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<p>Clin Oral Invest</p><p>DOI 10.1007/s00784-017-2163-6</p><p>ARTIGO ORIGINAL</p><p>Os efeitos da aplicação de ozônio sobre danos genotóxicos e</p><p>cicatrização de feridas em células de fibroblastos gengivais humanos</p><p>aplicados com bifosfonatos</p><p>Seudeuka Sinem Akdeniz1&E. Beyler1&Y. Korkmaz.2&E. Yurtku2&U. Ates3&K. Araz1&</p><p>FI Sahin4&OY Torun3</p><p>Recebido: 13 de dezembro de 2016 /Aceito: 23 de junho de 2017</p><p># Springer-Verlag GmbH Alemanha 2017</p><p>Abstrato</p><p>ObjetivosA osteonecrose dos maxilares relacionada a medicamentos</p><p>(MRONJ) é uma doença extremamente resistente à terapia que envolve</p><p>os maxilares, especialmente após o tratamento com bifosfonatos. Os</p><p>bifosfonatos acumulam-se nos ossos em concentrações suficientes para</p><p>serem diretamente tóxicos para o epitélio oral. As opções terapêuticas</p><p>atuais são inadequadas para a prevenção e tratamento da MRONJ. O</p><p>objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da terapia com plasma</p><p>com gás ozônio na cicatrização de feridas em fibroblastos humanos</p><p>aplicados com bifosfonatos.</p><p>material e métodosFibroblastos gengivais primários humanos foram</p><p>cultivados. As concentrações citotóxicas (CI50) dos bifosfonatos</p><p>(pamidronato (PAM), alendronato (ALN) e zoledronato (ZOL)) foram</p><p>determinadas pelo teste MTT. Uma aplicação de plasma de gás ozônio</p><p>de 60 μg/μl por 30 s foi realizada em todos os frascos de cultura</p><p>experimental após o tratamento medicamentoso em intervalos de 24</p><p>horas como 3 s/cm2. Os danos genotóxicos foram avaliados por ensaio</p><p>cometa e a cicatrização de feridas foi determinada por ensaio de</p><p>raspagem in vitro.</p><p>ResultadosAs aplicações de PAM, ALN e ZOL causaram danos genotóxicos no</p><p>DNA primário de fibroblastos gengivais humanos. A terapia com plasma com</p><p>gás ozônio diminuiu significativamente o genotóxico</p><p>dano (p</p><p>Israel). Inicialmente, em condições estéreis, o espécime foi cortado em</p><p>pequenos pedaços com bisturi e digerido enzimaticamente com</p><p>colagenase tipo I (Biochrom AG, Alemanha) na concentração de 5 mg de</p><p>colagenase/10 ml de DMEM-F12 em incubadora a 37 °C por 60 minutos.</p><p>min. A mistura foi então centrifugada a 500 g durante 9 min e o</p><p>sobrenadante foi removido. As células foram colocadas em meio de</p><p>cultura celular composto por solução DMEM-F12 contendo 10% de soro</p><p>fetal bovino inativado pelo calor (FBS; Biochrom AG, Alemanha), 2% de L-</p><p>glutamina (Biochrom AG, Alemanha) e 1% de estreptomicina, neomicina.</p><p>e mistura de penicilina. As células foram incubadas a 37 ° C com 5% de</p><p>dióxido de carbono numa incubadora humidificada (Heraeus, Hanau,</p><p>Alemanha). O meio de cultura foi atualizado a cada 2 dias e as células</p><p>foram subcultivadas quando a confluência atingiu 80%. A quarta a sexta</p><p>subcultura de células foi usada como</p><p>Aplicação de plasma de gás ozônio</p><p>Uma aplicação de plasma de gás ozônio de 60 μg / μl por 30 s (modo de</p><p>aplicador estimulador de cicatrização gengival) foi realizada por Ozonytron-XP</p><p>(Munique, Alemanha) em todos os frascos de cultura experimental após</p><p>tratamento medicamentoso em intervalos de 24 h como 3 s / cm2(Figo.1).</p><p>Figura 1A aplicação de plasma de gás ozônio foi realizada em todos os frascos de cultura</p><p>experimentais após o tratamento medicamentoso em intervalos de 24 horas como 3 s/cm2</p><p>Clin Oral Invest</p><p>Ensaio de genotoxicidade (ensaio cometa) o núcleo contado foi multiplicado por sua pontuação, e as pontuações totais</p><p>foram expressas como UA.</p><p>O dano genotóxico foi avaliado pelo método de eletroforese</p><p>alcalina em gel unicelular (ensaio cometa), conforme descrito</p><p>anteriormente [12]. Resumidamente, as células tripsinizadas foram</p><p>ressuspensas em PBS. A suspensão celular foi misturada com 1% (c/</p><p>v)agarose de baixo ponto de fusão (LMPA; Sigma-Aldrich) e</p><p>adicionada às lâminas pré-revestidas com 0,5% (c/v)agarose com</p><p>ponto de fusão normal (NMPA; Sigma-Aldrich). Lamelas foram</p><p>colocadas e as lâminas incubadas em bolsas de gelo até a</p><p>solidificação da agarose. Após a solidificação, as lamínulas foram</p><p>removidas e 1% (c/v)LMPA foi adicionado às lâminas como terceira</p><p>camada de agarose. As lâminas foram incubadas em solução de lise</p><p>(cloreto de sódio 2,5 M, sal dissódico de ácido</p><p>etilenodiaminotetracético (EDTA) 100 mM e Tris 10 mM; pH 10) a 4 °</p><p>C (escuro) por 2 h. Em seguida, as lâminas foram incubadas em</p><p>tampão de eletroforese (hidróxido de sódio 300 mM, sal dissódico</p><p>EDTA 1 mM; pH> 13) por 20 min no escuro, e a eletroforese foi</p><p>realizada a 24 V (300 mA) por 30 min. Após neutralização (Tris 0, 4</p><p>M; pH 7, 5), as lâminas foram coradas com 2 μg / ml de brometo de</p><p>etídio e os núcleos foram pontuados sob microscópio de</p><p>fluorescência (Nikon, Eclipse 600, Japão). Um mínimo de três</p><p>lâminas SCGE foram preparadas para cada tratamento e, no total,</p><p>150 núcleos foram pontuados às cegas por tratamento. OB</p><p>tamanho ^ e oBnúmero de pontas quebradas^ determina o padrão</p><p>de formação do cometa. Em função desses dois parâmetros,</p><p>moléculas de DNA com carga negativa migram em direção ao</p><p>ânodo, no campo elétrico. Fragmentos menores de DNA podem</p><p>migrar por longas distâncias na cauda do cometa; entretanto,</p><p>fragmentos maiores de DNA podem migrar por uma curta</p><p>distância. Quando o número de fragmentos de DNA aumenta, as</p><p>moléculas de DNA migram livremente para a cauda do cometa. Em</p><p>condições extremas, como a apoptose, a cabeça e a cauda do</p><p>cometa ficam completamente separadas. De acordo com esses</p><p>critérios, pela pontuação visual, foram categorizados 50 cometas</p><p>em cada lâmina. Os núcleos não danificados, ou seja, intactos, têm</p><p>formato globular e foram pontuados comoB0.̂ Núcleos</p><p>extremamente danificados foram pontuados comoB4+̂ (fig.2). Cada</p><p>Ensaio de arranhões in vitro (cicatrização de feridas)</p><p>O ensaio in vitro de cicatrização de feridas foi usado para estudar a</p><p>migração celular como descrito anteriormente [13].</p><p>Resumidamente, os fibroblastos gengivais foram semeados numa</p><p>placa de seis poços. Feridas lineares foram feitas usando uma ponta</p><p>de pipeta. As feridas por arranhões foram então visualizadas em</p><p>intervalos de 24 horas e as imagens foram capturadas usando um</p><p>microscópio invertido (Olympus IX73, Japão) (Fig.3). As áreas das</p><p>feridas foram analisadas por um programa de análise ImageJ. Para</p><p>quantificação, foi medida a distância entre as bordas da ferida em</p><p>pelo menos 15 pontos aleatórios de quatro áreas para cada</p><p>aplicação, e os valores médios foram calculados (d).A porcentagem</p><p>de cicatrização de feridas (WH) foi calculada como:</p><p>- -</p><p>%WH¼dferida original-dcura=dferida original-100</p><p>Análise estatística</p><p>Toda a análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 20</p><p>(IBM Corp. Lançado em 2011. IBM SPSS Statistics for Windows,</p><p>versão 20.0. Armonk, NY: IBM Corp.). Os dados foram expressos</p><p>como média ± desvio padrão (DP), mediana, frequência e</p><p>porcentagem. O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para testar a</p><p>normalidade das distribuições e a homogeneidade das variâncias</p><p>foi testada pelo teste de Levene. No caso de distribuição normal e</p><p>homogeneidade de variâncias, os dados foram avaliados</p><p>estatisticamente por análise ANOVA unidirecional em níveis de 0,05,</p><p>e análises post hoc de Tukey foram realizadas para encontrar</p><p>grupos cujas diferenças médias fossem significativas. Se os dados</p><p>não fossem distribuídos normalmente ou as variâncias não fossem</p><p>homogêneas, Kruskal-Wallis com teste post hoc de Bonferroni-</p><p>Dunn foi usado em níveis de 0,05.</p><p>Figura 2Todos os núcleos avaliados</p><p>foram pontuados como 0, 1+, 2+, 3+ e</p><p>4+ de acordo com a proporção relativa</p><p>aparente de DNA na cauda e na cabeça.</p><p>Sua pontuação multiplicou cada núcleo</p><p>contado, e a pontuação total mostrou</p><p>danos genotóxicos ao DNA</p><p>Clin Oral Invest</p><p>Figura 3A taxa de fechamento da ferida do ensaio de arranhão foi avaliada por um microscópio invertido e capturou imagens em intervalos de 24 horas</p><p>Resultados Ensaio de arranhões in vitro (cicatrização de feridas)</p><p>Concentrações de drogas citotóxicas De acordo com os resultados do ensaio de raspagem, observou-se que</p><p>todos os grupos BP causaram diminuição significativa (5–10%) na taxa</p><p>de cicatrização de feridas em comparação com o grupo controle não</p><p>tratado (p</p><p>significativo (2%) (p >0,05). A aplicação de plasma</p><p>de gás ozônio reduziu significativamente os efeitos genotóxicos de</p><p>todos os danos aos BPs em grupos experimentais com aplicação de BP (</p><p>p</p><p>células epiteliais orais e fibroblastos orais. Arch Oral</p><p>Biol56:491–498</p><p>4. Walter C, Klein MO, Pabst A, Al-Nawas B, Duschner H, Ziebart T (2009)</p><p>Influência dos bifosfonatos nas células endoteliais, fibroblastos e</p><p>células osteogênicas. Clin Oral Investiga 14:35–41</p><p>5. Pabst AM, Ziebart T, Koch FP, Taylor KY, Al-Nawas B, Walter C (2012)</p><p>A influência dos bifosfonatos na viabilidade, migração e apoptose</p><p>de queratinócitos orais humanos - estudo in vitro. Clin Oral</p><p>Investiga 16:87–93</p><p>6. Simon MJ, Niehoff P, Kimmig B, Wiltfang J, Açil Y (2010) Perfil de</p><p>expressão e síntese de diferentes tipos de colágeno I, II,</p><p>III e V de fibroblastos gengivais humanos, osteoblastos e células SaOS-2</p><p>após tratamento com bifosfonatos. Clin Oral Investiga 14:51–58</p><p>7. Acil Y, Moller B, Niehoff P, Rachko K, Gassling V, Wiltfang J,</p><p>Simon MJ (2012) Os efeitos citotóxicos de três bifosfonatos</p><p>diferentes in vitro em fibroblastos gengivais humanos,</p><p>osteoblastos e células de sarcoma osteogênico. J</p><p>Craniomaxilofac Surg 40:e229–e235</p><p>8. Cozin M, Pinker BM, Solemani K, Zuniga JM, Dadaian SC, Cremers S,</p><p>Landesberg R, Raghavan S (2011) Nova terapia para reverter os</p><p>efeitos celulares dos bifosfonatos em fibroblastos orais humanos</p><p>primários. J Oral Maxillofac Surg 69:2564–2578</p><p>9. Nogales CG, Ferrari PH, Kantorovich EO, Lage-Marques J (2008)</p><p>Ozonioterapia em medicina e odontologia. J Contemp Odontologia</p><p>9: 75–84</p><p>10. Azarpazhooh A, Limeback H (2008) A aplicação do ozônio em odontologia:</p><p>uma revisão sistemática da literatura. J Dentista 36: 104–116</p><p>11. 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Eur Rev Med Pharmacol</p><p>Ciências 16:1741-1747</p><p>Conclusão</p><p>A terapia com plasma com gás ozônio em culturas de células de</p><p>fibroblastos gengivais humanos tratadas com bifosfonatos reduz</p><p>significativamente o dano genotóxico. A aplicação de plasma de gás</p><p>ozônio na cultura de células de fibroblastos humanos imediatamente</p><p>após a intervenção cirúrgica e no pós-operatório pode ajudar a</p><p>promover a cicatrização da mucosa. São necessários estudos</p><p>moleculares e clínicos mais detalhados para esclarecer a aplicação mais</p><p>eficaz do ozônio e seu mecanismo de ação.</p><p>Conformidade com padrões éticos</p><p>Conflito de interessesOs autores declaram não ter conflito de</p><p>interesses.</p><p>FinanciamentoO trabalho foi apoiado financeiramente pelo Conselho de</p><p>Revisão Institucional e Comitê de Ética da Universidade Baskent (Projeto No:</p><p>D-DA 13/02).</p><p>Aprovação éticaTodos os procedimentos realizados em estudos envolvendo</p><p>participantes humanos estavam de acordo com os padrões éticos do comitê</p><p>de pesquisa institucional e/ou nacional e com a declaração de Helsinque de</p><p>1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis.</p><p>Consentimento informadoO consentimento informado foi obtido de todos os participantes</p><p>individuais incluídos no estudo.</p><p>Clin Oral Invest</p><p>19. 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