Met. AcNucleicos 1 - DNA

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Estrutura e replicação do DNA 
– Met. Ácidos Nucleicos I 
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Ø  Bioquímica Ilustrada: Pamela Champe & Richard Harvey; 2a. 
Edição, Cap. 30, p. 363 a 377 (até o final do ítem H. replicação do 
DNA eucariótico, inclusive) 
Ø  Bioquímica Ilustrada: Pamela Champe, R.Harvey, D. Ferrier. Cap. 
29, p.393-412, 3a. edição 
Ø  Bioquímica, 4a. Ed., 1996 Lubert Stryer 
l  Páginas 771 e 772 
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Objetivos 
Ø  Reconhecer as diferenças na origem de replicação entre 
procarióticos e eucarióticos 
Ø  Reconhecer a função das proteínas e enzima envolvidas 
na separação das hélices de DNA, e todos os eventos 
envolvidos na replicação de DNA 
Ø  Compreeder com riqueza de detalhes a forquilha de 
replicação do DNA 
Ø  Identificar as principais diferenças entre a replicação de 
DNA em procarióticos em relação a eucarióticos 
Ø  Identificar drogas que interferem com a replicação do 
DNA e seus mecanismos de ação 
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Tópicos 
Ø  I – Visão Geral 
Ø  II – Estrutura do DNA 
Ø  III – Etapas da síntese do DNA procariótico 
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I - Visão geral 
Ø  Ácidos nucleicos: responsáveis pelo armazenamento 
da informação genética 
Ø  Tipos de ácidos nucleicos: 
Ø  Ácido desoxiribonucleico – DNA 
Ø  Ácido ribonucleico - RNA 
Ø  Localiza-se no núcleo, mitocôndria e cloroplastos 
Ø  Células procarióticas: não possuem núcleo: DNA 
localiza-se em um cromossomo, e na forma de 
plasmídeo (DNA extracromossômico). 
Ø  Para a perpetuação dos seres vivos o DNA deve ser 
capaz de se replicar e fazer com que a informação 
genética seja expressa seletivamente – exemplo: ao 
longo do densenvolvimento embrionário até a fase 
adulta, diferentes genes são necessários em diferentes 
momentos 
Ø  O RNA participa na expressão desta informação 
genética 
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Resumo das Funções do DNA 
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II – Estrutura do DNA 
Ø  DNA é um polidesoxiribonucleotídeo 
Ø  Formado por muitos monodesoxiribonucleotídeos 
Ø  Pode apresentar-se com fita simples em alguns vírus 
Ø  Encontrado freqüêntemente com fita dupla 
Ø  Em EUCARIÓTICOS: 
l  Associado a proteínas formando as NÚCLEOPROTEÍNAS 
•  Localizados no NÚCLEO 
 
Ø  Em PROCARIÓTICOS: 
l  Complexo DNA-proteína está presente no nucleóide 
 
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Ø  DNA possui POLARIDADE: 
l  Uma extremidade 5’ não ligada a nenhum 
nucleotídeo 
l  Uma extremidade 3’ também livre 
Ø  NUCLEASES: 
l  Desoxiribonucleases: clivam ligações fosfodiéster do 
DNA 
l  Ribonucleases: RNA 
Ø  DUPLA HÉLICE: 
l  Em torno de um eixo comum 
l  Cadeias ANTIPARALELAS: 5’terminal de uma fita 
parea 3’ da outra fita 
 
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Ø  DUPLA HÉLICE (forma clássica “B” Watson & Crick”): 
l  Esqueleto hidrofílico da ribose -> localiza-se parte 
externa da cadeia 
l  Bases (hidrofóbicas) -> na parte interna da cadeia 
Ø  ACTINOMICINA D: 
l  Droga anti-câncer que se intercala na fenda menor da 
dupla hélice tem um efeito CITOTÓXICO na célula 
l  Interfere na síntese de DNA ou RNA 
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Por conveção: seqüência escrita 5’ para 3’ 
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ACTINOMICINA D: 
Anti-câncer 
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• Dada a seqüência de bases de uma cadeia é 
possível determinar a seqüência de bases da 
outra cadeia 
• Pontes e H mantém as bases juntas 
• PONTES DE HIDROGÊNIO, mais as 
INTERAÇÕES HIDROFÓBICAS entre as base 
fixas mantém a estrutura da dupla hélice 
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PONTES DE HIDROGÊNIO 
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DESNATURAÇÃO DO DNA: 
SEPARAÇÃO DA DUPLA HÉLICE 
•  Ocorre por alteração de pH e por aumento da 
temperatura 
•  A estrutura helical é perdida e as fitas DNA se 
separam 
TEMPERATURA DE DESNATURAÇÃO 
(Tm = melting temperature): 
 
Temperatura na qual a metade da estrutura helical 
é perdida. 
ABOSORBÂNCIA A 260 nm: 
DNA SIMPLES: MAIOR absrobância 
FITA DUPLA: MENOR absorbância 
Seqüências ricas em CG precisam maior 
temperatura para desnaturar. Tem maior número 
de pontes de H 
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• Z: hélice 
voltada para a 
esquerda; 
• ~12 pb por 
volta de 360º; 
• Ribose “faz 
ZigueZagues”; 
 
• B: descrita por 
Watson e Crick 
1953; 
•  hélice voltada 
para a direita; 
• ~10 pb por volta 
de 360º. 
• B: Forma 
predominante 
do DNA 
cromossômico 
 
• Transições 
entre as 
formas 
helicoidas 
podem 
desempenhar 
papel 
importante na 
regulação da 
expressão 
gênica 
FORMA CLÁSSICA 
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Plasmídios 
Ø  São móléculas de DNA extracromossômico que as 
bactérias possuem 
Ø  Servem para transporte de informação genética 
Ø  Tem replicação sincronizada ou não com a replicação de 
DNA cromossômico 
Ø  Facilitam a transferência de informação genética de uma 
bactéira para outra 
Ø  Carregam genes que codificam resistência bacteriana a 
antibióticos 
Ø  São utlizados como vetores na tecnologia de DNA 
recombinante (clonagem). 
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SEMICONSERVATIVA: apesar das fitas parentais se 
separarem, as fitas parentais permanecem conservadas 
intactas complementando as duas novas fitas. 
III - Síntese DNA Procariótico 
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Origem de replicação (ori) 
Ø  Polimerases: usam DNA de fita simples como 
molde – necessidade de separação das fitas 
Ø  Procarióticos: Ori de replicação em uma única 
seqüência de nucleotídeos – genoma pequeno 
Ø  Eucarióticos: replicação tem origem em 
múltipolo locais – genoma grande 
l  Em em locais ricos em A e T, menos pontes de 
hidrogênio, facilita a separação da dupla hélice 
l  Múltiplas origens – favorece mecanismo de 
replicação rápida 
**DESENHO DA FORQUILHA 24 
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO 
Proteína DnaA: 20-50 
monômeros se ligam a 
origem de replicação e 
separam as fitas; requer ATP 
DnaA DnaA DnaA DnaA 
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Formação da forquilha de 
replicação 
Ø Complexo de proteínas denominadas 
“complexo de formação” reconhecem a 
origem de replicação 
Ø Função do complexo: 
l  Reconhecer a origem de replicação 
l  Separar e manter as fitas de DNA separadas 
l  Desenrolar o DNA além da forquilha de 
replicação 
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Proteínas do complexo de formação 
Ø  DnaA: 20-50 monônomers se ligam a nucleotídeos 
específicos da ORI rep. (rica em bases AT). 
l  Separam as fitas de DNA utilizando ATP 
Ø  SSB: Proteínas de ligação de DNA de fita simples 
l  Ligam-se somente ao DNA de fita simples 
l  Ligam-se cooperativamente: a ligação de uma SSB favorece a 
ligação de outras 
l  Não apresentam atividade enzimática 
l  Mantém as fitas de DNA separadas 
l  Protegem o DNA das nucleases que clivam DNA de fita simples 
l  Favorecem a apresentação do MOLDE de DNA de fita simples 
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Proteínas do complexo de formação 
Ø  DNA helicases: 
l  Ligam-se ao DNA de fita simples próximo a forquilha 
de replicação 
l  Movem-se em direção à cadeia de fita dupla forçando 
as fitas a se separarem 
l  E desenrolando a dupla hélice de DNA 
l  Consumindo ATP 
l  Uma vez as fitas separadas, as SSB ligam-se para 
estabilizar a fita simples 
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Problema do superdobramento 
**demonstrar com uma fita 
• Superdobramento positivo: 
Contém MAIS voltas na hélice em 
relação ao DNA relaxado 
• Superdobramento negativo: 
Contém MENOS voltas na hélice 
em relação ao DNA relaxado 
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Ø  Opções: 
l  Cromossomo inteiro girar 
•  Problema: gastaria muita energia e causaria 
deformação na molécula 
l  Acumular superdobramento positivo 
•  Problema: interfere com o desenrolar da dupla 
hélice durante a replicação do DNA 
 
Problema do superdobramento 
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Solução do Superdobramento 
Ø TOPOISOMERASE DO TIPO I 
l  Tem atividade NUCLEASE: corta fita DNA 
l  Tem atividade LIGASE: liga a fita cortada 
l  Não requer ATP 
l  Cria uma “quebra” transitória de uma fita. A 
fita intacta gira na ligação fosfodiéstes oposta 
à quebra 
l  Relaxam os superdobramentos POSITIVOS 
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SUPERDOBRAMENTO + RELAXADO 
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Solução do Superdobramento 
Ø TOPOISOMERASE DO TIPO II 
l  Fazem uma quebra transitória nas fitas da 
dupla hélice 
l  Provoca um estiramento da dupla hélice de 
DNA para passar através da quebra 
l  Alivia superdobramentosNEGATIVOS e 
POSITIVOS 
l  Não requer ATP 
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DNA GIRASE 
Ø  Topoisomerase do Tipo II da E. coli 
Ø  Propriedade incomum: 
l  Introduz superdobramento NEGATIVO no DNA em 
repouso – facilita a replicação futura do DNA 
l  O superd. NEG vai neutralizar o superd. POS 
Ø  É alvo de um grupo de agentes antimicrobianos 
denominados de QUINOLONAS – sem a sua função, a 
bactéria não consegue prosseguir com a duplicação do 
DNA e cessa de se multiplicar. 
Ø  Sua atividade requer ATP 
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Direção da replicação de DNA 
DNA polimerase: 
• lê o molde de DNA sentido 3’-> 5’ 
• Sintetiza DNA sentido 5’-> 3’ 
As duas fitas novas de DNA crescem 
em direção oposta 
FITA LIDER: copiada em direção a forquilha de 
replicação 
FITA ATRASADA: copiada em direção oposta a 
forquilha de replicação. Resulta em muitos 
Fragmentos de Okazaki. 
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Primer de RNA 
Ø PRIMASE: é uma enzima RNA polimerase 
que sintetiza fitas curtas de RNA (~10 
nucleotídeo); 
Ø Função do primer RNA: fornece uma 
região curta de fita dupla com uma oxidrila 
livre no terminal 3’ para possibilitar a 
enzima DNA polimerase III iniciar a 
síntese de RNA; 
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PRIMOSSOMO 
Ø  Formado por um complexo de proteína + a 
primase 
Ø  Liga-se a fita simples de DNA, deslocando as 
SSB 
Ø  Move-se no sentido 5’->3’, junto a fita atrasada 
Ø  Nota: move-se em direção oposta a síntese de 
DNA 
Ø  Na fita líder apenas 1 primer de RNA é 
necessário, na atrasada, vários são necessários 
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DNA Polimerase III 
Ø  Alonga a cadeia de DNA: 
l  Atividade polimerase 5’ -> 3’ 
Ø  Corrige erros de base da nova cadeia DNA 
l  Atividade exonuclease 3’ -> 5’, mas requer base incorreta na 
extremidade 3’ 
l  Não tem atividade exonuclease 5’ -> 3’ (DNA pol. I tem) 
Ø  Identifica e remove o nucleotídeo incorreto e o 
substitui pelo correto 
Ø  É uma exonuclease pois degrada o DNA 
somente pela extremidade e não internamente 
como as endonucleases 
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3’-> 5’ exonuclease 
Esta atividade não 
degrada nucleotídeos 
pareados corretamente 
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DNA Polimerase I 
Ø  Atividade de POLIMERASE 5’-> 3’: 
l  preeche o espaço deixado pelo primer de RNA 
Ø  Atividade de EXONUCLEASE: 
l  5’-> 3’: 
•  remove primer de RNA e sintetiza novo DNA no espaço. 
•  Remove nucleotideos apropriadamente pareados (um de 
cada vez). 
•  Remove grupos de nucleotídeos alterado (1 a 10 nucleot.) 
l  Importante no reparo de DNA danificado 
l  3’-> 5’: corrige erros de base 
•  A remoção/síntese/correção ocorre um nucleotídeo de cada 
vez. 
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Ø  Fragmento Klenow: é o produto da digestão da DNA 
polimerase I pela protease subtilisina (origem: Bacillus 
subtilis) resultando em um fragmento com atividades: 
Ø  de polimerase 5'-> 3’, e 
Ø  de exonuclease 3'->5’. 
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 Figura 30.10 (Garret & Grishman): 
Este é um modelo da interação do 
fragmento Klenow com o DNA. 
a) A terminação 3’ do primer e da 
cadeia em alongamento localizada 
no sítio ativo de polimerase. 
b) A terminação 3’ está voltada no sítio 
ativo de exonuclease 3’. 
A proteína tem que deslizar sobre o 
DNA para mudar a extremidade 3’ da 
cadeia em alongamento de um sítio 
ativo para outro. Portanto, a atividade 
de polimerase e de correção da 
extremindade 3’ podem ocorrer sem a 
dissociação do DNA do fragmento 
Klenow. 
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Demonstração da atividade 3’ 5’ da enzima DNA 
Polimerase I corrigindo erros da atividade de polimerase 
Garret & Grhishman 
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DNA Ligase 
Ø  Tem a função de unir o DNA 
sintetizado pela DNA polimerase 
III com o DNA sintetizado pela 
DNA polimerase I 
Ø  Une o grupo 5’ fosfato da cadeia 
sintetizada pela Pol. III com o 
grupo 3’oxidrila da cadeia 
sintetizada pela Pol. I 
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5’ 
3’ 
Detalhe da 
Síntese de DNA 
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FORQUILHA DE REPLICAÇÃO 
PRIMOSSOMO: proteínas + primase 
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Fragmento de Okazaki: são os 
fragmentos recém sintetizados, na 
fita atrasada. Estes fragmentos de 
DNA estão entre os primer de RNA 
sintetizados pela Primase. 
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Replicação do DNA Eucariótico 
Ø  Apresenta proteínas de ligação de fita simples (=proc.) 
Ø  Apresenta helicases depentente de ATP (=proc.) 
Ø  DNA polimerase é designada em letras gregas (e não 
números romanos) 
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Replicação do DNA Eucariótico 
5 CLASSES DE DNA POLIMERASE EUCARIÓTICAS 
Ø  Pol alfa: 
l  tem atividade de primase: sintetiza os primers de RNA 
l  Inicia a síntese de DNA, adicionando um pequeno pedaço ao primer 
de RNA 
Ø  Pol delta: 
l  completa a síntese de DNA na fita líder e alonga cada um dos 
fragmentos de Okazaki 
l  Edita (corrige erros) o DNA recém sintetizado através da atividade 
3’->5’exo 
Ø  Pol épsilon: 
l  Envolvida no reparo do DNA 
Ø  Pol beta: envolvida no reparo do DNA 
Ø  Pol gama: replica DNA mitocondrial 
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Ø  Após a remoção da primer de RNA da extremidade 5’ final do 
DNA da fita descontínua (atrasada) não existe maneira de 
preecher a lacuna remanescente com DNA. A telomerase é um 
tipo especial de transcriptase reversa, que carrega sua própria 
molécula de RNA de aproximadamente 150 nucleotídeos. 
Nesse RNA estão cópias da seqüência A/C complementar a T/
G, presentes na extreminade dos cromossomos. 
Ø  Nas células que estão sofrendo processo de envelhecimento 
(senescência), as extremidades dos seus cromossomos 
tornam-se um pouco menores a cada divisão celular, até que 
os telômeros desapareçam e o DNA essencial para a função 
celular seja degradado (ataque de nucleases) - fenômeno 
relacionado ao envelhecimento e morte celular. 
Ø  As células que não envelhecem (exemplo: células da linha 
germinativa e células cancerosas) contém uma enzima 
chamada telomerase, que é responsável por refazer as 
extremidades perdidas. 
TELOMERASE 
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Telomerase: 
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57 http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.steve.gb.com/images/science/telomerase.png&imgrefurl=http://www.steve.gb.com/science/
dna_replication.html&h=557&w=664&sz=16&hl=pt-BR&start=19&tbnid=jqOh71tGBKBzqM:&tbnh=116&tbnw=138&prev=/images%3Fq%3Dtelomerase%26svnum%3D10%26hl%3Dpt-BR
%26lr%3D%26sa%3DG - 19 nov 2006. 
 
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Transcriptase reversa 
Ø  Os retrovírus, como por exemplo o HIV, tem seu genoma na 
forma de uma molécula de RNA de fita simples. Após a 
infecção de uma célula hospedeira, a enzima viral 
TRANSCRIPTASE REVERSA (TR) usa o RNA como molde 
para a síntese do DNA viral o qual torna-se então integrado 
aos cromossomos do hospedeiro. A transcriptase reversa 
move-se ao longo do molde de RNA no sentido 3’ --> 5’ 
sintetizando o RNA no sentido 5’ --> 3’. A TR não edita 
possíveis erros o que explica a alta taxa de mutação destes 
vírus. 
Ø  Pacientes com HIV normalmente são tratados com inibidores 
nucleosídicos ou não-nucleosídicos da transcriptase reversa, 
juntamente com inibidores de protease (os quais inbem outras 
enzimas de maturação do HIV), produzindo assim uma mistura 
(coquetel) que requer que o vírus desenvolva uma resistência 
múltipla para continuar a replicar-se. 
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Análogos de nucleosídeos 
Ø  ddi: 2,3 diddesoxiinosina 
Ø  Conversão da ribose em outro 
açúcar como a arabinose 
Ø  Citosina arabinosideo (citarabina, 
araC): quimioterapia anti-câncer 
Ø  Adenina arabinosideo (vidarabina, 
araA): antiviral 
Ø  Zidovudina (AZT): termina o 
alongamento da cadeia de DNA - 
anti-HIV