Purificação de DNA

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<p>Extração e Purificação de DNA e</p><p>RNA</p><p>Apresentação</p><p>1. OBJETIVO</p><p>Nesta prática laboratorial, você vai entender como ocorre a técnica de isolamento das moléculas</p><p>de DNA ou RNA. Seja em um laboratório ou em qualquer outra instituição, os princípios, os</p><p>reagentes e as etapas dos protocolos de extração e purificação de DNA ou RNA são similares.</p><p>Ao final deste experimento, você deverá ser capaz de:</p><p>analisar as funções e as finalidades de cada reagente e/ou material descritos no protocolo</p><p>de extração e purificação de DNA ou RNA;</p><p>•</p><p>definir cada etapa descrita no protocolo de extração e purificação de DNA ou RNA;•</p><p>alterar protocolos preexistentes, de acordo com suas necessidades e disponibilidade de</p><p>reagentes.</p><p>•</p><p>2. ONDE UTILIZAR ESSES CONCEITOS?</p><p>A extração e purificação de moléculas de DNA ou RNA é uma das principais técnicas que</p><p>compõem os diversos processos metodológicos utilizados na biologia molecular. No cotidiano,</p><p>essa técnica corresponde a uma das etapas primordiais utilizadas em muitas aplicações, como</p><p>em exames laboratoriais para a detecção de infecções ou doenças (como a covid-19), anomalias</p><p>genéticas e, até mesmo, na sexagem fetal. Além disso, as etapas posteriores à extração e</p><p>purificação de DNA ou RNA também são utilizadas nas indústrias, por meio da engenharia</p><p>genética, para a síntese de drogas/remédios ou para a produção de seus princípios ativos.</p><p>3. O EXPERIMENTO</p><p>Consiste em quatro etapas principais:</p><p>ruptura das membranas celulares e nucleares para liberação do material genético (DNA ou</p><p>RNA);</p><p>1.</p><p>separação e isolamento do DNA ou RNA de outros componentes celulares, por meio de</p><p>colunas de sílica ou precipitação;</p><p>2.</p><p>lavagens para a retirada de contaminantes, como sais, que podem interferir na qualidade do</p><p>material genético isolado;</p><p>3.</p><p>eluição e/ou ressuspensão do DNA ou RNA.4.</p><p>4. SEGURANÇA</p><p>Neste experimento, você deverá utilizar touca, luvas, jaleco, máscara, óculos de proteção e</p><p>sapatos fechados. Também deverá tomar muito cuidado durante a manipulação e a abertura de</p><p>tampões que contenham solventes orgânicos, como fenol/clorofórmio, pois podem causar</p><p>irritações nas mucosas.</p><p>5. CENÁRIO</p><p>O experimento deverá ser realizado em bancada devidamente limpa com água sanitária, na</p><p>concentração entre 1% a 2%, e álcool 70%. Aconselha-se forrar a bancada com papel kraft ou</p><p>outro tipo de papel absorvente, para proteção tanto do local onde será realizado o experimento</p><p>quanto de quem estiver próximo, caso haja algum acidente.</p><p>Bons estudos.</p><p>Sumário teórico</p><p>EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA E RNA</p><p>1. INTRODUÇÃO</p><p>As moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA – deoxyribonucleic acid) e de ácido ribonucleico</p><p>(RNA – ribonucleic acid) são formadas por pequenas estruturas denominadas nucleotídeos. Os</p><p>nucleotídeos, por sua vez, são formados por um açúcar composto por cinco carbonos (pentose),</p><p>um grupamento fosfato e uma base nitrogenada (adenina, timina ou uracila, guanina e citosina).</p><p>Cada base nitrogenada diferencia-se da outra pela composição de sua estrutura química.</p><p>Entretanto, elas apresentam similaridades entre si. Por exemplo, a citosina (C), a timina (T) e a</p><p>uracila (U) são classificadas como pirimidinas, porque suas estruturas provêm do anel das</p><p>pirimidinas, com seis átomos. Já a guanina (G) e adenina (A) são classificadas como purinas,</p><p>porque suas estruturas são compostas de dois anéis, um com seis átomos e o outro com cinco.</p><p>A junção dos nucleotídeos resultará na síntese das moléculas de DNA ou RNA, e ocorre por meio</p><p>de ligações fosfodiéster. As ligações fosfodiéster se devem ao ataque nucleofílico de uma</p><p>hidroxila da pentose de um nucleotídeo ao grupamento fosfato do nucleotídeo anterior, resultando</p><p>em uma estrutura semelhante a um “colar de miçangas”, no qual cada “miçanga” corresponde a</p><p>um nucleotídeo e o “cordão” que as une é a ligação fosfodiéster.</p><p>É interessante ressaltar que, em 1953, Watson e Crick propuseram o modelo tridimensional das</p><p>moléculas de DNA com base em descobertas anteriores de difração por raio X das fitas de DNA e</p><p>experimentos realizados por outros cientistas, como Erwin Chargaff. Nesse modelo, as fitas de</p><p>DNA foram caracterizadas como uma dupla-hélice formada por duas cadeias helicoidais</p><p>enroladas ao próprio eixo. Uma das forças que mantêm essa dupla-hélice são as ligações de</p><p>hidrogênio entre os pares de bases nitrogenadas que são denominadas como complementares</p><p>(adenina e timina/uracila e citosina e guanina). Cada porção do “colar de miçanga” (nucleotídeos)</p><p>tem regiões específicas, chamadas de genes. Os genes são responsáveis por todas as</p><p>características que um indivíduo herda de seus ancestrais. Cada gene tem regiões conhecidas</p><p>como éxons e íntrons. Os íntrons são geralmente porções do gene responsáveis por mecanismos</p><p>de regulação, enquanto os éxons são responsáveis pela síntese de proteínas. Os íntrons e os</p><p>éxons são organizados e separados pelo mecanismo de splicing da molécula de RNA transcrita</p><p>da fita de DNA.</p><p>O DNA é dividido em cromossomos, e cada gene tem um “lugar” específico no cromossomo,</p><p>denominado lócus. Cada espécie tem um conjunto característico de cromossomos. Por exemplo,</p><p>o genoma (informação genética) humano tem 22 cromossomos diferentes, sendo mais dois</p><p>cromossomos os sexuais (X ou Y). Dessa forma, cada célula (com exceção das de linhagem</p><p>germinativa e outros tipos muito raros, que não são capazes de se dividir) tem duas cópias de</p><p>cada um desses cromossomos, resultando em um total de 46 cromossomos. Por outro lado, as</p><p>bactérias têm um único DNA, no qual todos os genes estão distribuídos.</p><p>Diante do exposto, os ácidos nucleicos apresentam características estruturais específicas que</p><p>permitem que sejam isolados e manipulados para diversos tipos de aplicações. A técnica de</p><p>hibridização in situ, por exemplo, baseia-se na complementaridade das fitas de DNA ou RNA,</p><p>utilizando sondas fluorescentes para a detecção da fita complementar em uma determinada</p><p>amostra. Essa técnica permite o estudo da expressão gênica. Outra técnica, que também tem o</p><p>mesmo princípio e finalidade, é a reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa (RT-</p><p>PCR), muito utilizada no diagnóstico de algumas infecções e doenças. À vista disso, o primeiro</p><p>passo para a maioria das técnicas citadas é o isolamento e purificação das moléculas de DNA e</p><p>RNA, que será apresentado detalhadamente a seguir.</p><p>2. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA OU RNA</p><p>As técnicas de extração e purificação das moléculas de ácidos nucleicos (DNA ou RNA) têm</p><p>basicamente dois princípios: a extração do DNA ou RNA, por meio da lise das membranas</p><p>celulares, e a purificação das moléculas de DNA ou RNA, por meio da exclusão de outros</p><p>componentes celulares, como proteínas, e de lavagens específicas. Assim, cada protocolo</p><p>utilizará sempre esses mesmos princípios. Entretanto, o que muda entre um protocolo e outro?</p><p>Ao se explicarem as finalidades e funções de cada reagente utilizado nas etapas de purificação</p><p>do DNA ou RNA, as mudanças entre os protocolos ficarão mais claras.</p><p>A primeira etapa, como já citado, é a lise das membranas celulares. Para isso, geralmente, são</p><p>utilizados alguns tipos de detergentes, como o SDS (dodecil sulfato de sódio) e o CTAB (brometo</p><p>de cetiltrimetilamônio).</p><p>A segunda etapa envolve a separação do DNA dos outros componentes celulares, como as</p><p>proteínas. Para isso, são utilizados diversos tipos de reagentes, como: 1) agentes desnaturantes</p><p>de proteínas, como o tiocianato de guanidina, a proteinase K (faz a “digestão” das proteínas que</p><p>podem degradar os ácidos nucleicos ou daquelas que podem estar associadas a eles), o β-</p><p>mercaptoetanol (“quebra” as ligações dissulfeto formadas entre os aminoácidos de cisteínas das</p><p>proteínas); 2) agentes “quelantes”, como o EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), tanto para a</p><p>remoção de outros contaminantes, como taninos e polifenóis, quanto para a inativação de íons de</p><p>magnésio necessários para a atividade enzimática da DNAse (uma</p><p>enzima que cliva o DNA,</p><p>resultando em sua degradação); e 3) um tampão alcalino composto de Tris (pH 8,0) que,</p><p>juntamente com altas concentrações de um sal (geralmente, cloreto de sódio), auxilia na</p><p>neutralização das cargas negativas das moléculas de DNA ou RNA e na posterior precipitação</p><p>dessas moléculas.</p><p>Alternativamente, usam-se solventes orgânicos, em vez de altas concentrações de sais, como o</p><p>fenol e/ou o clorofórmio, que auxiliam na degradação das proteínas e na formação de duas fases:</p><p>uma solúvel, em que as moléculas de DNA ou RNA são dissolvidas, e uma insolúvel, na qual se</p><p>encontram os restos ou debris celulares, as proteínas e outros componentes celulares diferentes</p><p>dos ácidos nucleicos.</p><p>Outra alternativa para a não utilização de solventes orgânicos – que podem irritar as mucosas e</p><p>tornarem-se tóxicos – é o uso das colunas de sílica. As colunas de sílica são extremamente</p><p>versáteis na purificação do DNA ou RNA, porque são compostas de cargas positivas e, portanto,</p><p>têm alta afinidade com as moléculas de ácidos nucleicos de carga negativa. Geralmente, kits</p><p>comercialmente disponíveis utilizam essas colunas de sílica para a separação dos ácidos</p><p>nucleicos. Entretanto, além da lise e da separação do DNA ou RNA de outros componentes</p><p>celulares por meio da sílica, durante o uso desses kits comerciais, há algumas etapas adicionais</p><p>de lavagens, seguidas da eluição do DNA ou RNA da sílica com o auxílio de água ou tampões de</p><p>baixa força iônica (pH ≥ 7,0). Ainda, após a separação de DNA ou RNA de outros componentes</p><p>celulares, para a garantia da máxima pureza, os ácidos nucleicos são precipitados em etanol ou</p><p>isopropanol na presença de cátions monovalentes. Nessa fase, dependendo da quantidade de</p><p>DNA ou RNA extraído, eles ficam visíveis a “olho nu” como um precipitado branco.</p><p>3. CUIDADOS COM AS AMOSTRAS</p><p>As amostras contendo o DNA ou RNA purificados devem ser: 1) ressuspensas em um tampão e</p><p>armazenadas em tubos, ambos “livres” de enzimas que possam degradá-las (como DNAse ou</p><p>RNAse – nucleases); e 2) mantidas em baixas temperaturas (–20oC ou –80oC). Todos os</p><p>procedimentos devem ser realizados com luvas para evitar a degradação das amostras, devido à</p><p>presença de nucleases nos fluidos corporais das mãos.</p><p>REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS</p><p>ALBERTS, Bruce et al. Biologia molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. 1.728 p.</p><p>ISBN 978-85-363-2170-7.</p><p>BROWN, Theodore L. et al. Química: a ciência central. 9. ed. São Paulo: Pearson Prentice Hall,</p><p>2005. 987 p. ISBN 85-87918-42-7.</p><p>CHACON-CORTES, Diego; GRIFFITHS, Lyn R. Methods for extracting genomic DNA from whole</p><p>blood samples: current perspectives. Journal of Biorepository Science for Applied Medicine.</p><p>2014; 2:1-9. Disponível em: https://doi.org/10.2147/BSAM.S46573. Acesso em: 11 fev. 2021.</p><p>GRIFFITHS, Anthony J. F. et al. Introdução à genética. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara</p><p>Koogan, 2008. 712 p. ISBN 978-85-277-1497-6.</p><p>LODISH, Harvey et al. Biologia celular e molecular. 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 1.210 p.</p><p>ISBN 978-85-8271-050-0.</p><p>NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. 6. ed. Porto</p><p>Alegre: Artmed, 2014. 1.220 p. ISBN 978-85-8271-073-9.</p><p>REECE, Jane B. et al. Biologia de Campbell. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2015. 1.442 p. ISBN</p><p>978-85-8271-230-6.</p><p>https://doi.org/10.2147/BSAM.S46573.</p><p>Roteiro</p><p>INSTRUÇÕES GERAIS</p><p>1. Neste experimento, você irá realizar a extração e purificação do DNA e RNA.</p><p>2. Utilize a seção “Recomendações de Acesso” para melhor aproveitamento da experiência</p><p>virtual e para respostas às perguntas frequentes a respeito do Laboratório Virtual.</p><p>3. Caso não saiba como manipular o Laboratório Virtual, utilize o “Tutorial” presente neste</p><p>Roteiro.</p><p>4. Caso já possua familiaridade com o Laboratório Virtual, você encontrará as instruções para</p><p>realização desta prática na subseção “Procedimentos”.</p><p>5. Ao finalizar o experimento, responda aos questionamentos da seção “Avaliação dos</p><p>Resultados”.</p><p>RECOMENDAÇÕES DE ACESSO</p><p>DICAS DE DESEMPENHO</p><p>Para otimizar a sua experiência no acesso aos laboratórios virtuais, siga as seguintes dicas de</p><p>desempenho:</p><p>Feche outros aplicativos e abas: Certifique-se de fechar quaisquer outros aplicativos ou</p><p>abas que possam estar consumindo recursos do seu computador, garantindo um</p><p>desempenho mais eficiente.</p><p>•</p><p>Navegador Mozilla Firefox: Recomendamos o uso do navegador    Mozilla Firefox,</p><p>conhecido por seu baixo consumo de recursos em comparação a outros navegadores,</p><p>proporcionando uma navegação mais fluida.</p><p>•</p><p>Aceleração de hardware: Experimente habilitar ou desabilitar a aceleração de hardware no</p><p>seu navegador para otimizar o desempenho durante o acesso aos laboratórios virtuais.</p><p>•</p><p>Requisitos mínimos do sistema: Certifique-se de que seu computador atenda aos</p><p>requisitos mínimos para acessar os laboratórios virtuais. Essa informação está disponível em</p><p>nossa Central de Suporte.</p><p>•</p><p>Monitoramento do sistema: Utilize o Gerenciador de Tarefas (Ctrl + Shift + Esc) para</p><p>verificar o uso do disco, memória e CPU. Se estiverem em 100%, considere fechar outros</p><p>aplicativos ou reiniciar a máquina para otimizar o desempenho.</p><p>•</p><p>Teste de velocidade de internet: Antes de acessar, realize um teste de velocidade de</p><p>internet para garantir uma conexão estável e rápida durante o uso dos laboratórios virtuais.</p><p>•</p><p>Atualizações do navegador e sistema operacional: Mantenha seu navegador e sistema</p><p>operacional atualizados para garantir compatibilidade e segurança durante o acesso aos</p><p>laboratórios.</p><p>•</p><p>PRECISA DE AJUDA?</p><p>Em caso de dúvidas ou dificuldades técnicas, visite nossa Central de Suporte para encontrar</p><p>artigos de ajuda e informações para usuários. Acesse a Central de Suporte através do link:</p><p>https://suporte-virtual.algetec.com.br</p><p>Se preferir, utilize os QR Codes abaixo para entrar em contato via WhatsApp ou ser direcionado</p><p>para a Central de Suporte. Estamos aqui para ajudar! Conte conosco!</p><p>https://www.mozilla.org/pt-BR/firefox/new/</p><p>https://suporte-virtual.algetec.com.br/</p><p>https://suporte-virtual.algetec.com.br/</p><p>https://suporte-virtual.algetec.com.br/</p><p>https://suporte-contato.algetec.com.br/</p><p>https://suporte-virtual.algetec.com.br/</p><p>DESCRIÇÃO DO LABORATÓRIO</p><p>MATERIAIS NECESSÁRIOS</p><p>· Água Mili-Q;</p><p>· Álcool 96%;</p><p>· Centrífuga de Eppendorf;</p><p>· Hipoclorito de sódio;</p><p>· Incubadora;</p><p>· Jaleco;</p><p>· Kit de extração DNA – Proteinase K tipo L;</p><p>· Kit de extração DNA – Tampão de eluição SI;</p><p>· Kit de extração DNA – Tampão de lavagem SI;</p><p>· Kit de extração DNA – Tampão de lavagem SII;</p><p>· Kit de extração DNA – Tampão de lise S;</p><p>· Kit de extração DNA – Tampão de proteinase;</p><p>· Luvas;</p><p>https://suporte-contato.algetec.com.br/</p><p>https://suporte-virtual.algetec.com.br/</p><p>· Máscara;</p><p>· Micropipeta;</p><p>· Nanodrop (espectrofotômetro);</p><p>· Notebook;</p><p>· Óculos;</p><p>· Ponteira para micropipeta;</p><p>· Tubo de coleta com amostra de sangue;</p><p>· Tubo Eppendorf;</p><p>· Tubo spin;</p><p>· Vórtex.</p><p>PROCEDIMENTOS</p><p>1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO</p><p>Coloque os equipamentos de proteção individual localizados no “Armário de EPIs”.</p><p>2. REALIZANDO A ETAPA DE LISE</p><p>Pipete 25 µL da Proteinase K no tubo Eppendorf. Em seguida, pipete 200 µL da amostra de</p><p>sangue no mesmo tubo, e por último, pipete 200 µL do tampão lise S no tubo. Tampe o Eppendorf</p><p>e homogeneíze no Vórtex por 20 segundos. Após esse tempo, incube o Eppendorf por 15 min.</p><p>3. REALIZANDO A ETAPA DE LIGAÇÃO</p><p>Pipete 210 µL de álcool 96% no Eppendorf e homogeneíze de novo no Vórtex. Em seguida,</p><p>pipete 640 µL do Eppendorf para o tubo spin e centrifugue a 11.000 rpm por 1 minuto.</p><p>4. REALIZANDO A ETAPA DE LAVAGEM</p><p>Retire o Eppendorf da centrífuga, descarte o tubo de coleta e coloque o tubo spin em um novo</p><p>tubo de coleta. Em seguida, pipete 500 µL do tampão de lavagem SI no tubo spin e</p><p>centrifugue</p><p>novamente. Repita o mesmo processo de troca de tubo de coleta, porém a lavagem irá utilizar</p><p>600 µL o tampão de lavagem SII, e centrifugue novamente. Por fim, repita o mesmo processo da</p><p>troca do tubo de coleta e centrifugue novamente.</p><p>5. REALIZANDO A ETAPA DE ELUIÇÃO</p><p>Retire o Eppendorf da centrífuga, descarte o tubo de coleta e coloque o tubo spin em um novo</p><p>tubo de coleta. Em seguida, pipete 200 µL do tampão de eluição S no tubo spin, espere 1 minuto</p><p>e centrifugue a amostra.</p><p>6. MENSURANDO A AMOSTRA</p><p>Retire o Eppendorf da centrífuga e retire o tubo spin de dentro do tubo de coleta. Em seguida,</p><p>abra o espectrômetro e limpe-o, depois pipete 10 µL de água mili-q no mesmo e feche o</p><p>espectrômetro. Ligue o notebook, clique na opção “Nucleic acid” e depois na opção “blank”. Por</p><p>último, limpe o novamente o espectrômetro e pipete 10 µL da amostra, feche o espectrômetro e</p><p>selecione a opção “Measure”.</p><p>7. AVALIANDO OS RESULTADOS</p><p>Siga para a seção “Avaliação dos Resultados” e responda de acordo com o que foi observado</p><p>nos experimentos, associando também com os conhecimentos aprendidos sobre o tema.</p><p>AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS</p><p>1.     No que consiste a etapa de eluição da purificação?</p><p>2.     Qual a diferença entre os tampões de lavagem SI e SII?</p><p>3.   Na etapa de ligação, porque se utiliza o álcool 96%?</p><p>TUTORIAL</p><p>1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO</p><p>Visualize a pia clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome “Pia” localizada</p><p>dentro do painel de visualização no canto superior esquerdo da tela. Se preferir, também pode ser</p><p>utilizado o atalho do teclado “Alt+1”.</p><p>Lave as mãos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a pia.</p><p>Visualize o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome</p><p>“Armário de EPIs” ou através do atalho do teclado “Alt+2”.</p><p>Abra o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse sobre as portas.</p><p>Selecione os EPIs necessários para a realização do ensaio clicando com o botão esquerdo do</p><p>mouse sobre eles. Nesse experimento, é obrigatório o uso de jaleco, luvas, máscaras e óculos.</p><p>Feche as portas do armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse sobre as portas.</p><p>2. REALIZANDO A ETAPA DE LISE</p><p>Visualize a bancada clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome “Bancada”</p><p>ou através do atalho do teclado “Alt+3”.</p><p>Ajuste o volume da pipeta de 100 μL clicando com o botão direito do mouse na pipeta e selecione</p><p>a opção “Reajustar volume”.</p><p>Configure o volume para 25 µL utilizando seu teclado numérico, em seguida, confirme clicando</p><p>com o botão esquerdo do mouse em “OK”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo de Proteinase K clicando com o botão direito do mouse na pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Proteinase K”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo Eppendorf clicando com o botão direito do mouse na pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Eppendorf”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse na pipeta e selecione a opção “Trocar</p><p>ponteira”.</p><p>Ajuste o volume clicando com o botão direito do mouse na pipeta de 1000 uL e selecione a opção</p><p>“Reajustar volume”.</p><p>Configure o volume para 200 µL utilizando seu teclado numérico, em seguida, confirme clicando</p><p>com o botão esquerdo do mouse em “OK”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo com a amostra de sangue clicando com o botão direito do mouse na</p><p>pipeta e selecione a opção “Colocar em Amostra de sangue”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo Eppendorf clicando com o botão direito do mouse na pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Eppendorf”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse na pipeta e selecione a opção “Trocar</p><p>ponteira”.</p><p>Posicione a pipeta no tampão de lise S clicando com o botão direito do mouse na pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Tampão de lise S”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo Eppendorf clicando com o botão direito do mouse na pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Eppendorf”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse na pipeta e selecione a opção “Trocar</p><p>ponteira”.</p><p>Tampe o tubo Eppendorf clicando com o botão esquerdo do mouse no tubo Eppendorf.</p><p>Homogeneíze o Eppendorff no vortex clicando com o botão direito do mouse no tubo.</p><p>Espere 20 segundos ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse em “Avançar”.</p><p>Retire o tubo do vortex clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo.</p><p>Coloque o tubo na incubadora clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo.</p><p>Feche a tampa da incubadora clicando com o botão esquerdo do mouse na incubadora.</p><p>Ligue a incubadora clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Ligar”.</p><p>Espere 15 minutos ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse em “Avançar”.</p><p>Abra a tampa da incubadora clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a incubadora.</p><p>Retire o tubo da incubadora clicando com o botão direito do mouse sobre a incubadora.</p><p>3. REALIZANDO A ETAPA DE LIGAÇÃO</p><p>Ajuste o volume da pipeta clicando com o botão direito do mouse na pipeta e selecione a opção</p><p>“Reajustar volume”.</p><p>Configure o volume para 210 µL utilizando seu teclado numérico, em seguida, confirme clicando</p><p>com o botão esquerdo do mouse em “OK”.</p><p>Posicione a pipeta no recipiente de álcool 96° clicando com o botão direito do mouse no álcool</p><p>96° e selecione a opção “Colocar em Álcool 96°”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo Eppendorf clicando com o botão direito do mouse na pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Eppendorf”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a opção</p><p>“Trocar ponteira”.</p><p>Tampe o tubo Eppendorf clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o tubo.</p><p>Homogeneíze o Eppendorff no vórtex clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo.</p><p>Espere 20 segundos ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse em “Avançar”.</p><p>Retire o tubo do vórtex clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo.</p><p>Ajuste o volume da pipeta de 210 μL para 640 μL clicando com o botão direito do mouse sobre a</p><p>pipeta e selecione a opção “Reajustar volume”.</p><p>Configure o volume para 640 µL utilizando seu teclado numérico, em seguida, confirme clicando</p><p>com o botão esquerdo do mouse em “OK"."</p><p>Posicione a pipeta no Eppendorf clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Eppendorf”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo spin clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione</p><p>a opção “Colocar em Tubo spin”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a opção</p><p>“Trocar ponteira”.</p><p>Coloque o tubo spin dentro do tubo de coleta clicando com o botão esquerdo do mouse sobre</p><p>tubo spin.</p><p>Mova para a centrífuga o conjunto de tubos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre ele.</p><p>Ajuste a velocidade de rotação para 11.000 rpm clicando com o botão esquerdo do mouse sobre</p><p>os botões indicados.</p><p>Ajuste o tempo para 1 minuto clicando com o botão esquerdo do mouse sobre os botões</p><p>selecionados.</p><p>Feche a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>Inicie o processo de centrifugação clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão</p><p>“Start/Stop”.</p><p>Espere 1 minuto ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse em “Avançar”.</p><p>4. REALIZANDO A ETAPA DE LAVAGEM</p><p>Abra a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>Retire o conjunto de tubos clicando com o botão direito do mouse sobre a centrífuga.</p><p>Retire o tubo spin do tubo de coleta clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta</p><p>e selecione a opção a opção “Retirar tubo spin”.</p><p>Descarte o tubo de coleta clicando</p><p>com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta e</p><p>selecione a opção “Descartar”.</p><p>Ajuste o volume da pipeta de 640 μL para 500 μL  clicando com o botão direito do mouse sobre a</p><p>pipeta e selecione a opção “Reajustar volume”.</p><p>Configure o volume da pipeta para 500 µL utilizando seu teclado numérico, em seguida, confirme</p><p>clicando com o botão esquerdo do mouse em “OK"." Lembrar de colocar o volume.</p><p>Posicione a pipeta no tampão lavagem SI clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Tampão lavagem SI”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo spin clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione</p><p>a opção “Colocar em Tubo spin”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a opção</p><p>“Trocar ponteira”.</p><p>Mova o tubo spin para o tubo de coleta clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o tubo</p><p>spin.</p><p>Coloque na centrífuga o conjunto de tubos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o</p><p>tubo.</p><p>Feche a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>Inicie o processo de centrifugação clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão</p><p>“Start/Stop”.</p><p>Espere 1 minuto ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o box</p><p>“Avançar”.</p><p>Abra a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>Retire o conjunto de tubos clicando com o botão direito do mouse sobre a centrífuga.</p><p>Retire o tubo spin do tubo de coleta clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta</p><p>e selecione a opção “Retirar tubo spin”.</p><p>Descarte o tubo de coleta clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta e</p><p>selecione a opção “Descartar”.</p><p>Ajuste o volume da pipeta de 500 μL para 600 μL clicando com o botão direito do mouse sobre a</p><p>pipeta e selecione a opção “Reajustar volume”.</p><p>Configure o volume para 600 µL utilizando seu teclado numérico, em seguida, confirme clicando</p><p>com o botão esquerdo do mouse em “OK".</p><p>Posicione a pipeta no tampão lavagem SII clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Tampão lavagem SII”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo spin clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione</p><p>a opção “Colocar em Tubo spin”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a opção</p><p>“Trocar ponteira”.</p><p>Coloque o tubo spin no tubo de coleta clicando com o botão esquerdo do mouse no tubo spin.</p><p>Mova para a centrífuga o conjunto de tubos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o</p><p>tubo.</p><p>Feche a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>Inicie o processo de centrifugação clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão</p><p>“Start/Stop”.</p><p>Espere 1 minuto ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o box</p><p>“Avançar”.</p><p>Abra a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>Retire o conjunto de tubos clicando com o botão direito do mouse sobre a centrífuga.</p><p>Retire o tubo spin do tubo de coleta clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta</p><p>e selecione a opção “Retirar tubo spin”.</p><p>Descarte o tubo de coleta clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta e</p><p>selecione a opção “Descartar”.</p><p>Mova o tubo spin para o tubo de coleta clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o tubo</p><p>spin.</p><p>Coloque na centrífuga o conjunto de tubos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o</p><p>tubo.</p><p>Feche a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>Inicie o processo de centrifugação clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão</p><p>“Start/Stop”.</p><p>Espere 1 minuto ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o box</p><p>“Avançar”.</p><p>Abra a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>5. REALIZANDO A ETAPA DE ELUIÇÃO</p><p>Retire o conjunto de tubos clicando com o botão direito do mouse sobre a centrífuga.</p><p>Retire o tubo spin do tubo de coleta clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta</p><p>e selecione a opção “Retirar tubo spin”.</p><p>Descarte o tubo de coleta clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta e</p><p>selecione a opção “Descartar”.</p><p>Ajuste o volume da pipeta clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a</p><p>opção “Reajustar volume”.</p><p>Ajuste o volume da pipeta para 200 µL utilizando seu teclado numérico, em seguida, confirme</p><p>clicando com o botão esquerdo do mouse em “OK".</p><p>Posicione a pipeta no tampão eluição S clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Tampão eluição S”.</p><p>Posicione a pipeta no tubo spin clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione</p><p>a opção “Colocar em Tubo spin”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a opção</p><p>“Trocar ponteira”.</p><p>Espere 1 minuto ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o box</p><p>“Avançar”.</p><p>Mova o tubo spin para o tubo de coleta clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o tubo</p><p>spin.</p><p>Mova para a centrífuga o conjunto de tubos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o</p><p>tubo.</p><p>Feche a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>Inicie o processo de centrifugação clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão</p><p>“Start/Stop”.</p><p>Espere 1 minuto ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o box</p><p>“Avançar”.</p><p>Abra a tampa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão “Open”.</p><p>6. REALIZANDO A MENSURAÇÃO DA AMOSTRA</p><p>Retire o conjunto de tubos clicando com o botão direito do mouse sobre a centrífuga.</p><p>Retire o tubo spin do tubo de coleta clicando com o botão direito do mouse sobre o tubo de coleta</p><p>e selecione a opção “Retirar tubo spin”.</p><p>Visualize o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome</p><p>“Espectrofotômetro” ou através do atalho do teclado “Alt+7”.</p><p>Abra o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o espectrofotômetro.</p><p>Limpe o espectrofotômetro clicando com o botão direito do mouse sobre o espectrofotômetro.</p><p>Visualize a bancada clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome “Bancada”</p><p>ou através do atalho do teclado “Alt+3”.</p><p>Ajuste o volume da pipeta de 25 uL para 10 uL clicando com o botão direito do mouse sobre a</p><p>pipeta e selecione a opção “Reajustar volume”.</p><p>Configure o volume para 10 µL utilizando seu teclado numérico, em seguida, confirme clicando</p><p>com o botão esquerdo do mouse em “OK".</p><p>Mova a pipeta clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a opção “Colocar</p><p>em Água Ultra Pura”.</p><p>Mova a pipeta para o espectrofotômetro clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e</p><p>selecione a opção “Colocar em Espectrofotômetro”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a opção</p><p>“Trocar ponteira”.</p><p>Feche o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o espectrofotômetro.</p><p>Visualize o notebook clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome</p><p>“Notebook” ou através do atalho do teclado “Alt+8”.</p><p>Ligue o notebook clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão de ligar.</p><p>Selecione a opção “Nucleic Acid” clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a tela.</p><p>Selecione a opção “Blank” clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a tela.</p><p>Visualize o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome</p><p>“Espectrofotômetro” ou através do atalho do teclado “Alt+7”.</p><p>Abra o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo</p><p>do mouse sobre o espectrofotômetro.</p><p>Limpe o espectrofotômetro clicando com o botão direito do mouse sobre o espectrofotômetro.</p><p>Visualize a bancada clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome “Bancada”</p><p>ou através do atalho do teclado “Alt+3”.</p><p>Ajuste o volume da pipeta clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a</p><p>opção “Reajustar volume”.</p><p>Mova a pipeta clicando com o botão direito do mouse sobre a mesma e selecione a opção</p><p>“Colocar em Tubo de Coleta”.</p><p>Mova a pipeta clicando com o botão direito do mouse sobre a mesma e selecione a opção</p><p>“Colocar em Espectrofotômetro”.</p><p>Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre a pipeta e selecione a opção</p><p>“Trocar ponteira”.</p><p>Feche o espectrofotômetro clicando com o botão direito do mouse sobre o espectrofotômetro.</p><p>Visualize o notebook clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome</p><p>“Notebook” ou através do atalho do teclado “Alt+8”.</p><p>Selecione a opção “Measure” clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a tela do notebook.</p><p>7. AVALIANDO OS RESULTADOS</p><p>Siga para a seção “Avaliação dos Resultados” e responda de acordo com o que foi observado no</p><p>experimento associando também com os conhecimentos aprendidos sobre o tema.</p><p>Pré Teste</p><p>1)</p><p>Em 1940, Chargaff e colaboradores trouxeram informações importantes a respeito da</p><p>proporção de bases nitrogenadas que compõem o DNA. Eles concluíram que o número de</p><p>resíduos de guanina é igual ao de citosina (G = C), e que o de adenosina é igual ao de timidina</p><p>(A = T).</p><p>A partir dessa informação e de outros estudos de Chargaff e colaboradores, pode-se concluir</p><p>que:</p><p>A) a proporção de resíduos de guanina e citosina é diferente;</p><p>B) a composição das bases nitrogenadas que formam o DNA é igual;</p><p>C) a soma do número de bases pirimidinas é igual à de bases purinas (G + A = T + C).</p><p>2)</p><p>O genoma humano tem 22 cromossomos não sexuais e 2 sexuais.</p><p>Sabendo que cada célula de linhagem não germinativa tem duas cópias de cromossomos não</p><p>sexuais, o número total de cromossomos não sexuais presentes nessas células será:</p><p>A) 46;</p><p>B) 44;</p><p>C) 43.</p><p>3)</p><p>Os ácidos nucleicos apresentam características moleculares específicas, como carga</p><p>negativa em pH neutro, que possibilita o isolamento e a utilização dessas moléculas em</p><p>diversas aplicações.</p><p>Sobre a prática de isolamento do DNA ou RNA, assinale a alternativa correta.</p><p>A) É dividida em três etapas: lise das membranas celulares > quebra das ligações dissulfeto ></p><p>lavagens consecutivas dos ácidos nucleicos pós-separação;</p><p>B) É dividida em quatro etapas consecutivas: lavagens > lise das membranas celulares > ligação à</p><p>coluna de sílica > eluição;</p><p>C) É dividida em quatro etapas consecutivas: lise ou rompimento das membranas celulares ></p><p>ligação à coluna de sílica > lavagens > eluição.</p><p>4)</p><p>O primeiro passo do método de extração e purificação do DNA ou RNA envolve a lise ou</p><p>rompimento das membranas com soluções detergentes ou, até mesmo, uso de temperaturas</p><p>elevadas. O passo seguinte é o isolamento das macromoléculas de ácidos nucleicos dos</p><p>outros componentes celulares.</p><p>Com base na leitura do Sumário Teórico e na prática realizada, em qual etapa é possível a</p><p>visualização do DNA ou do RNA a “olho nu”?</p><p>A) Durante a etapa de adição de solventes orgânicos (fenol-clorofórmio);</p><p>B) Durante a etapa de adição de agentes que vão desnaturar as proteínas;</p><p>C) Durante a etapa de precipitação do DNA ou do RNA com álcoois e/ou sais.</p><p>5)</p><p>O protocolo de extração e purificação de DNA ou RNA é dividido em etapas. Em cada etapa,</p><p>utilizam-se reagentes específicos com determinadas finalidades, como no caso da proteinase</p><p>K, uma enzima que inativa e desnatura proteínas associadas ao DNA ou que podem degradá-</p><p>lo.</p><p>Você está na etapa 1 do protocolo de extração e purificação do DNA de uma amostra e</p><p>optou por utilizar um kit comercial. Com base no que você aprendeu nesta prática, qual a</p><p>finalidade dessa etapa?</p><p>A) Precipitar o DNA;</p><p>B) Lisar ou romper as membranas celulares;</p><p>C) Retirar os sais contaminantes das amostras de DNA.</p><p>Experimento</p><p>* Este laboratório também está disponível para dispositivos Android.</p><p>Conteúdo interativo disponível na plataforma de ensino!</p><p>Pós Teste</p><p>1) Os ácidos nucleicos (DNA ou RNsão as moléculas que "guardam" todas as informações</p><p>genéticas hereditárias e contêm sequências codificantes de proteínas responsáveis por</p><p>inúmeros processos biológicos celulares.</p><p>Sobre os ácidos nucleicos, eles são formados por:</p><p>A) lipídeos;</p><p>B) fenóis;</p><p>C) nucleotídeos.</p><p>2) O modelo da estrutura tridimensional proposto por Watson e Crick descreve o DNA como</p><p>uma dupla-hélice.</p><p>Assinale a alternativa que apresente uma das principais forças que mantêm essa dupla-</p><p>hélice.</p><p>A) Pontes ou ligações dissulfeto;</p><p>B) Ligações de hidrogênio;</p><p>C) Ligações fosfodiéster.</p><p>3) O DNA e o RNA apresentam características estruturais específicas que permitem que essas</p><p>moléculas sejam utilizadas para várias aplicações.</p><p>Indique a alternativa que corresponde a uma dessas aplicações.</p><p>A) Cultura de células;</p><p>B) RT-PCR;</p><p>C) HPLC.</p><p>O protocolo de extração e purificação de DNA ou RNA envolve algumas etapas. Você é um</p><p>cientista e precisa realizar esse protocolo para analisar a expressão gênica de uma amostra,</p><p>mas o orçamento disponibilizado para esse projeto é baixo e você precisará utilizar outros</p><p>4)</p><p>reagentes mais baratos do que a coluna de sílica disponível nos kits comerciais.</p><p>Para isso, assinale a alternativa correta.</p><p>A) Durante a etapa 2 de separação do DNA ou RNA dos outros componentes celulares, você</p><p>opta por adicionar solventes orgânicos (fenol-clorofórmio), faz a centrifugação das amostras e</p><p>coleta o DNA ou RNA na fração solúvel formada;</p><p>B) Busca na literatura alternativas mais baratas, como a adição de suco de abacaxi ou soluções</p><p>de limpeza de lentes de contato, para fazer a degradação das proteínas;</p><p>C) Utiliza detergente de cozinha.</p><p>5) Você está na etapa 2 do protocolo de extração e purificação do DNA de uma amostra e</p><p>optou por utilizar a coluna de sílica.</p><p>Com base no que você aprendeu nesta prática, qual a finalidade dessa etapa?</p><p>A) Romper a membrana plasmática;</p><p>B) Retirar os sais contaminantes das amostras de DNA;</p><p>C) Isolar o DNA dos outros componentes celulares.</p><p>Atividade</p><p>Responda as questões da seção “Avaliação dos Resultados” do “Roteiro” e anexe aqui o seu</p><p>relatório.</p>