Apostila aula prática Microbiologia_2024

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<p>UFLA – Universidade Federal de Lavras</p><p>DBI – Departamento de Biologia</p><p>MICROBIOLOGIA GERAL (GBI 111 e 132) PRÁTICAS DE LABORATÓRIO</p><p>2024/2</p><p>Nome:.........................................................................Matrícula..................Turma..........</p><p>Autores em ordem alfabética:</p><p>Profª. Cristina Ferreira Silva</p><p>Dr. Dirceu de Sousa Melo</p><p>Prof. Eustáquio Souza Dias</p><p>Profª. Patrícia Gomes Cardoso</p><p>Profª. Rosane Freitas Schwan</p><p>Prof. Victor Satler Pylro</p><p>Prof. Whasley Ferreira Duarte</p><p>REGRAS DO LABORATÓRIO</p><p>INSTRUÇÕES DE COMPORTAMENTO NO LABORATÓRIO</p><p>1</p><p>No caso de acidentes, comunicar imediatamente ao professor.</p><p>2</p><p>Limpar e desinfetar as bancadas e capelas no início e no final das aulas.</p><p>3</p><p>Ser cuidadoso com materiais que possam causar ferimentos na pele, como</p><p>seringas, pipetas Pasteur, lâminas de aço e vidros em geral.</p><p>4</p><p>Descartar o material utilizado nos locais apropriados.</p><p>5</p><p>Todo material utilizado deve ser devidamente identificado.</p><p>6</p><p>A alça de platina e agulha utilizadas na manipulação dos microrganismos</p><p>devem ser esterilizadas no bico de Bunsen antes e depois de utilizadas. Colocá-las sempre na posição vertical no suporte e não sobre a bancada.</p><p>7</p><p>Nunca pipetar com a boca.</p><p>8</p><p>Não sair com nenhum material das aulas.</p><p>9</p><p>Não devolva o reagente ao frasco original, principalmente em se tratando de</p><p>substância P.A. Nunca retire do frasco mais do que necessário. Nunca use uma mesma espátula para reagentes diferentes!</p><p>10</p><p>Cuidado com as espátulas usadas, descarte em local apropriado.</p><p>11</p><p>Cuidado com qualquer material quente, especialmente substâncias químicas. Espere que resfriem para o manuseio seguro, usando luvas adequadas ou</p><p>garras especiais.</p><p>12</p><p>Leia o roteiro de aula prática antes de iniciar qualquer procedimento. Anote</p><p>os resultados experimentais, discussões e conclusões. Faça todos os exercícios da apostila, pois, esta será conferida no final de cada aula.</p><p>13</p><p>Antes de deixar o laboratório em cada aula, ordenar todo o material usado, fechar a água, o gás e desligar o interruptor e a tomada do microscópio. Mantenha o laboratório organizado e limpo. Atenção especial com as</p><p>bancadas, sua segurança pode estar em jogo.</p><p>Estas normas têm como metas:</p><p>· A segurança de cada um e de todos;</p><p>· O bom funcionamento do laboratório;</p><p>· A eficiência e eficácia na condução das práticas.</p><p>ÍNDICE</p><p>Nº prática</p><p>Tema aula prática</p><p>Página</p><p>1.1</p><p>Introdução ao Laboratório de Microbiologia e observação de microrganismos no ambiente</p><p>1</p><p>1.2</p><p>Meios de cultura em microbiologia</p><p>8</p><p>2</p><p>Observação microscópica de protistas e algas</p><p>14</p><p>3.1</p><p>Isolamento de fungos filamentosos saprófitas e fitopatogênicos</p><p>25</p><p>3.2</p><p>Morfologia de fungos filamentosos – hifas septadas e não septadas</p><p>29</p><p>4</p><p>Visualização de esporos fúngicos assexuados e sexuados</p><p>31</p><p>5</p><p>Visualização de leveduras - morfologia, tipo de reprodução e viabilidade celular</p><p>52</p><p>6</p><p>Isolamento e enumeração de microrganismos – diluição</p><p>58</p><p>7</p><p>Obtenção de culturas puras: estrias simples e compostas</p><p>60</p><p>8</p><p>Preparações microscópicas fixadas: coloração de Gram</p><p>63</p><p>9.1</p><p>Antibiograma: avaliação da sensibilidade de bactérias aos antibióticos</p><p>74</p><p>9.2</p><p>Alterações genotípicas e fenotípicas em microrganismos</p><p>77</p><p>Referências</p><p>79</p><p>Anexo I. Protocolos para preparo de corantes, reagentes e meios</p><p>81</p><p>Prática 1.1 – Introdução ao Laboratório de Microbiologia e observação de microrganismos no ambiente</p><p>Estima-se que nosso planeta hospeda uma ordem de 1030 células microbianas – número esse, maior do que o de estrelas no universo observável – distribuídas em aproximadamente 1 trilhão de espécies (1012). Apesar da sua importância clínica, sabe-se que menos de 1 % dessa diversidade microbiana tem reconhecido potencial patogênico em humanos, e hoje, passa-se a entender que essa enorme diversidade tem papel fundamental para a manutenção do nosso estado saudável e na estabilidade de todos os ecossistemas.</p><p>Durante as aulas práticas do curso de Microbiologia Geral utilizaremos técnicas microbiológicas clássicas de isolamento, conservação e caracterização de microrganismos que são aplicadas em diversas pesquisas, na indústria bioquímica, de alimentos, na agricultura, na biotecnologia, entre outras áreas. Esses microrganismos apresentam distribuição ampla, podendo ser encontrados em quaisquer ambientes, superfícies ou mesmo em suspensão.</p><p>Um laboratório de microbiologia apresenta alguns equipamentos e vidrarias comuns a outros laboratórios, como os de química ou de análises clínicas. No entanto, algumas vidrarias são exclusivas para uso na área de microbiologia. Basicamente, um laboratório deve possuir autoclave, microscópio, câmara de segurança biológica (câmara de fluxo laminar), estufas de secagem e bacteriológica, BOD, refrigeradores e balanças analíticas.</p><p>Nesta primeira aula, conheceremos as normas básicas, materiais, e equipamentos rotineiramente utilizados em um Laboratório de Microbiologia. Também, teremos a oportunidade de verificar a presença de microrganismos no ambiente, justificando as normas propostas.</p><p>Objetivos</p><p>1- Reconhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratório de Microbiologia.</p><p>2- Averiguar a presença de microrganismos no ambiente.</p><p>PAGE 10</p><p>Abaixo, a descrição dos principais EQUIPAMENTOS:</p><p>Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo. A autoclave é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura, água, suspensões e descarte de material contaminado.</p><p>Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco toda vidraria convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 a 200o C por 1-2 horas.</p><p>Refrigerador - utilizado na conservação de culturas de microrganismos sob baixa temperatura, diminuindo o metabolismo.</p><p>Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos pela incubação na temperatura adequada.</p><p>Câmara de Segurança Biológica (câmara de fluxo laminar) - câmara asséptica, dotada de exaustor, lâmpada fluorescente e luz ultra violeta (germicida), sendo utilizada para diversos tipos de operações que requerem assepsia, tais como verter meio em placas de Petri, isolar e repicar microrganismos.</p><p>Microscópio óptico - utilizado em observação de imagem ampliada até mil vezes por meio de dois conjuntos de lentes: as objetivas, que ficam próximas do objeto, e ampliam a imagem real; e as oculares, próximas do olho do observador, que ampliam a imagem novamente. É constituído por duas partes – uma parte mecânica e uma parte óptica. Cada parte engloba uma série de componentes constituintes do microscópio. A parte mecânica serve para dar estabilidade e suportar a parte óptica. É constituída por base ou pé, parafusos macro e micrométricos, haste ou braço, mesa ou platina, charriot, presilha, tambor ou revólver das objetivas e canhão. A parte óptica é constituída por fonte de iluminação, lente condensadora ou condensador, botão do condensador, diafragma e pelas lentes oculares e objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objeto. A ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular. Visto que esses componentes são de alta precisão e alto custo, o microscópio requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção.</p><p>Balança analítica: usada para se obter massas de sólidos e líquidos com alta exatidão.</p><p>Bico de Bunsen: é um bico de gás, alimentado por um tubo de borracha, fixado em uma base metálica com entrada de ar, cuja chama é utilizada para técnicas de flambagem e esterilização de materiais contaminados.</p><p>Os principais MATERIAIS e VIDRARIAS são:</p><p>Erlenmeyer (1), proveta (2), béquer (3), placas de Petri (4), tubos de ensaio (5), lâminas e lamínulas (6), alça de Drigaslky (7), pipeta de transferência (8), câmara de Neubauer</p><p>(9) alça de inoculação (ou</p><p>induzidas são resultado da exposição do organismo a algum agente físico, químico ou biológico. O agente causador da mutação é chamado de mutagênico. Várias formas de radiação são altamente mutagênicas. As radiações eletromagnéticas mutagênicas podem ser divididas em duas categorias principais, ionizante e não ionizante. As radiações não ionizantes, como a radiação ultravioleta (UV), são mais amplamente utilizadas.</p><p>Mutantes morfológicos podem ser obtidos por meio do tratamento de esporos (conídios) do fungo Penicillium griseoroseum com luz UV. Mutantes originários desses esporos tratados com UV podem apresentar modificação na coloração dos conídios ou mesmo na organização dos conidióforos.</p><p>Modificações nas condições ambientais podem gerar alterações fenotípicas (reversíveis) em microrganismos. Um exemplo é o efeito da temperatura de incubação sobre a produção do pigmento prodigiosina, por culturas da bactéria Serratia marcescens. Outra variável interferindo na produção desse pigmento inclui o tipo de meio de cultura (disponibilidade de nutrientes) utilizado para o cultivo.</p><p>Objetivos</p><p>1 – Observar o efeito da temperatura na produção do pigmento prodigiosina por Serratia marcescens.</p><p>Materiais</p><p>Microrganismos: Serratia marcescens.</p><p>Soluções: Ágar nutriente, solução de Tween 80 (0,1 %, v/v) e solução salina (0,85 %, m/v).</p><p>Equipamentos e utensílios: Placas de Petri, alça de Drigalsky, alça de platina, tubos de ensaio, pipetas, ponteiras, vortex, e estufas de incubação.</p><p>Descrição do procedimento realizado</p><p>Produção de pigmento por S. marcescens</p><p>1- Utilizando uma caneta permanente, foi feito a divisão nas 2 placas de Petri contendo ágar nutriente;</p><p>2- Nas 2 placas, em uma das metades foi realizada uma estria simples com a cultura pigmentada de S. marcescens e na outra metade, uma estria simples com a cultura de S. marcescens não pigmentada.</p><p>3- As placas foram incubadas à temperatura ambiente e a outra a 40 oC, por 48 h.</p><p>4- Após o período de incubação, visualize os resultados.</p><p>Resultados</p><p>Após o período de incubação, visualize e descreva os resultados.</p><p>Esquematize os resultados obtidos com S. marcescens. Utilize caneta vermelha quando necessário.</p><p>Exercícios</p><p>1- Por que as colônias não pigmentadas de S. marcescens não são consideradas mutantes?</p><p>REFERENCIAS</p><p>ALEXOPOULOS, C.J. & MIMS, C.W. Introductory Mycology. Singapore: John Wiley & Sons, 1979. 632 p.</p><p>BROCK, T.D. & MADIGAN, M.T. Biology of microorganisms. New Jersey: Prentice Hall International, 1988. 835 p.</p><p>BUCHANAN, R.F.; GIBBONS, N.E. Bergy’s Manual of Determinative Bacteriology. 8 th. Ed. Baltimore, Wllians&wilkins Co. 1974.</p><p>CARLILE, M.J.; WATKINSON, S.C. The Fungi. San Diego: Academic, 1994. 482 p.</p><p>CASSINI, S. T. A. Exercícios Práticos de Microbiologia do Solo Viçosa, Imprensa Universitária, U. F. V. 1983</p><p>Dias, Disney R.; Schwan, Rosane Freitas. Leveduras. In: Moreira, F.M.S.; Cares, J. E.; Zanetti, R.; Stürmer, S. L. (Org.). O ecossistema solo: componentes, relações ecológicas e efeitos na produção vegetal. Lavras: UFLA, 2013, p. 311-324.</p><p>Dias, Disney R.; Schwan, Rosane Freitas. Isolamento e identificação de leveduras. In: Fatima M. S. Moreira; E. JeroenHuising; David E. Bignell. (Org.). (Org.). Manual de Biologia dos Solos Tropicais - Amostragem e Caracterização da Biodiversidade. Lavras: UFLA, 2010, p. 227-277.</p><p>GIRARD, H. & ROUGIEUX, R. Técnicas de Microbiología Agrícola. Zaragoza: Acribia, 1964. 267 p.</p><p>HUNGRIA, M., ARAÚJO, R.S., ARAÚJO, F.F. & JAMES, E. Princípios básicos em um laboratório de Microbiologia. In: Hungria, M.; Araújo, R. (eds) Manual de métodos empregados em estudos de Microbiologia Agrícola. Brasília: EMBRAPA. 1994. 542p.</p><p>LARPENT, J. P. & LARPENT-GOURGAUD, M. Microbiologia Prática. São Paulo: Edgard BlucherLtda-USP, 1975. 162p.</p><p>LOURES, E. G. & GUIMARÃES, W. V. Microbiologia. Técnicas de laboratório. Principais provas Empregadas para Identificação de Bactérias. Viçosa, Imprensa Universitária, U. F. V. 1981.</p><p>KRUGNER, T.L. & BACCHI, L.M.A. Fungos. In: BERGAMIN FILHO, A., KIMATI,</p><p>H., AMORIM, L. (eds.). Manual de Fitopatologia. São Paulo: Ceres, 1995, v. 1. p. 46- 96.</p><p>MALIK, K.A. Some Universal media for the isolation, growth and purity checking of a broad spectrum of microorganisms. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 8, p. 453-456, 1992.</p><p>NEDER, R.N. Microbiologia: Manual de Laboratório. São Paulo: Nobel, 1992. 138p.</p><p>PRESCOTT, L.M.; HARLEY, J.P. & KLEIN, D.A. Microbiology. Dubuque: Wm.C.Brown, 1990. 868 p.</p><p>RIBEIRO, M.C.; SOARES, M.M.S.R. Microbiologia Prática: roteiro e manual: bactérias e fungos. São Paulo: Editora Atheneu, 2000. 112p.</p><p>TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R. & CASE, C.L. Microbiologia. Artes Médicas Sul, Porto Alegre, 2000</p><p>ANEXO I – PREPARO DE CORANTES, REAGENTES E MEIOS</p><p>1. Azul de metileno (Loeffler) Solução A:</p><p>Azul de metileno	0,3 g</p><p>Álcool etílico	30,0 mL</p><p>Solução B:</p><p>Hidróxido de potássio	0,01 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL Misturar Solução A e B</p><p>2. Cristal Violeta</p><p>Solução A:</p><p>Cristal de Violeta (85%)	2,0 g</p><p>Álcool etílico	20,0 mL</p><p>Solução B:</p><p>Oxalato de Amônia	0,8 g</p><p>H2O destilada	80,0 mL</p><p>Misturar Solução A e B</p><p>3. Fucsina de Ziehl</p><p>Solução A:</p><p>Fucsina básica (90%)	0,3 g</p><p>Álcool etílico (95%)	10,0 mL Solução B:</p><p>Fenol	5,0 g</p><p>H2O destilada	95,0 mL</p><p>Misturar Solução A e B</p><p>4. Lugol</p><p>Iodo	1,0 g</p><p>Iodeto de potássio	2,0 g</p><p>H2O destilada	300 mL</p><p>Dissolver o iodeto de potássio em água e acrescentar o iodo.</p><p>5. Eritrosina Fenicada</p><p>Eritrosina	1,0 g</p><p>Fenol (5% solução aquosa)	100 mL</p><p>6. Barrit - reativo (teste de VP) Solução A:</p><p>Alfa-naftol	6,0 g</p><p>Álcool etílico	100,0 mL Solução B</p><p>Hidróxido de potássio	16 g</p><p>H2O destilada	1000 mLq.s.p.</p><p>Conservar as soluções em frascos separados</p><p>7. Vermelho de Metila</p><p>Vermelho de metila	0,1 g</p><p>Álcool etílico		300,0 mL Hidróxido de sódio (0,1N)	3,7 mL H2O destilada	q.s.p.	500 mL</p><p>8. Caldo Glucose</p><p>Extrato de carne	3,0 g</p><p>Peptona	5,0 g</p><p>Glucose	10,0 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL</p><p>9. Caldo Sacarose</p><p>Extrato de Carne	3,0 g</p><p>Peptona	5,0 g</p><p>Sacarose	10,0 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL</p><p>10. Ágar amido</p><p>Amido solúvel	200,0 g</p><p>Ágar nutritivo	1000 mL</p><p>11. Ágar extrato de solo</p><p>Glucose	15,0 g</p><p>K2HPO4	0,5 g</p><p>*Extrato de solo	100,0 mL</p><p>Água da torneira	900 mL</p><p>Ágar	15,0 g</p><p>*Extrato de solo esterilizado para uso no meio: juntar 1L de água de torneira a 1 Kg de solo rico. Agitar e autoclavar por 30 minutos. Acrescentar um pouco de CaCO3 e filtrar a suspensão. Esta suspensão deve ser filtrada novamente até tornar-se mais claro. Acondicionar em frascos de 100 mL e autoclavar por 15 minutos.</p><p>12. Meio “79” (Rhizobium)</p><p>Sacarose (açúcar cristal)	5,0 g</p><p>Glutamado de Na (Aji-no-moto®)	1,0 g</p><p>K2HPO4	0,4 g</p><p>KH2PO4	0,1 g</p><p>MgSO4.7 H2O	0,2 g</p><p>NaCL	0,1 g</p><p>Extrato de Levedura	0,5 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL</p><p>Ágar	15,0 g</p><p>Vermelho Congo: adicionar 30,0 mL.L-1 de uma solução alcóolica a 1/200.</p><p>13. MB - (meio básico)</p><p>Amido solúvel	10,0 g</p><p>Caseína ácida hidrolisada	10,0 g</p><p>Glucose	1,0 g</p><p>Na2HPO	3,0 g</p><p>Mg SO4 7H2O	0,1 g</p><p>Ágar	15,0 g</p><p>H2O destilada</p><p>1000 mL</p><p>14.</p><p>MB - 2 (Catalase)</p><p>Sacarose</p><p>10,0 g</p><p>Caseína Ácida hidrol.</p><p>8,0 g</p><p>Extrato de levedura</p><p>4,0 g</p><p>K2HPO</p><p>Mg SO4 7H2O</p><p>2,0 g</p><p>0,3 g</p><p>H2O destilada</p><p>1000 mL</p><p>15.	Azul de metileno (MB - 4):</p><p>Distribuir 1 mL de solução de azul de metileno 1:20000 em cada tubo contendo MB - 2.</p><p>16.	Gelatina</p><p>Caseína ácida hidrolisada</p><p>8,0 g</p><p>Extrato de levedura</p><p>4,0 g</p><p>Gelatina</p><p>150,0 g</p><p>H2O destilada</p><p>1.000 mL</p><p>17.	V.M. e V.P.</p><p>Glucose</p><p>5,0 g</p><p>Peptona</p><p>5,0 g</p><p>K2HPO4</p><p>5,0 g</p><p>H2O destilada</p><p>1.000 mL</p><p>18. BDA (Batata-Dextrose-Ágar)</p><p>Batata	200 g</p><p>Dextrose	15 g</p><p>Ágar	15 g</p><p>Água destilada (q.s.p.)	1.000 mL</p><p>19. Caldo Nutriente</p><p>Extrato de carne	3,0 g</p><p>Peptona	5,0 g</p><p>Água destilada (q.s.p.)	1.000 mL</p><p>20. Ágar Nutriente</p><p>Caldo nutriente	1.000 mL</p><p>Ágar	15,0 g</p><p>21. Solução Sulfo-Crômica</p><p>Ácido Sulfúrico Conc.	460 mL Dicromato de potássio	60,0 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL</p><p>22. Meio para Actinomicetos</p><p>K2HPO	1,0 g</p><p>Asparagina de sódio	10,0 g</p><p>Glicerol	10,0 g</p><p>Solução de oligoelementos	1,0 mL Ágar	15,0 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL pH final 7,0</p><p>Para isolamento de Streptomyces pode-se utilizar 1,0 mL de uma solução padrão</p><p>de 100 mg/mL de estreptomicina para inibição de bactérias.</p><p>23.</p><p>Caldo lactose</p><p>Extrato de carne</p><p>3,0 g</p><p>Peptona</p><p>5,0 g</p><p>Lactose</p><p>10,0 g</p><p>H2O destilada</p><p>1.000 mL</p><p>pH 6,8 - 7,0</p><p>24. Eosina Azul de Metileno (Agar)</p><p>Peptona	10,0 g</p><p>Lactose	10,0 g</p><p>Fosfato dipot. (K2HPO4)	2,0 g Ágar	15,0 g</p><p>Eosina Y	0,4 g</p><p>Azul de metileno	0,065 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL Esterilizar 115 °C por 15 a 20 minutos.</p><p>25. Solução Sacarose</p><p>- Para preparação de esporos de fungos endomicorrízicos e nematóides Sacarose	454 g</p><p>H2O destilada	1.000 ml</p><p>26. Caldo Lactosado verde Bile Brilhante 2%</p><p>Peptona	10,0 g</p><p>Lactose	10,0 g</p><p>Bile de boi desidratada	20,0 g Verde Brilhante	0,0133 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL</p><p>27. Caldo Indol</p><p>Triptona	5,0 g</p><p>NaCl	2,5 g</p><p>H2O destilada	1.000 mL</p><p>28. Indicador de Andrade</p><p>Fucsina ácida	1,0 g</p><p>H2O destilada	200 mL</p><p>29. Agar acetato para esporulação de leveduras</p><p>Extrato de levedura	2.5 g/l</p><p>Dextrose	1.0 g/l</p><p>Acetato de potássio	10 g/l</p><p>Agar	20g/l</p><p>pH (25 °C)	6,4±0.2</p><p>image76.jpg</p><p>image142.png</p><p>image67.png</p><p>image151.jpg</p><p>image150.jpg</p><p>image138.png</p><p>image19.jpg</p><p>image70.jpg</p><p>image69.png</p><p>image126.jpg</p><p>image122.jpg</p><p>image53.jpg</p><p>image104.png</p><p>image75.jpg</p><p>image123.png</p><p>image1.png</p><p>image153.jpg</p><p>image149.jpg</p><p>image147.png</p><p>image88.png</p><p>image25.jpg</p><p>image37.jpg</p><p>image82.png</p><p>image43.png</p><p>image111.png</p><p>image110.png</p><p>image128.png</p><p>image47.jpg</p><p>image22.jpg</p><p>image44.jpg</p><p>image38.jpg</p><p>image23.jpg</p><p>image17.jpg</p><p>image42.jpg</p><p>image32.jpg</p><p>image34.jpg</p><p>image35.jpg</p><p>image20.jpg</p><p>image50.jpg</p><p>image12.jpg</p><p>image85.jpg</p><p>image5.jpg</p><p>image54.jpg</p><p>image81.jpg</p><p>image30.jpg</p><p>image33.jpg</p><p>image51.jpg</p><p>image66.jpg</p><p>image14.jpg</p><p>image113.png</p><p>image106.png</p><p>image129.png</p><p>image28.png</p><p>image77.jpg</p><p>image2.png</p><p>image56.png</p><p>image114.png</p><p>image105.png</p><p>image148.png</p><p>image152.png</p><p>image140.png</p><p>image52.png</p><p>image103.png</p><p>image112.png</p><p>image96.jpg</p><p>image137.png</p><p>image143.png</p><p>image108.png</p><p>image46.jpg</p><p>image86.jpg</p><p>image90.jpg</p><p>image87.jpg</p><p>image91.jpg</p><p>image97.jpg</p><p>image95.jpg</p><p>image93.jpg</p><p>image94.jpg</p><p>image98.jpg</p><p>image100.jpg</p><p>image99.png</p><p>image102.jpg</p><p>image79.png</p><p>image27.jpg</p><p>image83.jpg</p><p>image61.jpg</p><p>image6.jpg</p><p>image4.jpg</p><p>image71.jpg</p><p>image13.png</p><p>image80.jpg</p><p>image60.jpg</p><p>image62.png</p><p>image16.jpg</p><p>image41.jpg</p><p>image40.jpg</p><p>image133.png</p><p>image144.png</p><p>image31.png</p><p>image125.png</p><p>image139.png</p><p>image120.png</p><p>image121.png</p><p>image107.png</p><p>image119.png</p><p>image136.png</p><p>image117.png</p><p>image124.png</p><p>image130.png</p><p>image145.png</p><p>image127.png</p><p>image115.png</p><p>image109.png</p><p>image135.png</p><p>image132.png</p><p>image7.png</p><p>image21.png</p><p>image10.png</p><p>image24.png</p><p>image55.png</p><p>image64.png</p><p>image3.png</p><p>image48.png</p><p>image74.jpg</p><p>image68.jpg</p><p>image73.jpg</p><p>image9.jpg</p><p>image57.jpg</p><p>image92.png</p><p>image72.jpg</p><p>image58.jpg</p><p>image36.jpg</p><p>image118.png</p><p>image116.png</p><p>image141.png</p><p>image131.png</p><p>image63.jpg</p><p>image45.jpg</p><p>image65.png</p><p>image78.jpg</p><p>image18.jpg</p><p>image59.png</p><p>image89.jpg</p><p>image15.png</p><p>image11.png</p><p>image26.jpg</p><p>image29.jpg</p><p>image101.png</p><p>image49.jpg</p><p>image39.jpg</p><p>image8.jpg</p><p>image84.jpg</p><p>image134.png</p><p>image146.png</p><p>de platina) (10), pipetas automáticas (11), pisseta (12).</p><p>1)</p><p>2)</p><p>3)</p><p>4)</p><p>5)</p><p>6)</p><p>7)</p><p>8)</p><p>9)</p><p>10)</p><p>11)</p><p>12)</p><p>Procedimentos</p><p>· Averiguação da presença de microrganismos no ambiente:</p><p>1- Exponha a placa de Petri, contendo o meio de cultura estéril, a uma condição de inoculação de sua preferência, por exemplo, exposição à pele, ao ar, cabelo, etc. Incubar à 25 ℃, por uma semana (até a próxima aula). Mantenha uma placa estéril como Controle.</p><p>· Verificação da utilidade do Bico de Bunsen</p><p>1- Abrir uma placa de Petri, contendo o meio de cultura estéril, próximo à chama do Bico de Bunsen, por 60 segundos e posteriormente, incubar à 25 ℃, por uma semana (até a próxima aula). Mantenha uma placa estéril como Controle.</p><p>LEMBRE-SE DE IDENTIFICAR O MATERIAL: as placas devem ser identificadas na borda da placa, com número da turma, bancada, data e condição de incubação.</p><p>Resultados</p><p>Após o período de incubação, anotar a presença ou ausência de microrganismos nas diversas condições, identificando os diferentes morfotipos encontrados.</p><p>· Averiguação da presença de microrganismos no ambiente:</p><p>Número de morfotipos:</p><p>Observação:</p><p>· Verificação da eficácia do Bico de Bunsen:</p><p>Número de morfotipos:</p><p>Observação:</p><p>Exercícios</p><p>1- Qual é a utilidade do Bico de Bunsen no Laboratório de Microbiologia?</p><p>2- Explique a finalidade e o princípio do funcionamento da autoclave.</p><p>3- Diferencie colônias de bactérias e fungos filamentosos. Dê as principais características da morfologia das colônias.</p><p>4- Com base nos resultados, o que aconteceu com os Controles? Explique os resultados dos Ensaios.</p><p>Prática 1.2 – Meios de cultura: utilização, preparo e esterilização</p><p>Todos os organismos vivos necessitam de uma variedade de elementos químicos que são essenciais para a síntese e funcionamento normal dos componentes celulares. Estes elementos estão presentes na natureza na forma de compostos orgânicos ou inorgânicos. O meio de cultura, também denominado meio de cultivo, consiste em um material nutritivo, preparado em laboratório, que se destina ao cultivo artificial dos microrganismos, devendo, portanto, fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. As exigências nutricionais dos microrganismos, em relação aos elementos requeridos, são bastante semelhantes àquelas exigidas pelas plantas ou animais, ou seja, necessitam de carbono, nitrogênio, hidrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo, cálcio, potássio, magnésio, além dos micronutrientes e vitaminas. A diferença básica entre os microrganismos e as plantas e animais é quanto à fonte de cada elemento. As plantas os utilizam predominantemente na forma inorgânica e os animais, na forma orgânica. Os microrganismos podem utilizá-los tanto na forma orgânica, inorgânica ou até mesmo gasosa. Entre os microrganismos, os que são capazes de se desenvolver em meios inteiramente inorgânicos (minerais) são chamados de autotróficos, enquanto que outros microrganismos que exigem compostos orgânicos como fonte de carbono e de energia são chamados de heterotróficos.</p><p>Dependendo da finalidade a que se destinam, os meios de cultura podem ser líquidos, sólidos ou semi-sólidos. Os meios líquidos podem ser usados em estudos de crescimento, de fermentação e na produção de biomassa, enquanto que os meios sólidos são úteis para contagem e isolamento de microrganismos. Por fim, os meios semissólidos são utilizados para fins muito específicos, como, por exemplo, para a detecção de placas de lise em culturas bacterianas infectadas por vírus. Os meios sólidos e semi-sólidos são acrescidos de agente solidificante, o ágar, normalmente na concentração de 1,5% para os meios sólidos e 0,75% para os meios semi-sólidos. O ágar consiste de uma mistura de dois polissacarídeos: agarose e agaropectina. A agarose é formada por unidades repetitivas de agarobiose (dissacarídeo formado por D-galactose e3,6-anidro-L- galactopiranose. e ácido D-glucurônico extraído de algas vermelhas (Gelidium corneum- alga marinha japonesa) a 80oC com H2SO4 diluído. O ágar tem a propriedade de fundir de 80 a 100oC e solidificar a 45oC.</p><p>Além disso, com respeito à sua composição, existem os meios de cultivo naturais, como infusão de batata, sangue e leite, nos quais a composição química exata não é conhecida. Existem, também, os meios sintéticos, contendo componentes químicos puros, orgânicos e/ou inorgânicos, bem como aqueles que podem ser obtidos pela combinação de reagentes puros com extratos naturais. A seguir, serão descritos os diferentes tipos de meios de cultura, os quais são classificados em função da composição química e/ou função.</p><p>1. Meios de cultura complexos ou indefinidos: são meios de cultura nos quais os componentes possuem todos os nutrientes requeridos pelos microrganismos, mas a quantidade exata não é especificada. Esses meios de cultura são preparados com base em produtos naturais, como: Extrato de carne - solução aquosa de carne bovina concentrada em pasta. Peptona - proteínas que foram parcialmente degradadas por enzimas, como hidrolisado de caseína do leite, hidrolisado de proteínas da soja, carne, gelatina e outras fontes de proteínas. Extrato de levedura, sangue, soro, leite, extrato de solo e fluido de rúmen - todos esses materiais são complexos e contêm açúcares, aminoácidos, vitaminas e sais.</p><p>2. Meios químicamente definidos: são os meios nos quais a composição exata de cada nutriente ou elemento químico é conhecido (Ex: Tabela 1). Adicionar ou retirar um determinado elemento do meio permite conhecer se aquele constituinte em particular é essencial para o crescimento de determinado microrganismo (fator de crescimento).</p><p>Tabela 1- Meio de cultura quimicamente definido para o crescimento de bactérias heterotróficas.</p><p>Ingrediente</p><p>Função</p><p>Quantidade</p><p>Glicose</p><p>Fonte de carbono e energia</p><p>10 g</p><p>NH4H2PO4</p><p>Fonte de nitrogênio, tampão e íons essenciais</p><p>5 g</p><p>K2HPO4</p><p>Tampão e íons essenciais</p><p>1 g</p><p>NaCl</p><p>Íons essenciais</p><p>5 g</p><p>Água destilada</p><p>Solvente</p><p>1000 mL</p><p>3. Meios Especiais: são meios formulados com objetivos específicos, utilizados principalmente nos trabalhos de isolamento e identificação de microrganismos. Podem ser:</p><p>3.1. Meios seletivos: são designados para o aumento do crescimento de um determinado microrganismo ou grupo de microrganismos em detrimento de outros. Alguns meios seletivos possuem corantes na sua composição (ex. verde brilhante), feniletanol e antibióticos, que inibem determinados grupos de microrganismos. Para o isolamento de bactérias, pode-se utilizar meio apropriado para o crescimento de bactérias e contendo também antibiótico contra fungos e vice-versa. Para o isolamento de fungos, pode-se utilizar também meio cuja composição seja desfavorável para bactérias, em função de pH e concentração de açúcares, como é o caso do meio Sabouraud para o crescimento de fungos (Tabela 2).</p><p>Tabela 2- Composição química do meio Sabouraud.</p><p>Ingrediente</p><p>Função</p><p>Quant.</p><p>Peptona</p><p>Fonte de carbono, nitrogênio e elementos</p><p>10 g</p><p>Glicose</p><p>Fonte de carbono e energia - Alta concentração inibe crescimento de bactérias</p><p>40 g</p><p>Ágar</p><p>Agente gelatinizante - ‘solidificante’</p><p>15 g</p><p>Água destilada</p><p>Solvente</p><p>1000 mL</p><p>pH</p><p>Baixo pH inibe bactérias, mas permite crescimento de fungos</p><p>4,5</p><p>3.2. Meios Diferenciais: são utilizados para diferenciar microrganismos entre vários tipos em uma mesma placa. Muito utilizados para determinar qualidade de água e de alimentos em geral.</p><p>Existem meios que são diferenciais/seletivos, porque, além de permitir a diferenciação entre diferentes grupos ou espécies, permitem a contagem de um grupo em detrimento de outro. Estes podem distinguir entre grupos de organismos morfologicamente e bioquimicamente relacionados, pois incorporam componentes químicos que, seguindo inoculação e incubação, produzem mudança característica na aparência do crescimento da colônia bacteriana e/ou no meio de cultura ao redor das</p><p>colônias, o que permite a diferenciação. Os meios de cultura a seguir são representativos desses dois tipos</p><p>I. Ágar</p><p>Sal Manitol: Este meio de cultura contém alta concentração de sal, 7,5 % NaCl, que é inibitório ao crescimento da maioria das bactérias, mas não para estafilococos. O meio de cultura também realiza função diferencial: contém o carboidrato manitol, que alguns estafilococos são capazes de fermentar e vermelho de fenol (phenolred), que é um indicador de pH para detectar ácido produzido pela fermentação do manitol. Colônias de estafilococos exibem um halo amarelo ao redor da colônia; estafilococos que não fermentam manitol não produzirão mudança na coloração.</p><p>II. Agar Sangue: O sangue que é incorporado neste meio de cultura é um ingrediente de enriquecimento para o cultivo de organismos exigentes como o Streptococcus spp. O sangue também permite a demonstração de propriedades hemolíticas de alguns microrganismos, particularmente estafilococos.</p><p>III. Ágar MacConkey: A ação inibitória do cristal violeta no crescimento de organismos Gram-positivos permite o isolamento de bactérias Gram-negativas. A Incorporação de lactose, sais biliares, e o indicador de pH vermelho neutro, permite a diferenciação de bactérias entéricas devido à habilidade de fermentar lactose. Neste meio de cultivo, enterobactérias são separadas em dois grupos:</p><p>a- Coliformes: produzem ácido como resultado da fermentação da lactose. A bactéria exibe coloração vermelha na superfície da colônia. Escherichia coli produz maiores quantidades de ácido pela lactose do que outras espécies de coliformes. Quando isso ocorre, o meio de cultura que cerca o crescimento também se torna vermelho por causa da ação do ácido que precipita sais biliares, seguindo-se, então, a absorção do vermelho neutro.</p><p>b- Bacilos da disenteria, tifoide e paratifoide: não são fermentadores de lactose, e, portando, não produzem ácido. As colônias aparecem sem cor e frequentemente transparentes.</p><p>IV. Ágar EMB (Eosyn Methylene Blue Agar, Levine): a presença de lactose e os corantes eosina e azul de metileno permitem diferenciação entre fermentadores e não fermentadores de lactose. As colônias de E. coli apresentam coloração azul-preta com brilho metálico esverdeado causado pela grande quantidade de ácido. Outra bactéria coliforme, como a Enterobacter aerogenes, produz colônias espessas, mucoides e rosas neste meio de cultura. Bactérias entéricas que não fermentam lactose produzem colônias</p><p>sem cor, que, devido à sua transparência, parecem adquirir a coloração roxa do meio de cultura. Este meio de cultura e também parcialmente inibitório ao crescimento de organismos Gram-positivos e, portanto, o crescimento de gram-negativos é mais abundante.</p><p>V. Ágar PEA (Phenyl ethyl alcohol agar): Este meio de cultura e usado para o isolamento da maioria de cocos Gram-positivos. O álcool fenil etílico inibe parcialmente bactérias Gram-negativas, as quais podem formar colônias visíveis, cujos tamanho e número são muito menores que em outros meios de cultura.</p><p>3.3. Meios de Enriquecimento: Meios convencionais enriquecidos com um ou mais componentes químicos que favoreçam uma determinada população de microrganismo numa população mista. Por exemplo, a adição de lactose no meio favorece o crescimento de bactérias que produzem β-galactosidase, aumentando o seu crescimento exponencialmente. Além dos meios de enriquecimento, podem-se utilizar outras técnicas de enriquecimento em função de diferentes condições físicas ou físico-químicas, como pH, temperatura, atmosfera, etc.</p><p>Além dos requerimentos nutricionais, fatores físicos interferem no crescimento microbiano, como temperatura, presença de oxigênio, de luz, salinidade e o pH. Cada espécie bacteriana cresce sob faixas de temperatura características: psicrófilos (15-20 oC), mesófilos (25-40 oC) e termófilos (45-60 oC). Quanto à presença de oxigênio livre, existem bactérias aeróbias, anaeróbias, anaeróbias facultativas e microaerófilas. Para a maioria das bactérias, o pH ótimo de crescimento varia entre 6,5 e 7,5.</p><p>Esterilização de meios de cultura</p><p>A utilização de meios de cultura estéreis é uma condição essencial para se trabalhar com microbiologia. Nesta aula prática teremos oportunidade de preparar meios de cultura líquido e sólido e esterilizá-los por calor úmido em autoclave, um dos métodos de esterilização de meios de cultura mais comuns no laboratório de microbiologia.</p><p>· A utilização de calor úmido é um dos métodos mais eficazes de destruição de microrganismos. A morte das células microbianas por ação do calor úmido resulta da desnaturação das proteínas e da desestabilização da membrana citoplasmática. A autoclave torna-se uma câmara com vapor de água saturado à</p><p>pressão de 1 atm acima da pressão atmosférica, a que corresponde, em locais ao nível do mar, a uma temperatura de ebulição da água de 121 ºC. No laboratório de microbiologia, é usual sujeitar o material a ser esterilizado a 121ºC durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as formas de vida bacterianas, incluindo a dos endósporos bacterianos mais resistentes ao calor que as células vegetativas. Contudo, o tempo necessário para se esterilizar convenientemente os materiais a esta temperatura depende da natureza do material a esterilizar e/ou do seu volume. O calor úmido sob pressão é utilizado na esterilização de meios de cultura que não contenham componentes termolábeis, na esterilização de materiais de laboratório utilizados nos estudos de microbiologia.</p><p>Objetivos</p><p>1- Observar os diferentes tipos de meios dispostos e classificá-los como: meios de cultura complexos ou indefinidos, definidos, especiais, seletivos e diferenciais.</p><p>2- Observação de placas com diferentes meios e culturas crescidas.</p><p>Exercícios</p><p>1- Sobre os meios Ágar Nutriente e BDA classifique se são definidos e indefinidos e cite as funções dos componentes de cada meio. A receita para o preparo dos meios estão nas páginas 99-100 da apostila.</p><p>2- Por que, algumas vezes, a esterilização de meios de cultura por calor sob pressão, em autoclave, não é adequada? Qual seria a alternativa sugerida nesses casos?</p><p>Prática 2 – Observação microscópica de protozoários e algas</p><p>Os protistas compreendem os microrganismos eucariotos fototróficos e não fototróficos, caracterizam-se pela ausência de parede celular e pela possível capacidade de locomoção por cílios e flagelos. As algas, por sua vez, possuem uma parede celular rígida, composta principalmente por celulose, realizam fotossíntese e algumas também possuem flagelo. As algas e os protistas são facilmente visualizados em preparações a fresco e muitos deles podem ser visualizados utilizando-se as objetivas de menor aumento (4 e 10 X). O protista Paramecium, por exemplo, apresenta 200 μm de comprimento.</p><p>Os Oomicetos se assemelham morfologicamente aos fungos, porém são filogeneticamente distintos desse grupo, apresentando várias características bioquímicas e moleculares diferentes, sendo classificados como Protistas. Microrganismos aquáticos apresentam esporos flagelados, hifas não septadas e reprodução assexuada por zoósporos. Na reprodução sexuada, ocorre a formação de um esporo de parede espessa chamado oósporo. Ao contrário dos fungos, a parede celular dos Oomicetos apresenta pequena quantidade (</p><p>70 % por 30 segundos, para quebrar a tensão superficial e iniciar a descontaminação da superfície do material vegetal;</p><p>4- Com uma pinça ou estilete flambado, transferir os quadrados para solução de hipoclorito de sódio 1 % por 30 segundos;</p><p>5- Transferir os fragmentos para água destilada estéril para remover o excesso de hipoclorito;</p><p>6- Em seguida, remover o excesso de água dos fragmentos em papel absorvente estéril (em placa de Petri);</p><p>7- Transferir os fragmentos (4) com uma pinça flambada (com álcool) para a placa de Petri com BDA. Incubar a temperatura ambiente por 7 dias.</p><p>Resultados</p><p>Avalie o crescimento dos fungos nos meios utilizados, e esquematize as colônias fúngicas encontradas de cada isolado obtido.</p><p>Exercícios</p><p>1- Porque no isolamento de fungos fitopatogênicos utiliza-se uma amostra contendo parte da lesão e parte saudável?</p><p>2- Como saber se realmente aquele fungo isolado é realmente o causador da doença na planta?</p><p>3- Discuta as diferenças quanto ao modo de vida dos fungos.</p><p>Pratica 3.2: Morfologia de fungos filamentosos – hifas septadas e não septadas</p><p>Os fungos são organismos heterotróficos, geralmente aeróbios, de ampla distribuição no ambiente e que podem se apresentar na forma de fungos filamentosos e/ou leveduras.</p><p>Os fungos filamentosos são caracterizados por distinta estrutura filamentosa, multinucleada, conhecida como micélio (podendo apresentar-se cotonoso, ou seja, com aspecto de algodão). O micélio é formado por um conjunto de filamentos ramificados que se irradiam sobre ou dentro do substrato utilizado como alimento. Cada um desses filamentos recebe o nome de hifa. A hifa é constituída por uma parede tubular delgada e transparente, contendo no seu interior o protoplasma. As hifas podem ser cenocíticas, ou seja, o protoplasma é contínuo, ou septada, quando o protoplasma é interrompido por paredes transversais denominadas septos.</p><p>A biologia e a biodiversidade de fungos são importantes para a caracterização e preservação de espécies, principalmente aquelas com potencial para aplicação biotecnológica. As preparações microscópicas para a observação de fungos são de grande importância para sua identificação, uma vez que características morfológicas dos micélios e células (esta aula), juntamente com características dos esporos (próxima aula) são rotineiramente utilizadas para tal fim.</p><p>Objetivos</p><p>1- Observar morfologia de fungos filamentosos (micélios) septados e não sepatados.</p><p>Materiais</p><p>Microrganismos: Placas com fungos filamentosos isolados na aula anterior para confecção de lâminas</p><p>Meios e soluções: azul de metileno, água destilada</p><p>Equipamentos e utensílios: Microscópio óptico, lâminas, alça de repicagem, bico de Bunsen, bandejas e suportes para lâminas.</p><p>Procedimento</p><p>Lâminas de fungos filamentosos</p><p>1. Manuseie corretamente o microscópio óptico (se você tem dúvida quanto à utilização do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize a lâmina de fungo filamentoso, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;</p><p>2. Observe a organização das hifas e a presença ou ausência de septo;</p><p>3. Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâminas.</p><p>4. Resultados</p><p>Desenhe as hifas fúngicas (fungos filamentosos), cenocíticas ou septadas, observadas no microscópio.</p><p>Prática 4 – Esporos fúngicos assexuados e sexuados</p><p>A reprodução sexuada em fungos pode ocorrer de várias maneiras. Os esporos sexuados são formados pela fusão de duas células (gametas), pelo processo denominado plasmogamia, que reúne dois núcleos em um único citoplasma. A etapa seguinte é a fusão desses dois núcleos, no processo denominado cariogamia, com a formação de um núcleo diplóide. A terceira etapa, meiose ou divisão redutora separa o núcleo diplóide em núcleos haplóides, que são posteriormente delimitados por uma membrana e parede celular, dando origem aos esporos haplóides. Como regra geral, os esporos sexuados são produzidos menos frequentemente e em menor número do que os esporos assexuados. Há quatro tipos de esporos sexuados de fungos: Zigósporos, Oósporos, Ascósporos e Basidiósporos. Quando estes são formados dentro de estruturas em forma de saco, conhecidas como ascos, os esporos recebem a denominação de ascósporos, e os fungos são incluídos na divisão Ascomycota. Tais esporos são frequentemente encerrados em um corpo de frutificação, denominado ascocarpo. Os tipos básicos de ascocarpo são: Cleistotécio, Peritécio, Apotécio, Ascostroma. Os esporos sexuados dos fungos pertencentes à divisão Basidiomycota se desenvolvem em estruturas em forma de clava, os basídios. Esses esporos são denominados basidiósporos e geralmente ocorrem em número de quatro por basídio. Quando maduros, os basidiósporos localizam-se na parte externa dos basídios, sobre os esterigmas. Em muitas espécies, os basídios e seus basidiósporos se organizam em corpos de frutificação altamente complexos, denominados basidiocarpos, conhecidos popularmente por cogumelos, orelhas-de-pau e bufos.</p><p>As preparações microscópicas para observação de fungos são de extrema importância, uma vez que a sua identificação depende, em grande parte, da observação de características morfológicas, como o tipo de micélio e de esporos sexuados e assexuados. A classificação dos fungos filamentosos baseia-se, principalmente, no tipo de micélio vegetativo que o fungo apresenta, isto é, cenocítico ou apocítico, e na presença de estruturas de reprodução sexuada e assexuada.</p><p>A seguir são dadas algumas características das divisões que serão abordadas nesta aula prática.</p><p>Reino Fungi - Filos</p><p>Chytridiomycota - Essa divisão apresenta cerca de 1.000 espécies e são considerados os fungos mais basais. A parede celular é composta de quitina e glucanas (polímeros de glicose). Somente os chitridios, apresentam zoósporos flagelados e móveis. Comuns em solos úmidos e no rúmen de animais. Esse filo, juntamente com a Zygomycota, tem sido um dos principais alvos de novas propostas de classificação.</p><p>Zygomycota - Os fungos pertencentes a esse filo caracterizam-se por produzir esporos assexuados endógenos, formados em estruturas chamadas de esporângios. A hifa que sustenta o esporângio é denominada esporangióforo. Ex: Mucor, Rhizopus</p><p>Glomeromycota - São fungos de extrema importância econômica, uma vez que apresentam associação simbiótica obrigatória com plantas, por meio de estruturas conhecidas como arbúsculos, sendo, por isso, conhecidos como fungos micorrízicos arbusculares. Ex: Glomus</p><p>Ascomycota - Apresentam micélio com hifas septadas e a característica que os distingue dos outros fungos é a presença de estrutura chamada asco, que se apresenta na forma de saco, contendo número definido de ascósporos (normalmente oito), resultantes dos processos de plasmogamia, cariogamia e meiose. Em geral, os ascomicetos produzem seus ascos e ascósporos em corpos de frutificação, denominados ascocarpos. Alguns fungos classificados anteriormente como deuteromicetos foram re-classificados e atualmente pertencem ao filo Ascomycota. Além dos fungos filamentosos, encontram-se nesse grupo muitas espécies de fungos leveduriformes. Ex: A levedura Sacharomyces cerevisiae, Aspergillus, Penicillium.</p><p>Basidiomycota - São popularmente conhecidos como cogumelos, bufos, orelhas-de-pau, ferrugens, carvões, etc. Os basidiomicetos diferem dos outros fungos por produzirem seus esporos sexuais (basidiósporos) em estruturas denominadas basídios. Os basidiósporos também são resultantes de plasmogamia, cariogamia e meiose. O seu corpo de frutificação é denominado basidiocarpo. Nesse grupo também estão algumas espécies de fungos classificados anteriormente como deuteromicetos que foram re-classificados na a divisão Basidiomycota. Ex: Pleurotus, Agaricus e algumas leveduras.</p><p>Objetivos</p><p>Observar as estruturas mais importantes para a identificação de alguns fungos, com ênfase nas estruturas que caracterizam cada divisão, como tipo de esporo e estrutura onde os esporos são formados. Atente</p><p>para o tipo de hifa, cenocítica ou septada (como visto na aula passada), pois também é uma característica importante para a classificação.</p><p>Materiais</p><p>Amostras: Lâminas prontas (permanentes) de fungos filamentosos e/ou suas estruturas reprodutivas.</p><p>Meios e Soluções: lactofenol ou azul de metileno.</p><p>Equipamentos e utensílios: microscópios.</p><p>Procedimento</p><p>Visualizar lâminas permanentes de fungos filamentosos, da seguinte maneira:</p><p>1- Manuseie corretamente o microscópio óptico (se você tem dúvida quanto à utilização do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize a lâmina de fungo filamentoso, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;</p><p>2- Observe a organização das hifas e a presença ou ausência de septo (quando possível);</p><p>3- Observe as estruturas reprodutivas;</p><p>4- Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de menor aumento, passando pela objetiva de 10X e abaixe a platina.</p><p>Resultados</p><p>Desenhe as estruturas observadas nas lâminas de fungos filamentosos.</p><p>Filo Zygomycota</p><p>Filo Glomeromycota</p><p>Filo Ascomycota - Reprodução sexuada</p><p>Filo Ascomycota - Reprodução assexuada</p><p>Filo Basidiomycota - Reprodução sexuada</p><p>Exercícios</p><p>1- Descreva as etapas da reprodução sexuada em fungos.</p><p>2- O que são corpos de frutificação?</p><p>3- Complete o quadro abaixo dando as principais características dos filos do reino Fungi.</p><p>Filo</p><p>Micélio</p><p>Tipo de esporo</p><p>Exemplo de Gênero</p><p>Importância</p><p>Chytridiomycota</p><p>Zygomycota</p><p>Glomeromycota</p><p>Ascomycota</p><p>Basidiomycota</p><p>REINO FUNGI CARACTERÍSTICAS GERAIS DE FUNGOS</p><p>Micélio: conjunto ou emaranhado de hifas Crescimento radial: formação de colônia fúngica Hifas: filamento tubular microscópico</p><p>Tipos de hifas:</p><p>-Hifas septadas</p><p>-Hifas não septadas</p><p>Esporo: unidade reprodutiva. Tamanho, forma e cores variadas</p><p>Filo Zigomycota</p><p>Características gerais</p><p>→ Hifas não septadas</p><p>→ Reprodução assexuada: esporangiósporos ou aplanósporos</p><p>→ Reprodução sexuada: zigósporo</p><p>Ex: Rhizopusstolonifer</p><p>Zigósporo</p><p>Filo Glomeromycota</p><p>Fungos endomicorrízicos</p><p>Estruturas: arbúsculos, vesículas e esporos</p><p>Micorriza: associação simbiótica entre fungos filamentosos e raízes de plantas</p><p>Segmento de raiz colonizado por Glomusmosseae.</p><p>Raiz clarificada com KOH e corada com azul de tripan para destacar o tecido fúngico.</p><p>Esporos :Gigaspora margarita (esporos claros/médios), Scutellosporaheterogama</p><p>(esporos marrons/menores) e Gigasporagigantea (esporos amarelos/maiores).</p><p>Azigósporo de Scutellosporagregaria</p><p>Hifa de sustentação	Azigósporo de Acaulosporamorrowae</p><p>Filo Ascomycota</p><p>Características gerais</p><p>→ Hifas septadas</p><p>→ Reprodução sexuada: ascósporo</p><p>→ Reprodução assexuada: conídios</p><p>→ Corpos de frutificação: Peritécio, Apotécio, Cleistotécio e Ascostroma</p><p>Peritecio	Cleistotécio</p><p>Apotécio tipo taça	Apotécio tipo Morel</p><p>(Morchella)Peritecio</p><p>Cleistotécio</p><p>Alternaria</p><p>Conidióforos pigmentados, normalmente curtos ou alongados, produzindo em cadeia simples ou ramificada de conídios. A forma do conídio é variável, grosseiramente elíptica a ovalada. Causa a pinta preta do tomateiro e da batata.</p><p>Aspergillus</p><p>Conidióforos longos terminando em projeção tipo clava, lembrando baquetas. Da projeção irradiam-se fiálides, dispostas em camada simples ou dupla, das quais se projetam cadeias de conídios esféricos. Massa de conídios pode apresentar coloração variada. São saprófitas comuns em produtos armazenados. Alguns podem produzir toxinas</p><p>Cladosporium</p><p>Conidióforos escuros ramificando-se vigorosamente no topo ou acima da porção mediana. Forma variável: oval, cilíndrica ou irregular. Causa queima em curcubitáceas.</p><p>Colletotrichum</p><p>Acérvulos circulares, conidióforo simples. Conídios hialinos, ovais, a oblongos ou falcados. Massa de conídios com coloração rósea. Podem estar presentes no acérvulo setas longas, septadas e pigmentadas. Causa antracnose em vários hospedeiros</p><p>Curvularia</p><p>Conídios escuros geralmente com três septos transversais, curvos em ângulo. Os segmentos internos são normalmente maiores e mais pigmentados que os dois extremos. Causa mancha de folha de milho</p><p>47</p><p>Fusarium</p><p>Conidióforos hialinos de forma variável simples ou ramificados, neste caso curtos e irregulares ou terminando em tufos de fiálides. Conidióforos isolados ou reunidos em esporodóquio. Macroconídio com vários septos transversais, levemente curvos, lembrando uma canoa. Microconídios sem septos e hialinos. As diferentes espécies causam diferentes doenças em plantas.</p><p>Nigrospora</p><p>Conidióforos curtos, com septos e inter-septos mais ou menos dilatados, normalmente pigmentados. Conídio esférico e negro localizando-se em uma vesícula situada no ápice do conidióforo.</p><p>Penicillium</p><p>Conidióforos longos, ramificando-se na parte terminal. Conídios esféricos e catenulados produzidos em fiálides dispostas em número variável na ramificação terminal do conidióforo (conjunto lembra uma vassoura). Massa de conídios com coloração esverdeada. Podridão de frutos cítricos</p><p>48</p><p>Pestalotiopsis</p><p>Conídios com 4 septos transversais, apresentando três secções intermediárias pigmentadas e as duas das extremidades, hialinas</p><p>PAGE 100</p><p>Filo Basidiomycota</p><p>Características gerais</p><p>→ Hifas septadas</p><p>→ Reprodução sexuada: basidiósporo</p><p>→ Reprodução assexuada: conídios</p><p>Basidiósporos</p><p>Prática 5 – Leveduras: morfologia, tipo de reprodução e viabilidade celular</p><p>As leveduras são fungos unicelulares classificadas como ascomicetos ou basidiomicetos, que se reproduzem vegetativamente por brotamento ou fissão, não produzindo corpo de frutificação. O termo levedura sempre foi associado à história do processo fermentativo. O significado da palavra levedura provém do latim “levere” e significa suspender, referindo-se à produção de gás carbônico durante a fermentação, levantando a superfície líquida como uma espuma.</p><p>As leveduras podem ser classificadas em anamórficas ou mitóticas (reproduzem- se assexuadamente por brotamento ou fissão) e teleomórficas ou meióticas (reproduzem- se sexuadamente). Representam um grupo muito heterogêneo de fungos unicelulares, que diferem amplamente nas características morfológicas e fisiológicas. Em leveduras, a reprodução assexuada é a forma primária de aumento do número de indivíduos na população. Há dois modos básicos de reprodução assexuada em leveduras conforme a espécie: fissão ou brotamento. No primeiro caso (por exemplo, em Schizosaccharomyces pombe) ocorre mitose nuclear, seguida de simples divisão celular equitativa. No segundo (por exemplo, em Saccharomyces cerevisiae), paralelamente à mitose nuclear, forma-se na superfície da célula-mãe uma pequena projeção - o broto - que, à medida que cresce, engloba material citoplasmático e um dos núcleos resultantes da mitose. Posteriormente, o broto libera-se da célula-mãe da qual é geneticamente idêntico. Na reprodução sexuada, duas células haplóides de tipos sexuais diferentes podem se fundir formando uma célula com dois núcleos que, eventualmente, se fundem, formando um núcleo diplóide. Esse sofre meiose originando quatro núcleos haplóides e, então, quatro novas células se formarão, cada uma com um dos quatro núcleos haplóides.</p><p>Objetivos</p><p>1. Observar morfologia das colônias de leveduras</p><p>2. Diferenciar leveduras de brotamento e fissão, conhecer as estruturas de formação de ascos e pseudomicélio.</p><p>3. Observar a diferença ao microscópio de leveduras viáveis e inativadas por aquecimento utilizando azul de metileno.</p><p>Materiais</p><p>Microrganismos: Placas de leveduras que apresentem reprodução assexuada e sexuada.</p><p>Meios e soluções: azul de metileno, água destilada</p><p>Equipamentos e utensílios: Microscópio óptico, lâminas, alça de repicagem, bico de Bunsen, bandejas e suportes para lâminas.</p><p>Procedimento</p><p>Lâminas de leveduras para visualização da morfologia celular</p><p>1. Limpe bem uma lâmina com papel;</p><p>2. Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen;</p><p>3. Quando a levedura estiver em meio líquido, transfira assepticamente com a alça de repicagem uma gota</p><p>da cultura de leveduras para o centro da lâmina. Se a cultura estiver em meio sólido, prepare uma suspensão de células da seguinte maneira: Coloque uma gota de água destilada ou azul de metileno sobre a lâmina e colete o material assepticamente, raspando, levemente a superfície do ágar com a alça de repicagem (com cuidado para não retirar pedaços do meio de cultura, pois o crescimento do microrganismo ocorre somente na superfície);</p><p>4. Manuseie corretamente o microscópio óptico (se você tem dúvida quanto à utilização do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize o material, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;</p><p>5. Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina;</p><p>6. Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula nas bandejas com detergente e desinfetante, colocadas na bancada lateral.</p><p>Lâminas de leveduras para visualização da viabilidade celular</p><p>1. Repita os procedimentos do preparo da lâmina descrito anteriormente e faça uma lâmina da levedura fresca em meio líquido e da levedura inativa por aquecimento (fervida)</p><p>2. Visualize a diferença na coloração das leveduras no microscópio.</p><p>Desenhe as estruturas vegetativas e reprodutivas das leveduras observadas no microscópio.</p><p>Observações</p><p>Morfologia da Colônia</p><p>Morfologia das células</p><p>Tipo de reprodução</p><p>MORFOLOGIA DE COLÔNIAS DE LEVEDURAS</p><p>Características macroscópicas</p><p>Saccharomyces cerevisiae</p><p>Pichia	Pichia</p><p>Arxulaadeninivorans</p><p>Torulaspora delbrueckii Saccharomyces kluyveri Candida albicans	Kluyveromyces lactis</p><p>Características microscópicas</p><p>Reprodução Assexuada: Brotamento</p><p>Reprodução assexuada: fissão</p><p>Formação de pseudomicélio:</p><p>(Dias & Schwan, 2010)</p><p>Fotomicrografias de células de leveduras (parte inferior): a) células elipsóides de Kluyveromyces marxianus (microscopia eletrônica de varredura – MEV); b) Ascósporos de Saccharomyces cerevisiae (microscópio óptico, MO, 400x); c) células globosas de S. cerevisiae (MEV); d) células globosas de S. cerevisiae em brotamento unipolar (MO, 400x); e) células globosas de S. cerevisiae em brotamento multipolar (MO 400); f) células cilíndricas de Schizosaccharomyces pombe em fissão (contraste de fase, 100 x). Dias & Schwan, 2010.</p><p>Prática 6 – Isolamento e enumeração de microrganismos</p><p>Nos ambientes naturais os microrganismos se encontram, quase sempre, sob forma de populações mistas. Assim sendo, para que seja possível estudar as características das espécies que compõem estas misturas, é necessário fazer seu isolamento em cultura pura. Uma porção representativa da amostra é transferida, com assepsia, para meio de cultura sólido (ágar) em placas de Petri. Células microbianas contidas na amostra, suficientemente separadas, são imobilizadas no gel de ágar contendo nutrientes e se multiplicam, formando um agregado de células idênticas denominado de colônia. Cultura pura é aquela em que todos os indivíduos se originaram a partir de uma única célula e são mantidas geneticamente idênticas. Quando uma cultura é formada por células de uma mesma espécie, porém, não necessariamente geneticamente idênticas, diz-se que essa cultura é axênica. Na prática, é muito difícil manter uma cultura pura, por causa das mutações que ocorrem numa população elevada de bactérias. Por isso, normalmente uma cultura inicialmente pura será, ao final do tempo de crescimento, uma cultura axênica. Apesar disso, é comum nos referirmos a essas culturas como sendo puras, pelo fato de terem sido obtidas a partir de uma única célula. Os estudos microbiológicos e suas aplicações são efetuados com a população dos microrganismos e não com uma única célula, sendo somente válidos se realizados com culturas puras.</p><p>Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura pura, as mais comumente utilizadas são a técnica de esgotamento e a técnica das diluições em placas. O isolamento em meio de cultura com ágar baseia-se no princípio de que quando se espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter células individuais que crescem em colônias completamente separadas umas das outras. As técnicas utilizadas são: i- de esgotamento do inóculo (estrias); ii- técnica de semeadura por espalhamento (alça de Drigalsky – “Spread Plate”) e, iii- técnica de semeadura em profundidade (“pour-plate”). Normalmente, numa população microbiana mista, a concentração de microrganismos é bastante elevada, sendo necessário fazer diluições sucessivas quando se deseja fazer a contagem em placas e determinar a população viável na amostra. Para isso, realizam-se quantas diluições forem necessárias para que cresça na placa de Petri um número final de colônias entre 30 e 300, o que facilitará a contagem e a estimativa da população microbiana presente. Nesse caso, também, o espalhamento não deve ser feito por meio de estrias, mas aplicando-se uma pequena alíquota conhecida (normalmente 0,1 mL) sobre a superfície do meio sólido e espalhando-se com alça de Drigalsky (“Spread Plate”). Outra opção é a utilização da técnica “Pour Plate”, na qual aplica-se primeiro a alíquota (normalmente 1 mL) e depois se verte o meio liquefeito e resfriado a 50 oC, fazendo-se movimentos rotatórios até que a suspensão de células fique bem distribuída no meio de cultura. O resultado será expresso como UFC (Unidades Formadoras de Colônias) por mililitro da amostra.</p><p>Nesta aula prática será realizado o procedimento de isolamento e enumeração de microrganismos, por meio do método de diluição em placas.</p><p>Objetivos</p><p>1- Realizar diluições seriadas de culturas microbianas ou amostras de solo, para plaqueamento e contagem de colônias, expresso em UFC/mL ou g (Unidades Formadoras de Colônias por mililitro ou grama) da suspensão ou amostra de solo original;</p><p>2- Executar rotina de plaqueamento.</p><p>Materiais</p><p>Meios e culturas: Ágar nutriente fundido, culturas de bactéria ou amostras de solo, Equipamentos e utensílios: Placas de Petri estéreis, bico de Bunsen e alças de repicagem, pipetas para inoculação, tubos de ensaio com 9 mL de solução salina estéril, agitador do tipo vortex para homogeneizar as diluições.</p><p>Procedimento</p><p>Contagem de microrganismos pelo método das diluições em placas</p><p>1- A partir da suspensão de cultura bacteriana ou obtida de amostras de solo, realizar diluições sucessivas, de 10-1 até 10-6, da seguinte maneira: transferir 1 mL da suspensão original para tubo contendo 9 mL de solução salina estéril. Homogeneizar. Essa é a diluição 10-1. A partir desse tubo repetir o procedimento para obter os tubos com as diluições 10-2, 10-3, e assim sucessivamente até 10-6;</p><p>2- A partir da diluição 10-4, proceder a inoculação de 0,1 mL em placa de Petri contendo meio Ágar Nutriente, em triplicata;</p><p>3- Espalhar o inóculo com o auxílio de uma alça de Drigalsky;</p><p>4- Incubar as placas a temperatura ambiente durante 24-48 horas. No caso de se desejar o isolamento de microrganismos que cresçam em temperaturas específicas, será necessário fazer a incubação em estufas ou incubadoras que permitam o controle da temperatura.</p><p>Esquema do procedimento:</p><p>Fonte: Adaptado de Microbiologia de Brock Michael T. Madigan ... [et al.], 2016. ISBN 978-85-8271-298-6</p><p>Resultados</p><p>Faça a contagem das colônias obtidas em cada placa, esquematizando os resultados nos círculos abaixo, e calcule a população total da amostra expressando a contagem em UFC/mL ou (g):</p><p>Grupo</p><p>Diluição</p><p>Número de colônias</p><p>População total</p><p>na amostra</p><p>1</p><p>2</p><p>3</p><p>4</p><p>5</p><p>6</p><p>A ESTIMATIVA DA POPULAÇÃO É DADA PELA FÓRMULA:</p><p>𝐔𝐅𝐂/ 𝐦𝐋 𝐨𝐮 𝐠 =</p><p>Note que:</p><p>𝐌é𝐝𝐢𝐚 𝐝𝐨 𝐧ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐥ô𝐧𝐢𝐚𝐬 𝐩𝐨𝐫 𝐩𝐥𝐚𝐜𝐚 𝐱 𝐅𝐚𝐭𝐨𝐫 𝐝𝐞 𝐝𝐢𝐥𝐮𝐢çã𝐨</p><p>𝐕𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞 𝐝𝐚 𝐚𝐥𝐢𝐪𝐮𝐨𝐭𝐚 (mL)</p><p>Diluição = alíquota/volume final. Exemplo: alíquota de 1 mL adicionada a um tubo contendo 9 mL. Neste caso, o volume final será de 10 mL, portanto, a</p><p>diluição será 1/10</p><p>= 10-1.</p><p>Fator de diluição = 1/volume da alíquota. Exemplo: alíquota de 0,1 mL, o fator de diluição será 1/0,1 = 10. Se a alíquota for de 1 mL, como ocorre, por exemplo na técnica do derramamento, o resultado será 1 e, portanto, nada mudará no resultado final.</p><p>Exercícios</p><p>1- Por que os meios sólidos são preferidos para o isolamento dos microrganismos?</p><p>2- Por que, ao realizarmos contagem em placas, consideramos somente aquelas onde tenham sido formadas entre 30 e 300 colônias?</p><p>3- Qual é a finalidade das diluições seriadas, efetuadas durante o procedimento de enumeração de microrganismos?</p><p>4- A estimativa da população na amostra é de 108 UFC/mL. Determine quantas diluições serão necessárias para que a estimativa populacional em placa, utilizando a técnica de plaqueamento em superfície, seja de 100 colônias.</p><p>5- Com base no esquema abaixo, responda:</p><p>a) Qual a diluição em cada etapa (A-D)?</p><p>b) Qual a diluição total em cada uma das etapas (A-D)</p><p>c) Qual a estimativa da população considerando o plaqueamento na etapa E e F?</p><p>Prática 7 – Obtenção de culturas puras: estrias simples e compostas</p><p>Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura pura, as mais comumente utilizadas são a técnica do esgotamento e a técnica das diluições em placas. O isolamento em meio de cultura com ágar baseia-se no princípio de que quando se espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter células individuais que crescem em colônias completamente separadas umas das outras. As técnicas utilizadas são a de esgotamento do inóculo (estrias) e a técnica semeadura por espalhamento (“Spread Plate”) e semeadura em profundidade (“Pour Plate”).</p><p>Nesta aula prática, será realizado o procedimento para obtenção de cultura pura pelo método do esgotamento do inóculo em superfície de ágar, utilizando estrias simples ou compostas.</p><p>Objetivo:</p><p>Realizar a técnica de isolamento/purificação por estrias simples e compostas de isolados obtidos na aula anterior.</p><p>Meios de cultivo e culturas: Ágar Nutriente liquefeito; cultura de bactérias em placa e meio líquido.</p><p>Equipamentos e utensílios: Placas de Petri com Ágar Nutriente, bico de Bunsen e alças de repicagem.</p><p>Procedimento:</p><p>1- Esterilize a alça de repicagem e espere esfriar atrás da chama;</p><p>2- Transfira assepticamente a suspensão bacteriana contida na alça de repicagem para a superfície do meio de cultura;</p><p>3- Espalhe conforme uma das técnicas: estria simples ou estria composta;</p><p>4- Flambe novamente a alça, deixe-a esfriar no suporte;</p><p>5- Incube as placas em posição invertida, a temperatura ambiente, por 24 horas. Observe o crescimento de colônias isoladas.</p><p>Resultados</p><p>Esquematize o crescimento obtido na superfície da placa estriada.</p><p>Estria simples Estria composta</p><p>Exercício</p><p>1 - Indique uma colônia que você selecionaria para o isolamento. Se você não obteve uma colônia isolada, sugira as possíveis razões para essa falha e o que faria para corrigi-la.</p><p>Prática 8 – Preparações microscópicas fixadas (coloração de Gram)</p><p>Preparações microscópicas fixadas e coradas são úteis para visualizar os microrganismos e diferenciá-los em grupos, para fins de diagnóstico ou de estudos de suas propriedades. Existem várias técnicas de preparação, desde as mais simples, como as preparações a fresco sem coloração, até as que exigem maiores cuidados na montagem, como é o caso das preparações fixadas e coradas. Nas preparações a fresco, em geral, são utilizados corantes que não comprometem a vitalidade das células (não tóxicos). O uso de compostos orgânicos coloridos ou corantes facilita a observação de células de microrganismos. Existem corantes que se ligam a elementos químicos específicos da célula microbiana, corantes que fluorescem, que mudam de cor na presença de reações químicas e corantes que facilitam a visualização. Em geral, os microbiologistas usam preparações coradas para mostrar as diferentes estruturas de microrganismos, para identificar suas estruturas internas e para ajudar a identificar microrganismos similares. Corante é geralmente um sal, em que um dos íons é um cromóforo. Se o cromóforo é positivo, o corante é básico ou catiônico, como por exemplo, o azul de metileno, o cristal violeta e a fucsina. Se o cromóforo é negativo, o corante é ácido ou aniônico, como por exemplo, o ácido pícrico. Corantes básicos são ideais para corar bactérias, porque os ácidos nucléicos e alguns componentes da parede celular apresentam carga negativa e atraem os cromóforos catiônicos. Nas técnicas de coloração simples, células microbianas são inicialmente espalhadas sobre a lâmina, formando um esfregaço; em seguida, são fixadas pelo calor e coradas com um único corante. Essa técnica é útil para visualizar a forma (cocos, bacilo ou espirilo) e o arranjo de células bacterianas. Algumas estruturas internas das células também podem ser visualizadas, como grânulos metacromáticos (polifosfato) e de glicogênio.</p><p>A técnica de coloração diferencial requer o uso de, pelo menos, três reagentes químicos, aplicados sequencialmente sobre o esfregaço fixado. O primeiro reagente é um corante que confere cor a todas as células; o segundo reagente é um descolorante, que pode ou não remover completamente o primeiro corante da célula ou de algumas de suas estruturas. As estruturas descoloradas podem adquirir a cor de um segundo corante, denominado de corante de contraste. Assim, grupos de células ou suas estruturas podem</p><p>ser diferenciados, com base no corante que é retido. Técnicas de coloração diferencial permitem não só a visualização de estruturas como flagelo, cápsula, esporo e núcleo, mas também a separação de microrganismos em grupos. A técnica diferencial mais importante em bacteriologia é a coloração de Gram, que separa as bactérias em dois grandes grupos, Gram-positivo e Gram-negativo, sendo importante para o diagnóstico e classificação das bactérias. A coloração de Gram envolve a aplicação de quatro soluções, conforme descrito a seguir.</p><p>· Cristal violeta (CV), primeiro corante que cora as células de roxo escuro.</p><p>· Lugol ou solução de Iodo (I), é a segunda solução, um mordente que aumenta a interação entre a célula bacteriana e o primeiro corante, formando um complexo insolúvel, Cristal violeta-Iodo (CV-I).</p><p>· Álcool, a terceira solução, é um descolorante. As bactérias Gram positivas, quando lavadas com descolorante, retêm o complexo CV-I e as bactérias Gram negativas perdem o complexo CV-I, ficando incolores. A ação do álcool com removedor do complexo CV- I da célula depende da concentração de lipídeos e da espessura da parede celular bacteriana.</p><p>· O último reagente é o corante de contraste, Safranina ou Fucsina, diferente da cor do cristal-violeta, corando as bactérias Gram-negativas de rosa-avermelhado, mas não altera a cor roxo-escura (azulada) das bactérias Gram-positivas.</p><p>Objetivos</p><p>1- Realizar a técnica de coloração diferencial de Gram e posterior visualização em microscópio;</p><p>2- Diferenciar bactérias de acordo com sua forma e arranjo predominante, além da resposta a coloração de Gram.</p><p>Materiais</p><p>Microrganismos: Cultura de bactérias em meio líquido ou sólido.</p><p>Meios e Soluções: Fucsina ou safranina, cristal violeta, água destilada.</p><p>Equipamentos e utensílios: Microscópio óptico, lâminas, alça de repicagem, bico de Bunsen, bandejas e suportes para lâminas.</p><p>Procedimento</p><p>1- Limpe bem uma lâmina com papel toalha ou higiênico. Nunca passe sobre a chama. Deixe-a sobre um papel na bancada.</p><p>2- Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen e espere esfriar;</p><p>3- Quando a bactéria estiver em meio líquido, transfira assepticamente com a alça de repicagem uma gota da cultura de bactérias para o centro da lâmina. Se a cultura estiver em meio sólido, prepare uma suspensão de células da seguinte maneira: Coloque uma gota de água destilada sobre a lâmina e colete o material assepticamente, raspando, levemente a superfície do ágar com a alça de repicagem (com</p><p>cuidado para não retirar pedaços do meio de cultura, pois o crescimento do microrganismo ocorre somente na superfície);</p><p>4- Prepare o esfregaço, espalhando a suspensão com a alça de repicagem;</p><p>5- Deixe o esfregaço secar ao ar. Nunca passe a lâmina ainda úmida sobre o fogo do bico de Bunsen.</p><p>6- Fixe o esfregaço três vezes, passando o lado oposto ao esfregaço acima da chama do bico de Bunsen. Evite o aquecimento excessivo, para não queimar e distorcer as células;</p><p>7- Deixe a lâmina esfriar;</p><p>8- Inicie a coloração de Gram.</p><p>Respeite o tempo indicado para cada reagente!</p><p>9- Cubra o esfregaço com Cristal Violeta, deixando em repouso por 1 minuto; em seguida, utilizando a piseta, lave com água destilada, gotejando sempre acima do esfregaço e não diretamente sobre o mesmo;</p><p>10- Cubra com solução de Lugol, por um minuto. Lave a preparação, utilizando a piseta com água destilada (evite jato de água sobre o esfregaço, para não o desprender);</p><p>11- Lave a lâmina com etanol 95 %, rapidamente, até que não se desprenda mais corante da preparação;</p><p>12- Lave o excesso de álcool com água;</p><p>13- Cubra o esfregaço com solução de Fucsina, durante 30 segundos;</p><p>14- Lave a lâmina com água. Em seguida deixe secar ao ar.</p><p>15- Manuseie corretamente o microscópio óptico (se você tem dúvida quanto a utilização do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo).</p><p>Focalize o material corado, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;</p><p>16- Trave o microscópio; adicione uma gota de imersão sobre o esfregaço e visualize com a objetiva de 100X, usando o micrométrico.</p><p>17- Terminada a observação, desligue a luz, gire o revólver para encaixar a objetiva de menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina.</p><p>18- Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula nas bandejas com detergente e desinfetante, colocadas na bancada lateral.</p><p>Preparo de lâminas (esfregaço)</p><p>Coloração diferencial de Gram</p><p>Resultados</p><p>Desenhe os campos observados, fazendo distinção entre a forma e o arranjo das bactérias.</p><p>Bactéria</p><p>Gram</p><p>Forma</p><p>Arranjo predominante</p><p>1</p><p>2</p><p>3</p><p>Exercícios</p><p>1- Qual é o propósito da fixação do esfregaço pelo calor?</p><p>2- Cite vantagens e desvantagens da preparação microscópica fixadas e coradas.</p><p>3- Por que os corantes básicos são ideais para corar bactérias?</p><p>4- Por que a coloração de Gram é importante em microbiologia?</p><p>5- Qual é a importância da solução de Lugol (iodo) na coloração de Gram?</p><p>6- Qual a função do álcool na técnica de coloração de Gram?</p><p>Prática 9.1 – Antibiograma: avaliação da sensibilidade de bactérias aos antibióticos</p><p>Os antibióticos são metabólitos produzidos por microrganismos, que mesmo em baixas concentrações, exibem capacidade de ocasionar morte ou inibição do crescimento de outros microrganismos. De modo geral, fungos e actinobactérias (além de outras bactérias) são considerados os principais produtores de antibióticos, porém, ampla faixa desses compostos pode também ser sintetizados quimicamente e alterados em laboratórios farmacêuticos a fim de se evitar resistências e/ou diminuir efeitos colaterais.</p><p>O primeiro antibiótico identificado foi a penicilina. Alexander Fleming, médico microbiologista conduzia pesquisas sobre substâncias capazes de matar ou impedir o crescimento de bactérias nas feridas infectadas de combatentes da Primeira Guerra Mundial (1914 – 1918), que morriam em consequência dessas infecções. Em 1928 Fleming descobriu a penicilina ao observar halos de inibição de crescimento em culturas de estafilococos contaminadas por fungos, o que parecia indicar que aquele fungo produzia uma substância bactericida. O fungo foi posteriormente identificado como Penicillium, dando origem ao nome penicilina, para a substância por ele produzida. A aplicação da penicilina em larga escala ocorreu apenas na década de 1940, principalmente em decorrência da Segunda Guerra Mundial, onde acredita-se ter salvo milhares de vidas.</p><p>Para utilização clínica dos antibióticos é preciso considerar algumas variáveis, como seletividade, dosagem, efeitos na microbiota intestinal, entre outros. A determinação laboratorial da seletividade ou resistência de uma dada bactéria a um ou vários antibióticos é realizada por meio do ensaio chamado antibiograma. O antibiograma pode ser realizado de duas maneiras: por diluição seriada do antibiótico em tubos ou placas ou pelo método de difusão em meio sólido, também conhecido como método de Kirby-Bauer. Por conta da praticidade, este último método é o mais utilizado. Utiliza-se discos de papel de filtro impregnados com doses conhecidas do antibiótico a ser testado, que são colocados em contato com a cultura bacteriana de interesse, na superfície do meio. A placa é incubada nas condições específicas de crescimento da bactéria e a susceptibilidade ou resistência ao antibiótico é avaliada por meio da aferição do diâmetro de halos de inibição em torno dos discos.</p><p>Objetivos</p><p>1- Demonstrar a atividade antimicrobiana de alguns antibióticos;</p><p>2- Visualizar o resultado do teste de antibiograma pelo método de difusão em meio sólido (método de Kirby-Bauer), para determinar a sensibilidade de bactérias a alguns antibióticos.</p><p>Materiais</p><p>Meios e culturas: Placas de Petri contendo ágar nutriente; culturas de bactérias obtidas na aula anterior.</p><p>Reagentes: discos de papel de filtro contendo diferentes antibióticos.</p><p>Descrição do procedimento realizado</p><p>1- Foi transferido, assepticamente, 0,1 mL da suspensão de células para as placas contendo meio sólido. Espalhou-se a alíquota uniformemente sobre o meio de cultura, com o auxílio da alça de Drigalsky, previamente flambada com álcool.</p><p>2- Transferiu-se, de forma asséptica, os discos de papel contendo os antibióticos para a superfície do meio de cultura previamente inoculado com a bactéria. Utilizou-se uma pinça previamente flambada para realizar esse procedimento.</p><p>3- As placas foram incubadas a 37 oC, por 16 a 18 h.</p><p>Resultados</p><p>Observe o crescimento da bactéria nas placas, identificando os halos de inibição em torno do disco de papel. Com o auxílio de uma régua, registre o diâmetro (mm) dos halos no quadro disponível nos resultados. Compare os resultados obtidos com o quadro de referência abaixo (Quadro 1), e avalie se a bactéria é sensível ou resistente a cada um dos antibióticos testados.</p><p>Quadro 1 – Avaliação do diâmetro de halo de inibição de diferentes antibióticos</p><p>Antibiótico</p><p>Concentração no disco (µg)</p><p>Diâmetro do halo de inibição (mm)</p><p>Resistente</p><p>ou =</p><p>Ampicilina</p><p>10</p><p>11</p><p>12-13</p><p>14</p><p>Canamicina</p><p>30</p><p>13</p><p>14-17</p><p>18</p><p>Cloranfenicol</p><p>30</p><p>12</p><p>13-17</p><p>18</p><p>Estreptomicina</p><p>10</p><p>11</p><p>12-14</p><p>15</p><p>Gentamicina</p><p>10</p><p>12</p><p>13-14</p><p>15</p><p>Ácido Nalidíxico</p><p>30</p><p>13</p><p>14-18</p><p>19</p><p>Resultados</p><p>Esquematize o crescimento obtido na superfície da placa. Indique os discos de antibióticos e as zonas de inibição com a informação da área (mm) se foram observadas.</p><p>Exercício</p><p>1- Existem diferenças do modo de ação dos antibióticos contra bactérias Gram positivas e Gram negativas?</p><p>2- Quais os principais mecanismos de ação dos antibióticos sobre as células microbianas e como isso influencia no espectro de ação?</p><p>3- Cite os principais microrganismos produtores de antibióticos. Dê exemplos de alguns gêneros.</p><p>Pratica 9.2 – Alterações genotípicas e fenotípicas em microrganismos</p><p>Ao conjunto de informações genéticas em uma célula damos o nome de genoma. O genótipo de um organismo é sua coleção de genes: a informação que codifica todas as características particulares do organismo. O fenótipo refere-se às propriedades expressas. Podemos dizer que o fenótipo é a manifestação do genótipo.</p><p>Uma mutação corresponde à alteração de natureza herdável na sequência de bases do genoma, que é passada da célula-mãe para sua progênie. As mutações podem ser espontâneas ou induzidas. Mutações espontâneas são aquelas que ocorrem ao acaso, que ocorrem sem uma causa aparente. A maior parte dessas mutações é decorrente de erros durante a replicação do DNA. Mutações</p>de 100 mg/mL de estreptomicina para inibição de bactérias.
	23.
	Caldo lactose
	
	
	Extrato de carne
	3,0 g
	
	Peptona
	5,0 g
	
	Lactose
	10,0 g
	
	H2O destilada
	1.000 mL
	
	pH 6,8 - 7,0
	
24. Eosina Azul de Metileno (Agar)
Peptona	10,0 g
Lactose	10,0 g
Fosfato dipot. (K2HPO4)	2,0 g Ágar	15,0 g
Eosina Y	0,4 g
Azul de metileno	0,065 g
H2O destilada	1.000 mL Esterilizar 115 °C por 15 a 20 minutos.
25. Solução Sacarose
- Para preparação de esporos de fungos endomicorrízicos e nematóides Sacarose	454 g
H2O destilada	1.000 ml
26. Caldo Lactosado verde Bile Brilhante 2%
Peptona	10,0 g
Lactose	10,0 g
Bile de boi desidratada	20,0 g Verde Brilhante	0,0133 g
H2O destilada	1.000 mL
27. Caldo Indol
Triptona	5,0 g
NaCl	2,5 g
H2O destilada	1.000 mL
28. Indicador de Andrade
Fucsina ácida	1,0 g
H2O destilada	200 mL
29. Agar acetato para esporulação de leveduras
Extrato de levedura	2.5 g/l
Dextrose	1.0 g/l
Acetato de potássio	10 g/l
Agar	20g/l
pH (25 °C)	6,4±0.2
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