EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO DERIVADO DE PLAQUETAS

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<p>UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA</p><p>"JÚLIO DE MESQUITA FILHO"</p><p>FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS</p><p>CÂMPUS DE ARARAQUARA</p><p>“EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO DERIVADO DE PLAQUET AS</p><p>HUMANAS (PDGF) SOBRE O PROCESSO DE REGENERAÇÃO ÓSSEA EM</p><p>TÍBIAS DE RATOS ”</p><p>CRISTINA MARTA DE OLIVEIRA BARBIERI</p><p>Tese de Doutorado apresentada à</p><p>Faculdade de Ciências Farmacêuticas de</p><p>Araraquara – UNESP para a obtenção do</p><p>título de Doutor em Análises Clínicas:</p><p>Área Imunologia.</p><p>Orientador: Prof. Dr. PAULO INÁCIO DA COSTA</p><p>Co-orientador: Profa. Dra. LIZETI TOLEDO DE OLIVEIRA RAMALHO</p><p>Araraquara</p><p>2006</p><p>Comissão Examinadora</p><p>Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa (Orientador)</p><p>Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP Araraquara</p><p>Prof. Dr. Iguatemy Lourenço Brunetti</p><p>Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP Araraquara</p><p>Prof. Dr. José Scarso Filho</p><p>Faculdade de Odontologia – UNESP Araraquara</p><p>Prof. Dr. Carlos Alberto de Souza Costa</p><p>Faculdade de Odontologia – UNESP Araraquara</p><p>Prof. Dr. Luiz Carlos de Mattos</p><p>Faculdade de Medicina – UNESP São José do Rio Preto</p><p>“As idéias antigas não podem escravizar o homem, porque elas se adaptam e</p><p>ganham novas formas. Então tomemos a riqueza filosófica do passado, sem</p><p>esquecer os desafios que o mundo presente nos propõe.”</p><p>(Confúcio)</p><p>Dedico este trabalho,</p><p>À Deus</p><p>Por iluminar o meu caminho, clarear meus pensamentos, direcionar os meus</p><p>passos e me fazer sentir sempre Sua presença.</p><p>A minha família</p><p>Especialmente aos meus pais Nair e Clarindo, pela vida, pelo amor, pelos</p><p>ensinamentos, pelo incentivo e por estarem sempre do meu lado.</p><p>Ao Luis pelo amor, pelo incentivo, pela admiração e sempre desejar o meu</p><p>sucesso.</p><p>Aos meus irmãos, sobrinhos, cunhados e sogros, que tenho a certeza que</p><p>sempre acreditaram e torceram por mim.</p><p>AGRADECIMENTO ESPECIAL</p><p>Ao Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa, pela orientação, confiança e incentivo no</p><p>decorrer deste trabalho.</p><p>À Profa. Dra. Lizeti Toledo de Oliveira Ramalho, pela orientação,</p><p>ensinamentos, confiança e incentivo sem os quais não seria possível a realização</p><p>deste trabalho.</p><p>Ao Hermes Pretel, pela generosidade, dedicação, incentivo, pelas cirurgias,</p><p>pelas sugestões, apoio constante. Obrigada, tenho a certeza que fiz um amigo.</p><p>Ao Prof. Dr. Leonardo Cardello, pela amizade, ensinamentos, sugestões e pelo</p><p>apoio na purificação da proteína, disponibilizando seu laboratório.</p><p>Aos doadores de sangue, pelo gesto nobre da doação e sem os quais não seria</p><p>possível o desenvolvimento deste trabalho.</p><p>Aos animais (ratos). Dar a vida em favor do outro... Que recebam a</p><p>recompensa de Deus.</p><p>AGRADECIMENTOS</p><p>À Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências</p><p>Farmacêuticas e Faculdade de Odontologia – Campus Araraquara. Ao Núcleo de</p><p>Atendimento à Comunidade, Coordenadoria de Análises Clínicas e Hemoterapia,</p><p>Hemonúcleo Regional de Araraquara, pela estrutura física e operacional que permitiu</p><p>o desenvolvimento deste trabalho.</p><p>A todos os professores que contribuíram de alguma forma para o</p><p>desenvolvimento deste trabalho, Profa. Dra. Maria Teresa Pepato pelo apoio com</p><p>material didático referente à fosfatase alcalina; Profa. Dra. Christiane Pienna Soares</p><p>pelas sugestões na apresentação do projeto junto ao Comitê de Ética Humanos; Profa</p><p>Dra. Cleni Mara Marzocchi Machado pelo apoio, incentivo e sugestões referentes a</p><p>estatística e em especial aos que participaram da banca examinadora apresentando</p><p>sugestões pertinentes que vieram a enriquecer este trabalho: Prof. Dr. Iguatemy</p><p>Lourenço Brunetti, Prof. Dr. José Scarso Filho, Prof. Dr. Carlos Alberto de Souza</p><p>Costa e Prof. Dr. Luiz Carlos de Mattos.</p><p>A todos os colegas do CRD e HN, Keila, Maria do Carmo, Flavia, Flavinha,</p><p>Tânia, Cris Viola e Marcy e em especial a Jamile, pela amizade, apoio e colaboração.</p><p>Às funcionárias da Pós-Graduação: Laura, Sonia e Claudia. A todos os</p><p>funcionários da biblioteca, em especial ao Moacir, Irani, Ana, Laura, Natalina e</p><p>Sonia. A todos os funcionários da histologia da Odontologia, em especial ao</p><p>Pedrinho, pela colaboração.</p><p>E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste</p><p>trabalho, os mais sinceros agradecimentos.</p><p>X</p><p>ÍNDICE</p><p>LISTA DE FIGURAS .........................................................................................................</p><p>XII</p><p>LISTA DE TABELAS ........................................................................................................</p><p>XIII</p><p>ABREVIATURAS ..............................................................................................................</p><p>XIV</p><p>RESUMO ............................................................................................................................</p><p>XVI</p><p>ABSTRACT</p><p>por</p><p>centrifugação em 3.000 rpm (raio = 26,06 cm) por 30 minutos a 4ºC e em seguida solubilizados em</p><p>altas concentrações de sais: primeiramente foi incubado por 1 hora com 200 mL de NaCl 0,39M,</p><p>Tris 0,01M, pH 7,4 e em seguida foi centrifugado em 3.000 rpm (raio = 26,06 cm) por 30 minutos a</p><p>4ºC reservando o sobrenadante; o precipitado foi novamente incubado por 1 hora com 200 mL de</p><p>NaCl 1,09M, Tris 0,01M, pH 7,4 e em seguida foi centrifugado em 3.000 rpm (raio = 26,06 cm) por</p><p>21</p><p>30 minutos a 4ºC. Todos os sobrenadantes foram reunidos e filtrados em filtro esterilizante de 0,45</p><p>µm CA (acetato de celulose – Corning), e o pH foi ajustado para 7,4 com Tris-base 1,0 M (Raines</p><p>& Ross, 1985). Posteriormente, o sobrenadante foi dializado por 24 horas em tampão Tris-HCl</p><p>0,01M, NaCl 0,09 M, pH 7,4 e liofilizado (FreeZone® 6 Liter Benchtop – Freeze Dry System –</p><p>mod. 77520).</p><p>3.4. Purificação do PDGF</p><p>3.4.1- Cromatografia</p><p>O lisado plaquetário liofilizado foi reconstituído em 30 mL de tampão Tris-HCl 10 mM pH</p><p>7,4 e aplicado a uma coluna de troca iônica, CM-Celulose (1,8 X 67 cm), pré-equilibrada no mesmo</p><p>tampão. Em seguida, a coluna foi exaustivamente lavada com tampão para remoção das proteínas</p><p>que não interagiram com a resina. A eluição das proteínas que interagiram com a resina foi</p><p>realizada através de um gradiente linear de NaCl (0 – 500 mM) coletando-se automaticamente</p><p>frações de 3 mL a um fluxo de 25 mL/hora.</p><p>3.5. Dosagem de proteínas</p><p>As frações coletadas foram monitoradas através da absorvância em 280 nm (Hitachi U-</p><p>1100). As concentrações protéicas foram calculadas assumindo que absorvância igual a 1,0 (A280 =</p><p>1,0) corresponde a 1 mg/mL de proteínas totais, considerando o caminho ótico igual a 1 cm (d =</p><p>1cm), conforme descrito por Raines e Ross (1982 -85).</p><p>Para melhor padronização, a concentração protéica da Amostra (determinada pelo volume</p><p>correspondente ao pico de eluição) e de um plasma pobre em plaquetas (usado para controle no Slot</p><p>Blot) foram determinadas pelo método de Lowry modificado (Hartree, 1972), usando 1 mg/mL de</p><p>soro albumina bovina (BSA) como padrão (Apêndice).</p><p>3.6. Detecção do PDGF</p><p>3.6.1. Immunoblot/Slot Blot</p><p>O equipamento usado foi o HYBRI SLOTTM Manitold (Gibco BRL Apparatus), onde foram</p><p>aplicados sobre uma membrana de nitrocelulose: recombinante humano de Fator de Crescimento</p><p>Derivado de Plaquetas isoforma BB (PDGF-BB – Leinco Technologies, Inc.); a Proteína purificada</p><p>e um plasma pobre em plaquetas (PPP) em várias diluições. Foi efetuada a filtração a vácuo, e o</p><p>bloqueio dos sítios-livres na membrana foi realizado pela solução de bloqueio TBS (Tris 0,05 M,</p><p>NaCl 0,15 M; pH 8,0) /Leite desnatado (5%) /Tween-20 (0,05%), por 6 horas à temperatura</p><p>ambiente (TA) e sob agitação constante. Em seguida a membrana foi lavada com TBS/Tween-20</p><p>22</p><p>(0,05%) e incubada durante uma noite à TA em agitação constante, com anticorpo de coelho anti-</p><p>PDGF isoforma BB humana (Rabbit Anti-Human PDGF-BB – Leinco Technologies, Inc.) diluídos</p><p>1:500 em solução de bloqueio. Após este período, a membrana foi lavada com TBS/Tween-20</p><p>(0,05%) 3 vezes de 10 minutos cada, e então incubada com o anticorpo anti-IgG de coelho</p><p>conjugado com peroxidase, diluído 1:1000 em solução de bloqueio, durante 1 hora à TA em</p><p>agitação constante e, posteriormente, lavada com TBS/Tween-20 (0,05%) 3 vezes de 10 minutos</p><p>cada. A revelação da reação foi obtida pela adição dos substratos da enzima: diaminobenzidina e</p><p>peróxido de hidrogênio (6 mg de diaminobenzidina e 10 µL de peróxido de hidrogênio 30% em 10</p><p>mL de Tris HCl 0,05 M; pH 8,0).</p><p>3.7 – Ensaio biológico do PDGF</p><p>3.7.1 Animais e anestesia</p><p>Neste trabalho foram utilizadas tíbias esquerdas de 60 animais, ratos machos (Rattus</p><p>norvegicus albinus HOLTZMANN), com peso médio de 250 gramas e mantidos durante todo o</p><p>período experimental, isolados em gaiolas plásticas identificadas no biotério da UNESP/Câmpus</p><p>Araraquara, com temperatura, luminosidade e umidade controladas, recebendo uma dieta alimentar</p><p>composta por ração sólida e água a vontade. Esta população foi dividida em 3 grupos de 5 animais,</p><p>os quais foram submetidos à anestesia com injeção intramuscular do anestésico Ketamina</p><p>(Francotar/ Virbac do Brasil - Ind. e Com. Ltda) e do relaxante muscular Cloridrato de Xilazina</p><p>(Virbaxil 2%/Virbac do Brasil – Ind. e Com. Ltda) nas dosagens de 0,4 e 0,04 mL por 100 g de peso</p><p>corporal, respectivamente, que reúnem ações sedativas, analgésicas e de relaxante muscular. A</p><p>seguir, os animais foram depilados com aparelho para depilação de animais (Professional</p><p>Detachable plus – Pet clipper/ Model AG) na região da tíbia esquerda. Foram confeccionados</p><p>defeitos ósseos nas tíbias de cada animal e preenchidos com PDGF-BB, proteína purificada (PDGF</p><p>purificado) e colágeno tipo I. Após os períodos de 7, 15, 30 e 45 dias estes animais foram mortos</p><p>com sobredose Hidrato de Cloral 10%, via intraperitoneal.</p><p>3.7.2. Preenchimento dos defeitos ósseos e técnica cirúrgica</p><p>Foi feito um isolamento da área com campos cirúrgicos estéreis, no local da cirurgia foi feita</p><p>à anti-sepsia com álcool 70% e em seguida uma incisão longitudinal de aproximadamente 5 mm na</p><p>tíbia esquerda, com bisturi e tesoura reta, de modo a ter acesso local facilitado. Foram realizados</p><p>cortes sucessivos em camadas teciduais até a divulsão do tecido muscular e exposição do periósteo,</p><p>o qual foi rebatido expondo o osso. Com o auxílio de uma broca esférica carbide nº ½ de baixa</p><p>rotação, previamente esterilizada e com irrigação com soro fisiológico para evitar aquecimento e</p><p>23</p><p>morte celular, foram confeccionados os defeitos ósseos nas tíbias esquerda dos ratos. Este defeito</p><p>foi o produto da remoção da cortical externa, promovendo uma fenestração de aproximadamente 4</p><p>mm de profundidade e 2,5 mm de largura, obtendo-se uma cavidade cirúrgica que recebeu o</p><p>tratamento com o componente em estudo.</p><p>De acordo com o tipo de componente colocado no defeito ósseo, o leito de implantação foi</p><p>classificado como:</p><p>Grupo A – tratamento com o PDGF-BB</p><p>Neste grupo foram utilizadas 5 tíbias (lado esquerdo) para cada período: 7, 15, 30 e 45 dias.</p><p>O defeito ósseo foi preenchido com uma mistura de PDGF-BB (0,1 µg/cm2) e colágeno tipo I (0,1</p><p>µg/ cm2), e após rebatimento do periósteo e dos outros tecidos foi realizada suturas com fio</p><p>reabsorvível (fio de sutura Vicryl- Poligatactina 910, Johnson & Johnson), sendo o número de</p><p>suturas variáveis, com o intuito de vedar o máximo à ferida cirúrgica, finalizando com a limpeza da</p><p>região cirúrgica com álcool 70%. O animal foi colocado novamente na gaiola.</p><p>Grupo B – tratamento com o PDGF</p><p>purificado</p><p>Neste grupo foram utilizadas 5 tíbias (lado esquerdo) para cada período: 7, 15, 30 e 45 dias.</p><p>O defeito ósseo foi preenchido com uma mistura de PDGF purificado (0,1 µg/cm2) e colágeno tipo I</p><p>(0,1 µg/cm2). Os demais procedimentos seguem os mesmos padrões do Grupo A.</p><p>Grupo C – tratamento com o Colágeno tipo I (Grupo Controle)</p><p>Neste grupo foram utilizadas 5 tíbias (lado esquerdo) para cada período: 7, 15, 30 e 45 dias.</p><p>O defeito ósseo foi preenchido somente com colágeno tipo I (0,1 µg/cm2). Os demais</p><p>procedimentos seguem os mesmos padrões do Grupo A.</p><p>3.7.3. Período experimental</p><p>Imediatamente após o procedimento cirúrgico os animais receberam uma dose única de</p><p>penicilina benzatina 16.000 UI por via intramuscular, na dose de 1 mL por animal, e dose única de</p><p>analgésico (Lisador – Farmasa) na dose de 0,2 mL por animal.</p><p>Durante todo período experimental foram alimentados com ração sólida e água.</p><p>Os animais foram mantidos isolados em gaiolas individuais por 7, 15, 30 e 45 dias após as</p><p>cirurgias de preenchimento dos defeitos ósseos, sob as mesmas condições descritas anteriormente.</p><p>3.7.4. Coleta da amostra para análise bioquímica</p><p>Foi coletado 1 mL de sangue venoso da cauda dos animais para obtenção de soro, após</p><p>preenchimento dos defeitos ósseos com PDGF-BB, PDGF purificado e colágeno tipo I, em 7, 15, 30</p><p>24</p><p>e 45 dias. As amostras foram coletadas sempre no mesmo período e imediatamente separadas,</p><p>sendo em seguida realizada a determinação da fosfatase alcalina óssea.</p><p>3.7.5. Preparo das peças</p><p>Passado o período experimental, os animais foram mortos com sobredose de Hidrato de</p><p>Cloral 10%. As áreas operadas foram reabertas por meio de incisão da pele e dissecação dos tecidos</p><p>moles ao redor das regiões onde foi efetuado o preenchimento dos defeitos ósseos, com lâmina de</p><p>bisturi nº 15. As tíbias correspondentes aos defeitos ósseos preenchidos foram cuidadosamente</p><p>separadas dos tecidos adjacentes, cortadas e removidas.</p><p>3.7.6. Fixação e descalcificação das peças</p><p>As peças com os defeitos ósseos preenchidos destinados à análise histomorfológica foram</p><p>reduzidas, fixadas em formol neutro tamponado, pH 7,4 por 5 (cinco) dias, lavadas em água</p><p>corrente por 2 horas para remover o excesso de fixador, prosseguindo então com a descalcificação</p><p>em solução de Morse até a completa descalcificação sendo que a solução descalcificadora foi</p><p>trocada a cada 3 dias. O tempo de descalcificação varia de acordo com o grau de mineralização do</p><p>fragmento do tecido e também do tamanho do mesmo. Durante toda a descalcificação as peças</p><p>foram mantidas em dispositivo plástico e permaneceram no líquido descalcificador sem tocar as</p><p>paredes do frasco. Na seqüência, as peças foram neutralizadas por 24 horas em Sulfato de Sódio</p><p>5%. A seguir, as amostras foram lavadas em água corrente por 24 horas, para remover e neutralizar</p><p>a solução de Morse.</p><p>3.7.7. Desidratação e diafanização</p><p>A desidratação foi realizada em concentrações crescentes de álcool etílico (70%, 80%, 90%</p><p>e Absoluto). O processo de desidratação consiste na imersão das peças nos álcoois graduados a fim</p><p>de promover a completa remoção de água dos fragmentos teciduais.</p><p>As peças foram diafanizadas em álcool etílico-xilol por 15 minutos, em xilol, por um</p><p>período de 1 hora, até observar-se à transparência das mesmas.</p><p>3.7.8. Inclusão</p><p>Encerrada a fase de diafanização, as peças foram embebidas em parafina, por 24 horas a</p><p>60ºC, em estufa, com quatro trocas. Em seguida, foi realizada a inclusão para a obtenção dos blocos</p><p>de parafina. As peças foram orientadas de forma a permitir cortes longitudinais.</p><p>25</p><p>3.7.9. Preparo dos blocos e coloração</p><p>Foram confeccionados 20 blocos de parafina para cada um dos 3 grupos. Os blocos foram</p><p>submetidos a cortes semi-seriados de 6 µm por meio de micrótomo rotatório (Microm – HM 325),</p><p>obtendo-se 30 lâminas de cada bloco, as quais foram coradas por hematoxilina e eosina, Tricrômico</p><p>de Mallory e Picro sirius.</p><p>O procedimento de coloração consiste de imersão das lâminas em xilol por 10 minutos,</p><p>seguida troca do mesmo por um novo xilol por mais 10 minutos. Prossegue-se por passagens</p><p>sucessivas pelo álcool etílico-xilol (1:1), álcool absoluto, álcool 90%, álcool 70%, seguida por água</p><p>deionizada, por um período de 5 minutos em cada banho. Após cada imersão, foi realizado o</p><p>processo de remoção dos excessos das substâncias envolvidas, apenas escorrendo-as. Após a</p><p>passagem nestas soluções, foi feita a coloração em hematoxilina de Harris por 1 minuto, seguida de</p><p>outra lavagem (viragem) em água corrente por 7 minutos, a seguir, em corante eosina por 30</p><p>segundos, e lavagem em água corrente para remover os excessos. Para a coloração com Tricrômico</p><p>de Mallory as lâminas foram imersas em água acidulada pelo ácido acético glacial por 1 minuto,</p><p>seguida pela imersão em solução (composta por: fucsina ácida, corante Biebricht, água destilada e</p><p>ácido acético glacial) por 30 segundos, lavagem em água corrente por 1 minuto, imersão em outra</p><p>solução (composta por azul de anilina, ácido acético e água destilada) por 1 minuto. Para a</p><p>coloração com o Picro sirius, cora-se como a Hematoxilina, sendo que após a viragem as lâminas</p><p>foram coradas por 1 hora com o corante Picro sirius (Sirius red em solução aquosa saturada de</p><p>ácido pícrico).</p><p>Para fins de desidratação das lâminas segue-se uma rápida imersão em álcool 95%, álcool</p><p>absoluto por 1 minuto, outra passagem por álcool absoluto por 5 minutos, álcool xilol por 5</p><p>minutos, xilol por 5 minutos e, finalmente, imersão em solução de xilol até montagem das</p><p>lamínulas. Por fim, montagem das lamínulas com resinas Permount e secagem em estufa por 3</p><p>horas.</p><p>3.7.10. Análise histológica</p><p>Para avaliação histológica, foi realizada a análise descritiva tipo experimento cego (Veira &</p><p>Hossne, 2002) das lâminas no microscópio óptico Jenaval Carl Zeiss e foram realizadas as</p><p>fotomicrografias. Foi também empregada análise histológica, baseada nos seguintes escores:</p><p>(1) Presença de células inflamatórias em meio de células conjuntivas</p><p>(2) Tecido conjuntivo denso</p><p>(3) Tecido cartilaginoso</p><p>(4) Formação de osso primário</p><p>26</p><p>(5) Formação de osso secundário</p><p>3.8. Análise bioquímica</p><p>3.8.1. Determinação da fosfatase alcalina óssea</p><p>A fosfatase alcalina isoenzima óssea foi determinada pelo método cinético</p><p>espectrofotométrico como descrito por Vieira et al.(1999) e Kazmierczak & Lott (1987) utilizando</p><p>como substrato o para-nitrofenil fosfato (pNPP – 10 mMol/L) em meio alcalino com tampão</p><p>dietanolamina (DEA – 1 Mol/L) com tratamento térmico (15 minutos em Banho Maria à 56ºC).</p><p>As amostras foram</p><p>colhidas antes do sacrifício dos animais, centrifugadas (10 minutos/2500</p><p>rpm-centrífuga sorológica). Após obtenção do soro, as amostras foram separadas em duas partes,</p><p>sendo que uma delas seria submetida à inativação. Foi realizada a leitura em espectrofotômetro 405</p><p>nm (U-3000 Spectrophotometer) em todas as amostras. A somatória das absorvâncias por minuto</p><p>multiplicado por um fator descrito no Kit é igual à atividade da fosfatase alcalina em U/I (� A/min</p><p>x fator = atividade da Fosfatase Alcalina (U/I)). O valor da fosfatase alcalina na amostra sem</p><p>inativação menos o valor da fosfatase alcalina na amostra inativada é igual à fosfatase alcalina</p><p>óssea.</p><p>3.9. Análise estatística</p><p>Neste trabalho, o estudo da variação Fosfatase alcalina óssea (FAO) em relação ao período</p><p>decorrido após a aplicação de tratamento foi efetuado pelo procedimento da análise de regressão</p><p>linear. Foram determinadas as estimativas dos coeficientes da regressão: a intersecção, que é o</p><p>valor da FAO correspondente a um valor zero para o período de tratamento, e a declividade, que</p><p>representa a taxa de variação da FAO por dia decorrido após o tratamento. O ajuste da reta de</p><p>regressão permitiu o cálculo do erro padrão e, através deste, a determinação de intervalos de 95% de</p><p>confiança para os valores reais dos coeficientes, ou seja, dos valores que razoavelmente poderiam</p><p>ser admitidos para os coeficientes de regressão.</p><p>Com a reta de regressão foram determinadas estimativas das médias de FAO em cada</p><p>período de tempo de tratamento e intervalos de 95% de confiança para a média real. Então, a</p><p>avaliação das médias de FAO resultantes da aplicação dos tratamentos, em função do período, foi</p><p>realizada por meio desses intervalos.</p><p>Para avaliar numericamente a qualidade do ajuste foi utilizado o procedimento da análise da</p><p>variância, ao nível de 5% de significância. Quando o valor de probabilidade p correspondente à</p><p>fonte de variação devida à regressão for menor do que 0,05 há evidência estatística de que existe</p><p>regressão da FAO sobre a o período de avaliação. Considerando que os experimentos foram</p><p>27</p><p>realizados com repetições em quatro ou cinco animais, acrescentou-se na análise o teste para a falta</p><p>de ajuste do modelo de regressão, ou seja, para testar se uma reta é adequada para representar as</p><p>observações, também ao nível de 5% de significância. Complementado a avaliação da qualidade do</p><p>ajuste, foi calculado o coeficiente de correlação para cada regressão, o qual indica o grau de</p><p>associação entre a FAO e o período de tempo decorrido após o tratamento em uma escala variando</p><p>de -1 a 1.</p><p>28</p><p>IV – RESULTADOS</p><p>- Purificação do PDGF</p><p>4.1-Cromatografia em troca iônica</p><p>O PDGF sob condição de pH 7,4 apresenta-se carregado positivamente, por essa razão, pode</p><p>ser facilmente adsorvido a trocadores catiônicos, fato que propiciou a escolha da coluna CM-</p><p>Celulose (Carboximetil-Celulose).</p><p>A partir de 120 unidades de bolsas de sangue total, foram obtidos 120 concentrados de</p><p>plaquetas apresentando no mínimo uma quantidade correspondente a 5,5 x 1010 plaquetas/unidade.</p><p>Após processamento sanguíneo, em condições padronizadas anteriormente citado no item 3.2., as</p><p>unidades plaquetárias foram submetidas à lise e o lisado plaquetário foi dializado e liofilizado para</p><p>concentração protéica (item 3.3.). Após reconstituição do liofilizado com 30 mL de tampão Tris-</p><p>HCl 10 mM pH 7,4 este foi utilizado para purificação das proteínas catiônicas sob coluna de CM-</p><p>Celulose.</p><p>A figura 6 mostra o perfil cromatográfico da amostra purificada. O pico corresponde à</p><p>retenção de proteínas catiônicas apresentou absorvância a 280 nm de aproximadamente 0,426 D.O.</p><p>0</p><p>0,3</p><p>0,6</p><p>0,9</p><p>1,2</p><p>1,5</p><p>1 31 61 91 121 151 181 211 241</p><p>Número das frações</p><p>A</p><p>bs</p><p>or</p><p>bâ</p><p>nc</p><p>ia</p><p>(</p><p>28</p><p>0</p><p>nm</p><p>)</p><p>0</p><p>100</p><p>200</p><p>300</p><p>400</p><p>500</p><p>Figura 6- Perfil cromatográfico do PDGF em CM-celulose. A coluna (1,8 X 67 cm) foi eluída com</p><p>gradiente linear de NaCl em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7,4 e frações de 3 ml foram coletadas a</p><p>um fluxo de 25 mL/hora. A seta indica o início do gradiente. O PDGF foi eluído a 150 mM de</p><p>NaCl.</p><p>N</p><p>aC</p><p>l (m</p><p>M</p><p>)</p><p>Eluição</p><p>29</p><p>4.2-Dosagem de proteínas</p><p>Após reunião das amostras correspondentes à área do pico de eluição, a estimativa da</p><p>concentração protéica foi equivalente a 1,697 mg/mL para a amostra purificada (PDGF purificado)</p><p>e de 40,8 mg/mL para o plasma pobre em plaquetas usado para controle no Slot Blot., usando o</p><p>método de Lowry modificado (Hartree, 1972).</p><p>4.3- Detecção do PDGF</p><p>4.3.1- Immunoblot/Slot Blot</p><p>A confirmação da presença do PDGF na fração catiônica da amostra eluída foi possível</p><p>através de Immunoblot/Slot Blot com anticorpo específico, anti-PDGF-BB, sendo que esta</p><p>confirmação não foi obtida para o plasma pobre em plaquetas, até mesmo quando aplicamos alta</p><p>concentração protéica (40,80 µg/µL). O TBS foi usado somente para preenchimento do Slot para</p><p>possibilitar a filtração a vácuo (Figura 7).</p><p>1 2 3 4 5 6 7 8 9 10</p><p>Figura 7 – Reatividade das bandas no Immunoblot/Slot Blot com o anticorpo anti-PDGF-BB: 1)</p><p>TBS, 2) PDGF-BB – Recombinante humano (0,10 µg/µL), 3)Plasma pobre em plaquetas (40,80</p><p>µg/µL), 4, 5, 6) Diluições do Plasma pobre em plaquetas (4,08; 2,04 e 1,02 µg/µL,</p><p>respectivamente), 7) Amostra eluída (1,70 µg/µL), 8, 9 e 10) TBS. Em cada Slot foram aplicados</p><p>100µL de cada amostra.O plasma pobre em plaquetas não apresentou reatividade com o anticorpo</p><p>testado.</p><p>4.4- Análise histológica</p><p>A avaliação histológica foi realizada pela análise descritiva das lâminas coradas com</p><p>Hematoxilina e eosina, Tricrômico de Mallory e Picro sirius no microscópio óptico Jenaval Carl</p><p>Zeiss (item 3.7.10). As lâminas foram confeccionadas a partir de cortes semi-seriados de blocos de</p><p>parafina contendo as peças com os defeitos ósseos preenchidos com PDGF-BB, PDGF purificado e</p><p>30</p><p>Colágeno Tipo I (item 3.7.9). A figura 8 mostra o defeito na tíbia e o preenchimento com Colágeno</p><p>Tipo I.</p><p>A B</p><p>Figura 8 - A- Defeito confeccionado com o auxilio de uma broca esférica de baixa rotação.</p><p>B- preenchimento do defeito com Colágeno Tipo I</p><p>Após preenchimento dos defeitos ósseos os animais permaneceram separados em gaiolas por</p><p>um período de 7, 15, 30 e 45 dias. Ao término de cada período os animais eram sacrificados e suas</p><p>tíbias esquerda removidas para confecção das peças ósseas que foram usadas para confecção das</p><p>lâminas (item 3.7).</p><p>Defeito ósseo preenchido com Colágeno Tipo I após 7 dias</p><p>Observou-se a presença de tecido conjuntivo fibroso de preenchimento revestindo a superfície</p><p>do leito ósseo. A porção central do defeito foi preenchida por coágulo sanguíneo com rede de</p><p>fibrina, células inflamatórias, leucócitos polimorfonucleares e mononucleares e também fibras</p><p>colágenas orientadas em meio a grande número de fibroblastos assentados sobre o leito ósseo. Neste</p><p>local também ocorreu pequenas raspas de tecido ósseo em processo de reabsorção (Figura 9). As</p><p>paredes laterais do defeito estavam revestidas por uma malha de matriz orgânica óssea neoformada</p><p>rica em células.As fibras colágenas da matriz estavam desorganizadas e separadas do osso maduro</p><p>do leito receptor por linha reversa de crescimento fortemente corada e bem visível (Figura 10 ).</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory (TM), o tecido ósseo neoformado neste período</p><p>apresentou-se imaturo do tipo embrionário com grandes espaços medulares preenchidos por tecido</p><p>conjuntivo rico em células (Figura 11).</p><p>Pela coloração do Picro sirius (PS) notou-se a ausência de birrefringência das fibras colágenas</p><p>do tecido conjuntivo fibroso presente no leito ósseo (Figura 12).</p><p>31</p><p>COLÁGENO TIPO I</p><p>Período: 7 dias</p><p>Figura 9 – Colágeno Tipo I: Raspas de</p><p>tecido ósseo em processo de reabsorção</p><p>H&E - ± 405 X</p><p>Figura 10 – Colágeno Tipo I: Neoformação</p><p>óssea e linha reversa</p><p>H&E - ± 405 X</p><p>Figura 11 – Colágeno Tipo I: Osso</p><p>neoformado imaturo</p><p>TM - ± 405 X</p><p>Figura 12 – Colágeno Tipo I: Tecido</p><p>conjuntivo fibroso do leito . Ausênsia de</p><p>birrefringência das fibras colágenas.</p><p>PS (sem polarização – ± 100 X</p><p>32</p><p>Defeito ósseo preenchido com PDGF-BB após 7 dias</p><p>Verificou-se uma intensa neoformação óssea preenchendo a cavidade. O tecido conjuntivo</p><p>apresentou muitas células em meio a nichos de matriz óssea neoformada, preenchida por</p><p>osteócitos volumosos e revestida por grande número de osteoblastos (Figura 13). Na porção</p><p>central do defeito havia uma condensação de tecido conjuntivo com intensa proliferação celular</p><p>e uma ligeira reação inflamatória caracterizada pela presença de leucócitos polimorfonucleares e</p><p>mononucleares. Persistia na porção central pequena porção do material de preenchimento</p><p>(PDGF-BB + Colágeno tipo I) rodeada por numerosas células.</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory notou-se a malha de matriz óssea em início de</p><p>formação com osteócitos volumosos revestidos pelos osteoblastos (Figura 14). Esta formação</p><p>celular intensa evidencia a presença de células cartilaginosas.</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se uma rede óssea neoformada acompanhada de</p><p>tecido conjuntivo denso com restos de material. A matriz óssea formou uma malha fina, cujos</p><p>espaços estavam preenchidos por tecido conjuntivo e havia a presença de inúmeros osteócitos</p><p>em meio às fibras colágenas. Algumas fibras colágenas apresentavam uma discreta</p><p>birrefringência, evidenciando seu amadurecimento (Figura 15 ).</p><p>33</p><p>PDGF-BB</p><p>Período: 7 dias</p><p>Figura 13 – PDGF-BB: Tecido conjuntivo</p><p>celularizado, matriz óssea com osteócitos e e</p><p>osteoblastos</p><p>H&E - ± 405 X</p><p>Figura 14 – PDGF-BB: Malha de matriz</p><p>óssea com osteócitos</p><p>TM - ± 405 X</p><p>Figura 15 – PDGF-BB: Malha de matriz</p><p>óssea , tecido conjuntivo . Discreta</p><p>birrefringência das fibras colágenas.</p><p>PS (Polarização total) - ± 100 X</p><p>34</p><p>Defeito ósseo preenchido com PDGF Purificado após 7 dias</p><p>Verificou-se o preenchimento total do defeito por células, poucos vasos sanguíneos e na</p><p>porção central observou-se um grupo de células volumosas semelhantes às células da cartilagem</p><p>hialina, sem evidência de inflamação. Junto ao leito ósseo as células cartilaginosas se</p><p>misturavam a uma matriz óssea que forma uma rede revestida por osteoblastos formando uma</p><p>verdadeira membrana de células rodeando as fibras colágenas que constituem o osteon, fibras</p><p>estas entremeadas por numerosas células bem volumosas ainda com poucos prolongamentos</p><p>celulares, os osteoblastos (Figura 16 ).</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory o tecido ósseo neoformado era visível através das</p><p>fibras colágenas fortemente coradas em azul formando trabéculas paralelas separadas por muitas</p><p>células. As fibras que formavam as trabéculas estavam aleatoriamente dispostas, desorganizadas</p><p>e distantes umas das outras separadas por tecido conjuntivo rico em células (Figura 17)</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se uma malha óssea imatura rica em osteócitos</p><p>associada ao tecido conjuntivo no centro do defeito. Notou-se uma discreta birrefringência das</p><p>fibras colágenas indicando início de amadurecimento.(Figura 18).</p><p>35</p><p>PDGF PURIFICADO</p><p>Período: 7 dias</p><p>Figura 16 – PDGF Purificado: Osteon rico</p><p>em osteoblastos e osteócitos.</p><p>H&E - ± 405 X</p><p>Figura</p><p>17 – PDGF Purificado: Trabéculas</p><p>ósseas</p><p>TM - ± 325 X</p><p>Figura 18 – PDGF Purificado: Osso</p><p>imaturo e tecido conjuntivo. Discreta</p><p>birrefringência das fibras colágenas.</p><p>PS (polarização total) - ± 100 X</p><p>36</p><p>Defeito ósseo preenchido com Colágeno Tipo I após 15 dias</p><p>O tecido ósseo em processo de formação apresentou-se ligeiramente mais amadurecido que</p><p>o período anterior (Figura 19). Houve preenchimento do defeito com numerosos condrócitos</p><p>formando nichos rodeados por matriz óssea constituída por fibrilas colágenas formadas</p><p>recentemente em meio a numerosos osteócitos. Salientamos que esta neoformação tecidual era</p><p>rica em células e nos espaços celulares havia riqueza de capilares e em cuja superfície deste</p><p>espaço encontravam-se numerosos osteoclastos ativos. Em alguns locais da cartilagem hialina</p><p>ocorreu condrócitos em processo de degeneração (Figura 20). A matriz óssea neoformada era</p><p>rica em osteócitos jovens e volumosos, fibrilas colágenas e capilares sanguíneos.</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory as lamelas ósseas estavam em processo de</p><p>organização, observando-se núcleos cartilaginosos e osteons em meio a numerosos vasos</p><p>sanguíneos e osteoclastos muito visíveis (Figura 21).</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se a presença de inúmeros espaços medulares com</p><p>fibras colágenas com discreta birrefringência em torno dos mesmos (Figura 22).</p><p>37</p><p>COLÁGENO TIPO I</p><p>Período: 15 dias</p><p>Figura 19 – Colágeno Tipo I: Osso em</p><p>amadurecimento</p><p>H&E - ± 405 X</p><p>Figura 20 – Colágeno Tipo I: Condrócitos</p><p>hipertróficos</p><p>H&E - ± 505 X</p><p>Figura 21 – Colágeno Tipo I: Presença de</p><p>cartilagem , osteon , osteoclastos e</p><p>vasos sanguíneos</p><p>TM - ± 155 X</p><p>Figura 22 – Colágeno Tipo I: Discreta</p><p>birrefringência das fibras colágenas</p><p>PS (polarização total) - ± 105 X</p><p>38</p><p>Defeito ósseo preenchido com PDGF-BB após 15 dias</p><p>O defeito encontrava-se preenchido por intensa malha de tecido osteoide com numerosos</p><p>espaços medulares e a matriz orgânica óssea (osteon) repleta de osteócitos no seu interior e</p><p>rodeada por osteoblastos ativos enquanto que a presença de osteoclastos era reduzida. Em meio</p><p>ao osteon ocorreu uma ilha de cartilagem hialina em substituição ao tecido rico em células</p><p>ocorrido aos 7 dias (Figura 23). A cartilagem hialina apresentava células em diversos estágios</p><p>de diferenciação, cartilagem seriada, hipertrófica e cartilagem em degeneração. O tecido que</p><p>limitava este núcleo cartilaginoso tinha um processo dinâmico de substituição da cartilagem por</p><p>tecido ósseo.</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory percebeu-se claramente a formação de osso do tipo</p><p>embrionário. O nicho cartilaginoso encontrava-se fortemente corado pelo Tricrômico de</p><p>Mallory confirmando a presença da proteína colágeno na cartilagem hialina (Figura 24). Os</p><p>limites deste núcleo cartilaginoso apresentavam a substituição da cartilagem por osso (Figura</p><p>25).</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se o leito ósseo preenchido por uma malha de tecido</p><p>ósseo com grandes espaços medulares e a substituição do tecido conjuntivo por uma ilha de</p><p>cartilagem hialina. Notou-se birrefringência moderada das fibras colágenas (Figura 26).</p><p>39</p><p>PDGF-BB</p><p>Período: 15 dias</p><p>Figura 23 – PDGF-BB: Ilha de cartilagem</p><p>hialina</p><p>H&E - ± 125 X</p><p>Figura 24 – PDGF-BB: Ilha de cartilagem</p><p>hialina</p><p>TM - ± 125 X</p><p>Figura 25 – PDGF-BB: Substituição da</p><p>cartilagem por osso</p><p>TM - ± 405 X</p><p>Figura 26 – PDGF-BB: Ilha de cartilagem</p><p>hialina Birrefringência moderada das</p><p>fibras colágenas.</p><p>PS (polarização total) - ± 100 X</p><p>40</p><p>Defeito ósseo preenchido com PDGF Purificado após 15 dias</p><p>Verificou-se a presença de uma matriz óssea primária com muitos osteócitos, grandes</p><p>espaços medulares e núcleos cartilaginosos (Figura 27).</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory observou-se a presença de células cartilaginosas</p><p>no interior das trabéculas ósseas (Figura 28).</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se a matriz óssea com osteócitos associada à</p><p>cartilagem hialina reparativa. Notou-se birrefringência moderada das fibras colágenas (Figura</p><p>29).</p><p>41</p><p>PDGF PURIFICADO</p><p>Período: 15 dias</p><p>Figura 27 – PDGF Purificado: Presença de</p><p>osso primário e células cartilaginosas.</p><p>H&E - ± 325 X</p><p>Figura 28 – PDGF Purificado: Trabéculas</p><p>ósseas com células cartilaginosas</p><p>TM - ± 405 X</p><p>Figura 29 – PDGF Purificado: Cartilagem</p><p>hialina reparativa Birrefringência</p><p>moderada das fibras colágenas</p><p>PS (polarização média) - ± 100 X</p><p>42</p><p>Defeito ósseo preenchido com Colágeno Tipo I após 30 dias</p><p>Verificou-se que ainda persistia a linha reversa de crescimento separando o osso neoformado</p><p>do leito ósseo. O osso neoformado encontrava-se em processo de amadurecimento com grande</p><p>número de osteócitos em processo de organização (Figura 30). Apresentava também grandes</p><p>espaços medulares preenchidos por tecido conjuntivo ricamente celularizado.</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory observou-se que as fibras colágenas da matriz</p><p>óssea formada estavam em processo de organização (Figura 31).</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se uma rede de tecido ósseo neoformado que</p><p>preenchia o defeito com amplos espaços medulares rodeados por osso jovem, cujas fibras</p><p>colágenas apresentavam boa organização lamelar e birrefringência moderada (Figura 32).</p><p>Observou-se ainda o nítido limite entre o osso do leito e o osso neoformado através da linha</p><p>reversa (Figura 33).</p><p>43</p><p>COLÁGENO TIPO I</p><p>Período: 30 dias</p><p>Figura 30 – Colágeno Tipo I: Osso</p><p>neoformado em processo de</p><p>amadurecimento</p><p>H&E - ± 125 X</p><p>Figura 31 – Colágeno Tipo I: Fibras</p><p>colágenas em processo de organização</p><p>TM - ± 405 X</p><p>Figura 32 – Colágeno Tipo I: Amplos</p><p>espaços medulares rodeados por osso jovem</p><p>Birrefringência moderada das fibras</p><p>colágenas.</p><p>PS (polarização total) - ± 100 X</p><p>Figura 33 – Colágeno Tipo I: Linha</p><p>reversa Birrefringência moderada das</p><p>fibras colágenas</p><p>PS (sem polarização) - ± 325 X</p><p>44</p><p>Defeito ósseo preenchido com PDGF-BB após 30 dias</p><p>O osso apresentava um certo grau de diferenciação com porções constituídas por osso</p><p>embrionário e porções constituídas por osso maduro sem no entanto apresentar as lamelas bem</p><p>definidas formando uma grossa rede (Figura 34). Neste período a cartilagem hialina</p><p>apresentava-se substituída por tecido ósseo em processo de formação. Os espaços medulares</p><p>eram grandes e encontravam-se preenchidos por tecido conjuntivo frouxo rico em células.</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory observou-se no núcleo cartilaginoso grande</p><p>concentração de fibras colágenas, sendo que tanto o osso embrionário como o osso maduro não</p><p>apresentavam organização eficiente destas fibras não evidenciando o processo de formação de</p><p>lamelas concêntricas (Figura 35).</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se uma malha óssea neoformada em substituição a</p><p>cartilagem hialina, com espaços medulares amplos e acentuada birrefringência das fibras</p><p>colágenas (Figuras 36 e 37).</p><p>45</p><p>PDGF-BB</p><p>Período: 30 dias</p><p>Figura 34 – PDGF-BB: Porções constituídas</p><p>de osso embrionário e porções de osso</p><p>maduro</p><p>H&E - ± 405 X</p><p>Figura 35 – PDGF-BB: Porções constituídas</p><p>de osso embrionário e porções de osso</p><p>maduro</p><p>TM - ± 405 X</p><p>Figura 36 – PDGF-BB: Malha óssea</p><p>neoformada e amplos espaços medulares</p><p>PS (sem polarização) - ± 100 X</p><p>Figura 37 – PDGF-BB: Acentuada</p><p>birrefringência das fibras colágenas</p><p>PS (polarização total) - ± 100 X</p><p>46</p><p>Defeito ósseo preenchido com PDGF Purificado após 30 dias</p><p>Verificou-se o preenchimento do defeito com grossas trabéculas ósseas contendo osteócitos, os</p><p>espaços medulares foram preenchidos com tecido conjuntivo, notando-se ainda a persistência de</p><p>células cartilaginosas esparsas em meio a matriz óssea (Figura 38).</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory confirmou-se a presença de células cartilaginosas em</p><p>meio às trabéculas ósseas (Figura 39).</p><p>Pela coloração do Picro sirius também se observou o amadurecimento do tecido ósseo</p><p>formando grossas trabéculas com acentuada birrefringência das fibras colágenas (Figura 40).</p><p>47</p><p>PDGF PURIFICADO</p><p>Período: 30 dias</p><p>Figura 38 – PDGF Purificado: Trabéculas</p><p>ósseas contendo osteócitos, espaços</p><p>medulares , células cartilaginosas esparsas</p><p>H&E - ± 405 X</p><p>Figura 39 – PDGF Purificado: Presença de</p><p>células cartilaginosas nas trabéculas</p><p>ósseas. TM - ± 200 X</p><p>Figura 40 – PDGF Purificado:</p><p>Amadurecimento do tecido ósseo,</p><p>birrefringência acentuada das fibras</p><p>colágenas</p><p>PS (polarização total)- ± 100 X</p><p>48</p><p>Defeito ósseo preenchido com Colágeno Tipo I após 45 dias</p><p>Observou-se uma modificação pouco relevante quando comparado aos 30 dias. Era nítida a</p><p>linha que separava o osso do leito e o osso neoformado preenchendo a cavidade, a chamada</p><p>linha reversa de formação óssea, fortemente corada pela Hematoxilina (Figura 41). O osso</p><p>neoformado era imaturo rodeando os canais medulares preenchidos por tecido conjuntivo</p><p>frouxo e vasos sanguíneos. Os inúmeros osteócitos encontravam-se dispostos irregularmente no</p><p>interior da matriz orgânica e os espaços medulares eram muito grande e irregulares, abrigando</p><p>muitas células sanguíneas sendo a maioria mononuclear (Figura 42).</p><p>A análise pela coloração do Tricrômico de Mallory mostrou o osso em processo de</p><p>amadurecimento com as fibras colágenas dispostas paralelas umas as outras, porém pouco</p><p>concêntricas. Notou-se neste período a presença de osteoclastos na superfície óssea e era</p><p>possível visualizar</p><p>a malha de neoformação óssea entremeada por numerosos espaços</p><p>medulares. No tecido ósseo neoformado havia presença dos osteócitos irregularmente dispostos</p><p>(Figura 43).</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se que o grau de maturidade do tecido de</p><p>preenchimento do defeito era semelhante ao do período de 30 dias, porém em algumas áreas</p><p>com osso secundário. Notou-se birrefringência acentuada das fibras colágenas (Figura 44).</p><p>49</p><p>COLÁGENO TIPO I</p><p>Período: 45 dias</p><p>Figura 41 – Colágeno Tipo I: Linha reversa</p><p>separando osso do leito do osso neoformado.</p><p>H&E – ± 505 X</p><p>Figura 43 – Colágeno Tipo I: Presença de</p><p>osteócitos irregularmente dispostos</p><p>TM - ± 250 X</p><p>Figura 44 – Colágeno Tipo I: Áreas com</p><p>osso secundário Birrefringência acentuada</p><p>das fibras colágenas.</p><p>PS (polarização total) - ± 100 X</p><p>Figura 42 – Colágeno Tipo I: Osso</p><p>neoformado imaturo</p><p>H&E - ± 505 X</p><p>50</p><p>Defeito ósseo preenchido com PDGF-BB após 45 dias</p><p>A formação óssea era completa, porém as fibras colágenas dispunham-se de forma irregular</p><p>e ocasionalmente já ocorria à disposição lamelar. Havia riqueza de osteócitos preenchendo os</p><p>nichos do osteon (matriz óssea) bem como uma riqueza de vasos sanguíneos preenchendo</p><p>pequenos espaços medulares (Figura 45). Tal tecido formava uma trama de malha grossa</p><p>entremeada pelos espaços medulares.</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory observou-se a disposição aleatória e concêntrica</p><p>das fibras colágenas ao redor dos osteócitos e canais de Havers (Figura 46).</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se uma mescla de osso lamelar e osso alamelar com</p><p>birrefringência acentuada (Figura 47).</p><p>51</p><p>PDGF-BB</p><p>Período: 45 dias</p><p>Figura 45 – PDGF-BB: Neoformação óssea</p><p>.H&E - ± 505 X</p><p>Figura 46 – PDGF-BB: Disposição das</p><p>fibras colágenas ao redor dos osteócitos e</p><p>canais de Havers</p><p>TM - ± 520 X</p><p>Figura 47 – PDGF-BB: Osso lamelar</p><p>e alamelar Birrefringência acentuada</p><p>das fibras colágenas.</p><p>PS (polarização total) - ± 100 X</p><p>52</p><p>Defeito ósseo preenchido com PDGF Purificado após 45 dias</p><p>O osso encontrava-se em processo de amadurecimento passando de osso primário para</p><p>secundário com diminuição dos espaços medulares e dos osteócitos formando estruturas</p><p>concêntricas (Figura 48).</p><p>Pela coloração do Tricrômico de Mallory notou-se a diminuição do número de osteócitos e a</p><p>arquitetura concêntrica das fibras colágenas formando o osso secundário (Figuras 50 e 51).</p><p>Pela coloração do Picro sirius observou-se uma matriz óssea formando lamelas, bem como</p><p>pequeno nicho cartilaginoso na porção central com presença de osso lamelar e birrefringência</p><p>acentuada das fribras colágenas (Figura 49).</p><p>53</p><p>PDGF PURIFICADO</p><p>Período: 45 dias</p><p>Figura 48 – PDGF Purificado: Presença de</p><p>osso secundário</p><p>H&E - ± 405 X</p><p>Figura 49 – PDGF Purificado: Matriz óssea.</p><p>Birrefringência acentuada das fibras</p><p>colágenas</p><p>PS (polarização média) - ± 100 X</p><p>Figura 50 – PDGF Purificado: Presença de</p><p>osso secundário</p><p>TM - ± 405 X</p><p>Figura 51 – PDGF Purificado: Lamela óssea</p><p>TM - ± 405 X</p><p>54</p><p>4.5- Análise da Fosfatase alcalina óssea nos diferentes tratamentos</p><p>Na tabela 4 são apresentados os valores de atividade da Fosfatase alcalina isoenzima óssea</p><p>(FAO) obtidas em tíbias de Rattus norvegicus albinus submetidos, respectivamente, aos tratamentos</p><p>de regeneração óssea: tratamento com PDGF-BB (Grupo A), tratamento com PDGF purificado</p><p>(Grupo B) e tratamento com Colágeno Tipo I (Grupo C: controle) de acordo com o período</p><p>decorrido após a aplicação do tratamento. Nessa tabela são dadas também as médias e os desvios</p><p>padrão de FAO em cada período.</p><p>Para o estudo da variação da FAO no decorrer dos períodos de avaliação foram empregados</p><p>métodos da análise de regressão.</p><p>Na tabela 5 são apresentados os sumários das análises de variância da regressão da FAO em</p><p>relação ao período de avaliação, separadamente para cada tratamento de regeneração óssea. Em</p><p>todas elas há evidência de regressão (p<0,05). Esses sumários incluem a falta de ajuste como fonte</p><p>de variação, a qual permite avaliar se a reta está bem ajustada às observações. Sempre o valor de</p><p>probabilidade correspondente à falta de ajuste foi maior do que 0,05, indicando que não há</p><p>evidência de que a regressão linear não seja adequada.</p><p>Na tabela 6 são apresentados os resultados do ajuste do modelo de regressão linear. As</p><p>retas ajustadas nos três casos estão representadas graficamente na figura 52, juntamente com as</p><p>médias da FAO em cada ocasião de medição.</p><p>Na tabela 7 apresentados os valores previstos para a média da FAO nas varias ocasiões de</p><p>medição. Junto com a média são mostrados o erro padrão e os limites inferior e superior de um</p><p>intervalo de confiança de 95% para a média real. Comparações detalhadas em cada ocasião podem</p><p>ser obtidas pela observação desses intervalos de confiança. Quanto maior a sobreposição dos</p><p>intervalos, menor a evidência de diferença significativa entre as médias. Na verdade, são</p><p>comprovados</p><p>os resultados apresentados acima.</p><p>Os resultados acima estão sintetizados na Figura 52, onde podemos observar diminuição da</p><p>FAO em média de 5 unidades por dia quando comparados os Grupos A e C, e aumento de 5</p><p>unidades por dia quando comparado o Grupo B com os demais grupos, sendo a atividade da FAO</p><p>no decorrer do período tendendo a similaridade em todos os grupos analisados.</p><p>55</p><p>Tabela 4- Valores de FAO obtidos para os Grupos A, B e C.</p><p>Grupo A</p><p>Animal Período (dias)</p><p>7 15 30 45</p><p>1 441,9 504,6 475,3 208,3</p><p>2 516,3 431,3 462,2 28,1</p><p>3 423,5 233,2 405,7 522,2</p><p>4 576,3 196,3 326,1 148,8</p><p>5 337,2</p><p>Média 489,5 341,4 417,3 248,9</p><p>Desvio padrão 70,4 150,0 67,9 189,0</p><p>Grupo B</p><p>Animal Período (dias)</p><p>7 15 30 45</p><p>1 45,0 238,2 416,4 305,2</p><p>2 163,5 274,2 309,8 391,1</p><p>3 155,8 261,9 434,6 318,8</p><p>4 176,4 269,3 307,2 300,5</p><p>5 303,8 335,6 438,8 500,8</p><p>Média 168,9 275,8 381,4 363,3</p><p>Desvio padrão 91,9 36,2 67,0 85,1</p><p>Grupo C</p><p>Animal Período (dias)</p><p>7 15 30 45</p><p>1 732,9 422,1 648,5 503,7</p><p>2 589,3 568,8 558,1 213,7</p><p>3 641,4 546,4 516,4 261,7</p><p>4 448,0 465,6 350,2 315,6</p><p>5 548,3 407,2 548,3</p><p>Média 592,0 500,7 496,1 368,6</p><p>Desvio padrão 106,0 68,6 119,0 149,0</p><p>56</p><p>Tabela 5- Sumário da análise de variância da regressão linear dos resultados obtidos sobre a FAO</p><p>em relação ao período de avaliação para os Grupos A, B e C.</p><p>Grupo A</p><p>Fonte de Graus de Média F p</p><p>variação liberdade quadrática</p><p>Regressão 1 91176,53 4,709 0,046</p><p>Desvios 15 19361,29</p><p>Falta de ajuste 3 17108,28 0,930 0,454</p><p>Erro puro 13 18391,89</p><p>Grupo B</p><p>Fonte de Graus de Média F p</p><p>variação liberdade quadrática</p><p>Regressão 1 107454,08 16,068 <0,001</p><p>Desvios 18 6687,42</p><p>Falta de ajuste 3 11459,52 2,132 0,136</p><p>Erro puro 16 5374,69</p><p>Grupo C</p><p>Fonte de Graus de Média F P</p><p>variação liberdade quadrática</p><p>Regressão 1 112610,71 8,773 0,009</p><p>Desvios 17 12836,62</p><p>Falta de ajuste 3 4564,61 0,335 0,800</p><p>Erro puro 15 13635,25</p><p>57</p><p>0</p><p>100</p><p>200</p><p>300</p><p>400</p><p>500</p><p>600</p><p>700</p><p>0 10 20 30 40 50</p><p>Período (dias)</p><p>F</p><p>A</p><p>O</p><p>Grupo A</p><p>Grupo B</p><p>Grupo C</p><p>Figura 52 - Representação gráfica das médias da FAO e as retas de regressão correspondentes aos</p><p>três grupos experimentais em estudo.</p><p>Tabela 6 - Estimativas dos coeficientes da regressão linear da variação da FAO com o período de</p><p>medição, limite inferior (LI) e limite superior (LS) de um intervalo de confiança (IC) de 95%</p><p>para o valor real.</p><p>Grupo Coeficientes Estimativas Erro IC de 95%</p><p>padrão LI LS</p><p>A Intersecção 491,8 66,7 349,6 634,0</p><p>Declividade -4,9 2,3 -9,7 -0,1</p><p>Correlação 0,489</p><p>B Intersecção 175,2 35,5 100,5 249,8</p><p>Declividade 5,0 1,3 2,4 7,7</p><p>Correlação 0,687</p><p>C Intersecção 617,7 50,7 510,7 724,7</p><p>Declividade -5,2 1,8 -8,9 -1,5</p><p>Correlação 0,583</p><p>58</p><p>Tabela 7 - Valores médios previstos de FAO de acordo com a época de medição, limite inferior</p><p>(LI) e limite superior (LS) de um intervalo de confiança (IC) de 95% para o valor real da média.</p><p>Grupo Período Média Erro IC de 95%</p><p>(dias) prevista padrão LI LS</p><p>A 7 457,5 53,7 343,1 571,9</p><p>15 418,2 41,2 330,4 506,1</p><p>30 344,7 35,3 269,5 419,9</p><p>45 271,1 55,6 152,7 389,5</p><p>B 7 210,4 28,4 150,9 270,0</p><p>15 250,7 21,7 205,2 296,3</p><p>30 326,3 19,7 285,0 367,6</p><p>45 401,9 31,9 335,0 468,8</p><p>C 7 581,2 40,6 495,5 666,9</p><p>15 539,5 31,1 473,8 605,2</p><p>30 461,3 27,6 403,1 519,5</p><p>45 383,1 44,1 290,0 476,2</p><p>Na tabela 8 são dados os escores resultantes da análise histológica. Em todas as lâminas</p><p>examinadas de cada animal, o escore foi sempre o mesmo, com exceção de um único animal do</p><p>grupo B onde um animal apresentou escore uma classe acima dos outros. Portanto, não houve</p><p>variação dos escores dentro de cada grupo em um mesmo período de avaliação. Desse modo, pode-</p><p>se atribuir a cada tempo para um mesmo grupo exatamente os escores constates da tabela 8, sendo</p><p>que:</p><p>(6) Presença de células inflamatórias em meio de células conjuntivas</p><p>(7) Tecido conjuntivo denso</p><p>(8) Tecido cartilaginoso</p><p>(9) Formação de osso primário</p><p>(10) Formação de osso secundário</p><p>Tabela 8 – Escores resultantes da análise histológica</p><p>Grupo Período</p><p>7 15 30 45</p><p>Grupo A 2* 3 4 5</p><p>Grupo B 3 3 4 5</p><p>Grupo C 2 3 4 4</p><p>* ocorreu uma única amostra com escore 3</p><p>59</p><p>V- DISCUSSÃO</p><p>A regeneração óssea é um processo complexo, no qual envolve muitos componentes</p><p>humorais e celulares, tendo muitas características similares às que ocorrem durante o</p><p>desenvolvimento do esqueleto embrionário e posnatal, onde as células e seus produtos interagem</p><p>para reparar o defeito ósseo (Gerstenfeld et al. 2003). O ambiente químico, no primeiro estágio do</p><p>processo de regeneração do tecido ósseo, contém componentes que medeiam importantes eventos</p><p>celulares tais como: fatores quimiotáticos para células sanguíneas precursoras de osteoblastos, bem</p><p>como induzir sua proliferação e diferenciação através da expressão e secreção de componentes</p><p>estruturais para a formação óssea (Mundy 1996; Gerstenfeld et al. 2003).</p><p>A migração celular, concomitantemente com a proliferação, na região do trauma, é de</p><p>importância crítica no processo de remodelação e formação de novo tecido durante a regeneração.</p><p>Os mecanismos detalhados deste processo não são conhecidos, mas as citocinas e os fatores de</p><p>crescimento desempenham um papel fundamental neste processo. Vários estudos relatam que um</p><p>único fator de crescimento incluindo TGF-β (Pfeilschifter et al. 1990; Hughes & McCulloch 1991;</p><p>Hughes et al. 1992), BMPs (Lind 1998; Mayr-Wohlfart et al. 2002), PDGF (Hughes et al. 1992;</p><p>Hsieh & Graves 1998), bFGF e VEGF (Mayr-Wohlfart et al. 2002) é capaz de promover respostas</p><p>quimiotáticas de células precursoras (Pfeilschifter et al. 1990; Hughes</p><p>& McCulloch 1991; Hughes</p><p>et al. 1992; Mayr-Wohlfart et al. 2002). A grandeza da resposta quimiotática, no entanto, difere</p><p>acentuadamente de acordo com os tipos celulares e variam com o tipo de fator de crescimento</p><p>envolvido (Hughes & McCulloch 1991; Hughes et al. 1992).</p><p>O PDGF tem demonstrado ser um potente agente quimiotático e mitogênico para</p><p>fibroblastos e osteoblastos, e, quando aplicado in vivo pode estimular a migração destas células, na</p><p>área da lesão, bem como promover sua proliferação. Além disso, este fator parece ser capaz de</p><p>estimular processos metabólicos de células recrutadas levando a formação de colágeno e osso</p><p>(Lynch et al., 1989).</p><p>Purificação do PDGF</p><p>Várias metodologias tem sido descritas objetivando a obtenção do PDGF purificado.</p><p>Partindo de uma fonte comum, as plaquetas, e o uso de uma série de colunas cromatográficas foi</p><p>possível obter o PDGF purificado, sendo que à medida que a proteína era submetida a um número</p><p>maior de procedimentos cromatográficos, aumentavam as possibilidades de se obter um</p><p>componente mais homogêneo e, consequentemente, efetivar sua caracterização (Heldin et al., 1977-</p><p>79; Antoniades et al., 1979; Antoniades, 1981; Deuel et al., 1981; Raines & Ross, 1982-85).</p><p>60</p><p>Usando 120 unidades de Concentrados de Plaquetas humanas com 5 dias de vencimento</p><p>para obtenção do PDGF, procuramos obter um componente purificado, envolvendo o uso de apenas</p><p>uma coluna cromatográfica de CM-Celulose. Através desse processo obtivemos 1,697 mg/mL de</p><p>proteína após eluição da CM-Celulose, rendimento próximo àquele descrito por Heldin et al. (1979)</p><p>que partindo de 200 unidades de Concentrados de Plaquetas humanas vencidas, obteve 2,7 mg/mL</p><p>de proteínas usando uma coluna cromatográfica de Blue-Sepharose.</p><p>A caracterização do PDGF purificado foi possível através dos ensaios de Immunoblot/Slot</p><p>Blot, com o uso de anticorpo policlonal Anti-PDGF-BB. Embora tenha sido caracterizado a</p><p>presença do PDGF-BB na proteína eluida da coluna CM-Celulose, não podemos afirmar que esta</p><p>proteína seja na sua totalidade de PDGF-BB, podendo conter outros fatores presentes nas plaquetas</p><p>tais como o TGF-β.</p><p>Este estudo foi conduzido para analisar histológica e bioquimicamente a influência do</p><p>PDGF-BB na regeneração do tecido conjuntivo mineralizado em tíbias de ratos, após defeito</p><p>cirurgicamente produzido. A formação de osso foi avaliada pela análise histológica e determinação</p><p>da atividade enzimática óssea da fosfatase alcalina.</p><p>Análise histológica</p><p>A coleta de dados para a avaliação histológica foi cuidadosamente realizada usando um</p><p>experimento cego para evitar tendenciosidade na análise dos grupos em questão.</p><p>Com relação aos corantes utilizados, optou-se pela utilização de três colorações:</p><p>Hematoxilina e Eosina (HE), Tricrômico de Mallory (TM) e Picro Sirius (PS) devido à análise mais</p><p>apurada que cada coloração pode oferecer. A HE, coloração de rotina nos permite avaliar a</p><p>morfologia celular, o TM evidencia a substância intercelular (Junqueira & Carneiro, 2004), e a</p><p>coloração pelo PS, para análise sob microscopia de polarização, é utilizada para detectar o</p><p>amadurecimento das fibras de colágeno tipo I. A cor e a itensidade da birrefringência do colágeno</p><p>variam dependendo do diâmetro das fibras e da espessura do tecido formado. Esse método possui a</p><p>vantagem de revelar a organização tridimensional das fibras colágenas, o principal componente do</p><p>osso (Garavello-Freitas et al., 2003)</p><p>Para avaliar o novo tratamento devemos separar em unidades similares dois grupos, um</p><p>grupo que receberá o novo tratamento e o outro que receberá o tratamento convencional ou padrão</p><p>(Vieira & Hossne, 2002). Desta forma foram realizados três grupos: Grupo A (tratamento com</p><p>Colágeno Tipo I + PDGF-BB), Grupo B (tratamento com Colágeno Tipo I + PDGF Purificado) e</p><p>Grupo C (Grupo Controle, tratamento com Colágeno Tipo I). Neste trabalho nós escolhemos o</p><p>Colágeno Tipo I como veículo por ter sido descrito em vários estudos como sendo um bom</p><p>61</p><p>carreador para fatores de crescimento (Nask et al., 1994; LeGrand, 1998; Stephan et al., 2000;</p><p>Kanematsu et al., 2004). O Colágeno Tipo I tem estrutura fibrilar, é a proteína mais abundante na</p><p>matriz extracelular do osso, promove deposição mineral e pode se ligar a proteínas da matriz não</p><p>colagenosas que também iniciam a mineralização (Lieberman et al., 2002).</p><p>Pela análise por microscopia óptica, com o emprego das diversas colorações obsevamos que</p><p>aos 7 dias os Grupos A e B apresentavam formação celular intensa evidenciando a presença de</p><p>células cartilaginosas e as fibras colágenas em inicio de amadurecimento, visto pela discreta</p><p>birrefringência das mesmas, sendo que no Grupo B foi observado presença de número maior de</p><p>células em relação aos demais grupos. Este resultado está em acordo com os relatados por Lynch et</p><p>al.(1991), Wang et al. (1994) e Mott et al. (2002), que observaram um aumento na atividade</p><p>osteoblásticas em 7 dias após aplicação do PDGF combinado a outros fatores. Enquanto o Grupo C</p><p>(Controle) apresentava células inflamatórias e sem evidência de birrefringência de fibras,</p><p>evidenciando um estágio de maturação anterior aos Grupos A e B. Lynch et al. (1989) e Wang et al.</p><p>(1994), trabalhando com regeneração periodontal em cães, observaram um predomínio de células</p><p>inflamatórias no grupo controle, enquanto que o grupo tratado com PDGF-BB/IGF-I havia a</p><p>ocorrência de nova formação óssea.</p><p>Este processo foi verificado no decorrer dos períodos analisados, finalizando no 45º dia,</p><p>onde observamos que as tíbias dos animais dos Grupos A e B apresentavam completa formação</p><p>óssea, enquanto o Grupo C ainda apresentavam uma mistura de osso primário e secundário, embora</p><p>algumas de suas fibras colágenas demonstraram birrefringência acentuada.</p><p>A eficiência do tratamento com o PDGF-BB também foi comprovada por Robson et al.</p><p>(1992), que observaram redução no tamanho de úlceras tratadas com PDGF-BB recombinante</p><p>humano (1µg/cm2/área) em relação ao grupo controle, após 28 dias de aplicação. O mesmo</p><p>resultado foi observado por Mustoe et al (1994), usando uma dosagem de 1 a 3 µg/cm2/área e, Steed</p><p>(1995), usando 2,2 µg/cm2/área. Saba et al. (2002) observaram o fechamento de feridas em 16 dias</p><p>após aplicação do PDGF-BB tanto em ratos como em humanos. Matsuda et al. (1992), Rutherford</p><p>et al. (1993), Giannobile et al. (1994 e 1996), Mc Guire et al. (2006) e Cooke et al. (2006) também</p><p>comprovaram a aplicação clínica do PDGF-BB em procedimentos de regeneração periodontal. No</p><p>entanto, nenhum desses pesquisadores mostraram um processo de regeneração em tão curto</p><p>intervalo de tempo após o tratamento usando tecido mineralizado.</p><p>62</p><p>Análise bioquímica</p><p>A fosfatase alcalina é uma glicoproteína de membrana com atividade enzimática,</p><p>considerada um bom marcador bioquímico de formação óssea. Oferece algumas vantagens na</p><p>prática clínica por não ser um processo invasivo e poder ser repetido (Pagani et al., 2005). Embora</p><p>sua função seja desconhecida, acredita-se que a enzima esteja envolvida com a formação de osso e a</p><p>mineralização da matriz óssea (Garnero & Delmas, 1993; Farley & Baylinl, 1995; Vieira, 1999).</p><p>Sua atividade sérica é proporcional à formação de colágeno e geralmente correlaciona-se bem com</p><p>o crescimento ósseo e com doenças metabólicas (Vieira, 1999). Existem diversas maneiras de se</p><p>estimar qualitativa ou semi-quantativamente a atividade da fosfatase alcalina esquelética, a maioria</p><p>refere-se ao uso da uréia ou do calor como agente de inativação. Em um procedimento típico,</p><p>atividade residual menor que 20% da fosfatase sérica após incubação por 10 minutos à 56ºC sugere</p><p>que a amostra contenha predominantemente fosfatase alcalina óssea.</p><p>Neste trabalho observamos que há o indicativo de que tanto para o Grupo A como para o</p><p>Grupo C, a FAO diminui em média de aproximadamente 5 unidades por dia. Considerando os</p><p>coeficientes de interseção, observamos que em todo o período de avaliação a média de FAO do</p><p>Grupo C esteve próxima de 126 unidades acima da média do Grupo A. Considerando o intervalo de</p><p>95% confiança para os coeficientes de intersecção, observamos que a diferença entre os efeitos de</p><p>regeneração óssea do Grupo A e Grupo C é estatisticamente significativa, embora ainda haja</p><p>alguma sobreposição dos dois intervalos. Após 7 dias do tratamento com PDGF-BB (Grupo A)</p><p>observa-se a aceleração do processo de regeneração óssea, porém, não se observou o efeito do</p><p>tratamento sobre os demais períodos. Isso pode ser confirmado pelo paralelismo razoável entre as</p><p>retas referentes aos dois grupos (Figura 52). Os resultados obtidos estão em acordo com aqueles</p><p>demonstrados por Heldin & Westermark (1996), onde o PDGF não altera a seqüência normal do</p><p>reparo, mas aumenta a eficiência do processo. Yokose et al. (2004), trabalhando com cultura de</p><p>polpa dentária observaram que a atividade da FAO em células tratadas com PDGF-BB era</p><p>significativamente menor que a do grupo controle em 5, 10 e 15 dias, depois aumentava</p><p>gradualmente, sendo que aos 20 dias a atividade da FAO do grupo tratado com o PDGF era similar</p><p>ao do grupo controle. Gallo et al. (1997), avaliando a atividade da fosfatase alcalina em cultura de</p><p>células endoteliais observaram que a atividade da enzima estava presente somente em fluidos</p><p>coletados durante a fase inflamatória do reparo da ferida, ou seja, nos primeiros 7 dias.</p><p>Em relação ao grupo B pode-se verificar um aumento da FAO de 5 unidades por dia, no</p><p>período de avaliação. A discussão desse resultado não é tão direta como aquela descrita acima em</p><p>relação aos grupos A e C. Como a FAO se relaciona com a capacidade de mineralização dos</p><p>63</p><p>osteoblastos e o colágeno tipo I estimula a proliferação de osteoblastos e diferenciação osteogênica,</p><p>o PDGF, ao contrário, estimula o influxo celular local que auxilia no processo de regeneração óssea,</p><p>como podemos demonstrar nas Figuras 16 e 17 (PDGF Purificado – 7 dias). O aumento da</p><p>migração celular pode não ser devido à ação exclusiva do PDGF, mas como efeito do sinergismo de</p><p>outros fatores de crescimento derivados de plaquetas, uma vez que não podemos afirmar que a</p><p>proteína purificada não continha outros fatores plaquetários. Desta forma, acreditamos que este</p><p>resultado seja devido ao PDGF agir na fase de recrutamento das células, diferenciação e depois</p><p>ativação; enquanto que o colágeno está mais relacionado com a fase de síntese da matriz e</p><p>mineralização. Por isso a FAO encontra-se aumentada no Grupo Colágeno Tipo I. Esta hipótese</p><p>encontra-se esquematizada a baixo, considerando-se um novo entendimento deste processo, baseado</p><p>em esquemas propostos anteriormente (Figura 53).</p><p>64</p><p>Figura 53. Esquema proposto sobre o processo de remodelação do tecido ósseo, modificado</p><p>de Ralston, 2002.</p><p>Por outro lado, os coeficientes de correlação linear, para os três grupos, estão entre 0,50 e</p><p>0,70, indicando que o grau de associação linear não é tão forte. Isso se deve a variação</p><p>relativamente grande dos valores de FAO em cada ocasião da avaliação. Entretanto, os modelos</p><p>lineares adotados são razoáveis para descrever a variação, em média, da FAO. Somente a precisão</p><p>nas estimativas não é boa.</p><p>No entanto, o uso da FAO como marcador bioquímico de formação óssea não demonstrou</p><p>neste trabalho ser de grande valia. O mesmo foi observado por Chaudhary et al. (2004), que</p><p>estudando o mecanismo de ação de agentes osteogênicos na formação óssea, concluíram que o</p><p>PDGF-BB tem pouco ou nenhum efeito na atividade da fosfatase alcalina. Seebeck et al. (2005),</p><p>observaram que não houve correlação entre os dados histológicos e marcadores de formação óssea,</p><p>Linhagem Celular</p><p>Quiescência</p><p>Mineralização</p><p>Formação</p><p>Síntese da Matriz</p><p>Osteblasto</p><p>- Recrutamento</p><p>- Diferenciação</p><p>- Ativação</p><p>Inversão</p><p>Osteclasto</p><p>- Apoptose</p><p>- Inversão</p><p>Reabsorção</p><p>Osteoclasto</p><p>- Recrutamento</p><p>- Diferenciação</p><p>- Ativação</p><p>Ação do PDGF</p><p>Ação do Colágeno Tipo I</p><p>Liberação da FAO</p><p>65</p><p>concluindo que os marcadores de formação óssea não foram adequados como marcadores gerais do</p><p>defeito no acompanhamento da cicatrização da fratura.</p><p>O desenvolvimento deste modelo experimental para o estudo de processo de regeneração do</p><p>tecido ósseo, pela indução com PDGF Purificado de plaquetas humanas vencidas, mostrou-se viável</p><p>e permitiu obter informação sobre a participação desta citocina na redução do tempo de formação</p><p>da matriz óssea. A purificação desta proteína a partir de hemocomponentes clinicamente vencidos,</p><p>que seriam descartados, representa uma contribui��ão para a elaboração de novos projetos de</p><p>pesquisa objetivando a implementação de uma linha de produção de um novo hemoderivado, quer</p><p>por processos cromatográficos, quer por engenharia genética como acontece com o Fator VIII.</p><p>Diante dos resultados obtidos, novos estudos deverão ser conduzidos no sentido da melhor</p><p>compreensão dos mecanismos bioquímicos e imunológicos envolvidos neste processo, tornando-se</p><p>possível a obtenção de tecido ósseo maduro com menor tempo de regeneração.</p><p>........................................................................................................................</p><p>XVII</p><p>I. INTRODUÇÃO ...............................................................................................................</p><p>1</p><p>1.1.</p><p>Características bioquímicas do PDGF .......................................................................</p><p>1</p><p>1.1.1. Obtenção de PDGF a partir de plaquetas humanas..........................................</p><p>2</p><p>1.2.</p><p>Características moleculares do receptor de PDGF ....................................................</p><p>5</p><p>1.3.</p><p>Atividades biológicas do PDGF ................................................................................</p><p>11</p><p>1.3.1. Regeneração de tecidos moles.......................................................................... 11</p><p>1.3.2. Regeneração de tecidos mineralizados............................................................. 12</p><p>1.4. Aplicação Clínica do PDGF....................................................................................... 16</p><p>1.4.1. Regeneração de tecidos moles.......................................................................... 16</p><p>1,4.2. Regeneração de tecidos mineralizados............................................................. 17</p><p>II. OBJETIVO .....................................................................................................................</p><p>19</p><p>III. MATERIAL E MÉTODOS ..........................................................................................</p><p>20</p><p>3.1. Comitê de Ética.......................................................................................................... 20</p><p>3.2.</p><p>Obtenção do concentrado de plaquetas .....................................................................</p><p>20</p><p>3.3.</p><p>Obtenção do lisado plaquetário .................................................................................</p><p>20</p><p>3.4.</p><p>Purificação parcial do PDGF .....................................................................................</p><p>21</p><p>3.4.1. Cromatografia ..................................................................................................</p><p>21</p><p>3.5.</p><p>Dosagem de proteínas ................................................................................................</p><p>21</p><p>3.6.</p><p>Detecção do PDGF ....................................................................................................</p><p>21</p><p>3.6.1. Immunoblot/Slot Blot ………………………….………………….…….……</p><p>21</p><p>3.7.</p><p>Ensaio biológico do PDGF ........................................................................................</p><p>22</p><p>PÁGINA</p><p>XI</p><p>3.7.1. Animais e Anestesia......................................................................................... 22</p><p>3.7.2. Preenchimento dos defeitos ósseos e técnicas cirúrgicas.................................</p><p>22</p><p>3.7.3. Período experimental................................. ......................................................</p><p>23</p><p>3.7.4. Coleta da amostra para análise bioquímica.. ...................................................</p><p>23</p><p>3.7.5. Preparo das peças..............................................................................................</p><p>24</p><p>3.7.6. Fixação e descalcificação das peças................................................................. 24</p><p>3.7.7. Desidratação e diafanização............................................................................. 24</p><p>3.7.8. Inclusão............................................................................................................. 24</p><p>3.7.9. Preparo dos blocos e coloração........................................................................ 25</p><p>3.7.10. Análise histológica......................................................................................... 25</p><p>3.8. Análise bioquímica..................................................................................................... 26</p><p>3.8.1. Determinação da fosfatase alcalina óssea......................................................... 26</p><p>3.9. Análise Estatística....................................................................................................... 26</p><p>IV- RESULTADOS.............................................................................................................</p><p>28</p><p>Purificação parcial do PDGF......................................................................................</p><p>28</p><p>4.1.</p><p>Cromatografia em troca iônica...................................................................................</p><p>28</p><p>4.2.</p><p>Dosagem de proteínas.................................................................................................</p><p>29</p><p>4.3.</p><p>Detecção do PDGF.....................................................................................................</p><p>29</p><p>4.3.1. Immunoblot/Slot Blot.......................................................................................... 29</p><p>4.4. Análise Histológica..................................................................................................... 29</p><p>4.5. Análise da FAO nos diferentes tratamentos............................................................... 54</p><p>V. DISCUSSÃO...................................................................................................................</p><p>59</p><p>VI. CONCLUSÕES.............................................................................................................</p><p>66</p><p>VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................</p><p>67</p><p>Apêndice</p><p>XII</p><p>LISTA DE FIGURAS</p><p>Figura 1.</p><p>Subfamília de receptores de tirosina quinases .........................................</p><p>6</p><p>Figura 2.</p><p>Processamento e ação das isoformas do PDGF........................................</p><p>7</p><p>Figura 3.</p><p>Fator de crescimento derivado de plaquetas- A: Estrutura dimérica, B:</p><p>Sítios de ligação ao receptor ....................................................................</p><p>8</p><p>Figura 4.</p><p>Processo de remodelação do tecido ósseo................................................</p><p>14</p><p>Figura 5. Reação catalisada pela fosfatase alcalina................................................. 15</p><p>Figura 6. Perfil cromatográfico do PDGF em CM-celulose.................................... 28</p><p>Figura 7. Reatividade no Immunoblot/Slot Blot com anti-PDGF-BB...................... 29</p><p>Figura 8. Confecção e preenchimento do defeito cirúrgico..................................... 30</p><p>Figuras 9-12 Resultados histológicos – Colágeno Tipo I, 7 dias................................... 31</p><p>Figuras 13-15 Resultados histológicos – PDGF-BB, 7 dias............................................ 33</p><p>Figuras 16-18 Resultados histológicos – PDGF</p><p>66</p><p>VI- CONCLUSÕES</p><p>Considerando as limitações deste estudo podemos concluir:</p><p>� a metodologia padronizada para a purificação do PDGF mostrou-se adequada, e os</p><p>resultados alcançados estiveram próximos aos descritos na literatura, mesmo</p><p>trabalhando com procedimentos cromatográficos de menor complexidade e de baixo</p><p>custo,</p><p>� o uso do PDGF Purificado com o colágeno tipo I como veículo, acelera o processo</p><p>de regeneração de tecido ósseo aos 7 dias após tratamento,</p><p>� aos 45 dias de seguimento houve formação de osso maduro induzido no defeito</p><p>preenchido com PDGF Purificado,</p><p>� a fosfatase alcalina óssea não se revelou como um marcador bioquímico primário na</p><p>determinação da eficácia do processo de regeneração do tecido ósseo.</p><p>67</p><p>VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS</p><p>AKESSON, K. 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Curva de referência para determinação de proteína pelo reagente de Folin-Ciocalteau,</p><p>segundo Lowry.</p><p>- Proteína – Soro Albumina Bovina: 15 mg em 50 mL de H2 O destilada</p><p>TUBOS</p><p>Proteína</p><p>v (mL)</p><p>H2 O dest.</p><p>v (mL)</p><p>Solução A</p><p>v (mL)</p><p>Tempo</p><p>de espera</p><p>Folin</p><p>v (mL)</p><p>Tempo</p><p>de espera</p><p>1</p><p>-</p><p>1,0</p><p>5,0</p><p>15 min.</p><p>0,5</p><p>30 min.</p><p>2</p><p>0,1</p><p>0,9</p><p>5,0</p><p>15 min.</p><p>0,5</p><p>30 min.</p><p>3</p><p>0,2</p><p>0,8</p><p>5,0</p><p>15 min.</p><p>0,5</p><p>30 min.</p><p>4</p><p>0,3</p><p>0,7</p><p>5,0</p><p>15 min.</p><p>0,5</p><p>30 min.</p><p>5</p><p>0,4</p><p>0,6</p><p>5,0</p><p>15 min.</p><p>0,5</p><p>30 min.</p><p>6</p><p>0,5</p><p>0,5</p><p>5,0</p><p>15 min.</p><p>0,5</p><p>30 min.</p><p>7</p><p>0,6</p><p>0,4</p><p>5,0</p><p>15 min.</p><p>0,5</p><p>30 min.</p><p>8</p><p>0,7</p><p>0,3</p><p>5,0</p><p>15 min.</p><p>0,5</p><p>30 min.</p><p>A solução A foi preparada no momento de uso:</p><p>- Solução A: - 50 mL de Na2 CO3 , 2% em NaOH 0,1 N</p><p>- 0,5 mL CuSO4 , 1% em H2 O destilada</p><p>- 0,5 mL de tartarato de sódio potássio 1% em H2 O destilada</p><p>- Reagente Folin-Ciocalteau: foi diluido 1:2 no momento de uso</p><p>- O gráfico foi construído após leituras no espectrofotômetro 660 nm .</p><p>83</p><p>Purificado, 7 dias................................. 35</p><p>Figuras 19-22 Resultados histológicos – Colágeno Tipo I, 15 dias................................. 37</p><p>Figuras 23-26 Resultados histológicos – PDGF-BB, 15 dias.......................................... 39</p><p>Figuras 27-29 Resultados histológicos – PDGF Purificado, 15 dias............................... 41</p><p>Figuras 30-33 Resultados histológicos – Colágeno Tipo I, 30 dias................................. 43</p><p>Figuras 34-37 Resultados histológicos – PDGF-BB, 30 dias.......................................... 45</p><p>Figuras 38-40 Resultados histológicos – PDGF Purificado, 30 dias............................... 47</p><p>Figuras 41-44 Resultados histológicos – Colágeno Tipo I, 45 dias................................. 49</p><p>Figuras 45-47 Resultados histológicos – PDGF-BB, 45 dias.......................................... 51</p><p>Figuras 48-51 Resultados histológicos – PDGF Purificado, 45 dias............................... 53</p><p>Figura 52. Representação gráfica das médias da FAO.............................................. 57</p><p>Figura 53. Esquema proposto sobre o processo de remodelação óssea..................... 64</p><p>XIII</p><p>LISTA DE TABELAS</p><p>Tabela 1.</p><p>Tipos de células normais que liberam o PDGF.........................................</p><p>3</p><p>Tabela 2.</p><p>Efeitos celulares mediados pelos receptores homodiméricos α e β de</p><p>PDGF...........................................................................................................</p><p>9</p><p>Tabela 3.</p><p>Tipos celulares que expressam receptores de PDGF .................................</p><p>10</p><p>Tabela 4. Valores de FAO obtidos para os Grupos A, B e C...................................... 55</p><p>Tabela 5. Sumário da análise de variância da regressão linear dos resultados</p><p>obtidos.........................................................................................................</p><p>56</p><p>Tabela 6. Estimativas dos coeficientes da regressão linear da variação da FAO....... 57</p><p>Tabela 7. Valores médios previstos de FAO por períodos.......................................... 58</p><p>Tabela 8. Escores resultantes da análise histológica................................................... 58</p><p>XIV</p><p>ABREVIATURAS</p><p>A Absorvância</p><p>aFGF Fator de crescimento de fibroblasto do tipo alfa</p><p>µµµµg Micrograma(s)</p><p>µµµµL Microlitro(s)</p><p>µµµµm Micrometro(s)</p><p>αααα Alfa</p><p>ββββ Beta</p><p>bFGF Fator de crescimento de fibroblasto do tipo beta</p><p>BMP Proteína da morfogenética do osso</p><p>BSA Soro albumina bovina</p><p>ºC Graus Celsius</p><p>CEEA Comitê de Ética em Experimentação Animal</p><p>cm Centímetro</p><p>CM-Celulose Carboximetil-Celulose</p><p>cm2 Centímetros quadrado</p><p>DEA Dietanolamina</p><p>EGF Fator de crescimento epidermal</p><p>FAO Fosfatase alcalina óssea</p><p>g Grama</p><p>GAP Proteína ativadora de GTPase (Guanosina trifosfatase)</p><p>H & E Hematoxilina e eosina</p><p>[H 3]-TdR Timidina tritiada</p><p>IC Intervalo de confiança</p><p>Ig Imunoglobulina</p><p>IGF-I e II Fator de crescimento semelhante a insulina I e II</p><p>kDa QuiloDalton – 1 kDa equivale a 1000 Daltons</p><p>LI Limite inferior</p><p>LS Limite superior</p><p>M Molar</p><p>min. Minuto</p><p>mg Miligrama(s)</p><p>XV</p><p>mL Mililitro(s)</p><p>mm Milímetro</p><p>mM Milimolar</p><p>nº Número</p><p>ng Nonograma (10-9 gramas)</p><p>nm Nanômetro(s)</p><p>PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida</p><p>PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas</p><p>PF-4 Fator 4 plaquetário</p><p>pg Picograma(s)</p><p>pI Ponto isoelétrico</p><p>pNPP Para-nitrofenil fosfato</p><p>PPP Plasma pobre em plaquetas</p><p>PRP Plasma rico em plaquetas</p><p>PS Picro sirius</p><p>rpm Rotações por minuto</p><p>SDS Dodecilsulfato de sódio</p><p>SH2 Src homology 2 – proteína oncogênica do vírus do Sarcoma de Rous</p><p>TA Temperatura ambiente</p><p>TBS Solução salina tamponada com Tris-HCl</p><p>TGF-ββββ Fator de crescimento de transformação β</p><p>TM Tricrômico de Mallory</p><p>Tris Tris[hidroximetil]aminometano</p><p>UI Unidades Internacionais</p><p>VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular</p><p>XVI</p><p>RESUMO</p><p>O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) é uma proteína catiônica com cadeias</p><p>polipeptídicas homo e heterodiméricas A e B, armazenado principalmente nos grânulos-α plaquetário.</p><p>Exerce seus efeitos sobre células alvo pela ativação de dois receptores estruturalmente relacionados aos</p><p>receptores da proteína tirosina quinase, denominados receptores α e β, que transduzem potentes sinais</p><p>mitogênicos. A atividade mitogênica do PDGF é observada sobre diversos tipos celulares, principalmente</p><p>fibroblastos e leiomiócitos, mostrando ser de grande importância no processo de regeneração tecidual. Este</p><p>fator tem sido usado, com sucesso, para acelerar o processo de regeneração tecidual, sozinho ou em</p><p>combinação com outros fatores de crescimento que parecem desenvolver uma função crítica sobre a</p><p>cicatrização óssea. Por isso, os estudos sobre esses fatores têm se tornado uma importante área de</p><p>investigação, com o objetivo de aumentar o processo de cicatrização de fraturas ou restaurações ósseas.</p><p>O reparo ósseo é um processo de múltiplas etapas envolvendo a migração, proliferação,</p><p>diferenciação e ativação de vários tipos celulares. O osso é constantemente remodelado por ciclos</p><p>de reabsorção e formação. Este processo tem sido avaliado pela determinação de marcadores</p><p>bioquímicos, sendo a fosfatase alcalina óssea considerada como um bom marcador de formação</p><p>óssea.</p><p>Nesse trabalho purificamos o PDGF a partir de concentrados de plaquetas humanas</p><p>vencidos, provenientes de doadores de sangue, hemocomponentes do Hemonúcleo Regional de</p><p>Araraquara – NAC/FCF – UNESP. O lisado plaquetário obtido a partir de aproximadamente 5 x</p><p>1010 plaquetas por unidade foi submetido ao fracionamento cromatográfico usando colunas de</p><p>trocadores catiônicos CM-Celulose. A presença do PDGF na fração eluída foi confirmada por</p><p>Immunoblot/Slot Blot, usando anticorpos policlonais anti-PDGF-BB. O PDGF obtido foi usado para</p><p>o preenchimento de defeitos cirúrgicos em tíbias de ratos e posterior avaliação</p><p>por análise</p><p>histológica e determinação da atividade da fosfatase alcalina com o objetivo de avaliar a</p><p>regeneração do tecido ósseo após 07, 15, 30 e 45 dias de observação. Aos 7 dias posteriores a</p><p>cirurgia, foi verificado diferenças estatisticamente significativas na dosagem da fosfatase alcalina</p><p>óssea (FAO) para os diferentes grupos ( Grupo A – PDGF-BB, Grupo B – PDGF Purificado e</p><p>Grupo C (controle)– Colágeno Tipo I, sendo este último com valores mais elevados. Por este</p><p>resultado, concluímos que a FAO não se revelou como um bom marcador bioquímico para</p><p>formação óssea. Pela análise histológica, observamos um maior número de células envolvidas no</p><p>processo de reparação do Grupo A e B em relação ao Grupo C. Desta forma, aos 45 dias de</p><p>seguimento houve formação de osso maduro induzido no defeito preenchido com PDGF-BB e</p><p>PDGFPurificado, enquanto que no Grupo Controle existia predomínio de osso primário,</p><p>comprovando o efeito mitogênico do PDGF e sua eficácia na indução da regeneração óssea.</p><p>XVII</p><p>ABSTRACT</p><p>The Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) is a cationic protein of homo- and heterodimers of</p><p>disulfide-bonded A- and B- polypeptide chains, stored mainly in the α-granules of platelets. It exerts its</p><p>effects on target cells by activating two structurally related protein tyrosine kinase receptors, the α- and β-</p><p>receptors. Both α- and β-receptors homodimers transducer potent mitogenic signals. The PDGF mitogenic</p><p>activity is observed over manifold cellular types, mainly for fibroblasts and smooth muscle cells, turning out</p><p>to be of great importance on the tissue healing process. This factor has been successfully used to accelerate</p><p>the tissue healing process, alone or combined with other growth factors which seem to develop a critical</p><p>function towards bone healing. Therefore, the studies on these factors have become an important research</p><p>field, aiming at speeding up the healing process of fractures and bone remodeling.</p><p>Bone repair is a process of multiple stages involving the migration, proliferation, differentiation and</p><p>activation of several cellular types. The bone is constantly remodeled by reabsorption cycles and formation.</p><p>This process has been assessed by the determination of biochemical markers, being the alkaline phosphatase</p><p>a good marker of bone formation.</p><p>Human platelet-derived growth factor (PDGF) was purified from lysates of clinically outdated</p><p>human platelets (NHHA - NAC/FCF -UNESP-Araraquara) by ionic exchange chromatography in CM-</p><p>Cellulose. The eluated fraction was submitted to the Immunoblot/Slot Blot assay having used anti-PDGF-BB</p><p>polyclonal antibodies. The Immunoblot/Slot Blot assay using anti-PDGF-BB antibodies proved the presence</p><p>of the PDGF in chromatographic cationic fraction. The PDGF obtained was used to fill the surgical fractures</p><p>in rat tibias and further evaluation by histological analysis and determination of the alkaline phosphatase in</p><p>order to evaluate the bone tissue healing process after 07, 15, 30 and 45 days follow-ups.</p><p>Seven days following the surgery, has been verified statistically significant differences as to the</p><p>dosage of bone alkaline phosphatase (FAO) for the different groups (Group A – PDGF-BB, Group B –</p><p>PDGF Purified and Group C (control) – Collagen type I, the last one having higher values. By this result, it’s</p><p>concluded that FAO did not show itself as a good biochemical marker to bone formation. According to the</p><p>histological analysis, it was observed a higher number of cells involved on the repair process of Group A and</p><p>B in relation to Group C. Hence, 45 days later there was an indeced mature bone formation in the fracture</p><p>filled with PDGF-BB and PDGF-Purified, whereas in the control group was the predominance of the primary</p><p>bone, asserting the PDGF mitogenic effect and its eddicacy on inducing bone healing.</p><p>1</p><p>I – INTRODUÇÃO</p><p>Os fatores de crescimento são mediadores biológicos peptídeos naturais que exercem vários</p><p>efeitos sobre os processos de regeneração tecidual. Estes polipeptídeos são a chave para regular</p><p>diversos eventos celulares tais como: síntese de DNA, quimiotaxia, citodiferenciação e síntese de</p><p>matriz óssea (Lynch et al., 1989; Giannobile, 1996; Anitua, 1999). Podemos encontrar fatores de</p><p>crescimento tais como: Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF), Fator de Crescimento</p><p>de Transformação β (TGF-β), Fator de Crescimento de Fibroblasto a e b (aFGF e bFGF), Fator de</p><p>Crescimento Semelhante à Insulina I e II (IGF–I e II) e Proteínas Morfogenética do Osso (BMPs),</p><p>nos ossos e em vários tecidos em regeneração (Giannobile, 1996; Marx,1999). Atenção especial</p><p>pode ser dada ao PDGF que é encontrado nas plaquetas (aproximadamente 60 pg/106 plaquetas) e</p><p>exerce seu efeito no processo biológico de regeneração tecidual (Marx et al., 1998).</p><p>O plasma rico em plaquetas (PRP) é um hemocomponente rico em fatores de crescimento</p><p>originários dos grânulos-α plaquetários, destacando-se o PDGF. As estratégias terapêuticas usadas</p><p>fundamentam-se na aceleração dos efeitos dos fatores de crescimento contidos nas plaquetas, que</p><p>são os principais iniciadores do processo de regeneração tecidual (Lynch et al., 1989; Marx et al.,</p><p>1998). Recentemente, relatos científicos chamaram a atenção para a capacidade regenerativa do gel</p><p>plaquetário obtido do PRP, usado com sucesso nas áreas de cirurgia reconstrutiva oral, maxilofacial</p><p>e implantodontia quando comparado ao enxerto ósseo (Anitua, 1999; Scarso et al., 2000; Tischler,</p><p>2002). O gel plaquetário consiste na mistura de plasma rico em plaquetas com trombina bovina e</p><p>cloreto de cálcio (Lind et al., 1996; Scarso et al., 2000; Tischler, 2002). A trombina na presença de</p><p>cálcio cliva o fibrinogênio em fibrina e ativa o fator XIII, desencadeando a formação organizada do</p><p>coágulo. Esta reação em cadeia confere à mistura uma consistência adesiva e gelatinosa, facilitando</p><p>o manejo cirúrgico dos enxertos (Scarso et al., 2000).</p><p>1.1. Características bioquímicas do PDGF</p><p>O Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF) é uma família de homo e</p><p>heterodímeros catiônicos (pI 9,8 – 10,2) de cadeias de polipeptídios A e B unidas por pontes</p><p>dissulfeto (Deuel et al., 1981; Hart et al., 1990). É resistente ao calor (100ºC) e ao tratamento com</p><p>vários agentes de dissociação, mas suscetível a agentes redutores (Heldin et al., 1979; Johnsson et</p><p>al., 1982; Anitua, 1999). As cadeias A e B possuem aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos</p><p>com 60% de homologia, possuindo oito resíduos de cisteina conservados entre as duas cadeias</p><p>(Hammacher et al., 1988; Hart et al., 1990; Anitua, 1999). Os genes que codificam para as cadeias</p><p>A e B do PDGF encontram-se localizados nos cromossomos 7 e 22 (braço longo), respectivamente.</p><p>As cadeias A e B, são sintetizadas como moléculas precursoras sendo clivadas proteolíticamente,</p><p>2</p><p>pós-tradução, em seus NH2-terminais, e no caso da cadeia B, ocorre também sobre o COOH-</p><p>terminal (Hammacher et al., 1988; Östman et al., 1991; Anitua, 1999).</p><p>O PDGF apresenta três isoformas: PDGF-AA, PDGF-BB e PDGF-AB, podendo ser</p><p>observadas sob condições desnaturantes, na eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, migrando</p><p>como um componente de massa molecular entre 32 a 35 kDa, quando não submetido a agentes</p><p>redutores, e na presença de agentes redutores, são observadas duas cadeias distintas com massas</p><p>moleculares de aproximadamente 14 kDa e 17 kDa (Antoniades, 1981; Johnsson et al., 1982).</p><p>Outros relatos mostraram que a massa molecular pode variar nas diferentes preparações de PDGF</p><p>como: 26 a 32 kDa (Heldin et al., 1977) e 10 a 25 kDa (Ross et al., 1978) para PDGF parcialmente</p><p>purificado. Plaquetas humanas expressam naturalmente ambas cadeias A e B, conseqüentemente,</p><p>todas as suas isoformas, o que sugere que a formação dos dímeros ocorre como um processo casual</p><p>(Hammacher et al., 1988; Hart et al., 1990).</p><p>Recentemente foram descobertos mais dois novos membros da família do PDGF, o PDGF-C</p><p>e o PDGF-D (Betsholtz et al., 2001); possuem estruturas proteicas semelhantes as do PDGF-A e</p><p>PDGF-B. As expressões desses genes em células endoteliais de artérias “in vivo” ou “in vitro”,</p><p>sugerem que podem transduzir sinais de proliferação e migração para pericitos e células musculares</p><p>lisas. Neste sentido, novas investigações serão necessárias para o entendimento da biologia destas</p><p>proteínas bem como prover caminhos para assegurar o papel biológico do PDGF (Gilbertson et al.,</p><p>2001; Uutela et al., 2001).</p><p>1.1.1. Obtenção de PDGF a partir de plaquetas humanas</p><p>O PDGF foi identificado como um componente obtido do soro humano e, posteriormente,</p><p>foi purificado de plaquetas humanas (Antoniades, 1981). Embora os grânulos-α plaquetários</p><p>tenham sido implicados como o principal local de armazenamento de PDGF, estudos recentes</p><p>mostraram que outros tipos celulares também o sintetizam (Marx et al., 1998; Anitua, 1999;</p><p>Rönnstrand & Heldin, 2001), como mostrado na Tabela 1 (Heldin & Westermark, 1999).</p><p>3</p><p>Tabela 1 – Tipos de células normais que liberam o PDGF (1)</p><p>Tipos de Células</p><p>PDGF-A</p><p>PDGF-B</p><p>Fibroblastos</p><p>+ (2)</p><p>+</p><p>Queratinócitos + +</p><p>Citotrofoblastos placentais + +</p><p>Células de Leydig + +</p><p>Células mesangiais renais + +</p><p>Mioblastos esqueléticos + ND (3)</p><p>Células musculares lisas vasculares + +</p><p>Células endoteliais vasculares + +</p><p>Astrócitos + ND</p><p>Neurônios + +</p><p>Células de Schwann + +</p><p>Oócito, blastócito + ND</p><p>Miométrio/endométrio uterinos + +</p><p>Células epiteliais de mamíferos + +</p><p>Células epiteliais de pigmento da retina + +</p><p>Macrófagos + +</p><p>Megacariócitos/ plaquetas + +</p><p>(1) PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas</p><p>(2) +: expressão do PDGF</p><p>(3) ND: não determinado</p><p>4</p><p>As primeiras tentativas de purificação do PDGF humano foram prejudicadas pelos baixos</p><p>níveis teciduais, a limitada disponibilidade das plaquetas, e a aparente heterogeneidade das</p><p>preparações de PDGF purificado, devido a glicosilação variável (Bradshaw & Cavanaugh, 1991).</p><p>Quatro grupos, trabalhando independentemente, utilizaram plaquetas humanas vencidas nos</p><p>primeiros esquemas de purificação para o isolamento do PDGF (Antoniades et al., 1979; Heldin et</p><p>al., 1979; Deuel et al., 1981; Raines & Ross., 1982).</p><p>Três propriedades físico/químicas do PDGF eram exploradas nos primeiros esquemas de</p><p>purificação: natureza catiônica, estabilidade ao calor e hidrofobicidade. O alto ponto isoelétrico do</p><p>PDGF representava um eficiente passo de purificação na cromatografia de troca iônica e foi</p><p>utilizado nos protocolos originais. O grau de purificação resultante da separação por cargas era alto,</p><p>produzindo um aumento de 500 vezes em atividade específica no estudo de Raines & Ross (1982).</p><p>A resistência à desnaturação pelo calor era utilizada por Antoniades et al. (1979) e Deuel et al.</p><p>(1981), eliminando por este tratamento, vários contaminantes de atividade mitogênica dos extratos</p><p>plaquetários. A cromatografia hidrofóbica, que tem desempenhado um papel importante nos</p><p>protocolos de purificação de muitos fatores de crescimento, era usada na forma de Blue-Sepharose</p><p>(Heldin et al., 1979; Deuel et al., 1981) e Phenyl-Sepharose (Raines & Ross, 1982) na purificação</p><p>do PDGF. Estas técnicas, em conjunto com técnicas de separação mais convencionais, tais como a</p><p>filtração em gel, a focalização isoelétrica e a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE),</p><p>formaram a base para os protocolos originais de purificação do PDGF (Bradshaw & Cavanaugh,</p><p>1991).</p><p>A quantidade de PDGF purificado na maioria dos esquemas originais era muito baixa devido</p><p>à recuperação que geralmente era menor que 10%. Raines & Ross (1982) relataram um</p><p>procedimento de purificação que incluiu uma cromatografia Heparin-Sepharose e recuperaram 21%</p><p>da atividade biológica, um percentual significante em relação aos rendimentos anteriores.</p><p>Vários grupos subseqüentemente desenvolveram protocolos de purificação para o PDGF,</p><p>em larga escala, que basicamente utilizaram as mesmas técnicas descritas nos relatos originais</p><p>(Heldin et al., 1977; Deuel et al., 1981).</p><p>Heldin et al. (1977-79) desenvolveram um protocolo de purificação a partir de plaquetas</p><p>humanas vencidas, seguido pela obtenção do lisado plaquetário, cromatografia troca iônica,</p><p>focalização isoelétrica, cromatografia em gel, cromatografia em ConA Sepharose, cromatografia</p><p>Hydroxylapatite e eletroforese em gel de poliacrilamida.</p><p>Antoniades et al.(1979) e Antoniades (1981), basicamente seguiram o mesmo protocolo</p><p>descrito por Heldin et al. (1977-79), iniciando a partir de plaquetas humanas vencidas, seguido pela</p><p>5</p><p>extração por aquecimento das plaquetas, cromatografia de troca iônica, filtração em Bio-Gel P-150</p><p>em ácido acético 1M, focalização isoelétrica e eletroforese em gel de poliacrilamida.</p><p>Deuel et al. (1981) desenvolveram um protocolo de purificação a partir do plasma rico em</p><p>plaquetas (PRP) e posteriormente o submeteram a cromatografia, iniciando-se com a coluna</p><p>Sulfadex G-50 (preparado pela sulfatação da Sephadex) e em seguida as colunas CM-Sephadex,</p><p>Blue-Sepharose, Bio-Gel P-100 e focalização isoelétrica.</p><p>Raines & Ross (1982-85) também seguiram o protocolo de purificação a partir de plaquetas</p><p>humanas vencidas, obtendo um lisado plaquetário que foi submetido à cromatografia em colunas de</p><p>CM-Sephadex, Sephacryl S-200, Heparin-Sepharose CL-6B e Phenyl-Sepharose CL –6B.</p><p>1.2. Características moleculares do receptor de PDGF</p><p>As isoformas do PDGF</p><p>exercem seus efeitos sobre células alvo pela ativação de dois</p><p>receptores, α e β, que possuem massas moleculares de aproximadamente 170 e 180 kDa,</p><p>respectivamente, após glicosilação de suas cadeias polipeptídicas (Terracio et al., 1988; Claesson-</p><p>Welsh et al., 1989). Estes receptores são estruturalmente relacionados à proteína tirosina quinase,</p><p>sendo que cada receptor contém um domínio transmembrana, localizado no centro do polipeptídio;</p><p>cinco domínios extracelulares semelhantes à imunoglobulina (Ig) e um domínio intracelular</p><p>dividido em três subdomínios: o domínio justamembrana, o domínio tirosina quinase que é dividido</p><p>em duas partes por uma inserção de 100 aminoácidos denominada inserção quinase e o domínio C-</p><p>terminal (Claesson-Welsh, 1996). As Figuras 1 e 2 mostram domínios estruturais do PDGF.</p><p>A junção de ligantes aos domínios extracelulares do receptor ativa seu domínio intracelular</p><p>tirosina quinase, resultando na sua dimerização e autofosforilação, bem como a fosforilação da</p><p>proteína alvo intracelular que propaga o sinal iniciado pela ligação do fator de crescimento (Heldin</p><p>et al., 1998). Por ser um dímero, o PDGF se liga a duas moléculas de receptor (Figura 3). O</p><p>receptor α pode se ligar às cadeias de PDGF A e B com alta afinidade, enquanto o receptor β se liga</p><p>somente a cadeia B com alta afinidade (Figura 2) (Anitua, 1999; Bergsten et al., 2001; Gilbertson et</p><p>al., 2001).</p><p>6</p><p>Figura 1– Subfamílias de receptores de tirosina quinases (Ilustração de Alberts et al., 1997),</p><p>onde:</p><p>JM: domínio justamembrana</p><p>TQ: domínio tirosina quinase</p><p>CT: domínio C-terminal</p><p>JM</p><p>TQ</p><p>CT</p><p>7</p><p>Figura 2 – Processamento e ação das isoformas do PDGF. As cadeias A e B são sintetizadas</p><p>como moléculas precursoras que formam dímeros ligados por pontes dissulfeto e sofrem</p><p>processamento proteolítico (Ilustração de Heldin & Westermark, 1999).</p><p>8</p><p>Figura 3– Fator de crescimento derivado de plaquetas. (A) Estrutura dimérica da proteína com as</p><p>regiões de ligação do receptor sombreadas em amarelo. A união do dímero ocorre por três pontes</p><p>dissulfeto (não mostrado). (B) Como o PDGF é um dímero, com dois sítios de ligação ao receptor,</p><p>ele pode unir receptores adjacentes para iniciar o processo de sinalização intracelular (Ilustração de</p><p>Alberts et al., 1997).</p><p>A autofosforilação do receptor desempenha duas funções principais na sinalização destes</p><p>receptores: a fosforilação dos resíduos de tirosina dentro do domínio catalítico pode desempenhar</p><p>uma função reguladora por aumento da atividade do receptor proteína quinase e a fosforilação dos</p><p>resíduos de tirosina do lado de fora do domínio catalítico cria sítios de ligação específicos para</p><p>proteínas adicionais, que transmitem a cascata de sinais intracelulares dos receptores ativados. A</p><p>associação destas moléculas da cascata de sinalização com os receptores proteína tirosina quinase é</p><p>mediada por domínios protéicos, tais como os domínios SH2 (de Src homology 2 – proteína</p><p>oncogênica do vírus do Sarcoma de Rous) que se ligam a peptídeos específicos que contêm</p><p>fosfotirosina. Esta associação pode ter vários efeitos: direcionar as proteínas contendo SH2 para a</p><p>membrana plasmática, levar à sua associação com outras proteínas, promover sua fosforilação e</p><p>estimular suas atividades enzimáticas. Representando assim, a primeira etapa na transmissão</p><p>intracelular de sinais iniciada pela ligação de fatores de crescimento à superfície celular (Cooper,</p><p>2001).</p><p>Os receptores α e β homodiméricos transduzem potentes sinais mitogênicos. No entanto,</p><p>podem ser observadas diferenças biológicas entre os receptores relacionadas aos seus efeitos</p><p>celulares (Heldin & Westermark, 1999) (Tabela 2). As células alvo clássicas para o PDGF,</p><p>fibroblastos e leiomiócitos (células musculares lisas), expressam ambos os receptores α e β, mas</p><p>geralmente os níveis de expressão dos receptores β são maiores (Heldin & Westermark, 1999)</p><p>(Tabela 3).</p><p>9</p><p>Tabela 2– Efeitos celulares mediados pelos receptores homodiméricos α e β de PDGF</p><p>Efeitos</p><p>Receptor-α</p><p>Receptor-β</p><p>Crescimento celular</p><p>Estimulação</p><p>Estimulação</p><p>Reorganização</p><p>da actina</p><p>Estimulação do rufflin (2) terminal</p><p>e perda das fibras de estresse</p><p>Estimulação do ruffling terminal,</p><p>perda das fibras de estresse e</p><p>estimulação de ruffles circulares.</p><p>Quimiotaxia</p><p>Estimulação ou Inibição,</p><p>dependendo do tipo celular</p><p>Estimulação</p><p>Mobilização de Ca+2</p><p>Estimulação fraca</p><p>Estimulação</p><p>Comunicação juncional</p><p>GAP (1)</p><p>?</p><p>Inibição</p><p>Apoptose</p><p>?</p><p>Inibição</p><p>(1) GAP: proteína ativadora de GTPase.</p><p>(2) Ruffling: refere-se ao movimento “retrógrado” dos lamelipódios e das microespículas,</p><p>observados em cultura de células.</p><p>10</p><p>Tabela 3 – Tipos celulares que expressam receptores de PDGF</p><p>Tipo Celular</p><p>Receptor-α</p><p>Receptor-β</p><p>Fibroblastos</p><p>+ (1)</p><p>+</p><p>Células mesangiais do rim + +</p><p>Células Leydig + +</p><p>Células adiposas de Ito - (2) +</p><p>Células endoteliais sinusoidais do fígado + -</p><p>Mioblastos - +</p><p>Células musculares lisas vasculares + +</p><p>Células endoteliais de capilares - +</p><p>Pericitos - +</p><p>Astrócitos + -</p><p>Neurônios + +</p><p>Células de Schwann + +</p><p>Células epiteliais de mamíferos - +</p><p>Células epiteliais de pigmento de retina + +</p><p>Plaquetas/megacariócitos + -</p><p>Células T - +</p><p>Células hematopoiéticas mielóide - +</p><p>Macrófagos - +</p><p>(1) + : expressão do receptor</p><p>(2) - : não expressão do receptor</p><p>11</p><p>1.3. Atividades biológicas do PDGF</p><p>1.3.1. Regeneração de tecidos moles</p><p>Dentre as principais atividades biológicas do PDGF, o efeito mitogênico sobre fibroblastos,</p><p>leiomiócitos e outras células, parece ser o mais importante (Deuel et al., 1981; Heldin &</p><p>Westermark, 1996; Betsholtz et al., 2001).</p><p>A regeneração de tecidos moles envolve a reepitelização, a angiogênese e a deposição da</p><p>matriz extracelular. Diferentes tipos de fatores de crescimento regulam os diferentes passos no</p><p>processo da regeneração (Heldin & Westermark, 1996). A regeneração normal da lesão consiste de</p><p>uma série de eventos cronobiológicos que seguem a formação da lesão associada à coagulação</p><p>sanguínea e trombose que ocorre durante o processo. As primeiras células que aparecem na lesão</p><p>são leucócitos, principalmente neutrófilos polimorfonucleares junto com os monócitos. Os</p><p>monócitos tornam-se uma célula dominante em 1 ou 2 dias seguido da formação da lesão e o</p><p>aparecimento destas células é seguido pelo ingresso e proliferação de capilares, fibroblastos, e</p><p>leiomiócitos (Raines et al., 1991; Robson et al., 1998).</p><p>O processo inicia-se com a deposição de numerosas plaquetas ativadas pela trombina e</p><p>outros fatores presentes no coágulo sanguíneo, durante o processo de formação da lesão. A</p><p>liberação do PDGF das plaquetas ocorre juntamente com outros fatores liberados pelas plaquetas,</p><p>tais como TGF-β (fator de crescimento de transformação β), PF-4 (fator 4 plaquetário) e β-</p><p>tromboglobulina, que podem induzir a quimiotaxia de células na lesão. O subseqüente aparecimento</p><p>de monócitos/macrófagos, capilares, fibroblastos e leiomiócitos também representam possíveis</p><p>fontes de PDGF; isto permitirá a formação e secreção de PDGF na lesão em diferentes tempos</p><p>durante o processo de regeneração (Raines et al., 1991).</p><p>O PDGF atua sobre diversos tipos celulares envolvidos na regeneração tecidual: estimula a</p><p>mitogenicidade, a quimiotaxia de fibroblastos e de leiomiócitos e a quimiotaxia de neutrófilos e</p><p>macrófagos (Heldin & Westermark, 1996). A mitogenicidade do PDGF in vitro, tem sido avaliada</p><p>pelo teste de incorporação da [H3]-TdR usando várias linhagens celulares: células gliais normais da</p><p>linhagem U-787 CG (Heldin et al., 1977), fibroblastos confluentes de ratos Swiss da linhagem</p><p>Balb/c-3T3 (Antoniades et al., 1979; Antoniades, 1981), fibroblastos confluentes de ratos Swiss da</p><p>linhagem CLL92 (Deuel et al., 1981), fibroblastos confluentes de ratos Swiss da linhagem 3T3</p><p>(Raines & Ross, 1982-85) e fibroblastos de tecido embrionário de ratos Swiss normais da linhagem</p><p>NIH/3T3 (Barbieri & Costa, 2004).</p><p>O PDGF tem sido responsabilizado por estimular a produção de várias moléculas da matriz</p><p>extracelular, como colágeno (Canalis, 1981) e colagenase (Bauer et al., 1985), fibronectina (Blatti</p><p>et al., 1988), ácido hialurônico (Heldin et al., 1989) e proteoglicanas (Schonherr et al., 1991).</p><p>12</p><p>Também tem sido importante nos estágios posteriores à regeneração de lesões, uma vez que</p><p>estimula a contração da matriz do colágeno in vitro, o que sugere um papel na contração in vivo</p><p>(Clark et al., 1989).</p><p>Para que o PDGF atue na regeneração tecidual in vivo é necessário que esteja presente no</p><p>local da lesão. Observações anteriores revelaram que o PDGF é secretado pelas plaquetas,</p><p>macrófagos ativados, células endoteliais estimuladas por trombina, fibroblastos ativados, bem como</p><p>pelos queratinócitos da epiderme, sugerindo sua presença na área da lesão (Katz et al., 1991; Soma</p><p>et al., 1992; Heldin & Westermark, 1996). Outro pré-requisito para a ação do PDGF sobre a</p><p>regeneração tecidual é que as células na área de regeneração expressem receptores de PDGF.</p><p>1.3.2. Regeneração de tecidos mineralizados</p><p>A regeneração óssea é um processo de múltiplas etapas envolvendo a migração,</p><p>proliferação, diferenciação e ativação de vários tipos celulares. A formação óssea ocorre através de</p><p>dois processos distintos: a ossificação intramembranosa, onde as células mesenquimais se</p><p>diferenciam diretamente em osteoblastos formadores de osso, o que ocorre durante o</p><p>desenvolvimento de alguns ossos do crânio e face; e a ossificação endocondral, onde a formação</p><p>óssea ocorre via uma cartilagem intermediária presente no desenvolvimento de ossos longos e</p><p>vértebras (Street et al., 2002)</p><p>O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo formado por células (osteócitos,</p><p>osteoblastos e osteoclastos) e material extracelular calcificado, a matriz óssea (Junqueira &</p><p>Carneiro, 2004). A matriz óssea é composta por uma parte orgânica (95% de Colágeno Tipo I e o</p><p>restante de Substância Fundamental Amorfa, formada por proteoglicanas e glicoproteínas adesivas)</p><p>e uma parte inorgânica cuja composição é dada basicamente por íons fosfato e cálcio formando</p><p>cristais de hidroxiapatita (Junqueira & Carneiro, 2004). O Colágeno Tipo I estimula a proliferação</p><p>de osteoblastos e a diferenciação osteogênica de células derivadas da medula óssea, é ainda,</p><p>quimiotático para osteoblastos, fibroblastos e células endoteliais, tendo um papel crítico na</p><p>formação óssea (Fuerst et al., 2004).</p><p>Os osteócitos estão localizados em cavidades ou lacunas dentro da matriz óssea. Destas</p><p>lacunas formam-se canalículos que se dirigem para outras lacunas, tornando assim a difusão de</p><p>nutrientes possível graças à comunicação entre os osteócitos. Os osteócitos têm um papel</p><p>fundamental na manutenção da integridade da matriz óssea.</p><p>Os osteoblastos sintetizam a parte orgânica da matriz óssea e também concentram fosfato de</p><p>cálcio, participando da mineralização da matriz. Possuem sistema de comunicação intercelular</p><p>13</p><p>semelhante ao existente entre os osteócitos. Os osteócitos inclusive originam-se de osteoblastos,</p><p>quando estes são envolvidos completamente por matriz óssea.</p><p>Os osteoclastos participam dos processos de absorção e remodelação do tecido ósseo. São</p><p>células gigantes e multinucleadas, extensamente ramificadas, derivadas da fusão de monócitos que</p><p>atravessam os capilares sangüíneos. Dilatações dos osteoclastos, através da sua ação enzimática,</p><p>escavam a matriz óssea, formando depressões conhecidas como lacunas de Howship.</p><p>Macroscopicamente, o osso se divide em compacto, que não possui cavidades visíveis, e</p><p>esponjoso, com cavidades intercomunicantes. Microscopicamente, dividem-se em imaturo ou</p><p>primário e maduro, secundário ou lamelar. Os dois tipos possuem as mesmas células e os mesmos</p><p>constituintes da matriz, porém, enquanto no tecido ósseo primário as fibras colágenas se dispõem</p><p>irregularmente, sem orientação definida, no tecido ósseo secundário ou lamelar essas fibras se</p><p>organizam em lamelas. Possui o sistema de Havers, que é formado por 4 a 20 lamelas concêntricas,</p><p>cujo canal central é o canal de Havers, por onde passam vasos e nervos (Junqueira & Carneiro,</p><p>2004)</p><p>O osso é constantemente remodelado por ciclos de reabsorção e formação. Diferentes fases</p><p>vão se suceder para a produção de osso novo.</p><p>A fase de quiescência, onde ocorre o reagrupamento dos osteoblastos inativos na superfície</p><p>óssea.</p><p>A fase de ativação, onde ocorre</p><p>o recrutamento por quimiotaxia dos osteoclastos que vem se</p><p>alojar na superfície óssea.</p><p>A fase de reabsorção, onde os osteoclastos vão secretar vesículas de exocitose contendo a</p><p>fosfatase ácida, capaz de provocar a desmineralização dos cristais de hidroxiapatita. As colagenases</p><p>permitem a degradação das fibras de colágeno da matriz extracelular.</p><p>A fase de inversão, que corresponde ao momento onde os osteoclastos vão parar a</p><p>degradação do osso e onde os osteoblastos vão se ativar para serem funcionais. Observa-se, na</p><p>superfície óssea o aparecimento de uma matriz mineralizada que caracteriza o fim da ativação dos</p><p>osteoblastos.</p><p>A fase de formação, onde os osteoblastos recrutados na fase anterior entram em ativação e</p><p>sintetizam a matriz orgânica. Esta vai então se mineralizar e terminar o ciclo (Rosenberg, 1999)</p><p>(Figura 4). Este processo tem sido avaliado pela determinação de marcadores bioquímicos, sendo a</p><p>fosfatase alcalina um bom marcador de formação óssea e a fosfatase ácida, tartarato resistente, um</p><p>bom marcador de reabsorção óssea (Oliveira et al., 1999; Vieira et al., 1999).</p><p>14</p><p>Figura 4. Processo de remodelação do tecido ósseo (Ilustração de Ralston, 2002)</p><p>A fosfatase alcalina é uma glicoproteína de membrana com atividade enzimática (Akesson,</p><p>1995). Esta enzima catalisa reações como hidrólise dos ésteres fosfóricos de álcoois, fenóis e</p><p>mononucleotídeos (Figura 5). No metabolismo ósseo, a fosfatase alcalina se relaciona com a</p><p>capacidade de mineralização dos osteoblastos, atuando no controle da concentração dos inibidores</p><p>da mineralização como os pirofosfatos inorgânicos, através de um aumento da concentração local</p><p>de íons fosfatos, removendo o fosfato de outras proteínas e/ou possivelmente atuando como</p><p>transportador iônico. É encontrada no soro humano e em tecidos que formam os ossos, rins, fígado,</p><p>intestino e placenta, entre outros (Garnero & Delmas, 1993; Akesson, 1995). As duas formas</p><p>predominantes em circulação são a hepática e a óssea (Farley & Baylink, 1995; Vieira et al., 1999).</p><p>Este marcador detecta grandes aumentos do metabolismo ósseo, especialmente na doença de Paget,</p><p>metástases ósseas avançadas e durante a consolidação de fraturas. A fratura de um osso longo causa</p><p>Quiescência</p><p>Reabsorção</p><p>Inversão</p><p>Formação</p><p>Osteoclasto</p><p>- Recrutamento</p><p>- Diferenciação</p><p>- Ativação</p><p>Síntese da Matriz</p><p>Osteclasto</p><p>- Apoptose</p><p>- Inversão</p><p>Linhagem Celular</p><p>Mineralização</p><p>Osteblasto</p><p>- Recrutamento</p><p>- Diferenciação</p><p>- Ativação</p><p>15</p><p>uma elevação na atividade sérica da fosfatase alcalina, como acontece no reparo cirúrgico ou na</p><p>manipulação cirúrgica do osso (Nogueira et al, 1990; Marchesano, 2005)</p><p>Figura 5 - Reação catalisada pela fosfatase alcalina (Ilustração de Panteghini et al., 2006)</p><p>Moss & Withby (1975), considerando a labilidade da fração óssea da fosfatase alcalina, ao</p><p>calor, propuseram um método da inativação térmica, no qual a atividade da fosfatase alcalina óssea</p><p>pode ser determinada subtraindo-se a atividade da fosfatase alcalina termoestável da atividade da</p><p>fosfatase alcalina total.</p><p>Existe, cada vez mais evidências de que ambas as fases do processo de remodelação sejam</p><p>controladas pela liberação local de fatores de crescimento (Jiang et al., 1999; Kubota et al., 2002;</p><p>Szczesny, 2002). Estes fatores de crescimento parecem desenvolver uma função crítica sobre a</p><p>regeneração óssea. Por isso, os estudos sobre esses fatores têm se tornado uma importante área de</p><p>investigação, com o objetivo de acelerar o processo de regeneração de fraturas ou restaurações</p><p>ósseas (Lane et al., 1999).</p><p>Os cinco fatores de crescimento com potencial para promover a regeneração óssea são: o</p><p>PDGF, o TGF-β, o EGF (fator de crescimento epidermal), o IGF-I (fator de crescimento semelhante</p><p>4-nitrofenilfosfato 4-nitrofenolato 4-nitrofenóxido</p><p>(incolor) (levemente colorido) (amarelo)</p><p>16</p><p>à insulina I), e o bFGF (fator de crescimento de fibroblasto básico) (Szachowicz, 1995). Vários</p><p>estudos, in vivo, realizados nas últimas décadas, demonstraram que os fatores de crescimento,</p><p>futuramente, serão usados em cirurgias ortopédicas, otimizando a formação e a regeneração óssea e,</p><p>conseqüentemente, melhorando os resultados dos procedimentos cirúrgicos (Lind, 1998; Anitua,</p><p>1999; Schliephake, 2002).</p><p>As plaquetas são uma das primeiras células recrutadas no local da injuria óssea e provem a</p><p>liberação de fatores de crescimento críticos para o sucesso da regeneração. Os fatores de</p><p>crescimento liberados são importantes em todas as fases da regeneração óssea. A liberação destes</p><p>fatores influencia a regeneração óssea, sendo que o aumento da concentração destes leva a uma</p><p>rápida formação óssea. A liberação de PDGF após a injúria óssea aumenta a proliferação e</p><p>quimiotaxia de osteoblastos, e a síntese de colágeno, além de otimizar o TGF-β, sendo uma fonte de</p><p>formação óssea por diferenciação das células osteoblásticas. O TGF-β e o PDGF-BB podem</p><p>participar do recrutamento de osteoblastos durante a remodelação óssea uma vez que ambos são</p><p>encontrados na matriz óssea e podem ser liberados durante a reabsorção óssea osteoclástica (Wang</p><p>et al., 1994; Lind et al., 1995; Marx et al., 1998; Fujii et al., 1999; Bouletreau et al., 2002; Gruber</p><p>et al., 2002; Pacifici et al., 2002).</p><p>O PDGF é um dos principais fatores de crescimento presente no calo ósseo durante o</p><p>processo de regeneração óssea (Lane et al., 1999).</p><p>1.4. Aplicação clínica do PDGF</p><p>1.4.1. Regeneração de tecidos moles</p><p>A triagem clínica envolvendo a aplicação de fatores de crescimento recombinantes</p><p>exógenos, em lesões crônicas, tem sido investigada por mais de 10 anos na tentativa de acelerar o</p><p>processo de regeneração. Estudos usando uma variedade de modelos animais sugerem que a adição</p><p>de fatores de crescimento em lesões é benéfica (Robson et al., 1998).</p><p>Robson et al. (1992), observaram redução no tamanho de úlceras tratadas com PDGF-BB</p><p>recombinante humano (1µg/cm2/área) em relação ao grupo controle, após 28 dias de aplicação. O</p><p>mesmo resultado foi observado por Mustoe et al (1994), usando uma dosagem de 1 a 3 µg/cm2/área</p><p>e, Steed (1995), usando 2,2 µg/cm2/área. Matsuda et al. (1992) também comprovaram a aplicação</p><p>clínica do PDGF-BB em procedimentos de regeneração periodontal. Scackelford et al. (2002)</p><p>tratando pacientes que apresentavam úlceras crônicas, com a aplicação tópica de um gel de PDGF-</p><p>BB recombinante humano na concentração de 0,01%, observaram uma diminuição de 21 dias no</p><p>tempo de regeneração em relação ao grupo controle.</p><p>17</p><p>Uma única aplicação de PDGF-BB em lesões com cortes incisionais, reduziu</p><p>significativamente a lesão em relação ao controle e diminuiu o tempo de regeneração (Pierce et al.,</p><p>1989). As lesões tratadas com PDGF mostraram um aumento da granulação tecidual, rica em</p><p>fibroblastos e glicosaminoglicanas, e, elevou o nível da reepitelização e da neovascularização;</p><p>assim o PDGF não altera a seqüência normal da regeneração, mas aumenta a eficiência do processo</p><p>(Mustoe et al., 1991; Pierce et al., 1991; Heldin & Westermark, 1996).</p><p>A triagem clínica tem revelado que o PDGF-BB aumenta a regeneração de úlceras crônicas,</p><p>sugerindo que seja um potente agente na regeneração do tecido mole (Robson et al., 1992). Análises</p><p>de segmentos de lesões humanas regeneradas mostrou que o PDGF-BB induz a proliferação e</p><p>diferenciação de fibroblastos (Pierce et al., 1994). Piazuelo et al (2000) usando um modelo in vitro</p><p>para estudar a resposta do fibroblasto humano na regeneração de lesões, também observaram o</p><p>aumento da proliferação de fibroblastos induzida pelo PDGF-BB. O PDGF-BB também acelera o</p><p>processo de regeneração em pacientes com diminuição da capacidade de regeneração, tais como os</p><p>diabéticos (Steed, 1995; Robson et al., 1998; Embil et al., 2000; Cohen & Eaglstein, 2001; Embil &</p><p>Nagai, 2002). Para ter um efeito máximo na regeneração tecidual, o PDGF-BB deve ser</p><p>administrado em altas concentrações (2-20 µg/mL) (Pierce et al., 1988; Cupp & Bloom, 2002).</p><p>1.4.2. Regeneração de tecidos mineralizados</p><p>A regeneração óssea é uma meta importante no campo da cirurgia ortopédica que ainda</p><p>permanece distante (Lane et al., 1999).</p><p>A aplicação clínica de fatores de crescimento pode ter valor em situações onde a formação</p><p>óssea aperfeiçoada é necessária, tais como regeneração de um grande defeito ósseo em oncologia</p><p>ortopédica, regeneração de pseudoartrose, e em cirurgia prostética não cementada em pacientes com</p><p>osteoporose e artrite (Lind et al, 1995).</p><p>O PDGF exógeno tem um efeito estimulatório na regeneração de fraturas (Nash et al.,</p><p>1994).O PDGF-BB tem sido demonstrado estimular a formação óssea in vitro e in vivo, tendo um</p><p>papel crítico no desenvolvimento do osso normal em estudos com animais e com humanos. O</p><p>PDGF-BB estimula células ósseas in vitro e tem sido mostrado estimular regeneração periodontal</p><p>em cães e primatas não humanos bem como defeitos ósseos encontrados na triagem clinica em</p><p>humanos (Stephan, et al., 2000).</p><p>Clark et al. (1991) observaram que o PDGF estimula a síntese de DNA na tíbia de ratos para</p><p>formação óssea. Chen & Li, em 1999 também realizaram um estudo sobre os efeitos do PDGF no</p><p>conteúdo de DNA osteoblástico de ratos. Os autores concluíram que o PDGF otimiza a regeneração</p><p>da fratura óssea, estimulando a síntese do DNA osteoblástico e a proliferação celular. Mott et al.</p><p>18</p><p>(2002) trabalhando com a mistura de PDGF e outros fatores em aloenxertos ósseo, também</p><p>verificaram um aumento na atividade osteoblástica em murino quando comparado com o controle</p><p>que não continha fatores de crescimento.</p><p>A engenharia do tecido é o desenvolvimento de tratamentos clínicos baseado na combinação</p><p>efetiva de matrizes, fatores de crescimento e células no local. As últimas gerações de substitutos</p><p>ósseos podem ser provavelmente uma avançada matriz combinada com fatores de crescimento</p><p>osteogênicos produzido por técnicas de biologia molecular. As observações apresentadas aqui</p><p>sugerem que um material composto consistindo de mineral ósseo purificado, colágeno e PDGF-BB</p><p>podem servir como um efetivo material de enxerto ósseo com propriedades osteogênicas</p><p>aumentadas. Desta forma, Stephan, et al. (2000) conduziram um estudo sobre a otimização do</p><p>substituto ósseo por PDGF, trabalhando com a adsorção de PDGF-BB a uma matriz óssea bovina</p><p>verificaram um aumento da proliferação de células osteoblásticas em cultura em comparação a</p><p>matriz não tratada. Os resultados deste estudo sugerem que é possível a adsorção de PDGF a uma</p><p>matriz óssea bovina e que essa combinação possui um potencial para aplicações clínicas. O mesmo</p><p>efeito tinha sido anteriormente relatado por Jiang et al. em 1999.</p><p>19</p><p>II – OBJETIVOS</p><p>� Purificar o Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas Humanas vencidas e avaliar</p><p>seu efeito in vivo sobre o processo de regeneração óssea,</p><p>� Avaliar a atividade da fosfatase alcalina óssea como marcador bioquímico de</p><p>formação óssea.</p><p>20</p><p>III – MATERIAL E MÉTODOS</p><p>3.1. Comitê de ética</p><p>Todos os procedimentos realizados em material e métodos encontram-se devidamente</p><p>aprovados pelos Comitês de Ética pertinentes: Comitê de Ética em Experimentação Animal-CEEA</p><p>da Faculdade de Odontologia de Araraquara (Proc. 22/2003 – dezembro de 2003) e Comitê de Ética</p><p>em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (Parecer nº 08/2004 – março</p><p>de 2004).</p><p>3.2. Obtenção do concentrado de plaquetas</p><p>O concentrado de plaquetas foi obtido a partir de bolsas de aproximadamente 500 mL de</p><p>sangue total (até 6 horas após coleta) de doadores de sangue do Hemonúcleo Regional de</p><p>Araraquara da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – Câmpus Araraquara. As bolsas de</p><p>sangue total foram centrifugadas em centrífuga refrigerada (Sorvall – mod. RC 3C Plus) a 22ºC por</p><p>5 minutos a 2.300 rpm (raio= 26,06 cm), onde se obteve o plasma rico em plaquetas (PRP), e este</p><p>foi centrifugado novamente a 22ºC por 10 minutos a 4.100 rpm (raio = 26,06 cm), obtendo desta</p><p>forma o concentrado de plaquetas de volume final entre 50 a 70 mL, que permaneceu em repouso</p><p>por aproximadamente 1 hora, nesta mesma temperatura, até ocorrer à desagregação plaquetária</p><p>espontânea. O concentrado de plaquetas tem validade de 05 dias a contar da data da coleta do</p><p>sangue total, após este período não pode ser usado para fins transfusionais, então se diz que estes</p><p>estão vencidos para uso clínico.</p><p>3.3 – Obtenção do lisado de plaquetas</p><p>Foram usados aproximadamente seis litros de concentrados de plaquetas vencidos (período</p><p>superior a 05 dias), correspondentes a 120 unidades de plaquetas, tendo em média 5,5 x 1010</p><p>plaquetas/unidade. Os concentrados de plaquetas foram armazenados em freezer a (-20ºC) até o</p><p>momento de uso. Foram então, congelados e descongelados num total de 3 vezes e depois</p><p>incubados a 55-57ºC por 8 minutos em banho de água para precipitação de fibrinogênio. Após</p><p>aquecimento os concentrados foram deixados uma noite a 4ºC em centrifuga refrigerada (Sorvall –</p><p>mod. RC 3C Plus). O precipitado de proteínas e as membranas plaquetárias foram removidos</p>