 
 
Figura 1: Diagrama esquemático simplificado de um cromatógrafo a líquido. 
A capacidade de resolução de uma coluna cromatográfica operando em fase líquida 
é um fator fundamental para a eficiência e precisão da separação dos componentes 
de uma mistura complexa. Entre os principais parâmetros que determinam essa 
capacidade destacam-se a altura e o número de pratos teóricos. O número de pratos 
teóricos (N) é uma medida da eficiência da coluna, enquanto a altura do prato 
 
 
teórico (H) indica a separação em termos de comprimento da coluna por prato, 
sendo inversamente proporcional a N, segundo a relação , onde L é o 𝑁 = 𝐿
𝐻
comprimento da coluna. A equação de Van Deemter é amplamente utilizada para 
descrever a variação da altura do prato teórico em função da velocidade móvel (u), 
sendo dada por [2]: 
 𝐻 = 𝐴 + 𝐵
𝑢 + 𝐶 × 𝑢
Onde A representa a contribuição do fluxo de massa em regime turbulento 
(convecção e eddies), B está relacionado à difusão longitudinal dos solutos, e C 
refere-se à resistência à transferência de massa entre as fases móvel e estacionária. 
A otimização da velocidade móvel permite minimizar H e, consequentemente, 
maximizar o número de pratos teóricos, melhorando assim a eficiência da coluna. O 
poder de resolução (R) entre dois picos adjacentes, que indica a separação entre 
eles, pode ser calculado pela equação [2]: 
 𝑅 = 
2×(𝑡
𝑅2
− 𝑡
𝑅1
) 
𝑤
1
+ 𝑤
2
Onde tR1 e tR2 são os tempos de retenção dos dois picos, e w1 e w2 são as larguras 
dos picos na base. Valores de R ≥ 1,5 indicam uma separação completa dos picos, 
assegurando a boa resolução analítica. Quanto aos parâmetros qualitativos, eles 
envolvem o reconhecimento e identificação dos compostos presentes na amostra, 
em geral obtida pela comparação dos tempos de retenção e características 
espectrais dos analitos com padrões conhecidos. Já os parâmetros quantitativos 
referem-se à determinação da concentração dos componentes, frequentemente 
realizados por meio da construção de curvas analíticas utilizando áreas ou alturas 
dos picos, garantindo linearidade, precisão e exatidão do método. Assim, a 
interpretação correta dos resultados qualitativos e quantitativos é essencial para 
garantir a confiabilidade da análise cromatográfica em fase líquida [2]. 
A cromatografia pode ser classificada em fase normal ou fase reversa, 
diferenciando-se principalmente pela polaridade relativa entre as fases móvel e 
estacionária. Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de fase reversa, a 
fase estacionária é apolar, enquanto a fase móvel apresenta polaridade moderada 
ou contém componentes polares. A fase estacionária mais comum consiste em sílica 
 
 
quimicamente modificada com grupos alquila C18, conferindo caráter hidrofóbico à 
coluna. Nessa modalidade, compostos menos polares apresentam maior retenção 
na fase estacionária, enquanto os mais polares eluem mais rapidamente. A 
cromatografia em fase reversa é a técnica predominante atualmente no campo 
analítico. Em contraste, a cromatografia de fase normal utiliza uma fase estacionária 
polar e uma fase móvel apolar, sendo mais adequada para a separação de 
compostos polares. A escolha entre fase normal e fase reversa depende das 
propriedades químicas dos analitos a serem separados, com a fase reversa 
apresentando maior versatilidade para compostos apolares e complexos. Esta 
distinção é fundamental para a aplicação correta da CLAE em diferentes contextos 
analíticos, maximizando a eficiência da separação e a qualidade dos resultados 
obtidos em pesquisas químicas [3]. 
Quanto aos métodos de eluição, a eluição isocrática é realizada com um único 
solvente ou mistura de solventes de composição constante, enquanto a eluição por 
gradiente envolve o uso de dois ou mais solventes com polaridades distintas, 
permitindo um controle mais eficiente da separação ao longo do tempo [3]. 
 
 
2. OBJETIVO 
Obtenção de um cromatograma para a cafeína e determinação do número de pratos 
teóricos (N) para a cafeína sob cada condição de análise. Além disso, calcular a 
resolução entre o pico de KNO3 e à cafeína. 
 
3. MATERIAIS E REAGENTES 
• Béqueres; 
• Tubos de falcon; 
• Padrão de KNO3 25 ppm ; 
• Padrão de cafeína 25 ppm; 
• Micropipetas automáticas; 
 
 
• Cromatógrafo a líquido Shimadzu modelo Prominence modo isocrático operando 
com coluna C18; 
• Água destilada previamente filtrada ; 
• Metanol previamente filtrada; 
 
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
Partindo-se de soluções padrões de 1000 ppm de cafeína e KNO3 preparou-se a 
solução em um tubo de falcon visando obter concentração final de 25 ppm de cada 
analito. Portanto, transferiu-se 250 µL da solução padrão de cafeína e 250 µL da 
solução padrão de KNO3 para um tubo de falcon de 10 mL, completando-se o 
volume com água destilada até atingir 10 mL e obtendo-se, assim, soluções a 25 
ppm de cada composto. 
Para a análise cromatográfica, utilizou-se um cromatógrafo Shimadzu operando em 
modo isocrático, equipado com coluna C18. A fase móvel empregada foi metanol e 
água na proporção de 70:50 (v/v), com vazão ajustada a 0,700 mL min⁻¹. As 
amostras foram injetadas manualmente utilizando alça de amostragem, com volume 
de injeção de 20 µL. A detecção foi realizada por absorção molecular no UV, nos 
comprimentos de onda de 215,0 nm e 273,0 nm, sendo a área de pico utilizada para 
quantificação. Repetiu-se esse mesmo procedimento para uma fase móvel de 
metanol e água na proporção de 50:50 (v/v). 
 
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 
Os cromatogramas obtidos para as soluções padrão de cafeína evidenciaram picos 
bem definidos e reprodutíveis sob todas as condições cromatográficas avaliadas,em 
25 ppm (figura 2) e 50 ppm (figura 3). Em cada análise, o analito apresentou tempo 
de retenção distinto, variando de acordo com a composição da fase móvel e o fluxo 
aplicado. A morfologia dos picos, caracterizada por simetria adequada e ausência de 
cauda expressiva, indicou que as condições operacionais foram apropriadas para a 
eluição da cafeína em coluna C18. 
 
 
 
Figura 2: Cromatograma contendo o pico da cafeína em 25 ppm. 
 
Figura 3: Cromatograma contendo o pico da cafeínaem 50 ppm. 
 
A Tabela 1 apresenta os parâmetros cromatográficos determinados para os padrões 
de KNO₃ e cafeína na concentração de 25 ppm, analisados sob diferentes condições 
de fase móvel e vazão. Foram registrados os tempos de retenção e as áreas da 
base dos picos para cada composto, permitindo avaliar a influência das condições 
de eluição na eficiência da separação. Esses dados constituem a base para o 
cálculo do número de pratos teóricos e da resolução entre os picos, além de 
servirem como referência para as análises quantitativas subsequentes. 
Condição de análise 
Fase móvel 
MeOH:H2O 
50:50 
Fase móvel MeOH:H2O 
70:30 
Vazão 
Condição 
A: 0,7 
mL/min 
Condição 
B: 0,7 
mL/min 
Condição 
C: 0,4 
mL/min 
Tempo de retenção do KNO3 no padrão 
(25,0 ppm) / min 3,50 3,40 6,10 
 
 
Tempo de retenção da cafeína no padrão 
(25,00 ppm) / min 7,60 6,30 11,40 
Área da base do pico do KNO3 no padrão 
(25,00 ppm) / min 3,20 a 3,80 3,00 a 3,60 5,00 a 6,50 
Área da base do pico da cafeína no 
padrão (25,00 ppm) / min 7,30 a 7,90 6,00 a 6,80 
11,00 a 
12,00 
Tabela 1: Parâmetros cromatográficos obtidos para os padrões de KNO₃ e cafeína (25 ppm) sob 
diferentes condições de fase móvel e vazão. 
A eficiência da coluna foi investigada mediante determinação do número de pratos 
teóricos (N) para o pico correspondente à cafeína. O cálculo foi realizado utilizando a 
relação entre o tempo de retenção (tR) e a largura do pico na base (Wb), conforme 
descrito pela equação: 
 𝑁 = 16 ×
𝑡
𝑟
𝑤
𝑏
( )2
Para condição A: 𝑁 = 16 × 7,60
7,90−7,30( )2
= 2567, 11
Para condição B: 𝑁 = 16 × 6,30
6,80−6,00( )2
= 992, 25
Para condição C: 𝑁 = 16 × 11,40
12,00−11,00( )2
= 2079, 39
A condição A, com fase móvel MeOH:H2O 50:50 e vazão de 0,7 mL/min, apresentou 
o maior número de pratos teóricos (N = 2567,11), indicando maior eficiência 
cromatográfica entre as condições avaliadas. Esta condição proporcionou picos mais 
estreitos e um tempo de retenção adequado, favorecendo melhor resolução dos 
analitos. Já a condição C, com proporção maior de metanol (70%) e vazão reduzida 
(0,4 mL/min), apresentou número de pratos teóricos intermediário (N = 2079,39), 
demonstrando que a redução da vazão compensou parcialmente o efeito da maior 
concentração de metanol, que geralmente diminui a eficiência do método. Por sua 
vez, a condição B, com 70% de metanol e vazão de 0,7 mL/min, teve o menor 
número de pratos teóricos (N = 992,25), refletindo menor eficiência, provavelmente 
pela combinação entre maior teor de metanol e vazão elevada, que aumenta a 
dispersão e prejudica a separação [2]. 
 
 
Esses resultados corroboram a literatura, que aponta que a diminuição da vazão 
reduz a dispersão do analito na coluna e melhora a eficiência cromatográfica, 
enquanto o aumento do solvente orgânico tende a diminuir o tempo de retenção e 
pode comprometer a resolução devido à menor interação analito-fase estacionária. 
Assim, a otimização do método analítico depende do equilíbrio entre a composição 
da fase móvel e a vazão, para garantir alta eficiência e boa resolução na análise por 
HPLC [2]. 
A seletividade do método foi avaliada pela determinação da resolução (Rs) entre os 
picos de KNO₃ e cafeína, calculada pela seguinte expressão: 
 𝑅 = 
2×(𝑡
𝑅2
− 𝑡
𝑅1
) 
𝑤
1
+ 𝑤
2
Para condição A: 𝑅 = 2×(7,60− 3,50) 
0,6+0,6 = 6, 83
Para condição B: 𝑅 = 2×(6,3− 3,40) 
0,8+0,6 = 4, 14
Para condição C: 𝑅 = 2×(11,4− 6,10) 
1+0,5 = 6, 09
A condição A exibiu a maior resolução (6,83), indicando uma separação superior dos 
picos analíticos, o que reflete o equilíbrio adequado entre a proporção da fase móvel 
e a vazão empregada. Essa elevada resolução assegura que os analitos são bem 
separados, minimizando a sobreposição dos picos e garantindo maior acurácia na 
quantificação [3]. Na condição C, com resolução de 6,09, observou-se uma 
eficiência separativa também satisfatória, iniciando da redução da vazão como fator 
compensatório para o aumento da proporção de metanol na fase móvel, que 
usualmente tende a diminuir o tempo de retenção e aumentar a dispersão dos picos. 
Já a condição B apresentou a menor resolução (4,14), indicando menor eficiência na 
separação dos picos, o que pode acarretar em sobreposição e dificultar análises 
quantitativas precisas. Esse desempenho inferior é atribuído à combinação da maior 
concentração de metanol com a vazão elevada, que reduz o tempo de retenção e 
aumenta a dispersão do pico [3]. Portanto, a otimização da condição cromatográfica, 
especialmente na escolha equilibrada entre a composição da fase móvel e a vazão, 
 
 
mostrou-se essencial para garantir altos níveis de resolução e qualidade analítica no 
método HPLC desenvolvido. 
 
6. CONCLUSÃO 
A análise cromatográfica dos padrões de cafeína e KNO3 demonstrou que as 
condições de fase móvel e vazão exercem influência direta sobre a eficiência e 
seletividade do método HPLC. A condição A, com fase móvel MeOH:H2O 50:50 e 
vazão de 0,7 mL/min, apresentou o melhor desempenho, evidenciado pelo maior 
número de pratos teóricos e a maior resolução entre os picos. Isso indica picos mais 
estreitos, melhor separação dos analitos e maior qualidade analítica. 
 
7. BIBLIOGRAFIA 
[1] KÜCHLER, Ivo; RODRIGUES, Silvana; MOREIRA, Soly. Apostila de Análise 
Instrumental I Experimental. Atualizada por FÁBIO GRANDIS LEPRI. Universidade 
Federal Fluminense, [S.l.], 2023. p. 32-35. 
[2] SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Princípios de análise 
instrumental. Porto Alegre. 2008. 5ª Ed. Bookman. p. 641-67. 
[3] HARVEY, Daniel. High-Performance Liquid Chromatography. In: Analytical 
Chemistry 2.1. LibreTexts, [s.d.]. Disponível em: 
. Acesso em: 20 nov. 2025. 
 
https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Analytical_Chemistry/Analytical_Chemistry_2.1_(Harvey)/12%3A_Chromatographic_and_Electrophoretic_Methods/12.05%3A_High-Performance_Liquid_Chromatography
https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Analytical_Chemistry/Analytical_Chemistry_2.1_(Harvey)/12%3A_Chromatographic_and_Electrophoretic_Methods/12.05%3A_High-Performance_Liquid_Chromatography
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