Modulo_6 Imunoensaios

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<p>Disciplina: Imunologia</p><p>Imunologia</p><p>Módulo 6</p><p>Prof. Wallace Pacienza Lima, PhD.</p><p>wallace.pacienza@gmail.com</p><p>wallace.lima@unigranrio.edu.br</p><p>@WallacePacienza</p><p>Wallacepacienza</p><p>Wallace Pacienza Lima</p><p>@WallacePacienza</p><p>Imunoensaios:</p><p>INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO</p><p>Detecção, quantificação e</p><p>caracterização dos anticorpos e seu</p><p>uso como ferramenta para pesquisa e</p><p>diagnóstico</p><p>Mensuração de anticorpos</p><p>Amostra</p><p>biológica</p><p>Anticorpo</p><p>secundário com</p><p>marcador</p><p>Revelação</p><p>Fase solida</p><p>Mensuração de antigenos</p><p>Amostra</p><p>biológica</p><p>Anticorpo</p><p>secundário com</p><p>marcador</p><p>Revelação</p><p>Fase sólida</p><p>Características das interações Ag-Ac</p><p>Avidez</p><p>- Força de interações total entre Ac e Ag.</p><p>- Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos</p><p>Especificidade</p><p>- Capacidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ags.</p><p>Reação cruzada</p><p>- Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente</p><p>semelhantes</p><p>- Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não</p><p>relacionado, mas com propriedades químicas similares.</p><p>INTERAÇÕES</p><p>⚫ Reações reversíveis.</p><p>⚫ Ligações não covalentes:</p><p>-Pontes de hidrogênio</p><p>-Interações hidrofóbicas</p><p>-Interações de Van der Waals</p><p>-Ligações iônicas</p><p>Avidez x Afinidade</p><p>É importante levar-se em conta como ocorre a ligação</p><p>Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos.</p><p>Observe abaixo:</p><p>Zona de excesso</p><p>de anticorpo</p><p>Zona de</p><p>equivalência</p><p>Zona de excesso</p><p>de antígeno</p><p>+ - -</p><p>+- -</p><p>Anticorpo livre</p><p>Antígeno livre</p><p>100%--</p><p>Percentual de</p><p>complexo</p><p>imune</p><p>precipitado</p><p>Quantidade de antígeno adicionado</p><p>MÉTODOS</p><p>1) Reagentes não marcados</p><p>• Reação de precipitação</p><p>• Reação de aglutinação</p><p>2) Reagentes marcados</p><p>• RIA</p><p>• ELISA</p><p>• Imunofluorescência</p><p>• Western Blotting</p><p>MÉTODOS</p><p>1) Reagentes não marcados</p><p>• Reação de precipitação</p><p>• Reação de aglutinação</p><p>2) Reagentes marcados</p><p>• RIA</p><p>• ELISA</p><p>• Imunofluorescência</p><p>• Western Blotting</p><p>• Ac + Ag multivalente particulado</p><p>• Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-</p><p>quantitativo)</p><p>• Pró-zona: excesso de Ac</p><p>• Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica</p><p>(repulsão)</p><p>• Agregação visível de</p><p>partículas = Eritrócitos,</p><p>bactérias, fungos e látex</p><p>REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO</p><p>Reação de aglutinação</p><p>Direta eritrócitos (hemaglutinação), bactérias, fungos</p><p>Passiva látex</p><p>(Ag insolúvel)</p><p>Qualitativos Semi-quantitativos</p><p>Ex.: classificação sanguinea Ex.: detectar infecções</p><p>18</p><p>2) Reagente (anticorpo anti A, B):</p><p>AGLUTINAÇÃO DIRETA</p><p>1) Amostra de sangue na placa teste:</p><p>Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)</p><p>Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação</p><p>19</p><p>3) Controle negativo:</p><p>4) Mistura-se:</p><p>AGLUTINAÇÃO DIRETA</p><p>20</p><p>5) Leitura do resultado:</p><p>Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível</p><p>(aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.</p><p>negativo positivo</p><p>AGLUTINAÇÃO DIRETA</p><p>AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)</p><p>Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas:</p><p>• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação</p><p>covalente) e então distribuídas nos poços da placa.</p><p>• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente</p><p>diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.</p><p>• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se</p><p>aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando</p><p>não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo</p><p>do poço.</p><p>Aglutinação Positiva</p><p>Negativa</p><p>Ag solúveis associados a outras superfícies</p><p>(Partículas de látex ou superfície de hemácias)</p><p>23</p><p>Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)</p><p>INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO</p><p>+</p><p>Soro anti - hCGUrina</p><p>São incubados e</p><p>colocados numa</p><p>placa</p><p>Adicionam-se Partículas revestidas</p><p>com hCG</p><p>Resultado positivo:</p><p>(presença de hCG</p><p>na urina): não ocorre</p><p>aglutinação.</p><p>Ac se ligaram no hCG da urina,</p><p>(ficando bloqueados), na incubação inicial</p><p>Resultado negativo:</p><p>(ausência de hCG na</p><p>urina).</p><p>Ocorre aglutinação, pois</p><p>os anticorpos anti-hCG</p><p>não são bloqueados na</p><p>incubação inicial,</p><p>porque não havia o</p><p>hormônio na urina.</p><p>Livres, podem aglutinar</p><p>as partículas revestidas</p><p>de hCG.</p><p>TESTE DE</p><p>COOMBS</p><p>• Ac anti-imunoglobulinas (Robert</p><p>Coombs);</p><p>• DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;</p><p>• Não aglutinam os eritrócitos;</p><p>• Direto: Ac ligados aos eritrócitos</p><p>fetais;</p><p>• Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes</p><p>no soro materno.</p><p>• Permite detectar incompatibilidades</p><p>Rh, prevenindo contra DHRN.</p><p>FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO</p><p>REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO</p><p>• Interação entre Ac e Ag solúvel</p><p>• Ac precisa ser bivalente</p><p>• Ag precisa ser bi ou polivalente</p><p>• A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que</p><p>cada Ac possui para seu Ag</p><p>PRECIPITADO</p><p>REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO</p><p>IMUNOCROMATOGRAFIA</p><p>• Teste qualitativo</p><p>• Rápido e simples</p><p>• Econômico</p><p>• Fácil interpretação</p><p>• Leitura é feita a olho nu</p><p>• Apresenta sensibilidade e</p><p>especificidade similares ao</p><p>ELISA</p><p>• Fase móvel: amostra</p><p>diluida</p><p>• Fase sólida: membrana</p><p>revestida</p><p>Utilizada uma matriz de membrana de nitrocelulose ligada a uma tira de acetato</p><p>transparente;</p><p>Para detectar antígeno, emprega-se um anticorpo de captura, ligado à matriz e</p><p>um anticorpo marcado específico ao antígeno pesquisado;</p><p>Para detectar anticorpo, utiliza-se um antígeno específico ligado à matriz e um</p><p>anticorpo anti-imunoglobulina marcado;</p><p>• Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C</p><p>– Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex</p><p>– Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveis</p><p>devido às partículas de látex</p><p>Rapid Check HIV e Sífilis</p><p>• Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)</p><p>• Tipos:</p><p>- RIA</p><p>- ELISA</p><p>- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO</p><p>- WESTERN BLOTTING</p><p>Princípio da técnica:</p><p>• Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma</p><p>substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no</p><p>espectro visível.</p><p>• Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser</p><p>usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.</p><p>• A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as</p><p>comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de</p><p>fluorescência).</p><p>• Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e</p><p>rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta</p><p>ou saduíche.</p><p>IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)</p><p>IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)</p><p>- Utilizam-se Ac ou Ag conjugados a moléculas reveladoras</p><p>chamadas fluorocromos.</p><p>- Visualização em microscópio de fluorescência</p><p>Microscópio de fluorescência com epiluminação</p><p>luz UV atinge o ma-</p><p>terial examinado</p><p>fluorescência emitida</p><p>chega ao observador</p><p>TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA</p><p>Imunofluorescência Direta</p><p>Aplicações:</p><p>- Detecção direta de microrganismos</p><p>(secreções, urina, cortes de tecidos);</p><p>- Identificação de subpopulações de</p><p>linfócitos;</p><p>- Fenotipagem de células tumorais</p><p>Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis</p><p>em secreção uretral</p><p>Ex.: Detecção de Ac anti- T. cruzi</p><p>Aplicações:</p><p>- Detecção de anticorpos específicos</p><p>contra</p><p>diversos microrganismos;</p><p>- Diagnóstico de doenças auto-imunes;</p><p>Detecção de Ac anti-nuclear</p><p>Imunofluorescência Indireta</p><p>IFA direta:</p><p>• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes</p><p>de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.</p><p>IFA indireta:</p><p>• Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de</p><p>Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.</p><p>• É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e</p><p>especificidade.</p><p>APLICAÇÃO DA TÉCNICA</p><p>• A imunohistoquímica combina técnicas histológicas, imunológicas e bioquímicas objetivando</p><p>identificar componentes celulares ou tissulares (denominados antígenos) através da reação com</p><p>anticorpos específicos, em uma secção histológica, esfregaço ou suspensão celular.</p><p>• O anticorpo de detecção, antígeno-específico,</p><p>é marcado com uma substância fluorescente,</p><p>elemento radioativo, ouro coloidal ou enzima.</p><p>• As amostras são, então, incubadas com substratos enzimáticos (quando Ac está marcado com</p><p>enzima), produzindo um produto que sofre precipitação direta no corte histológico, gerando</p><p>uma coloração castanha ou vermelha, que reflete a distribuição do antígeno alvo no</p><p>tecido/célula analisado.</p><p>• A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação é realizada em microscópio óptico</p><p>comum ou fluorescente.</p><p>• Frequentemente o anticorpo de detecção é biotinilado (conjugado com biotina, uma vitamina</p><p>com alta afinidade por estreptoavidina) nos ensaios enzimáticos. Essa metodologia serve para</p><p>ampliar o sinal gerado, tornando o método mais sensível.</p><p>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS</p><p>• Em neoplasias</p><p>• Diferenciar uma proliferação celular maligna e benigna.</p><p>• Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente</p><p>indiferenciadas.</p><p>• Subtipagem de neoplasia para seleção terapêutica.</p><p>• Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas (ex:</p><p>hormônios).</p><p>A imunohistoquímica pode ser utilizada:</p><p>• Em neoplasias</p><p>• Caracterizar a origem de carcinomas.</p><p>• Identificar micrometástases.</p><p>• Avaliação prognóstica (ex: detecção de receptores hormonais em</p><p>neoplasia mamária).</p><p>• Orientação terapêutica.</p><p>A imunohistoquímica pode ser utilizada:</p><p>• Para detecção de antígenos:</p><p>• Virais: dengue, febre amarela, citomagalovírus, adenovírus, etc.</p><p>• Bacterianos: micobactérias, leptospiras.</p><p>• De Fungos: Paracoccidioides, Histoplasma, etc.</p><p>• De Protozoários: Toxoplasma, Trypanosoma cruzi, Leishmania sp,</p><p>Plamodium sp.</p><p>• De Helmintos: Schistosoma.</p><p>A imunohistoquímica pode ser utilizada:</p><p>Imunohistoquímica anti- ERB2</p><p>Imunohistoquímica anti-</p><p>tirosina hidroxilase em</p><p>estrutura axonal</p><p>Imunohistoquímica: detecção</p><p>de múltiplos antígenos</p><p>- Detecta, separa e quantifica células contendo um</p><p>antígeno particular, marcadas com um fluorocromo;</p><p>- Cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente;</p><p>- As células são então analizadas no citômetro de fluxo.</p><p>CITOMETRIA DE FLUXO</p><p>• Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em</p><p>uma corrente através de um feixe de Laser.</p><p>• Separa as células por fluorescência ativada.</p><p>• Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.</p><p>• É um teste qualitativo e quantitativo.</p><p>APLICAÇÕES</p><p>• Tipo de linfócitos;</p><p>• Quantidade, tamanho, granulosidade;</p><p>• Isolamento de populações celulares;</p><p>• HIV</p><p>CITOMETRIA DE FLUXO</p><p>- As células saem de uma</p><p>célula de fluxo e são</p><p>iluminadas por um raio laser;</p><p>Citometria de fluxo</p><p>- A quantidade de raios laser</p><p>que é dispersa para fora das</p><p>células durante a passagem</p><p>das mesmas pelo laser pode</p><p>ser medida, o que</p><p>proporciona informação a</p><p>respeito do tamanho das</p><p>células.</p><p>- O laser pode também excitar o fluorocromo nas células e a</p><p>luz fluorescente emitida pode ser medida por um ou mais</p><p>detectores.</p><p>Aplicações:</p><p>-Caracterização de populações celulares;</p><p>- Contagem de microrganismos;</p><p>- Separação de populações celulares de</p><p>acordo com a densidade dos antígenos,</p><p>tamanho e granulosidade das células;</p><p>- Análise de proliferação celular.</p><p>CD4</p><p>CD8</p><p>CD19</p><p>Citometria de fluxo</p><p>Amostra</p><p>Dispersão frontal</p><p>Dispersão lateral</p><p>PMT vermelho</p><p>PMT verde</p><p>CD45</p><p>D</p><p>is</p><p>p</p><p>e</p><p>rs</p><p>ã</p><p>o</p><p>la</p><p>te</p><p>ra</p><p>l</p><p>d</p><p>e</p><p>l</p><p>u</p><p>z</p><p>F</p><p>Neutrófilos</p><p>Linfócitos</p><p>Monócitos</p><p>e</p><p>s</p><p>fe</p><p>ra</p><p>s</p><p>CD45</p><p>D</p><p>is</p><p>p</p><p>e</p><p>rs</p><p>ã</p><p>o</p><p>la</p><p>te</p><p>ra</p><p>l</p><p>d</p><p>e</p><p>l</p><p>u</p><p>z</p><p>F</p><p>Fenotipagem de linfócitos</p><p>Linfócito</p><p>CD4+</p><p>CD4F</p><p>F</p><p>F</p><p>TCR</p><p>CD45RA</p><p>CD3</p><p>CD27</p><p>F</p><p>IgG1</p><p>Ig</p><p>G</p><p>1</p><p>H</p><p>L</p><p>A</p><p>-D</p><p>R</p><p>CD38 CD25</p><p>CD45RA</p><p>C</p><p>D</p><p>2</p><p>7</p><p>C</p><p>D</p><p>9</p><p>5</p><p>Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay</p><p>ELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção de</p><p>anticorpos/antígenos específicos no plasma sanguíneo. Este teste é</p><p>usado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção</p><p>de imunoglobulinas.</p><p>ELISA</p><p>http://pt.wikipedia.org/wiki/Teste</p><p>http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Imunoenzim%C3%A1tico&action=edit&redlink=1</p><p>http://pt.wikipedia.org/wiki/Anticorpo</p><p>http://pt.wikipedia.org/wiki/Plasma</p><p>http://pt.wikipedia.org/wiki/Sangu%C3%ADneo</p><p>Ensaio Imunoadsorvente</p><p>Ligado à Enzima - ELISA</p><p>• O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois</p><p>conjugados com enzimas.</p><p>• O produto final corado surge por ação da enzima que converte um</p><p>substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado</p><p>pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).</p><p>• A quantidade de Atg ou Atc produto final corado, através de</p><p>leitura em fotocolorímetro.</p><p>• Principais tipos de ELISA:</p><p>• INDIRETO: detecta principalmente Atc</p><p>• DIRETO: detecta principalmente Atg</p><p>• COMPETIÇÃO: detecta Atg com baixo peso molecular (monovalentes)</p><p>• CAPTURA: detecção de Atcs (principalmente IgM, evitando a ação do fator</p><p>reumatóide)</p><p>Fosfatase alcalina</p><p>Peroxidase</p><p>B-galactosidase</p><p>APLICAÇÕES</p><p>•</p><p>•Doenças infecciosas (HIV...)</p><p>•</p><p>•Detectar alergia a alimentos (leite, ovo...)</p><p>•Identificação de antígenos (hormônio da gravides, alergia a</p><p>drogas...)</p><p>•</p><p>•Doenças auto-imunes</p><p>•Concentração sérica de anticorpos</p><p>Componentes</p><p>•Anticorpo ou Ag ligado</p><p>•Enzima ativa</p><p>•Substrato</p><p>•Produtos solúveis</p><p>2 Enzyme-linked Atc</p><p>Serum Atc</p><p>Antigen</p><p>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS</p><p>1- Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços dispostos em</p><p>12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual Ag/Ac irão se ligar através de</p><p>interações hidrofóbicas.</p><p>2- É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.</p><p>http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html</p><p>http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html</p><p>http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html</p><p>http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html</p><p>http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html</p><p>http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html</p><p>TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto</p><p>DIRETO OU</p><p>SANDUÍCHE</p><p>INDIRETO PLACA</p><p>UTILIZADA</p><p>ELISA Indireto</p><p>ELISA Direto ou Sanduíche</p><p>antígeno</p><p>la</p><p>v</p><p>a</p><p>g</p><p>e</p><p>m</p><p>anticorpo</p><p>(amostra)</p><p>E E</p><p>anti-imunoglobulina</p><p>marcada</p><p>la</p><p>v</p><p>a</p><p>g</p><p>e</p><p>m</p><p>la</p><p>v</p><p>a</p><p>g</p><p>e</p><p>m E E</p><p>substrato</p><p>cromogênico</p><p>Método indireto</p><p>Método de Captura de IgM</p><p>la</p><p>v</p><p>a</p><p>g</p><p>e</p><p>m</p><p>la</p><p>v</p><p>a</p><p>g</p><p>e</p><p>m</p><p>la</p><p>v</p><p>a</p><p>g</p><p>e</p><p>m</p><p>la</p><p>v</p><p>a</p><p>g</p><p>e</p><p>m</p><p>anti-IgM IgM (amostra) antígeno anti-antígeno</p><p>marcado</p><p>E E</p><p>Substrato</p><p>cromogênico</p><p>E E</p><p>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS</p><p>Vantagens</p><p>• Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O</p><p>ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.</p><p>• Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o Ag</p><p>ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos.</p><p>• Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.</p><p>• Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas</p><p>de imunodiagnóstico.</p><p>Desvantagens</p><p>•Necessidade de mão de obra especializada.</p><p>•Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à luz do sol ou a elevadas</p><p>temperaturas.</p><p>•Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível a erros de pipetagem, variações</p><p>nos tempos de incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.</p><p>RADIOIMUNOENSAIO - RIA</p><p>➢ Marcações:</p><p>⚫ I125: emite raios gama</p><p>⚫ H3: raios beta</p><p>➢ Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)</p><p>➢ Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.</p><p>➢ Aplicações:</p><p>Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,</p><p>proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa</p>