Apostila Biotecnologia UENF

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<p>APOSTILA: FUNDAMENTOS EM BIOTECNOLOGIA</p><p>Editores:</p><p>Dra. Claudete Santa-Catarina</p><p>Professora Associada – LBCT/CBB/UENF</p><p>Dr. Vanildo Silveira</p><p>Professor Associado LBT/CBB/UENF</p><p>Dr. Álvaro Fabrício Lopes Rios</p><p>Professor Associado LBT/CBB/UENF</p><p>Dra. Marília Amorim Berbert de Molina</p><p>Professora Associada LBT/CBB/UENF</p><p>Aline Martins de Vita</p><p>Biológa – CBB/UENF</p><p>Vanessa de Souza Rodrigues</p><p>Graduanda Ciências Biológicas – CBB/UENF</p><p>Equipe do projeto Extensão:</p><p>M.Sc. Tatiana Barroso Chiquieri</p><p>Doutoranda em Biociências e Biotecnologia – CBB/UENF</p><p>Nayara Justo Nogueira</p><p>Graduanda Licenciatura em Ciências Biológicas – CEDERJ/UENF</p><p>Telma Ferreira Costa Aguiar</p><p>Técnica em Química - LBT/CBB/UENF</p><p>Apoio:</p><p>UENF – Universidade Estadual do Norte Fluminense</p><p>PROEX - Pró-Reitoria de Exensão - UENF</p><p>FAPERJ - (Auxílio ao Projeto Extensão - Processo E-26/111.109/2010)</p><p>Arte:</p><p>ASCOM - UENF</p><p>Primeira Edição: Setembro/2011</p><p>Campos dos Goytacazes – RJ</p><p>2011</p><p>iii</p><p>SUMÁRIO</p><p>INTRODUÇÃO .................................................................................................. 1</p><p>CAPÍTULO 1 - BIOTECNOLOGIA VEGETAL .................................................. 9</p><p>1. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS ............................................................................................ 11</p><p>2. PARÂMETROS ESSENCIAIS PARA A MANIPULAÇÃO DAS CULTURAS DE TECIDOS</p><p>VEGETAIS......................................................................................................................................... 14</p><p>2.1. Explantes ................................................................................................................................ 14</p><p>2.2. Assepsia .................................................................................................................................. 15</p><p>2.3. Condições de incubação ......................................................................................................... 16</p><p>2.4. Meio de cultura ........................................................................................................................ 16</p><p>2.4.1. Meio de cultura semi-sólido ............................................................................................... 17</p><p>2.4.2. Meio de cultura líquido ...................................................................................................... 18</p><p>3. FATORES QUE INFLUENCIAM NO ESTABELECIMENTO DA CULTURA ................................. 19</p><p>3.1. Oxidação fenólica .................................................................................................................... 19</p><p>3.2. Densidade mínima de inoculação ............................................................................................ 19</p><p>4. MICROPROPAGAÇÃO ................................................................................................................. 20</p><p>4.1. Estágios da micropropagação ................................................................................................. 20</p><p>4.2. Vantagens da micropropagação .............................................................................................. 22</p><p>4.3. Desvantagens da micropropagação ........................................................................................ 22</p><p>5. PRINCIPAIS METODOLOGIAS DA MICROPROPAGAÇÃO ........................................................ 22</p><p>5.1. Organogênese direta ............................................................................................................... 22</p><p>5.1.1 Estágios da organogênese direta ....................................................................................... 23</p><p>Figura 3. Estágios da organogênese direta a partir de meristemas ou segmentos nodais.</p><p>(Modificada de George, 2008) ................................................................................................. 23</p><p>5.2. Organogênese indireta ............................................................................................................ 23</p><p>5.2.1. Estágios da organogênese indireta ................................................................................... 24</p><p>6. EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA ...................................................................................................... 24</p><p>6.1. Estágios da embriogênese somática ....................................................................................... 25</p><p>6.2. Vantagens da embriogênese somática .................................................................................... 28</p><p>iv</p><p>6.3. Limitações/Desvantagens da embriogênese somática ............................................................ 28</p><p>7. APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE MICROPROPAGAÇÃO ........................................................ 29</p><p>7.1. Produção de sementes sintéticas ............................................................................................ 29</p><p>7.2. Conservação de germoplasma ................................................................................................ 29</p><p>7.3. Produção de metabólitos secundários ..................................................................................... 30</p><p>7.4. Micropropagação de espécies de interesse ............................................................................. 31</p><p>8. TRANSGÊNESE EM PLANTAS .................................................................................................... 32</p><p>8.1. Princípios da Transformação Gênica ....................................................................................... 34</p><p>8.2. Transformação por Agrobacterium tumefaciens ...................................................................... 36</p><p>8.3. Eletroporação de protoplastos ................................................................................................. 36</p><p>8.4. Biobalística .............................................................................................................................. 37</p><p>8.5. Dificuldades na Transformação Gênica em Plantas ................................................................ 37</p><p>8.6. Potencial da transformação gênica .......................................................................................... 38</p><p>8.6.1. Adição de novas ou diferentes funções ............................................................................. 38</p><p>8.6.2. Adição de novas características ........................................................................................ 39</p><p>8.6.3. Biorremediação ................................................................................................................. 39</p><p>8.6.4. Fármacos .......................................................................................................................... 39</p><p>8.6.5. Alteração no desenvolvimento ou morfologia do indivíduo ................................................ 39</p><p>9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 39</p><p>CAPÍTULO 2 - BIOTECNOLOGIA ANIMAL ................................................... 41</p><p>1. ESTRUTURA DOS GENES ........................................................................................................... 41</p><p>2. AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DA ENGENHARIA GENÉTICA ....................................................... 43</p><p>2.1. Clonagem do gene .................................................................................................................. 43</p><p>2.2. Sequenciamento do DNA ........................................................................................................ 44</p><p>2.3. Amplificação gênica in vitro ..................................................................................................... 44</p><p>2.4. Construção gênica ...................................................................................................................</p><p>(explantes) removidos da planta-matriz ou indiretamente de células</p><p>desorganizadas (culturas em suspensão) ou tecidos (culturas de calos) estabelecidos pela</p><p>proliferação de células internas dos explantes.</p><p>4.1. Estágios da micropropagação</p><p>A micropropagação pode ser dividida em cinco estágios básicos, desde a escolha da planta</p><p>utilizada como planta doadora ao estabelecimento dos novos propágulos no ambiente natural.</p><p>Estágio 0: Seleção da planta-mãe e preparação do material. Nesse estágio, uma atenção</p><p>cuidadosa deve ser dada à seleção das plantas estoque. Elas devem representar a qualidade do</p><p>genótipo a ser multiplicado, além de estar com qualidade fitossanitária e nutricional, livre de doenças</p><p>e microorganismos. O sucesso da cultura in vitro pode ser garantido pelo tratamento prévio da planta</p><p>escolhida (ou parte dela), utilizando-se quando possível, a transferência para a casa de vegetação.</p><p>Métodos para detectar e reduzir ou eliminar doenças virais ou bacterianas sistêmicas devem ser</p><p>utilizados.</p><p>Estágio I: Estabelecimento de uma cultura asséptica. O segundo passo do processo de</p><p>micropropagação é obter uma cultura asséptica do material vegetal selecionado. O sucesso desse</p><p>estágio primeiramente está relacionado com a escolha adequada do explante e a assepsia adequada</p><p>dos mesmos. Os explantes serão transferidos do ambiente de cultivo da planta matriz para condição</p><p>in vitro, em condições assépticas, livre de contaminantes microbianos, que em condições nutricionais</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>21</p><p>e ambientais adequadas iniciarão a resposta morfogenética desejada (por exemplo, crescimento de</p><p>ápice caulinar ou formação de calos).</p><p>Para este estágio é necessário estabelecer a metodologia adequada para a assepsia dos</p><p>explantes a serem inoculados in vitro. Para a assepsia utiliza-se a lavagem dos explantes com</p><p>agentes desinfestantes (água sanitária, hipoclorito de sódio, álcool 70%, entre outros), com tempos</p><p>variáveis para cada tipo de explante e para cada espécie, seguidos de lavagens com água destilada</p><p>autoclavada para a retirada destes compostos utilizados.</p><p>Em seguida, um conjunto de explantes é transferido para o cultivo in vitro ao mesmo tempo.</p><p>Após um curto período de incubação, qualquer recipiente que contenha explantes ou meio de cultura</p><p>contaminados devem ser descartados. Esse estágio é considerado satisfatório se um número</p><p>adequado de explantes tenha sobrevivido ao processo de assepsia, sem ocorrer a contaminação e</p><p>desenvolvem o seu crescimento in vitro.</p><p>Estágio II: A produção e multiplicação de propágulos. O objetivo desse estágio é a</p><p>produção de novas plantas ou propágulos que, quando separados da cultura são capazes de originar</p><p>plantas inteiras. De acordo com a técnica in vitro que está sendo utilizada, a multiplicação pode</p><p>ocorrer a partir de brotos adventícios ou axilares, embriões somáticos. Os propágulos produzidos</p><p>neste estágio são usados em ciclos repetitivos de multiplicação nos quais eles são subcultivados</p><p>para aumentar o seu número.</p><p>Estágio III: Preparação para o crescimento no ambiente natural. Plântulas oriundas de</p><p>embriões somáticos ou brotos derivados do estágio 2 são pequenos e ainda não são capazes de se</p><p>auto-sustentarem no solo. Neste estágio alguns passos são dados para crescer plântulas individuais</p><p>ou em conjunto, capazes de realizar a própria fotossíntese e de sobreviver sem um suprimento</p><p>artificial de carboidrato. Algumas plântulas oriundas de embriões somáticos precisam ser</p><p>especialmente tratadas nesse estágio, para terem um crescimento maior para poderem ser</p><p>transferidas para o viveiro. Neste estágio inclui ainda o enraizamento in vitro de brotos para a sua</p><p>transferência ao solo, sendo uma fase importante para o sistema de propagação in vitro. É</p><p>necessário induzir o enraizamento utilizando-se meio de cultura suplementado com reguladores de</p><p>crescimento (ácido indol butírico, por exemplo) ou compostos (como carvão ativado) para induzir a</p><p>formação das raízes.</p><p>Estágio IV: Transferência para o ambiente natural. Os métodos pelos quais as plântulas</p><p>são transferidas do ambiente in vitro para o ex vitro são extremamente importantes. Se não ocorrer</p><p>de forma adequada, esta transferência pode resultar em perda significativa do material propagado.</p><p>Este estágio é uma fase crítica do processo, uma vez que os brotos desenvolvidos na cultura in vitro</p><p>são produzidos em condições com alta umidade e baixa intensidade de luz. Neste caso, os</p><p>estômatos das folhas produzidas in vitro geralmente não são funcionais, por não ter necessidade de</p><p>regular a abertura dos mesmos na condição exposta. Adicionalmente, a suplementação com a</p><p>sacarose e a manutenção em baixas condições de luz, as plântulas micropropagadas não são</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>22</p><p>totalmente dependentes da fotossíntese. Na prática, as plântulas são transferidas do estágio 3,</p><p>sendo então mantidas em solo composto por substrato comercial em um ambiente com alta umidade</p><p>e intensidade luminosa reduzida, visando a aclimatação. Esta etapa é fundamental para que as</p><p>novas plântulas possam emitir novas raízes e se aclimatar às condições extra vitro. A aplicação de</p><p>vapor de água é muito efetiva para manutenção da umidade no ambiente, reduzindo as perdas na</p><p>sobrevivência pela falta de água.</p><p>4.2. Vantagens da micropropagação</p><p>Uma das grandes vantagens da micropropagação se refere à grande quantidade de</p><p>propágulos obtidos a partir de explantes pequenos utilizados para dar início à cultura, permitindo</p><p>assim a propagação clonal massal. A necessidade de um pequeno espaço físico para manter e</p><p>multiplicar as plantas propagadas in vitro também constitui uma das vantagens da técnica. O fato de</p><p>a micropropagação se desencadear em um ambiente asséptico também é vantajoso no intuito de se</p><p>obter plantas livres de doenças. Além disso, destaca-se a possibilidade de ajuste dos fatores que</p><p>influenciam a propagação in vitro, tais como nutrientes e concentrações de reguladores de</p><p>crescimento, luz e temperatura. Dessa forma, a taxa de propagação in vitro pode ser muito maior</p><p>quando comparada à propagação convencional, e pode acontecer durante o ano todo, não sendo</p><p>dependente das mudanças de estação.</p><p>4.3. Desvantagens da micropropagação</p><p>Uma desvantagem da micropropagação se refere à instalação especializada e de alto custo</p><p>para a propagação de novas plântulas. Destaca-se ainda que estudos específicos geralmente são</p><p>necessários para obter resultados otimizados para cada espécie ou variedade, sendo assim</p><p>necessário o estabelecimento de protocolos para cada espécie. Além disso, destaca-se a</p><p>necessidade de pessoal técnico especializado e treinado na área de biotecnologia para o</p><p>desenvolvimento das atividades.</p><p>5. PRINCIPAIS METODOLOGIAS DA MICROPROPAGAÇÃO</p><p>5.1. Organogênese direta</p><p>Em determinadas espécies, gemas ou primórdios de gemas pré-existentes são induzidos à</p><p>proliferação. A indução da regeneração direta de brotos depende da natureza do órgão vegetal de</p><p>onde o explante foi retirado e é amplamente dependente do genótipo da planta. Em plantas</p><p>responsivas, brotos adventícios podem ser formados in vitro em partes do tecido derivado de vários</p><p>órgãos (folhas, segmentos nodais, pétalas de flores ou raízes), já em outras espécies eles ocorrem</p><p>em um número limitado de tecidos tais como escamas de bulbos, embriões zigóticos ou tecidos de</p><p>plântulas recém germinadas. Para algumas espécies, a morfogênese direta é raramente observada</p><p>ou desconhecida.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>23</p><p>5.1.1 Estágios da organogênese direta</p><p>A organogênese direta é obtida através dos seguintes estágios (Figura 3):</p><p>Estágio I: consiste no estabelecimento in vitro de explantes de tecido livres de qualquer</p><p>contaminação. Os explantes a serem utilizados podem ser segmentos nodais ou meristemas apicais.</p><p>Estágio II: é reconhecido pela formação, crescimento e proliferação de brotos adventícios a</p><p>partir</p><p>do explante primário. Subcultivos subseqüentes devem ser estabelecidos a partir de brotos</p><p>individuais. Brotos adventícios, algumas vezes, surgem diretamente das folhas das plantas durante a</p><p>cultura. A formação de brotos adventícios de determinadas plantas ocorre em grandes recipientes de</p><p>meio líquido aerado, permitindo uma escala de propagação muito elevada.</p><p>Estágio III: similar ao estágio III da maioria dos outros sistemas de micropropagação. Brotos</p><p>individuais ou conjuntos de brotos são transferidos para um meio nutritivo com adição de reguladores</p><p>de crescimento e ingredientes que não induza a proliferação adicional de brotos e que promova o</p><p>enraizamento. Como alternativa, os brotos podem ser removidos da cultura e enraizados ex vitro</p><p>(Figura 3).</p><p>Figura 3. Estágios da organogênese direta a partir de meristemas ou segmentos nodais. (Modificada de George, 2008)</p><p>5.2. Organogênese indireta</p><p>Na organogênese indireta, novas gemas e eixos caulinares são induzidos a partir de tecidos</p><p>não organizados (calos) originados a partir de explantes de diferentes tipos. A propagação por</p><p>organogênese indireta é utilizada devido o seu potencial como método de propagação, uma vez que</p><p>a ocorrência de variação genética pode ser controlada, o que é de fundamental importância para a</p><p>regeneração e propagação de plantas geneticamente modificadas.</p><p>Fundamentalmente, o ajuste do balanço de reguladores de crescimento no meio de cultura</p><p>pode levar à formação de brotos ou raízes em calos de um grande número de espécies diferentes, o</p><p>que vai depender do tipo de explante utilizado para a indução.</p><p>No entanto, as culturas de calos podem variar quanto ao seu potencial ou competência</p><p>morfogenética, sendo dependente do tipo de explante utilizado para a indução. Por conta disso, calos</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>24</p><p>originados de determinadas espécies ou tipos de explantes podem não ser responsivos à sinalização</p><p>celular, não resultando na morfogênese. Esta resposta é dependente do tipo de explante utilizado e</p><p>da espécie a ser estudada. Usualmente, denomina-se calo não-morfogenético para aquele que não</p><p>resulta em resposta morfogenética quando submetido à sinalização celular, ou pode ser um calo</p><p>morfogenético, que contrariamente, resulta na resposta morfogenética uma vez submetido à</p><p>sinalização adequada. Na cultura in vitro, pode-se obter várias linhagens de calos com diferentes</p><p>características morfogenéticas. Em alguns casos, linhagens de calos com diferentes aparências</p><p>(textura, coloração etc) e/ou capacidades morfogenéticas podem ser isolados do mesmo explante.</p><p>Essas diferenças podem refletir o potencial epigenético das células ou ser causado pela variabilidade</p><p>genética entre as células da cultura. De acordo com Street (1979), explantes primários podem ser</p><p>compostos de células ou tecidos capazes de regenerarem a resposta morfogenética, sendo</p><p>designado de células competentes, e outros que são incapazes, sendo, portanto, chamado de</p><p>células não-competentes. Neste sentido, é fundamental o estudo para estabelecer as melhores</p><p>condições in vitro, como meio de cultura e seus componentes, para que ocorra a expressão do</p><p>potencial morfogenético das células do explante.</p><p>5.2.1. Estágios da organogênese indireta</p><p>Estágio I – indução de calos: o crescimento do calo é geralmente iniciado inoculando-se o</p><p>explante escolhido em um meio semi-sólido no qual a auxina é incorporada em concentrações</p><p>relativamente altas, com ou sem o balanço com citocinina. Como mais de um tipo de calo pode ser</p><p>originado a partir de um único explante, o sucesso da propagação pode depender do reconhecimento</p><p>deste calo que será capaz de originar brotos ou embriões somáticos.</p><p>Estágio II – obtenção e multiplicação de brotações: uma vez que o calo morfogenético foi</p><p>isolado, a multiplicação ocorre tanto pelo subcultivo do calo ou pela obtenção de suspensões</p><p>celulares. Para a multiplicação de calos em meio de cultura semi-sólido, é realizada a subdivisão de</p><p>calos, o qual é separado em pedaços menores que se tornam maiores quando subcultivados em</p><p>meio de cultura apropriado. Para a obtenção de suspensões celulares, calos são colocados para</p><p>crescer em meio de cultura líquido, visando uma taxa rápida de multiplicação a partir de calos</p><p>competentes. Após esta multiplicação, as células em suspensão celular podem então serem</p><p>colocadas para produzir novas colônias de calos em meio de cultura semi-sólido, visando a</p><p>regeneração. A etapa de regeneração necessita de um balanço entre os reguladores de crescimento</p><p>que permitam a regeneração.</p><p>6. EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA</p><p>A embriogênese zigótica em plantas se inicia com a formação do zigoto diplóide na dupla</p><p>fecundação, e passa por uma sequência de estágios característicos, os quais são denominados</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>25</p><p>sequencialmente como globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar. Por outro lado, a embriogênese</p><p>somática é um processo análogo à embriogênese zigótica, no qual uma célula somática isolada ou</p><p>um pequeno grupo de células somáticas são os precursores da formação de embriões somáticos</p><p>(Tautorus et al., 1991). Os embriões somáticos se assemelham morfologicamente aos embriões</p><p>zigóticos, passando pelos estágios similares, sendo bipolares, ou seja, meristema apical do caule e</p><p>da raiz em pólos contrários.</p><p>A embriogênse somática ocorre naturalmente em poucas espécies, dentro de óvulos (por</p><p>exemplo, Paeonia) e mais raramente em folhas (por exemplo, Asplenium e Kalanchoe). Desde a</p><p>primeira observação de formação de embriões somáticos em suspensões de Daucus carota celular</p><p>por Steward et al. (1958) e Reinert (1958) o potencial para a embriogênese somática na cultura in</p><p>vitro foi mostrado para uma grande quantidade de espécies. Durante os últimos 40 anos, a</p><p>embriogênese somática tem sido descrita em um grande número de espécies, e métodos</p><p>modificados utilizados para a indução de culturas embriogênicas são continuamente relatados.</p><p>Ressalta-se que embriões somáticos são utilizados como um sistema modelo em vários</p><p>estudos morfogenéticos. Porém, o maior interesse na obtenção destes embriões somáticos está na</p><p>sua aplicação prática para a propagação vegetativa em larga escala, principalmente por causa da</p><p>possibilidade de ampliar a propagação usando biorreatores. Além disso, na maioria dos casos, os</p><p>embriões somáticos ou culturas embriogênicas podem ser criopreservados, o que torna possível</p><p>estabelecer bancos de linhagens celulares e germoplasma. Culturas embriogênicas também são um</p><p>alvo atraente para a transformação genética.</p><p>A embriogênese somática pode ser obtida para todas as espécies de plantas, desde que seja</p><p>utilizado o explante apropriado, e sejam utilizados os meios de cultura e as condições ambientais</p><p>adequadas. Desta forma, a embriogênese somática pode ser direta, quando os embriões somáticos</p><p>se diferenciam diretamente do explante sem a fase de calos, ou indireta quando os embriões</p><p>somáticos se diferenciam após a indução de calos no explante. Os explantes dos quais a</p><p>embriogênese direta é induzida incluem micrósporos, óvulos e embriões zigóticos. Um caso especial</p><p>de embriogênese somática direta é o processo que geralmente é classificado como embriogênese</p><p>secundária, também chamada de contínua ou acessória, em que o primeiro embrião somático</p><p>formado falha em se desenvolver em uma plântula e dá origem a ciclos sucessivos de produção de</p><p>embriões secundários, terciários etc. Se embriões somáticos formados diretamente sob o explante</p><p>são convertidos em plântulas não é possível a sua multiplicação.</p><p>Na embriogênese indireta, os calos formados podem ser embriogênicos ou não-</p><p>embriogênicos, os quais podem ser facilmente distinguidos baseados na morfologia e coloração.</p><p>6.1. Estágios da embriogênese somática</p><p>Para se obter a resposta positiva neste processo, uma série de estágios e tratamentos deve</p><p>ser aplicada (Figura 4). Atenção deve ser</p><p>dada no desenvolvimento destes tratamentos e</p><p>compreensão de seu mecanismo de ação, visando obter o maior número de embriões somáticos que</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>26</p><p>apresentem ao mesmo tempo a maior taxa de germinação e conversão de embriões somáticos em</p><p>plântulas. Conseqüentemente, o crescimento ex vitro de plantas de embriões somáticos está sob</p><p>uma influência cumulativa dos tratamentos previstos durante a fase in vitro.</p><p>Figura 4. Estágios de desenvolvimento da embriogênese somática e sua modulação. (Modificado de Steiner et al., 2008).</p><p>A regeneração de plantas via embriogênese somática inclui cinco estágios, de acordo com</p><p>George (2008):</p><p>Estágio I: Indução de culturas embriogênicas - Início das culturas embriogênicas pelo</p><p>cultivo de explantes primários em meio de cultura suplementado com reguladores de crescimento</p><p>vegetal como auxina em grandes concentrações, principalmente o ácido 2,4-diclorofenoxiacético</p><p>(2,4-D) sendo algumas vezes balanceado com concentrações de citocinina, dentre elas</p><p>benziladeninopurina (BAP). A indução de embriogênese somática deve consistir no encerramento de</p><p>um padrão atual de expressão gênica no tecido do explante e sua substituição por um programa de</p><p>expressão gênica embriogênico. Os reguladores de crescimento vegetal e estresse têm um papel</p><p>central na mediação da cascata de transdução de sinal que leva à reprogramação da expressão</p><p>gênica. Isso resulta em uma série de divisões celulares que induzem o crescimento tanto do calo</p><p>desorganizado ou no crescimento polarizado levando a embriogênese somática. O início da via</p><p>embriogênica é restrito apenas a determinadas células sensíveis que têm o potencial para ativar os</p><p>genes envolvidos na geração de células embriogênicas. Apenas algumas células do explante</p><p>primário são competentes para a indução embriogênica, que segundo Dudits et al. (1995) pode ser o</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>27</p><p>resultado de sensibilidade dessas células à diferentes auxina. Auxinas sintéticas são normalmente</p><p>utilizadas para iniciar culturas embriogênicas, e um provavelmente mecanismo pelo qual auxina pode</p><p>regular a embriogênese é através da acidificação do citoplasma e da parede celular (Kutschera,</p><p>1994). Mais comumente usado é 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético). No entanto, em alguns</p><p>casos, é necessário combinar diferentes auxinas e citocinina (baixa concentração).</p><p>Estágio II: Proliferação das culturas embriogênicas - Esta fase é obtida em meio semi-</p><p>sólido ou em suspensões celulares suplementado com auxinas em baixas concentrações.</p><p>Uma vez que as células embriogênicas são formados, eles continuam a proliferar. Calos</p><p>embriogênicos são mantidos em um meio semelhante ao utilizado para a indução. A auxina é</p><p>necessária para a proliferação mas é um inibidor para o desenvolvimento de embriões somáticos. O</p><p>grau de diferenciação do embrião na presença de auxina varia em diferentes espécies, e a depleção</p><p>de auxina no meio de cultura que inicia-se após alguns dias promoverá o desenvolvimento dos</p><p>embriões se as culturas não são transferidas para meio novo a cada semana. As culturas podem ser</p><p>mantidas em meio semi-sólido para seu aumento, porém, para a multiplicação em grande escala é</p><p>recomendado estabelecer suspensões celulares. Além do fato de que a taxa de proliferação é maior</p><p>em culturas em suspensão, outra vantagem é que as culturas tornam-se mais sincronizados. O pH</p><p>baixo do meio de cultura é essencial para manter as culturas em fase de proliferação. Culturas</p><p>embriogênicas de algumas espécies e alguns genótipos podem ser repicadas por um período</p><p>prolongado em meio contendo reguladores de crescimento vegetal, e ainda manter o seu potencial</p><p>embriogênico, ou seja, a capacidade para produzir embriões somáticos maduros que podem se</p><p>desenvolver em plantas. No entanto, o risco de aumentar a taxa de variação somaclonal aumenta.</p><p>Estágio III: Pré-maturação de embriões somáticos – iniciada em meio sem regulador de</p><p>crescimento, o que inibe a proliferação e estimula a formação de embriões somáticos e o início do</p><p>desenvolvimento. A compreensão da transição de massas pró-embriogênicas para embriões</p><p>somáticos, entre a proliferação de culturas embriogênicas e o desenvolvimento embrionário</p><p>organizado, desempenha um papel importante. Parece provável que a incapacidade de muitas</p><p>linhagens de células embriogênicas se desenvolverem em embriões somáticos está na grande</p><p>maioria associada a esta transição. Auxinas sintéticas, tais como 2,4-D, que são particularmente</p><p>eficazes para promover a criação e proliferação de culturas embriogênicas, geralmente não são</p><p>metabolizadas pelas células da mesma forma como auxinas natural. Assim, para estimular um maior</p><p>crescimento dos embriões somáticos é necessário transferir as culturas embriogênicas para meio</p><p>sem auxina por um período para posterior transferência para a maturação dos embriões (estágio IV).</p><p>Esta etapa auxilia também na sincronização do desenvolvimento dos embriões somáticos.</p><p>Estágio IV - Maturação de embriões somáticos - este estágio ocorre pelo cultivo das</p><p>culturas embriogênicas em meio suplementado com agentes promotores de maturação como ácido</p><p>abscísico (ABA) e/ou redução do potencial osmótico, com o uso de polietilenoglicol (PEG) e maltose.</p><p>Durante o estágio de maturação de embriões somáticos estes sofrem alterações morfológicas e</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>28</p><p>bioquímicas. Os cotilédones, órgãos de armazenamento, expandem concomitante com a deposição</p><p>de compostos de armazenamento, a repressão de germinação e na aquisição de tolerância à</p><p>dessecação. Embriões somáticos acumulam compostos de armazenamento que apresentam as</p><p>mesmas características que as dos embriões zigóticos. Dentre os compostos, ocorre a síntese e</p><p>deposição proteínas de reserva e proteínas LEA (late embryogenesis abundant proteins) durante a</p><p>embriogênese somática, assim como é observada na embriogênese zigótica, as quais são reguladas</p><p>pela expressão de genes induzidos pelo ABA e estresse osmótico (pela aplicação de PEG e</p><p>maltose). Em algumas espécies, o tratamento de maturação é seguido por uma dessecação parcial o</p><p>estimula a frequência de germinação de embriões somáticos. É sugerido que na dessecação ocorre</p><p>a redução dos níveis endógenos de ABA, um inibidor do processo germinativo.</p><p>Estágio V: Regeneração de plantas - em meio sem reguladores de crescimento.</p><p>Embriogênese somática é um processo complexo onde a qualidade do produto final, ou seja, a</p><p>sobrevivência e o crescimento das plantas regeneradas dependem das condições previstas nas</p><p>fases anteriores, quando os embriões somáticos maduros são formados e germinam. Portanto, a fim</p><p>de desenvolver a propagação em massa de plantas a partir de embriões somáticos, um</p><p>monitoramento dos fatores críticos que possam contribuir para o desempenho ex vitro de plantas é</p><p>necessário. Apenas os embriões maduros que se acumularam compostos de reserva suficiente e</p><p>tenham adquirido tolerância à dessecação no final de maturação se desenvolvem em plantas</p><p>normais.</p><p>6.2. Vantagens da embriogênese somática</p><p>Comparando-se às demais técnicas de micropropagação, como a organogênese, a</p><p>embriogênese somática apresenta as seguintes vantagens: a) permite a obtenção de uma grande</p><p>quantidade de propágulos (os embriões somáticos); b) o sistema permite um alto grau de</p><p>automatização, permitindo baixar os custos por unidade produzida, através da utilização de</p><p>biorreatores; c) os embriões somáticos podem ser produzidos de forma sincronizada, com alto grau</p><p>de uniformização e pureza genética; d) pode ser utilizada como uma ferramenta integrada a</p><p>programas de melhoramento genético, em especial quando associada às técnicas de</p><p>criopreservação e engenharia genética.</p><p>6.3. Limitações/Desvantagens da embriogênese somática</p><p>Entretanto, a principal limitação dos sistemas de embriogênese somática, desenvolvidos para</p><p>várias espécies, é a escassez de protocolos</p><p>otimizados de maturação, a qual acontece</p><p>principalmente em espécies arbóreas, obtendo uma baixa taxa de conversão dos embriões</p><p>somáticos em plântulas de determinadas espécies. Adicionalmente, a variação somaclonal ocorrida</p><p>após sucessivas subculturas, afetando o desenvolvimento das plantas produzidas é uma</p><p>desvantagem.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>29</p><p>7. APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE MICROPROPAGAÇÃO</p><p>7.1. Produção de sementes sintéticas</p><p>Sementes sintéticas ou sementes artificiais são propágulos (embriões somáticos)</p><p>encapsulados artificialmente que podem ser usadas para a propagação, mimetizando a semente</p><p>verdadeira, uma vez que elas podem ser semeadas e possuem a habilidade de se converter em uma</p><p>planta em condições in vitro ou ex vitro, além de reterem esse potencial até mesmo após</p><p>armazenamento.</p><p>A tecnologia do encapsulamento é uma crescente área da pesquisa em biotecnologia que</p><p>possui um grande impacto na conservação e distribuição de plantas cultivadas in vitro de uma forma</p><p>mais econômica. Essa tecnologia consiste em uma técnica excelente de propagação de híbridos</p><p>raros, genótipos de elite, plantas geneticamente modificadas e plantas raras ou ameaçadas de</p><p>extinção para os quais as sementes são muito caras ou não estão disponíveis. Como o custo de</p><p>produção de sementes híbridas (em vegetais, forrageiras, cereais ou plantas economicamente</p><p>importantes) ou outros métodos convencionais de propagação são muito altos, as sementes</p><p>sintéticas podem oferecer uma alternativa menos custosa. Algumas outras vantagens potenciais da</p><p>técnica do encapsulamento incluem a facilidade de transporte (devido o pequeno tamanho da</p><p>cápsula), uniformidade genética de plantas e semeadura direta ao solo ou em casas de vegetação.</p><p>Além disso, as sementes sintéticas podem ser produzidas ao longo do ano enquanto a maioria das</p><p>espécies arbóreas produz sementes em determinados meses do ano. Adicionalmente, as sementes</p><p>sintéticas podem ser utilizadas na conservação de germoplasma a longo prazo pela criopreservação</p><p>in vitro.</p><p>Muitas plantas economicamente importantes como cereais, frutas, plantas medicinais são</p><p>estudadas no mundo inteiro para o melhoramento vegetal, na engenharia genética, na propagação e</p><p>para propósitos farmacêuticos. Nesse contexto, a aplicação mais importante das sementes sintéticas</p><p>pode ser a troca de material vegetal axênico entre laboratórios devido o seu tamanho reduzido e a</p><p>relativa facilidade de transporte dessas estruturas.</p><p>7.2. Conservação de germoplasma</p><p>A conservação de germoplasma como uma atividade científica foi proposta nos anos 70 para</p><p>prevenção da erosão genética e para o melhoramento da produtividade agrícola (IBPGR, 1993). A</p><p>conservação de germoplasma de espécies nativas, cultivares domésticas e parentes silvestres de</p><p>espécies agronômicas tem sido uma das mais importantes áreas de pesquisa na Botânica desde</p><p>então. Seu principal objetivo é o desenvolvimento de técnicas para a conservação em longo prazo da</p><p>variabilidade genética de espécies vegetais com a máxima integridade genética e biológica possível.</p><p>Existem duas estratégias básicas de conservação: a conservação in situ (manutenção das</p><p>espécies no seu habitat natural em parques, reservas biológicas ou reservas ecológicas) e ex</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>30</p><p>situ (coleções de plantas no campo, de sementes em bancos de sementes ou de coleções de</p><p>plântulas em bancos in vitro).</p><p>Algumas espécies vegetais necessitam de procedimentos de conservação alternativos ao de</p><p>banco de sementes. Este é o caso de espécies que se propagam exclusivamente por propagação</p><p>vegetativa por que: a) não produzem sementes viáveis; b) apresentam intensa heterozigosidade ou</p><p>elevada segregação, o que pode resultar na expressão de caracteres indesejáveis na população; c)</p><p>são espécies arbóreas de grande porte que demoram muitos anos para passar do estágio juvenil</p><p>para o estágio adulto reprodutivo ou d) sementes que não toleram armazenamento por longo período</p><p>(sementes recalcitrantes). No caso destas espécies é mais apropriado conservar outra forma de</p><p>propágulo que não a semente. Estas espécies problema têm sido mantidas em bancos a campo ou</p><p>em bancos de germoplasma in vitro. No primeiro caso as plantas são mantidas como plantações no</p><p>campo. Este é um tipo de conservação eficiente para a manutenção de coleções por curto e médio</p><p>prazo. Entretanto, esta metodologia requer grandes extensões de terra e envolve altos custos</p><p>de manutenção associados com poda, controle de pestes, pragas e ervas daninhas, propagação e</p><p>fertilização, entre outros. Igualmente preocupante é o fato de que plantas conservadas no campo</p><p>estão vulneráveis ao ataque de pragas e doenças e a desastres climáticos, os quais podem</p><p>subitamente dizimar toda a coleção.</p><p>A conservação in vitro envolve a manutenção de material vegetal a curto/médio ou longo</p><p>prazo. Na conservação a curto/médio prazo, também chamada de conservação de redução do</p><p>crescimento, a finalidade é aumentar o intervalo ente as subculturas pela redução do crescimento, o</p><p>qual é obtido pela modificação das condições ambientais (como temperatura) e/ou meio de cultura</p><p>(redução na concentração de sacarose e nutrientes). A conservação in vitro em longo prazo pode ser</p><p>obtida via criopreservação, usualmente realizada em temperaturas ultra-baixas (-196 ºC) com o uso</p><p>de nitrogênio líquido. Nesta temperatura todos os processos metabólicos e de divisão celular são</p><p>inativados e, dessa forma, o material pode ser estocado por tempo ilimitado. Recentemente varias</p><p>técnicas de criopreservação foram desenvolvidas, incluindo o encapsulamento, baseado na</p><p>tecnologia desenvolvida para a produção de sementes sintéticas.</p><p>7.3. Produção de metabólitos secundários</p><p>As técnicas de cultura de tecidos vegetais podem ser aplicadas para obtenção de culturas</p><p>vegetais ou linhagens celulares de espécies de interesse farmacológico. Estudos sobre metabólitos</p><p>secundários vegetais vem crescendo nos últimos 50 anos. Essas moléculas desempenham papéis</p><p>importantes na adaptação das plantas ao seu ambiente, mas também representam uma fonte</p><p>importante de compostos ativos para a produção de fármacos. As tecnologias para cultura de células</p><p>vegetais foram introduzidas no final dos anos 1960 como uma possível ferramenta tanto para o</p><p>estudo como para a produção de metabólitos secundários vegetais.</p><p>Diferentes estratégias utilizando sistemas in vitro têm sido estudadas com o objetivo de</p><p>aprimorar a produção de compostos vegetais secundários, principalmente cultura de células</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>31</p><p>desdiferenciadas, mas existe um grande interesse na cultura de pelos radiculares e de outros órgãos.</p><p>A utilização de biorreatores representa a etapa crucial que leva a possibilidade da produção</p><p>comercial em larga escala de metabólitos secundários a partir de culturas celulares vegetais.</p><p>Muitas vias metabólicas têm sido investigadas na cultura in vitro de plantas de interesse</p><p>farmacológico, mas os alcalóides tem recebido maior atenção devido à sua relevância farmacêutica.</p><p>No caso da indústria de papéis, a separação da lignina da celulose traz um custo considerável ao</p><p>meio ambiente. Portanto, reduzir o conteúdo de lignina ou modificar a composição da lignina por</p><p>meio de um processo químico aprimorado poderia tornar a extração mais fácil.</p><p>Outra vertente dessa engenharia metabólica é a modificação das cores das flores, muito</p><p>utilizada em plantas ornamentais, que é alcançada por uma alteração nas vias metabólicas de</p><p>flavonóides, betalaínas e carotenóides.</p><p>7.4. Micropropagação de espécies de interesse</p><p>As diferentes técnicas biotecnológicas podem ser utilizadas para a produção clonal de</p><p>propágulos de espécies vegetais que apresentam interesse agronômico ou ecológico. Uma vez</p><p>estabelecidas, as metodologias adequadas e as melhores condições para a micropropagação, estas</p><p>podem ser aplicadas em escala, obtendo-se</p><p>a propagação massal destas espécies de interesse.</p><p>Dentre as espécies de interesse agronômico destaca-se a produção in vitro de mudas de banana,</p><p>batata, abacaxi, cana-de-açúcar, plantas e flores ornamentais, espécies florestais (como Eucaliptus,</p><p>Pinus). Adicionalmente, destaca-se a importância da micropropagação de espécies nativas</p><p>ameaçadas de extinção, incluindo espécies ornamentais (orquídeas e bromélias) e espécies</p><p>arbóreas. Fatores como a intensa exploração de inúmeras espécies florestais madeireiras e não</p><p>madeireiras, aliada à expansão da indústria, da agricultura, do turismo e da urbanização de modo</p><p>não sustentável causaram a redução das áreas de matas nativas brasileiras. Atualmente, a Mata</p><p>Atlântica está reduzida a 7,9 % de sua configuração original, e apesar da devastação acentuada,</p><p>esta floresta ainda apresenta o mais alto nível de diversidade de plantas do planeta,</p><p>aproximadamente 20 mil espécies, sendo que 40% são endêmicas.</p><p>Desta forma, a aplicação de técnicas alternativas de propagação em complementação aos</p><p>métodos de propagação tradicionais é fundamental para gerar tecnologias viáveis que possam ser</p><p>utilizadas em futuros programas de recuperação e reposição destas espécies nas áreas</p><p>impactadas, apresentando um grande potencial de aplicação na produção de mudas para programas</p><p>de reflorestamento e restauração de áreas degradadas, bem como em programas de conservação</p><p>de germoplasma. Neste sentido, técnicas biotecnológicas, como a cultura de tecidos in vitro, pelos</p><p>métodos de micropropagação e embriogênese somática, são opções viáveis para a propagação</p><p>clonal de espécies de interesse econômico, como espécies arbóreas nativas, principalmente porque,</p><p>nestas espécies, os métodos de propagação por estaquia são de difícil controle, devido à relação</p><p>inversa entre a idade das plantas doadoras e a capacidade de enraizamento das estacas, bem como</p><p>as sementes apresentam baixa viabilidade quando armazenadas por longos períodos e baixa taxa de</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>32</p><p>germinação. No Brasil, esta propagação em escala vem sendo realizada por várias empresas</p><p>privadas, com a SBW do Brasil (http://www.sbwbrasil.com.br/), a Biofábrica de Cacau</p><p>(http://www.biofabricadecacau.com.br/).</p><p>Adicionalmente, protocolos estabelecidos para a micropropagação de espécies de interesse</p><p>econômico são importantes para dar suporte a transgenia de plantas, que dependem destas</p><p>metodologias estabelecidas para obter as plântulas transformadas com os genes de interesse.</p><p>8. TRANSGÊNESE EM PLANTAS</p><p>Há muitos anos, plantas cultivadas vêm sendo manipuladas geneticamente pelo homem, por</p><p>meio de melhoramento clássico. Características fenotípicas de interesse, determinadas por genes, são</p><p>transferidas à progênie, através de cruzamentos. No entanto, esses métodos convencionais de</p><p>melhoramento esbarram em uma série de problemas, como a redução de pool gênico, a ligação</p><p>gênica e a incompatibilidade sexual, além do tempo necessário para se transferirem caracteres</p><p>desejáveis para cultivares de interesse que podem durar décadas em espécies bienais e em perenes</p><p>ou em espécies altamente heterozigotas. Atualmente o melhoramento de plantas pode recorrer às</p><p>técnicas de engenharia genética.</p><p>A combinação de técnicas de biologia molecular, cultura de tecidos e transferência de genes</p><p>representa uma ferramenta poderosa para introduzir novas características em uma determinada</p><p>planta. Genes oriundos de diferentes espécies vegetais, animais ou microorganismos podem ser</p><p>introduzidos de forma controlada em um genoma vegetal receptor, de modo independente da</p><p>fecundação. A variabilidade genética existente na natureza é a fonte desses genes. Entretanto, sua</p><p>utilização no processo de transformação de plantas exige o desenvolvimento da pesquisa básica em</p><p>biologia molecular e celular. O gene responsável pela característica de interesse deve ser localizado e</p><p>isolado dos demais genes do genoma. De posse do gene, ele será então caracterizado e introduzido</p><p>em vetores para transformação de plantas (Figura 5).</p><p>http://www.sbwbrasil.com.br/</p><p>http://www.biofabricadecacau.com.br/</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>33</p><p>Figura 5. Etapas na obtenção de plantas transgênicas (Adaptado de Brasileiro & Carneiro, 1998).</p><p>O fenômeno da totipotência permite que plantas transgênicas sejam obtidas de células</p><p>originalmente transformadas com o DNA exógeno, possibilitando a formação de um organismo</p><p>completo. Métodos de obtenção de plantas transgênicas já estão bem estabelecidos. Agrobacterium</p><p>tumefaciens, por exemplo, é um eficiente vetor na engenharia genética de plantas, principalmente em</p><p>espécies de dicotiledôneas. Essas bactérias do solo transferem naturalmente parte de seu genoma às</p><p>células vegetais, no momento da infecção. O DNA da agrobactéria pode também ser manipulado por</p><p>engenharia genética, de maneira a portar genes de interesse. No processo de infecção de células</p><p>vegetais, a agrobactéria se encarregará de integrá-lo no genoma vegetal. São por isso chamadas de</p><p>engenheiros genéticos naturais. A regeneração das células que contem esse DNA exógeno dará</p><p>origem a plantas transgênicas, transmitindo o gene integrado à progênie de forma mendeliana.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>34</p><p>Outras técnicas de transferência de genes podem ser aplicadas, tanto em plantas</p><p>dicotiledôneas quanto em monocotiledôneas. Essas técnicas, conhecidas como métodos diretos de</p><p>transformação, permitem a introdução do DNA exógeno na célula vegetal por meio de mecanismos</p><p>físicos ou químicos. Na eletroporação de protoplastos, por exemplo, aplica-se um pulso de alta</p><p>voltagem a uma solução contendo DNA e protoplastos em suspensão. O choque elétrico faz com que</p><p>poros se abram temporariamente na membrana plasmática, permitindo a passagem do DNA. Esse</p><p>método exige técnicas cuidadosas de cultura de tecidos, uma vez que a regeneração de protoplastos</p><p>deve ser desenvolvida e muitas vezes o método é específico ao genótipo empregado. Outro método</p><p>de transformação direta, o bombardeamento de partículas ou biobalística utiliza microprojéteis</p><p>impulsionados em alta velocidade para carrear DNA para dentro das células. Ele apresenta a</p><p>vantagem de poder ser usado em tecidos intactos, dispensando procedimentos prévios de cultura de</p><p>tecidos.</p><p>Posteriormente à transformação utilizando os diferentes métodos, é necessária a obtenção</p><p>das plântulas transformadas. Para tanto, é necessário, na escolha da espécie, que esteja estabelecido</p><p>o protocolo da propagação in vitro desta espécie, fundamental para a obtenção das plântulas</p><p>transformadas. Neste sentido, a cultura in vitro de células e tecidos vegetais é uma técnica</p><p>biotecnológica fundamental para o sucesso da transformação genética.</p><p>Os riscos que a engenharia genética pode trazer ao meio ambiente e diretamente ao homem</p><p>tem sido muito debatidos, e para isso, a maioria dos países que desenvolvem pesquisas com</p><p>organismos geneticamente modificados (OGMs) criou uma legislativa própria de biossegurança.</p><p>No Brasil, os cultivos de soja, milho e algodão transgênicos chegam aos 50.000 hectares e,</p><p>segundo dados estatísticos, essa produção tem se tornado crescente no mundo inteiro desde 1996 (</p><p>http://www.isaaa.org.).</p><p>O Brasil regulamentou a utilização de plantas transgênicas com a criação da lei nº 11.105, de</p><p>24 de março de 2005, a qual estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização de</p><p>atividades que envolvam organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados, cria o</p><p>Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS e reestrutura a Comissão Técnica Nacional de</p><p>Biossegurança – CTNBio, dentre outras coisas (https://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2004-</p><p>2006/2005/Lei/L11105.htm).</p><p>8.1. Princípios da Transformação Gênica</p><p>O termo geneticamente modificado é, com freqüência, usado para descrever organismos que</p><p>foram geneticamente transformados ou engenheirados. A engenharia genética foi desenvolvida</p><p>com o</p><p>objetivo de construir genes para a transformação genética de organismos. Essa transformação</p><p>envolve a escolha de um doador com o gene desejável, a clonagem desse gene e a seleção de um</p><p>vetor para a sua transferência ao receptor.</p><p>Os sistemas de transformação possuem três componentes principais:</p><p> Mecanismo para introdução do DNA exógeno na célula,</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>35</p><p> Tipo de célula ou tecido adequado para transformação e</p><p> Métodos para identificação e seleção de células ou indivíduos transformados.</p><p>O sucesso no desenvolvimento de sistemas de transformação para qualquer espécie</p><p>depende da disponibilidade de tecnologias a respeito desses três componentes. Obviamente, cada um</p><p>deles apresenta requerimentos para sua otimização e, portanto, oferece algumas barreiras ou</p><p>limitações ao sistema.</p><p>O objetivo final da transformação é adicionar características novas ou diferentes ao indivíduo.</p><p>Quando a característica desejada existe em outros indivíduos sexualmente compatíveis com aquele</p><p>no qual a característica deve ser introduzida, a primeira alternativa deve ser a transferência do gene</p><p>que a codifica por meio de cruzamentos e posterior seleção de progênies que apresentam tal</p><p>característica.</p><p>Essa estratégia tem sido utilizada pelos melhoristas desde o século XIX. As modernas</p><p>variedades de soja, arroz, milho etc. que têm sido utilizadas na agricultura, bem como as linhagens de</p><p>suínos, bovinos e aves hoje existentes, foram obtidas pelo cruzamento e seleção de indivíduos que,</p><p>por reunirem grande número de atributos positivos, tornaram essas variedades ou linhagens</p><p>superiores às demais já existentes.</p><p>Uma das principais limitações do melhoramento genético convencional é que o melhorista fica</p><p>limitado às características presentes nos indivíduos das espécies sexualmente compatíveis. Por</p><p>exemplo, o feijão é uma espécie rica em aminoácidos sulfurados, porém pobre em lisina, enquanto o</p><p>arroz é naturalmente rico em lisina, mas pobre em aminoácidos sulfurados. Uma vez que não é</p><p>possível realizar o cruzamento entre essas duas espécies, o melhorista convencional não pode reunir</p><p>em uma nova variedade elevado níveis de lisina e de aminoácidos sulfurados.</p><p>Com a transformação gênica, o intercâmbio de genes, anteriormente limitado pelas barreiras</p><p>reprodutivas da incompatibilidade entre espécies, deixou de existir. Com a engenharia genética e a</p><p>transformação gênica, é possível intercambiar genes entre bactérias, animais e plantas.</p><p>Os elementos básicos para a engenharia genética são as enzimas de restrição, utilizadas</p><p>para cortar o DNA em sítios específicos, e as enzimas ligases, que promovem a união de fragmentos</p><p>de DNA.</p><p>Com a escolha criteriosa das enzimas de restrição, é possível cortar o plasmídio circular das</p><p>bactérias, convertendo-o em um filamento linear. Por meio da enzima ligase, pode-se adicionar outro</p><p>fragmento de DNA que contenha o gene de interesse e, posteriormente, induzir a circularização do</p><p>plasmídio. Este pode ser introduzido na bactéria Agrobacterium tumefaciens por transformação</p><p>bacteriana, e essa bactéria, então é utilizada para transferir o transgene para a espécie a ser</p><p>transformada. Se o DNA do plasmídio é integrado ao genoma da espécie receptora e os genes</p><p>transferidos se expressam, o indivíduo receptor é denominado transformado ou transgênico.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>36</p><p>O plasmídio transformado, portador do gene de interesse, é normalmente designado por</p><p>abreviatura, em geral as iniciais do cientista ou da instituição responsável, seguida de um número,</p><p>como no caso do plasmídio pCAMBIA 1201.</p><p>8.2. Transformação por Agrobacterium tumefaciens</p><p>O sistema de transferência de DNA Agrobacterium-planta é largamente utilizado para a</p><p>obtenção de plantas transgênicas, já que se trata de um sistema simples, eficiente e relativamente</p><p>barato. Embora originalmente A. tumefaciens fosse um vetor utilizado apenas em espécies</p><p>dicotiledôneas, como soja, tomate, ervilha, algodão etc., essa bactéria tem sido empregada</p><p>recentemente, também na transformação de monocotiledôneas (gramíneas).</p><p>A utilização de Agrobacterium baseia-se na sua capacidade de transferir, para o genoma da</p><p>célula-alvo vegetal, uma região específica denominada T-DNA do inglês “transferred DNA” que</p><p>significa DNA de transferência. O pré-requisito para a utilização desse método é a susceptibilidade da</p><p>espécie vegetal à infecção por Agrobacterium, a qual envolve várias etapas. Inicialmente, as bactérias</p><p>no solo são atraídas por quimiotactismo em resposta a algum ferimento na planta. Uma vez em</p><p>contato, as bactérias se fixam à célula vegetal. A seguir, ocorre o processo de transferência do T-DNA</p><p>e, finalmente, a integração do T-DNA no genoma da célula vegetal. Para a obtenção de uma planta</p><p>transgênica, todas essas etapas são conduzidas em condições in vitro, sendo que o material vegetal a</p><p>ser transformado, denominado explante (pedaços de folhas, entrenós, raízes, entre outros) é mantido</p><p>em contato com a suspensão de uma linhagem desarmada de Agrobacterium, contendo em um vetor</p><p>os genes de interesse a serem introduzidos. Após várias etapas de cultura in vitro, as plantas</p><p>transgênicas obtidas são transferidas para casa de vegetação, onde vários ensaios moleculares e</p><p>bioquímicos deverão ser realizados.</p><p>Este método tem sido eficiente em diversas dicotiledôneas, como fumo, tomate, soja,</p><p>beterraba e algodão, dentre outras.</p><p>8.3. Eletroporação de protoplastos</p><p>A eletroporação de protoplastos é um método utilizado para introduzir macromoléculas em</p><p>células vegetais. Protoplastos são células vegetais desprovidas de paredes celulares. Em condições</p><p>bem estabelecidas de cultura de tecidos, os protoplastos constituem suas paredes, dividem-se,</p><p>formam colônias de células, calos e regeneram plantas, por embriogênese ou organogênese.</p><p>A obtenção de protoplastos requer a incubação do tecido vegetal em meio de digestão</p><p>composto de enzimas pectocelulolíticas, ou seja, enzimas que digerem a celulose, a hemicelulose e a</p><p>pectina, principais componentes da parede celular e principais nutrientes do meio de cultivo. Após a</p><p>digestão da parede celular, os protoplastos devem ser purificados e o número de protoplastos intactos</p><p>determinado.</p><p>A eletroporação consiste na indução de poros reversíveis em membranas celulares,</p><p>resultando em fluxo de íons e moléculas através da membrana deformada. Dessa maneira, foi</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>37</p><p>introduzido pela primeira vez um DNA exógeno em células de camundongo por Neumann e</p><p>colaboradores em 1982. A eletroporação de protoplastos é realizada imediatamente após a purificação</p><p>dos mesmos. Adiciona-se à suspensão de protoplastos, o plasmídeo no qual estão clonados os genes</p><p>de interesse a ser incorporado na planta e os genes marcadores, que são utilizados para a seleção</p><p>das células transformadas. Dentre os genes de interesse mais visados estão os genes que conferem</p><p>resistência a herbicidas, o gene Bt que confere ao vegetal a capacidade de produzir a delta toxina</p><p>atuando na proteção contra insetos da classe dos lepdópteros, mais recentemente genes</p><p>responsáveis pelo aumento da produção de determinados compostos e ainda em fases de teste genes</p><p>que induzem a produção de anticorpos, hormônios, soroalbumina humana, antígenos vacinais e</p><p>enzimas.</p><p>A seleção é feita no início da cultura, quando a maioria das células derivadas dos protoplastos</p><p>está na segunda divisão, Essa seleção precoce é bastante eficiente, evita o aparecimento de falsos</p><p>transformantes ou quimeras, o que é um problema em outras técnicas de transformação, nas quais a</p><p>seleção é realizada em tecidos ou órgãos intactos.</p><p>8.4. Biobalística</p><p>O processo de biobalística foi inicialmente proposto por Sanford et al. (1987), com o objetivo</p><p>de introduzir material genético no genoma nuclear de plantas superiores. Desde então sua</p><p>universalidade de aplicações tem sido avaliada, demonstrando</p><p>ser um processo também efetivo e</p><p>simples para a introdução e expressão de genes em bactérias, protozoários, fungos, algas, insetos e</p><p>tecidos animais.</p><p>A biobalística utiliza microprojéteis em alta velocidade para introduzir ácidos nucléicos e</p><p>outras moléculas em células e tecidos in vivo. Esse processo também é chamado de</p><p>bombardeamento com microprojéteis, aceleração de partículas, entre outros. Foi demonstrado que as</p><p>partículas (de ouro ou tungstênio) penetram a parede e a membrana plasmática das células vegetais</p><p>de maneira não-letal, alojando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Posteriormente, o DNA é</p><p>dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular e integrado no genoma nuclear do</p><p>organismo receptor, resultando na transformação genética.</p><p>A maioria das variedades transgênicas comerciais hoje disponíveis foi desenvolvida com o</p><p>uso da biobalística. Entretanto devido ao custo do uso desta tecnologia e ao fato de o padrão de</p><p>integração do transgene aparentemente muito complexo, vários grupos de pesquisa estão usando,</p><p>preferindo a transformação gênica via A. tumefaciens.</p><p>8.5. Dificuldades na Transformação Gênica em Plantas</p><p>A cultura de tecidos tem sido apontada como um dos maiores obstáculos no desenvolvimento</p><p>de variedades transgênicas vegetais, uma vez que é necessário desenvolver protocolos que permitam</p><p>a regeneração de indivíduos a partir das células transformadas. Uma das dificuldades encontradas</p><p>pelos cientistas está no fato de que metodologias de regeneração funcionam bem com algumas, mas</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>38</p><p>não com outras espécies, limitando o espectro daquelas que podem ser transformadas. Nesses casos,</p><p>o procedimento tem sido a transferência dos transgenes via genética clássica, por meio de</p><p>cruzamentos, a partir do indivíduo transformado com a característica desejada.</p><p>Outra dificuldade associada com o uso da cultura de tecidos na transformação gênica envolve</p><p>as variações somaclonais (aparecimento de tipos distintos decorrentes de mutações e outras</p><p>anomalias inerentes à cultura de tecidos). A frequência de variação somaclonal ou mutações nos</p><p>indivíduos regenerados por cultura de tecidos é relativamente alta.</p><p>Os métodos de transformação gênica que ainda estão em fase de desenvolvimento e que,</p><p>provavelmente, revolucionarão a maneira de se introduzirem genes em plantas são bastante</p><p>promissores, alguns dos quais já estão sendo utilizados com a planta-modelo Arabidopsis thaliana.</p><p>Um desses métodos envolve a submersão dos botões florais da planta em uma solução contendo os</p><p>plasmídios portadores dos transgenes. Outra opção é a transformação de sementes mediada por</p><p>Agrobacterium tumefaciens. Embora esses métodos tenham sido utilizados com sucesso em</p><p>Arabidopsis, a literatura científica apenas começou a registrar seu uso em outras espécies vegetais de</p><p>importância agronômica. Uma importante vantagem desses métodos é a transformação sem</p><p>necessidade de uso da cultura de tecidos.</p><p>8.6. Potencial da transformação gênica</p><p>As metas finais no desenvolvimento de novas variedades e linhagens por meio da</p><p>biotecnologia são as mesmas do melhoramento genético convencional, ou seja, produtividade, vigor,</p><p>resistência a doenças, qualidade nutricional etc. Entretanto, a biotecnologia oferece possibilidades de</p><p>se desenvolverem rapidamente vários tipos com características que não podem ser geradas pelo</p><p>melhoramento convencional.</p><p>8.6.1. Adição de novas ou diferentes funções</p><p>Formas alteradas de enzimas: a introdução de genes de uma enzima estruturalmente</p><p>diferente do tipo selvagem, porém ativa, pode resultar em sua maior tolerância às diferentes condições</p><p>do meio ambiente. Por exemplo, o herbicida glifosato bloqueia a biossíntese dos aminoácidos</p><p>aromáticos. A introdução de um gene que codifica a síntese da enzima EPSP estruturalmente</p><p>modificada resultou na resistência ao herbicida glifosato.</p><p>Superprodução de proteínas: a introdução de diversas cópias de um gene ou mesmo de um</p><p>promotor forte pode resultar na superprodução de uma proteína, a exemplo da proteína de reserva das</p><p>leguminosas.</p><p>Silenciamento de genes endógenos: o bloqueio, ou silenciamento, de genes de um organismo</p><p>pode ser obtido pela tecnologia do RNA anti-senso, do RNAi (RNA de interferência), dentre outras. Por</p><p>exemplo, a tecnologia RNAm anti-senso consiste na introdução de uma sequência complementar ao</p><p>RNAm do gene de interesse. O RNAm anti-senso hibridiza com o RNAm primário, formando uma fita</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>39</p><p>dupla, que bloqueia o processo de tradução. Teoricamente, o RNAm anti-senso pode ser utilizado</p><p>para inibir a expressão de quaisquer genes.</p><p>8.6.2. Adição de novas características</p><p>Genes de outras espécies podem ser introduzidos na espécie de interesse, criando uma nova</p><p>característica. Existem várias possibilidades, por exemplo: a) metabolismo: transferência de genes das</p><p>leguminosas que fixam nitrogênio para as gramíneas; b) biopesticidas: tem-se como exemplo o caso</p><p>da transferência do gene codificador da produção da toxina Bt, um bioinseticida natural proveniente da</p><p>bactéria Bacillus thuringiensis, para o milho; c) resistência a doenças: a exemplo da introdução do</p><p>gene da proteína do envelope viral na cevada, conferindo proteção cruzada ao vírus BYD; d) macho-</p><p>esterilidade: a introdução desta característica genética facilita a fecundação cruzada em espécies com</p><p>elevada taxa de autofecundação.</p><p>8.6.3. Biorremediação</p><p>Introdução de genes que codificam para a produção de princípios ativos utilizados na</p><p>produção de medicamentos.</p><p>8.6.4. Fármacos</p><p>Introdução de genes que codificam para a produção de princípios ativos utilizados na</p><p>produção de medicamentos.</p><p>8.6.5. Alteração no desenvolvimento ou morfologia do indivíduo</p><p>Alteração na época de florescimento da planta ou mesmo na sua arquitetura ou coloração.</p><p>9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS</p><p>Barros, L.M.G., Carneiro, V.C. (1998) Eletroporação de Protoplastos. In: Manual de Transformação Genética de</p><p>Plantas. Brasileiro, A.C.M. Carneiro, V.C. (Eds). Brasilia: Embrapa – SPI/Embrapa – Cenargen. Cap. 2, p.</p><p>35-49.</p><p>Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. (2001) Production of plant secondary metabolites: a historical</p><p>perspective. Plant Science, 161: 839-851.</p><p>Brasileiro, A.C.M. Carneiro, V.C. (1998) Introdução à Transformação Genética de Plantas. In: Manual de</p><p>Transformação Genética de Plantas. Brasileiro, A.C.M. Carneiro, V.C. (Eds). Brasilia: Embrapa –</p><p>SPI/Embrapa – Cenargen. Cap. 1, p. 13-16.</p><p>Duditis, D., Gyorgyeyj., Bogre, L., Bako, L. (1995) Molecular biology of somatic embryogenesis. Pp 267-308 in</p><p>Thorpe, T.A. (ed) In vitro embryogenesis in plants Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London.</p><p>George, E.F., Debergh, P.C. (2008) Micropropagation: Uses and Methods. In: Plant Propagation by Tissue</p><p>Culture 3</p><p>rd</p><p>Edition. George, E.F., Hall, M.A., De Klerk, G.J. (Eds). Springer. v. 1. Cap. 2, p. 29-64.</p><p>Guerra, M.P., Torres, A.C., Teixeira, J.B. (1999) Embriogênese somática e sementes sintéticas. In: Torres,</p><p>A.C., Caldas, L.S., Buso, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa, v.</p><p>3, p. 533-568.</p><p>Gupta, P.K., Pullman, G. S. (1991) Method for reproducing coniferous plants by somatic embryogenesis using</p><p>abscisic acid and osmotic potential variation. US patent 5,036,007.</p><p>http://www.biofabricadecacau.com.br/, acesso em 28/07/2011.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>40</p><p>http://www.isaaa.org, acesso em 01/09/2011.</p><p>http://www.sbwbrasil.com.br/, acesso em 28/07/2011.</p><p>https://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2004-2006/2005/Lei/L11105.htm, acesso em 01/09/2011.</p><p>Kutschera, U. (1994) The current status of the acid-growth hypothesis. New Phytol. 126: 549-569.</p><p>Lakshmanan, P., Geijskes, R.J., Aitken, K.S., Grof, C.L.P., Bonnett, G.D., Smith, G.R. (2005) Sugarcane</p><p>biotechnology: the challenges and opportunities. In vitro Cellular</p><p>and Developmental Biology Plant. 41:345-</p><p>363.</p><p>Lloyd, G. & McCown, B. (1981) Commercially-feasible micropropagation of Mountain laurel, Kalmia latifolia, by</p><p>use of shoot tip culture. Int. Plant Prop. Soc. Proc. 30: 421-427.</p><p>Miller, C.O., Skoog, F., Okumura, F.S., Von Saltza, M.H., Strong, F.M. (1955) Structure and synthesis of kinetin.</p><p>J. Am. Chem. Soc. 77: 2662-2663.</p><p>Moreira, J. de A. N.; Nóbrega, M. B. de M.; Vieira, R. de M. (1999) Engenharia genética no algodoeiro. In</p><p>BELTRÃO, N. E. de M. O agronegócio do algodão no Brasil. Embrapa-algodão. v. 1, Cap. XV, p. 390-404.</p><p>Murashige T.; Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</p><p>Physiol. Plant. 15: 473-497.</p><p>Nodari, R.O., Guerra, M.P. (2003) Plantas transgênicas e seus produtos: impactos, riscos e segurança</p><p>alimentar (Biossegurança de plantas transgênicas). Revista de Nutrição, 16(1): 105-116.</p><p>Oliveira, M.M. (2000) Aplicações e Avanços na Área da Biotecnologia Vegetal. Boletim de Biotecnologia, 22-27.</p><p>Rai, M.K., Asthana, P. Singh, A.K., Jaiswal, V.S., Jaiswal, U. (2009) The encapsulation technology in fruit plants</p><p>– A review. Biotechnology Advances. 27:671-679.</p><p>Rech, E.L., Aragão, F.J.L. (1998) Biobalística. In: Manual de Transformação Genética de Plantas. Brasileiro,</p><p>A.C.M. Carneiro, V.C. (Eds). Brasília: Embrapa – SPI/Embrapa – Cenargen. Cap. 3, p. 51-74.</p><p>Reinert, J. (1958) Untersuchungen über die Morphogenese an Gewebenkulturen. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 71:15.</p><p>Sanford, J.C. et al. (1987) Delivery of substances into cells tissues using a particle bombardment</p><p>process. Particul Sci Technol. 5: 27-37.</p><p>Santos, I.R.I. (2000) Criopreservação: Potencial e perspectivas para conservação de germoplasma vegetal.</p><p>Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 12(Edição especial): 70-84.</p><p>Skoog, F. & Miller, C.O. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in</p><p>vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 11: 118-131.</p><p>Steiner, N., Santa-Catarina, C., Andrade, J.B.R., Balbuena, T.S., Guerra, M.P., Handro, W., Floh, E.I.S. Silveira,</p><p>V. (2008) Araucaria angustifolia Biotechnology - Review. Funct. Plant. Sci. Biotech. 2:20-28.</p><p>Steward, F.C., Mapes, M.O., Hears, K. (1958) Growth and organized development of cultured cells. II. Growth</p><p>and division of freely suspended cells. Am. J. Bot. 45: 705-708.</p><p>Studart-Guimarães, C.; Lacorte, C.; Brasileiro, A. C. M. (2003) Transformação genética em espécies florestais.</p><p>Ciência Florestal, Santa Maria, 13(1): 167-178.</p><p>Tautorus, T.E., Fowke, L.C., Dunstan, D.I. (1991) Somatic embryogenesis in conifers. Can. J. Bot. 69:1873-</p><p>1899.</p><p>Thomas, T.L. (1993) Gene expression during plant embryogenesis and germination: An overview. Plant Cell. 5:</p><p>1401-1410.</p><p>Von Arnold, S. (2008) Somatic Embryogenesis. In: Plant Propagation by Tissue Culture 3</p><p>rd</p><p>Edition. George,</p><p>E.F., Hall, M.A., De Klerk, G.J. (Eds). Springer. v. 1. Cap. 1, p. 1-28.</p><p>Von Arnold, S., Eriksson, T. (1981) In vitro studies of adventitious shoot formation in Pinus contorta. Can. J. Bot.</p><p>59: 870-874.</p><p>White, P.R. (1942) Plant tissue cultures. Annu. Rev. Biochem. 11: 615-628.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>1Bolsista UAB. Pós-graduanda em Biociências e Biotecnologia.</p><p>2Bolsista de extensão. Graduanda em Ciências Biológicas.</p><p>3Biólogo, Doutor, Professor Associado da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.</p><p>CAPÍTULO 2 - BIOTECNOLOGIA ANIMAL</p><p>Aline Martins de Vita1</p><p>Vanessa de Souza Rodrigues2</p><p>Álvaro Fabrício Lopes Rios3</p><p>O desenvolvimento de protocolos de biotecnologia utilizando células animais proporcionou a</p><p>obtenção de uma grande quantidade de conhecimento científico a respeito da biologia das mesmas.</p><p>Dois exemplos que devem ser citados são a produção de células iPS (do inglês, induced pluripotent</p><p>stem cells) e a clonagem interespecífica. O conhecimento das redes gênicas que governam a</p><p>pluripotência embrionária através de técnicas de biologia molecular, entre elas a transgenia, permitiu</p><p>que em 2006, um cientista japonês, Shinya Yamanaka, tratasse células diferenciadas (fibroblastos)</p><p>com genes responsáveis pelo estabelecimento e manutenção da pluripotência celular. Esses</p><p>fibroblastos foram “reprogramados” em um tipo celular próximo às células-tronco embrionárias.</p><p>Essas iPS são capazes de se diferenciar em qualquer tipo celular presente em um organismo adulto.</p><p>Outra pesquisa de grande importância é a clonagem de animais ameaçados de extinção</p><p>utilizando oócitos de espécies relacionadas, mas não em risco de extinção (clonagem</p><p>interespecífica). Em geral, o núcleo celular da espécie ameaçada é colocado no citoplasma de um</p><p>oócito de uma espécie com grande número de indivíduos. Essa espécie serve como receptora do</p><p>embrião clonado (um citoplasma e uma barriga de aluguel). Alguns resultados tem sido promissores</p><p>como a clonagem de lobos ameaçados de extinção em oócitos de cães domésticos. Algumas</p><p>espécies de gado selvagem tem sido submetidas a esse tipo de biotecnologia. Recentemente, um</p><p>grupo de pesquisadores de diversos países utilizou material congelado de uma espécie de cabra</p><p>selvagem extinta (Capra pyrenaica pyrenaica) e clonaram em uma receptora doméstica. O animal</p><p>nasceu, mas morreu em seguida.</p><p>1. ESTRUTURA DOS GENES</p><p>Os códigos genéticos variam em seu tamanho de acordo com a espécie. Em eucariotos, a</p><p>maioria dos genes são intercalados por sequências não codificadoras denominadas íntrons que são</p><p>eliminados dos RNAs mensageiros (mRNA) recém sintetizados, processo denominado splicing, para</p><p>gerar o mRNA pronto para ser traduzido, que então migra do núcleo para o citoplasma onde ocorre a</p><p>tradução das proteínas. mRNAs maduros são então formados apenas por éxons que se associam</p><p>após os íntrons serem eliminados.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>1Bolsista UAB. Pós-graduanda em Biociências e Biotecnologia.</p><p>2Bolsista de extensão. Graduanda em Ciências Biológicas.</p><p>3Biólogo, Doutor, Professor Associado da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.</p><p>Os íntrons podem participar no controle de qualidade de mRNAs no núcleo. Portanto, se sabe</p><p>que a processamento do mRNA maduro ocorre no núcleo para checar a sua funcionalidade.</p><p>Um códon de terminação seguido por um íntron menor que 50 nucleotídeos é considerado não-</p><p>funcional, porém alguns íntrons são tão longos que contem genes funcionais, um exemplo pode</p><p>ser atribuído aos primeiros íntrons localizados na porção 5’ que servem de sítios de ligação para</p><p>fatores de transcrição. Sua presença parece importante por manter um local da cromatina aberta e</p><p>favorecer a transcrição.</p><p>E ainda, alguns mRNAs não possuem introns. Esse é o caso das histonas e numerosos</p><p>mRNAs virais. Esses RNAs contem sinais que permitem que o mRNA seja transportado do núcleo</p><p>para o citoplasma.</p><p>A transcrição é controlada por mecanismos complexos que envolvem a ação de proteínas que</p><p>são chamadas de fatores de transcrição, as quais reconhecem sequências curtas específicas de</p><p>DNA (cerca de 12 nucleotídeos). Alguns dos fatores de transcrição se ligam ao DNA e controlam a</p><p>síntese de RNA apenas após ter sido ativado por outros mecanismos celulares como fatores de</p><p>crescimento, hormônios, estresse celular etc. Um determinado fator de transcrição pode participar no</p><p>controle de diversos genes uma vez que ele pode se associar a uma série de fatores específicos</p><p>para cada tipo celular</p><p>Regiões promotoras ou “promotores” estão localizados no sítio de iniciação da transcrição. A</p><p>combinação de fatores de transcrição que se ligam ao promotor determina sua potência e</p><p>especificidade celular. O complexo de transcrição responsável pela síntese de mRNA é formado na</p><p>região promotora.</p><p>Os primeiros promotores encontrados em genomas virais e na maioria dos genes mais</p><p>expressos contem sequências (consensus sequences). Uma região rica em AT (A = adenina; T =</p><p>timina) denominada TATA Box está presente em muitos genes a cerca</p><p>de -30 bp (pares de base) à</p><p>montante do sítio de iniciação da transcrição. Fatores específicos se ligam ao TATA Box e fazem</p><p>parte do complexo de iniciação da transcrição.</p><p>À montante (upstream) dos promotores e em distâncias variáveis, elementos acentuadores</p><p>(do inglês, enhancers) da transcrição são encontrados na maioria se não todos os genes animais. O</p><p>nome enhancer foi dado a essas regiões regulatórias dos genes uma vez que eles são capazes de</p><p>aumentar a taxa de transcrição global. Estudos recentes mostram que acentuadores não aumentam</p><p>a taxa de transcrição por si só, mas a probabilidade de ocorrer a transcrição. Acentuadores atuam</p><p>aumentando a freqüência do complexo de transcrição estar ativo na célula. Eles geralmente contem</p><p>múltiplos sítios de ligação para fatores de transcrição. O complexo fator de transcrição-DNA interage</p><p>com o complexo de transcrição a uma determinada distância pela formação de um loop que carrega</p><p>o acentuador e o promotor muito próximos.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>43</p><p>Os mRNAs maduros no citoplasma contem regiões diferentes com funções distintas e</p><p>específicas. A região que precede o códon de iniciação denominada região não traduzida 5’ (5’UTR)</p><p>está geralmente envolvida no controle da tradução. 5’UTR ricas em GC não favorecem ou até</p><p>mesmo inibem a tradução enquanto 5’UTR ricas em AU favorecem ou pelo menos não prejudicam a</p><p>tradução do RNA. Algumas 5’UTR contem regiões regulatórias especiais permitem que um mRNA</p><p>seja traduzido ou não de acordo com o estado fisiológico da célula.</p><p>A região downstream do códon de terminação chamada de região não-traduzida 3’ (3’UTR) é</p><p>relativamente longa em muitos genes, enquanto 5’UTR são geralmente curtas. Algumas 3’UTRs</p><p>contem sequências às quais proteínas se ligam. As 3’UTRs de alguns mRNAs contem sequências</p><p>que formam um complexo com proteínas do citoplasma, direcionando os mRNAs a compartimentos</p><p>celulares específicos.</p><p>Um dos pontos chave da transgênese consiste na construção de genes que sejam expressos</p><p>de forma apropriada quando transferidos aos animais. Os mecanismos que controlam a expressão</p><p>gênica não são totalmente conhecidos e a construção de um gene pode eliminar alguns sinais</p><p>essenciais ou combinar sinais incompatíveis que levarão ao insucesso da transgênese.</p><p>2. AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DA ENGENHARIA GENÉTICA</p><p>A maioria das mensagens contidas no DNA são lineares. Esse é o caso das mensagens</p><p>genéticas baseadas na sucessão de códons, que definem a ordem dos aminoácidos nas proteínas</p><p>correspondentes. O mesmo pode ser definido em certo grau para as regiões regulatórias. Os sítios</p><p>que ligam fatores de transcrição são compostos de cerca de 12 nucleotídeos adjacentes. Os outros</p><p>sinais também contam com sequências de DNA, tendo cada categoria de sinal seu tipo de linguagem</p><p>específica, sempre baseado no alfabeto de quatro letras ATGC, correspondente às quatro bases do</p><p>DNA.</p><p>2.1. Clonagem do gene</p><p>O primeiro passo consiste na clivagem do DNA em fragmentos que podem variar de poucas a</p><p>muitas centenas de quilobases (kb). Esses fragmentos são introduzidos em vetores bacterianos para</p><p>clonagem. Os diferentes vetores disponíveis foram desenhados para abrigarem diferentes</p><p>comprimentos de DNA. Plasmídeos, cosmídeos, fago P1, BACs (cromossomos bacterianos</p><p>artificiais) e YACs (cromossomos artificiais de leveduras) pode abrigar até 20 kb, 40 kb, 90 kb, 200 kb</p><p>e 1000 kb de DNA, respectivamente. Cada vetor contendo apenas um fragmento de DNA é</p><p>introduzido em uma bactéria, sendo amplificado, formando um clone.</p><p>A clonagem direta de um fragmento de DNA contendo um determinado gene geralmente não</p><p>é possível. A clonagem do cDNA (DNA complementar) correspondente geralmente é um passo</p><p>intermediário. Para esse propósito, os mRNAs de um tipo celular são re-transcritos em DNA por uma</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>44</p><p>transcriptase reversa viral. O DNA fita única obtido dessa forma é então convertido em DNA fita-</p><p>dupla por uma DNA polimerase. Os fragmentos de DNA resultante são clonados em plasmídeos para</p><p>gerar um banco de cDNA. Por fim, o clone contendo o cDNA em questão pode ser identificado e</p><p>isolado para o uso na transgênese.</p><p>2.2. Sequenciamento do DNA</p><p>O seqüenciamento do DNA consiste em determinar a ordem das bases em um fragmento do</p><p>DNA. Por anos, o seqüenciamento foi realizado por técnicas lentas. Nos dias de hoje, o</p><p>seqüenciamento foi automatizado e ocorre em uma escala industrial. Agora, é possível seqüenciar</p><p>vários milhares de quilobases diariamente, o que é absolutamente necessário para o</p><p>seqüenciamento sistemático dos genomas. Pesquisadores também necessitam de computadores</p><p>poderosos para determinar a estrutura dos fragmentos de DNA que foram isolados, mutados ou</p><p>agrupados.</p><p>2.3. Amplificação gênica in vitro</p><p>A técnica conhecida como PCR (reação em cadeia da polimerase) para amplificação</p><p>específica de uma região do DNA está entre as mais utilizadas pelos biólogos moleculares. Esta</p><p>técnica consiste da síntese da fita complementar de uma região do DNA iniciada a partir de um</p><p>iniciador primer. O primer é um oligonucleotídeo composto de aproximadamente 15-20 nucleotídeos,</p><p>os quais são quimicamente sintetizados e reconhecem especificamente a região do DNA escolhida.</p><p>O oligonucleotídeo é alongado por uma DNA polimerase bacteriana, gerando uma fita de DNA</p><p>complementar, a qual o primer é ligado. Na maioria dos casos, dois primers que reconhecem</p><p>seqüências diferentes de ambas as fitas do DNA são usadas simultaneamente. Assim, dá-se início a</p><p>síntese de um DNA dupla fita correspondendo a região localizada entre os dois primers. Regiões de</p><p>DNA de 1 kb são comumente usadas. Fragmentos de até 20-40 kb podem ser sintetizados</p><p>especificamente sobre condições otimizadas. Após cerca de 30 ciclos de amplificação, milhares de</p><p>cópias da sequência de DNA estão presentes no tubo iniciadas a partir de uma única cópia. Isso</p><p>permite a identificação de uma região específica do DNA genômico. Essa técnica é então utilizada</p><p>para tipagem genômica, mas também para identificar indivíduos. Ela tem se tornado comum na</p><p>prática de determinação de paternidade e identificação de assassino. PCR também é uma técnica</p><p>essencial para mutação de fragmentos de DNA in vitro e para construção de genes funcionais a partir</p><p>de vários fragmentos de DNA.</p><p>2.4. Construção gênica</p><p>O estudo de genes requer a construção de genes funcionais a partir de vários elementos.</p><p>Esses elementos podem ser regiões regulatórias, mas também regiões transcritas. Eles podem estar</p><p>em sua estrutura nativa ou mutados experimentalmente. Isto pode ajudar a identificar as regiões</p><p>regulatórias que controlam a expressão gênica. As regiões codificantes podem ter sua estrutura</p><p>nativa. A construção pode então ser usada para estudar o efeito do gene nas células ou organismos</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>45</p><p>inteiros. As regiões transcritas podem conter um gene repórter que codifica uma proteína que pode</p><p>ser facilmente visualizada ou quantificada por sua atividade enzimática específica. Isto revela em</p><p>quais células e em que proporção o gene repórter é expresso.</p><p>A engenharia genética também pode ser usada numa escala industrial para reprogramar</p><p>células ou organismos inteiros para produzir DNAs recombinantes de interesse farmacêutico e para</p><p>prevenir a rejeição imunológica de órgãos transplantados.</p><p>Em todos os casos, os genes devem ser construídos experimentalmente. A construção gênica</p><p>contem pelo menos uma região promotora, uma região transcrita e um terminador da transcrição. O</p><p>gene construído é, então inserido um vetor de expressão.</p><p>A construção de um gene implica no uso de enzimas de restrição, as quais clivam o DNA em</p><p>sítios específicos, a síntese química de oligonucleotídeos, a amplificação in vitro de fragmentos de</p><p>DNA por PCR e a associação covalente dos diferentes fragmentos de DNA por uma ligase. Na</p><p>maioria das vezes, esses fragmentos</p><p>são adicionados em plasmídeos, que são transferidos para o</p><p>interior de bactérias. Os clones bacterianos são selecionados e amplificados.</p><p>A escolha dos elementos a serem adicionados na construção gênica depende do objetivo do</p><p>experimento e particularmente do tipo celular no qual o gene em questão deve ser expresso. O</p><p>código genético é universal mesmo se alguns códons são mais utilizados em um determinado tipo</p><p>celular que outros. O código que define a atividade das seqüências regulatórias é específico a cada</p><p>tipo de organismo. O promotor de um gene bacteriano não está ativo em uma célula vegetal ou</p><p>animal, assim como o contrário.</p><p>2.5. Transferência do gene</p><p>Um gene isolado pode ser transcrito in vitro e seu mRNA pode também ser traduzido em um</p><p>sistema sem célula. Isto permite aos pesquisadores que possuem uma quantidade muito pequena de</p><p>proteínas, tornar essa quantidade suficiente para estudos bioquímicos. Essa técnica é insuficiente</p><p>para um número de estudos, tal como determinar a atividade biológica da proteína in vivo ou</p><p>determinar sua estrutura por cristalização.</p><p>Para ser decodificado e traduzido em uma proteína, um gene deve ser transferido para dentro</p><p>da célula, a qual, por natureza, contem todos os fatores para transcrição e tradução. A membrana</p><p>plasmática de diferentes tipos celulares possui uma barreira que permite um carregamento seletivo</p><p>de compostos. Em alguns casos, as moléculas entram nas células através de poros que são abertos</p><p>ou fechados de uma forma controlada.</p><p>Carreadores específicos podem também transportar determinadas moléculas a serem</p><p>transferidas para dentro da célula. Em outros casos, a molécula reconhece receptores específicos do</p><p>lado de fora da membrana plasmática e o complexo formado modifica a membrana localmente,</p><p>levando a uma internalização do complexo e da membrana ao redor. Esse processo é chamado de</p><p>endocitose.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>46</p><p>O DNA é uma molécula grande e carregada negativamente e, portanto, não pode atravessar</p><p>espontaneamente a membrana plasmática. Essa é uma forma das células de se protegerem do DNA</p><p>estranho que pode estar na vizinhança. Oligonucleotídeos adicionados ao meio de cultura ou</p><p>injetados em animais podem entrar nas células em condições em que eles estão presentes em</p><p>concentração relativamente alta.</p><p>Várias técnicas foram desenhadas para forçar o DNA a entrar nas células e atingir seu</p><p>núcleo. Essas diferentes formas de transferir o gene para dentro das células foram agrupadas e</p><p>denominadas transfecção.</p><p>3. TÉCNICAS PARA TRANSFERÊNCIA NUCLEAR (CLONAGEM) E TRANSGÊNESE</p><p>3.1. Clonagem</p><p>3.1.1. As principais etapas da diferenciação</p><p>A clonagem é, por definição, a reprodução de uma célula e, de forma mais geral, de um</p><p>organismo inteiro sem qualquer modificação de seu genótipo. Esse fenômeno ocorre amplamente na</p><p>natureza uma vez que bactérias e fungos se reproduzem de acordo com esse processo. A mesma</p><p>situação é encontrada em células somáticas de organismos pluricelulares, com exceção daquelas do</p><p>sistema imune que sintetizam anticorpos e receptores T. Um número de plantas pode se multiplicar</p><p>independentemente da reprodução sexuada. Estacas são estratégias utilizadas pelos jardineiros para</p><p>a reprodução de muitas plantas e os organismos resultantes são clones.</p><p>Nenhum fenômeno desse tipo foi observado em vertebrados. Os mecanismos de</p><p>desenvolvimento em plantas e animais são bem diferentes. Isso explica por que a clonagem em</p><p>plantas pode ser obtida a partir do simples prolongamento do estado diferenciado, enquanto para</p><p>animais isso não ocorre. Em animais superiores, sabe-se que a célula inicial do zigoto formada logo</p><p>após a fertilização é totipotente. Isso significa que a célula pode gerar todas as células daquele</p><p>organismo. O mesmo acontece para duas ou quatro células do início do embrião em</p><p>desenvolvimento. Essas células podem se desenvolver em um organismo vivo se introduzidas na</p><p>zona pelúcida de um oócito. Essas células, portanto, ainda são totipotentes. Após esse estágio, as</p><p>células embrionárias começam a perder a totipotência e se tornam pluripotentes. Essas células,</p><p>conhecidas como blastômeros, não são diferenciadas. Essas células perdem a capacidade de gerar</p><p>um organismo vivo após serem transferidas para a zona pelúcida.</p><p>Após alguns dias, dependendo da espécie, o embrião, conhecido como blastocisto, pode ser</p><p>dividido em duas categorias de células: a) as células que formam uma camada unicelular ao longo da</p><p>zona pelúcida, que dará origem à placenta e; b) as células que formam um bloco compacto,</p><p>conhecido como massa de células internas, que é precursor do próprio embrião.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>47</p><p>3.1.2. Clonagem por transferência nuclear</p><p>Cerca de 40 anos atrás, a clonagem de uma rã (Rana pipiens) e de um sapo de laboratório,</p><p>(Xenopus laevis), foi realizada por uma técnica que foi essencialmente a mesma usada para gerar a</p><p>ovelha Dolly.</p><p>A técnica é baseada em uma simples ideia. O citoplasma do oócito deve ser capaz de</p><p>favorecer ou induzir totipotência na célula. Na verdade, o núcleo espermático é inativado em nível</p><p>transcricional. O DNA espermático é coberto por proteínas básicas, as protaminas, e a cromatina é</p><p>amplamente condensada. Logo após a fertilização, o núcleo espermático é descondensado.</p><p>Protaminas são substituídas por histonas, levando a ativação progressiva do genoma alguns dias</p><p>depois, dependendo da espécie. O citoplasma do oócito assim tem uma capacidade forte de</p><p>reprogramar o genoma para o desenvolvimento do embrião. Muitos genes são requeridos para o</p><p>desenvolvimento do embrião e a expressão massiva de genes é observada em células totipotentes e</p><p>pluripotentes. Não se conhece até que ponto a expressão de todos esses genes é requerida no início</p><p>do embrião. Sabe-se que a diferenciação é acompanhada e provavelmente causada por uma</p><p>extinção seletiva de genes específicos e pela ativação de outros. Isso leva a um padrão de</p><p>expressão que caracteriza cada célula diferenciada.</p><p>Núcleos isolados de células embrionárias de Xenopus foram transferidos por</p><p>micromanipulação em citoplasmas de oócitos enucleados. A enucleação é indispensável para</p><p>eliminar o genótipo do oócito e prevenir que embrião se torne triplóide após a transferência de um</p><p>núcleo diplóide. A enucleação ocorreu por aspiração usando uma micropipeta. Esses experimentos</p><p>pioneiros não tiveram sucesso. Foi postulado que isso se deve a utilização de um núcleo isolado, que</p><p>pode ter perdido componentes essenciais durante o processo de micromanipulação.</p><p>Uma outra estratégia foi utilizada. Ela consistia na injeção de uma célula embrionária diplóide</p><p>entre a zona pelúcida e a membrana plasmática do oócito enucleado. Esse primeiro passo foi</p><p>seguido pela fusão das membranas plasmáticas da célula e do oócito. Isso foi alcançado por</p><p>submeter o material a um campo elétrico alternativo. Esse tratamento desestabiliza as membranas</p><p>celulares, as quais espontaneamente se fundem sob essas condições. O núcleo da célula é então</p><p>transferido para o citoplasma do oócito sem qualquer micromanipulação. O campo elétrico tem outra</p><p>função que é essencial. A fertilização não é só a transferência do genoma do esperma no oócito. O</p><p>esperma também contem fatores que induzem o transporte de cálcio pelo oócito. Este é um sinal</p><p>essencial para levar ao desenvolvimento do embrião. O campo elétrico cria poros na membrana do</p><p>oócito, tornando possível que o cálcio no meio entre na célula. Isso mimetiza a ativação do oócito</p><p>pelo esperma. O embrião reconstituído pode assim iniciar seu desenvolvimento (Figura 1). Xenopus</p><p>foi clonado dessa forma há 40 anos atrás.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>48</p><p>Figura 1: Princípios da clonagem animal por transferência nuclear (Modificada de Houdebine, 2003).</p><p>Cerca de 15 anos atrás, parecia importante estender a técnica de clonagem para animais de</p><p>fazenda para acelerar a seleção</p><p>44</p><p>2.5. Transferência do gene ............................................................................................................. 45</p><p>3. TÉCNICAS PARA TRANSFERÊNCIA NUCLEAR (CLONAGEM) E TRANSGÊNESE ................. 46</p><p>3.1. Clonagem ................................................................................................................................ 46</p><p>3.1.1. As principais etapas da diferenciação ............................................................................... 46</p><p>3.1.2. Clonagem por transferência nuclear ................................................................................. 47</p><p>3.2. Transgênese ........................................................................................................................... 49</p><p>v</p><p>3.2.1. Os objetivos e o conceito de transgênese animal ............................................................. 49</p><p>3.2.2. Transferência do gene nos gametas ................................................................................. 50</p><p>3.2.2.1. Transferência do gene no esperma ............................................................................ 50</p><p>4. APLICAÇÕES DA TRANSGÊNESE ............................................................................................. 51</p><p>4.1. Estudos básicos ...................................................................................................................... 51</p><p>4.2. Estudo de doenças humanas .................................................................................................. 51</p><p>4.3. Produção farmacêutica ............................................................................................................ 52</p><p>5. GENES CANDIDATOS QUE PODEM MELHORAR A PRODUÇÃO ANIMAL .............................. 53</p><p>6. APLICAÇÕES DA CLONAGEM .................................................................................................... 54</p><p>6.1. Estudos básicos ...................................................................................................................... 54</p><p>6.2. Reprodução animal ................................................................................................................. 55</p><p>6.3. Reprodução humana ............................................................................................................... 56</p><p>6.4. Clonagem terapêutica ............................................................................................................. 56</p><p>6.5. Transplante ............................................................................................................................. 57</p><p>7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 58</p><p>CAPÍTULO 3 - BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL ............................................ 60</p><p>1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 60</p><p>2. PROCESSOS FERMENTATIVOS ................................................................................................. 62</p><p>Fermentação - Produção de energia por reações de oxirredução envolvendo substâncias</p><p>orgânicas. Ex.: produção de ácido lático por bactérias láticas (Ex.: Lactobacillus plantarum), de</p><p>acetona-butanol (Clostridium acetobutylicum) ou etanol (Saccharomyces cerevisiae). .................. 63</p><p>3. PRODUTOS DA BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL: APLICAÇÕES E BENEFÍCIOS .................... 64</p><p>3.1. Metabólitos primários e secundários e suas aplicações........................................................... 65</p><p>3.1.1. Metabólitos primários ........................................................................................................ 65</p><p>3.1.1.1. Aminoácidos ............................................................................................................... 65</p><p>3.1.1.2. Vitaminas .................................................................................................................... 65</p><p>3.1.1.3. Nucleotídeos .............................................................................................................. 65</p><p>3.1.1.4. Ácidos Orgânicos ....................................................................................................... 66</p><p>3.1.1.5. Etanol ......................................................................................................................... 67</p><p>3.1.1.6. Enzimas...................................................................................................................... 67</p><p>3.1.2. Metabólitos secundários ................................................................................................... 68</p><p>vi</p><p>3.1.2.1. Antibióticos ................................................................................................................. 68</p><p>3.1.2.2. Agentes antitumorais .................................................................................................. 69</p><p>3.1.2.3. Agentes redutores de colesterol ................................................................................. 69</p><p>3.1.2.4. Agentes usados no transplante de órgãos .................................................................. 69</p><p>3.1.2.5. Agentes antiparasitários ............................................................................................. 69</p><p>3.1.2.6. Bioinseticidas ............................................................................................................. 70</p><p>3.1.3. Produtos alimentícios e bebidas ........................................................................................ 70</p><p>3.1.3.1. Biomassa microbiana ................................................................................................. 70</p><p>3.1.3.2. Queijos e leites fermentados ...................................................................................... 71</p><p>3.1.3.3. Vegetais fermentados ................................................................................................. 71</p><p>3.1.3.4. Bebidas alcoólicas ...................................................................................................... 71</p><p>3.1.4. Produtos voltados para o Meio Ambiente .......................................................................... 71</p><p>3.1.4.1. Produção de compostos químicos a partir de matérias-primas renováveis ................. 71</p><p>3.1.4.2. Geração de energia: biocombustíveis ......................................................................... 72</p><p>3.1.4.3. Produção de inoculantes agrícolas ............................................................................. 72</p><p>3.1.4.4. Produção de biopolímeros: plásticos biodegradáveis ................................................. 73</p><p>3.1.5. Produtos obtidos por bioconversões microbianas ............................................................. 73</p><p>3.1.6. Produtos da Biotecnologia Industrial Moderna .................................................................. 73</p><p>3.1.6.1. Biofármacos ............................................................................................................... 73</p><p>4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 77</p><p>GLOSSÁRIO DE BIOTECNOLOGIA .............................................................. 78</p><p>Introdução</p><p>1</p><p>INTRODUÇÃO</p><p>O homem utiliza a biotecnologia há muito tempo, desde que fez o primeiro pão, produziu a</p><p>primeira taça de vinho e selecionou os melhores grãos de milho para o replantio da nova safra. Na</p><p>atualidade, o pão e cerveja são os componentes mais abundantes na dieta, tanto social e em rituais.</p><p>No século da biotecnologia, convive-se com biotecnologias tradicionais (as antigas</p><p>biotécnicas) e modernas (engenharia genética, genômica, proteômica e clonagem – manipulação</p><p>biológica do DNA). É correto afirmar que incluindo a manipulação genética, a biotecnologia</p><p>genética como era o caso das plantas. O protocolo definido para</p><p>Xenopus também foi utilizado em ovelha e os cordeiros clonados foram obtidos dessa forma.</p><p>A taxa de sucesso desses experimentos foi e ainda é baixa, e foi levemente melhorada ao</p><p>longo dos últimos 15 anos. Cerca de 1 % dos embriões reconstituídos por transferência nuclear deu</p><p>origem a animais normais. Esse número é insuficiente para acelerar a seleção genética. Na verdade,</p><p>o genótipo do embrião do qual as células doadoras foram isoladas não é conhecido. Apenas o</p><p>genótipo e o fenótipo de seus progenitores são conhecidos.</p><p>Para melhorar os resultados da clonagem, protocolos modificados foram adotados, mas com</p><p>sucesso moderado. Uma das razões pela qual a clonagem falha tão frequentemente pode resultar da</p><p>discordância entre os estágios do ciclo de divisão das células doadoras e os oócitos recipientes. Na</p><p>verdade, é fácil imaginar que uma célula doadora na fase mitótica não entregue seus cromossomos</p><p>ao oócito recipiente de uma forma apropriada. A fase da célula doadora é desconhecida na maioria</p><p>dos casos e a transferência nuclear gera provavelmente embriões não viáveis.</p><p>Um número crescente de estudos está progredindo para descrever os fenômenos que são</p><p>regularmente observados após a clonagem. Uma das descobertas mais marcantes é a discrepância</p><p>entre o número de blastocistos obtidos após a transferência nuclear seguido pelo desenvolvimento in</p><p>vitro e o número de recém-nascidos que sobrevivem. Outra descoberta surpreendente é o grande</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>49</p><p>número de abortos tardios que ocorrem após a transferência nuclear e a morte de cerca de 40 % dos</p><p>fetos e recém-nascidos. Diversas anormalidades são comumente observadas, tais como grande</p><p>embrião com uma placenta pouco desenvolvida. Outras observações têm sido constatadas como:</p><p>aplasia tímica, atrofia do rim, flutuações da temperatura corporal, hipertrofia do fígado ou do coração,</p><p>concentração alta de leptina, imunossupressão parcial etc.</p><p>3.2. Transgênese</p><p>3.2.1. Os objetivos e o conceito de transgênese animal</p><p>A transgênese consiste da introdução de uma sequência exógena de DNA no genoma de um</p><p>organismo pluricelular que então se torna presente na maioria das células e é transferida para a</p><p>progênie. A palavra transgênese é, portanto, restrita a plantas e animais. Leveduras, bactérias e</p><p>células cultivadas carregando um fragmento de DNA externo são conhecidas como células</p><p>recombinantes ou transformadas.</p><p>A transgênese é, portanto, diferente da terapia gênica. Na verdade, no último caso, as células</p><p>germinativas não abrigam o DNA externo. A expressão terapia gênica germinativa é também</p><p>utilizada. Ela designa uma terapia que ainda não foi tentada em humanos e que implica que o gene</p><p>externo esteja contido nas células germinativas e transmitido para a progênie.</p><p>Os fragmentos de DNA usados para gerar organismos transgênicos são, na prática, quase</p><p>sempre os genes contem uma sequência precedida por um promotor que direciona sua expressão</p><p>em um RNA e geralmente em uma proteína. No entanto, é fácil imaginar que o DNA externo é</p><p>desprovido da capacidade de ser transcrito e que sua presença é desejável, mas não a de seu</p><p>transcrito.</p><p>O transcrito do gene pode ser um RNA não traduzido em uma proteína. Esse é o caso do</p><p>RNA antisentido, das ribozimas e dos genes transcritos pela RNA polimerase I e III.</p><p>O objetivo da transgênese é adicionar informação genética exógena a um genoma ou</p><p>também suprimir um gene endógeno. Em alguns casos, a substituição de gene funcional por outro</p><p>gene funcional é desejada. O gene exógeno pode ser um mutante do gene endógeno ou um</p><p>completamente diferente.</p><p>A adição de um gene pode ser realizada para fornecer ao organismo uma proteína. Isso pode</p><p>resultar na extinção de um gene endógeno. A adição de um gene pode ser usada para estudar o</p><p>mecanismo de ação de um promotor no organismo inteiro. A associação de genes repórter com</p><p>promotores é geralmente a regra para esse método.</p><p>A substituição do gene é principalmente utilizada para inativar um determinado gene. Na</p><p>prática, ela consiste da substituição do gene endógeno por um mutante inativado. Espera-se que</p><p>essa técnica dê informação sobre a função biológica do gene, como no caso da adição do gene. Na</p><p>verdade, tanto a adição gênica quanto a inativação podem induzir modificações em animais</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>50</p><p>transgênicos, as quais podem ser observadas ou medidas. Mutantes do gene substituído podem</p><p>fornecer informação de uma forma mais sutil.</p><p>O DNA exógeno deve atingir o núcleo da célula para se tornar integrada ao seu genoma. O</p><p>destino do DNA exógeno não é o mesmo dependendo se ele foi introduzido no citoplasma ou</p><p>diretamente no núcleo.</p><p>O DNA transferido em células cultivadas está geralmente na forma de um plasmídeo circular.</p><p>O plasmídeo é clivado pela DNAse citoplasmática em sítios aleatórios. A principal parte do DNA é</p><p>destruída no citoplasma. Uma pequena parte migra para o núcleo, onde ele pode ser transcrito.</p><p>Dessa forma, o DNA exógeno é instável e é eliminado assim que as células se dividem. Uma</p><p>pequena proporção do DNA exógeno se torna integrado no genoma. Durante a transferência do</p><p>citoplasma para o núcleo, os fragmentos de DNA exógeno se associam para formar polímeros</p><p>chamados concatâmeros. No citoplasma, as associações covalentes dos fragmentos do DNA</p><p>ocorrem aleatoriamente, gerando algumas vezes genes rearranjados em sequência ou posição</p><p>cabeça-cauda.</p><p>3.2.2. Transferência do gene nos gametas</p><p>Parece lógico transferir genes em gametas para gerar animais transgênicos. A fertilização</p><p>então traz o DNA exógeno para todas as células do embrião e do adulto. Assim, os primeiros animais</p><p>transgênicos foram obtidos por transferência do DNA em embriões no estágio de primeira célula.</p><p>3.2.2.1. Transferência do gene no esperma</p><p>O esperma maduro tem um genoma inativo que não se replica. Seu DNA é coberto por</p><p>protaminas deixando pouco acesso para o DNA exógeno no genoma do esperma. O DNA exógeno</p><p>não tem chance de se integrar ao DNA do esperma.</p><p>Experimentos realizados há uma década, o qual provou ser fracamente reproduzível, mostrou</p><p>que o esperma incubado na presença de DNA poderia carregá-lo para o oócito durante a fertilização,</p><p>levando a geração de camundongos transgênicos. Estudos bioquímicos mostraram que o DNA se</p><p>liga prontamente ao esperma, mas ainda não foi provado se isso foi seguido pela sua integração. O</p><p>esperma então desempenha a função de um veículo para o DNA exógeno.</p><p>Após vários anos esse método foi estendido para vacas, porcos, ovelhas e ao peixe-arroz (Oryzias</p><p>latipes). Em todos esses casos e por razões desconhecidas os experimentos pareceram ser</p><p>fracamente reproduzíveis. Além disso, na maioria dos casos, o DNA exógeno integrado no genoma</p><p>do hospedeiro foi amplamente rearranjado. Um estudo revelou que até mesmo após uma lavagem</p><p>cuidadosa, o esperma contem DNAse, que degrada o DNA exógeno. A DNAse é abundante no</p><p>plasma seminal e quantidades variáveis da enzima permanece ligada ao esperma, explicando por</p><p>que o experimento não foi reproduzível e por que o DNA exógeno foi fragmentado. Também é</p><p>interessante observar que o DNA exógeno parece induzir a atividade da DNAse no esperma isolado.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>51</p><p>Uma possível interpretação para esse fenômeno é que a DNAse é um meio de proteger o esperma</p><p>da contaminação por DNA exógeno do epidídimo ao oócito.</p><p>4. APLICAÇÕES DA TRANSGÊNESE</p><p>A transgênese é mais utilizada por pesquisadores, mas também pela indústria para diferentes</p><p>propósitos. Por uma questão de conveniência, é possível dividir as aplicações da transgênese animal</p><p>em três categorias. A primeira, e a principal, razão para utilizar animais transgênicos é para obter</p><p>informação fundamental sobre os organismos vivos e as doenças humanas. A segunda razão é usar</p><p>animais como uma fonte de proteínas</p><p>farmacêuticas, células e órgãos. A terceira é melhorar a</p><p>produção animal.</p><p>4.1. Estudos básicos</p><p>A grande maioria dos animais transgênicos é gerada para ser usada como modelos para o</p><p>estudo da função gênica e mecanismos de ação. A tendência neste campo é usar animais de uma</p><p>forma integrada e crescentemente sistemática. Laboratórios especiais pertencentes às universidades</p><p>ou a companhias privadas geram animais transgênicos experimentais (camundongos, C. elegans,</p><p>Drosophila) pela adição ou substituição de um gene. Nesses casos, os genes usados são</p><p>conhecidos e os pesquisadores precisam de animais transgênicos para avaliar uma hipótese sobre a</p><p>função ou mecanismo de controle de seus genes.</p><p>Um método mais recente consiste do “knocking out” (bloqueio) de genes de animais em</p><p>laboratório sem qualquer hipótese particular sobre sua função. Bancos de animais com um gene</p><p>bloqueado por recombinação homóloga ou “gene trapping” estão disponíveis para pesquisadores e</p><p>companhias. Esse método sistemático e o completo seqüenciamento dos genomas dos animais</p><p>podem fornecer a melhor chance de obter o máximo de informação de forma rápida sobre a função</p><p>do gene.</p><p>4.2. Estudo de doenças humanas</p><p>Os métodos descritos acima para estudar a função do gene são também amplamente usados</p><p>para estudar doenças humanas. Na verdade, um gene envolvido em uma doença humana pode ser</p><p>adicionado ou especificamente inativado em camundongos. Os modelos obtidos dessa forma podem</p><p>auxiliar os pesquisadores com animais experimentais sem valor científico a descrever doenças</p><p>humanas e avaliar os efeitos terapêuticos de compostos químicos, proteínas recombinantes ou</p><p>genes transferidos a tecidos de pacientes.</p><p>O camundongo é a espécie mais comumente usada para esse propósito. Embora satisfatório</p><p>em muitos casos, o camundongo não mimetiza algumas das doenças humanas. Isso ocorre devido</p><p>ao fato de o camundongo ser um roedor e não um primata e algumas funções biológicas serem</p><p>diferentes em camundongos e humanos. Um exemplo marcante é a fibrose cística. Essa doença</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>52</p><p>humana é essencialmente causada por mutações do gene CFTR. Camundongos cujo gene CFTR foi</p><p>bloqueado não desenvolve a doença. Sabe-se que a ação do canal de cloro CFTR não mais</p><p>funcional é compensada pelo efeito de outro gene que não possui o mesmo padrão de expressão em</p><p>humanos.</p><p>Muitos camundongos transgênicos são modelos candidatos para o estudo de doenças</p><p>humanas, sejam elas genéticas ou infecciosas. Na prática, apenas um número limitado de</p><p>camundongos parece relevante. Isso ocorre devido o fato de o transgene ou gene bloqueado nem</p><p>sempre gere uma doença que se assemelha a patologia humana. O background genético do</p><p>camundongo é também muito importante. Isso, às vezes, implica que a modificação genética obtida</p><p>em uma linhagem de camundongo tem que ser transferida para outra linhagem por cruzamento.</p><p>4.3. Produção farmacêutica</p><p>Todas as comunidades humanas estão em busca de substâncias que combatam doenças.</p><p>Originalmente, extratos de plantas naturais desempenhavam esse papel. Esse método ainda é muito</p><p>popular. A emergência da química tornou possível determinar a estruturas das moléculas ativas nos</p><p>extratos vegetais e, em alguns casos, obter essas moléculas ou análogos através da síntese</p><p>química. O caso da aspirina é ilustrativo. Extrato de folhas de salgueiro foi amplamente utilizado até</p><p>que se descobriu que seu composto ativo é o ácido salicílico. A síntese química de um análogo, o</p><p>ácido acetilsalicílico, conhecido como aspirina, foi alcançada no início do século XX. Esse protocolo</p><p>ainda é utilizado para preparar drogas muito eficientes.</p><p>A engenharia genética tem contribuído muito nesse aspecto. Um gene que codifica uma</p><p>proteína de interesse farmacêutico pode ser isolado, inserido em um vetor de expressão e transferido</p><p>para células ou organismos que se tornam produtores da proteína em escala industrial.</p><p>Isso foi conseguido pela primeira vez com a insulina humana, que foi preparada a partir de</p><p>uma bactéria geneticamente modificada há 15 anos. A maioria dos diabéticos é agora tratada com</p><p>insulina recombinante e não mais com insulina extraída do porco. O hormônio recombinante tem</p><p>maior grau de pureza e é estruturalmente idêntico à insulina nativa humana.</p><p>Algumas observações levaram ao uso de células animais geneticamente modificadas como a</p><p>fonte de proteínas recombinantes. Essa técnica é usada com sucesso para preparar proteínas em</p><p>escala industrial. Anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de linfócitos B imortalizados</p><p>cultivados in vitro conhecidos como hibridomas. Sua produção continua limitada e muitos hibridomas</p><p>são geneticamente instáveis e perdem os genes que codificam os anticorpos.</p><p>A produção de proteínas recombinantes a partir de células é uma realidade, mas esse</p><p>processo tem sua limitação. Quantidades de proteínas que não excedem alguns quilogramas por ano</p><p>podem ser preparadas a partir de células com um custo moderado. Outra técnica possível é usar</p><p>células animais em organismos vivos. As vantagens são que as células são tão numerosas quanto</p><p>requeridas e mantidas em condições metabólicas ideais. Essa possibilidade foi levantada pela</p><p>primeira vez em 1982, quando o primeiro camundongo expressando seu transgene em um nível</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>53</p><p>elevado foi obtido. Esses animais carregando o gene do hormônio de crescimento de rato ou humano</p><p>exibiram crescimento acelerado e alguns deles tiveram uma concentração alta de hormônio de</p><p>crescimento no seu sangue (acima de 50 µg/mL). Esse fato originou a ideia de que o sangue de</p><p>animais transgênicos poderia ser uma fonte de proteínas recombinantes.</p><p>4.4. Melhoramento genético</p><p>A seleção genética é um dos métodos principais usados para melhorar a produção animal.</p><p>Essa técnica tem se tornado mais poderosa desde a descoberta das leis da hereditariedade e ainda</p><p>vem sendo melhorada pelo uso de marcadores genéticos. Com a transgênese, se espera gerar</p><p>mutantes de interesse que não poderiam ser obtidos pela seleção clássica, pelo menos dentro de um</p><p>intervalo de tempo considerável.</p><p>A transgênese em plantas, que é baseada somente na adição do gene por razões técnicas e,</p><p>em hipótese alguma, na substituição do gene, tem gerado algumas novas variedades amplamente</p><p>apreciadas por agricultores. O mesmo é teoricamente possível para animais. Na prática, isso é</p><p>parcialmente verdadeiro. Na verdade, a transgênese é ainda mais complexa e custosa em animais</p><p>do que em plantas. Além disso, a introgressão das características genéticas introduzidas pelos</p><p>transgenes pode não ser um processo rápido, até mesmo se a clonagem dos fundadores é</p><p>implementada. O número de repetições possíveis em animais é e continuará sendo menor em</p><p>animais do que em plantas. Os genes candidatos para melhorar a produção animal por transgênese</p><p>deve, portanto, ser cuidadosamente selecionados.</p><p>5. GENES CANDIDATOS QUE PODEM MELHORAR A PRODUÇÃO ANIMAL</p><p>Resistência a doenças: Na agricultura, mais de 40 por cento do que é colhido pode ser</p><p>perdido com resultado de diferentes doenças. No melhoramento, a perda pode atingir 20 por cento.</p><p>Os genes capazes de prevenir doenças em animais são teroricamente muito diversos. Esses genes</p><p>podem inibir a infecção ou replicação. Alguns alelos naturais são conhecidos por proteger os</p><p>indivíduos contra doenças. Esses genes são raramente identificados. O estudo sistemático do</p><p>genoma de animais de fazenda contribuirá progressivamente para identificar esses genes, que</p><p>podem ser transferidos para animais da mesma espécie e, possivelmente de outra espécie para</p><p>protegê-los contra determinada doença.</p><p>Digestão e metabolismo: Otimizar a digestão em animais de fazenda pode ter diversas</p><p>vantagens. Ela pode diminuir o risco de rejeição e poluição, reduzir o consumo de alimento e</p><p>acentuar a produção. Modificações metabólicas podem gerar</p><p>animais melhores adaptados à</p><p>alimentação disponível ou de baixo-custo.</p><p>Composição do leite: O leite é fonte de cerca de 30 por cento das proteínas consumidas por</p><p>humanos em países desenvolvidos. A produção de leite tem sido melhorada pela seleção e</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>54</p><p>alimentação otimizada. A composição do leite foi levemente modificada. A concentração lipídica foi</p><p>essencialmente acentuada.</p><p>6. APLICAÇÕES DA CLONAGEM</p><p>A clonagem oferece a oportunidade única de obter células totipotentes a partir de células</p><p>totalmente diferenciadas. A clonagem é, portanto, um novo e atraente modelo experimental para</p><p>estudar os mecanismos responsáveis pela desdiferenciação e diferenciação celular. A clonagem</p><p>também é um novo método de reprodução animal e potencialmente de reprodução humana,</p><p>produzindo indivíduos geneticamente idênticos a um adulto. Aplicações potenciais foram</p><p>desenvolvidas para melhor controlar a reprodução animal e humana. Hoje, se sabe que a</p><p>transgênese é em alguns casos, facilitada pela clonagem. Um número de doenças poderia ser</p><p>curado pela terapia celular. Isso implica que células meristemáticas estão disponíveis para regenerar</p><p>tecidos lesionados. Células meristemáticas embrionárias podem ser obtidas por clonagem e células</p><p>meristemáticas de órgãos podem ser derivadas de células meristemáticas embrionárias. Portanto,</p><p>teoricamente, a clonagem poderia contribuir para a terapia celular por autografting. Na prática, essas</p><p>aplicações ainda são iniciais e algumas delas podem não se tornar realidade devido a problemas</p><p>técnicos ou éticos.</p><p>6.1. Estudos básicos</p><p>O nascimento da ovelha Dolly demonstrou que a composição genética de células</p><p>diferenciadas é essencialmente a mesma de um embrião. A evidência de que o genoma de uma</p><p>célula adulta pode gerar um embrião foi confirmada.</p><p>Uma das principais questões levantadas pela clonagem é conhecer como os numerosos</p><p>genes que são silenciados em células diferenciadas podem ser reativados para participar do</p><p>desenvolvimento do embrião. Esse processo raramente ocorre devido à constante baixa eficiência da</p><p>clonagem. As razões para numerosas falhas são desconhecidas. É convincente que um determinado</p><p>número de genes em células diferenciadas seja mutado e inativado. O desenvolvimento do embrião</p><p>pode ser prejudicado se genes essenciais não requeridos para sobrevivência da célula adulta não</p><p>funcionem mais.</p><p>Um fator é marcante. A maioria dos animais clonados incapazes de sobreviver após o</p><p>nascimento apresenta síndromes repetidas, algumas delas são similares a determinadas doenças do</p><p>desenvolvimento humano. Isso sugere que o mesmo grupo de genes não é funcional nos clones.</p><p>Esse fato é consistente com mutações genéticas aleatórias em células adultas usadas como</p><p>doadoras nucleares.</p><p>Estudos recentes sustentam fortemente a ideia de que animais clonados são modificados</p><p>epigeneticamente. Na verdade, o DNA é metilado anormalmente em embriões gerados pela</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>55</p><p>clonagem e não por fertilização normal. Subsequentemente, muitos genes não são reativados pela</p><p>desmetilação do DNA e indisponibilizados para o desenvolvimento do embrião. Uma identificação</p><p>sistemática dos genes metilados em clones que se desenvolvem normalmente ou não poderia</p><p>explicar porque tantos clones são anormais. Esse estudo poderia revelar a função de alguns genes</p><p>na organogênese. Isso não implica necessariamente que a metilação do gene nos clones poderia ser</p><p>controlada e que isso acentuaria os resultados da clonagem. A metilação do DNA parece ser um</p><p>processo sutil, que pode não ser facilmente modificado em alguns genes específicos. O defeito na</p><p>reprogramação do genoma e a metilação anormal do DNA pode justificar os efeitos da clonagem na</p><p>vida dos animais.</p><p>6.2. Reprodução animal</p><p>Reprodução por clonagem pode teoricamente acelerar a seleção genética de diferentes</p><p>formas. Clones de animais com um genoma valioso podem ser gerados e cruzados com outros</p><p>animais da mesma raça ou não, em um número limitado. As propriedades fenotípicas dos animais</p><p>podem sugerir que vale a pena os traços surgidos em animais clonados serem introgredidos por</p><p>reprodução clássica em uma grande quantidade de animais reprodutores.</p><p>Apesar da baixa eficiência e da incerteza que envolve a sobrevivência em longo prazo de</p><p>animais de fazenda clonados, a clonagem deve ser implementada para gerar geneticamente animais</p><p>idênticos usados como reprodutores para acelerar a seleção genética. De acordo com isso,</p><p>reprodutores forçados prematuramente a parar suas atividades por certas razões e particularmente</p><p>por acidentes letais, podem ser clonados utilizando-se de células congeladas e obter sua reprodução</p><p>via reprodutores clonados. Este protocolo está atualmente sendo seguido em diversos laboratórios.</p><p>Não se espera que o impacto da clonagem seja significante, enquanto sua eficiência for baixa.</p><p>Todavia, seu uso, do modo como está hoje, parece ser justificável para vários propósitos.</p><p>Cavalos de corrida são geralmente muito valiosos e seus clones podem produzir campeões</p><p>mais rapidamente do que com a reprodução clássica.</p><p>Por razões não compreensíveis, animais de estimação serão clonados futuramente.</p><p>Recentemente, um gato foi clonado pela transferência nuclear clássica. Os donos desses animais</p><p>acreditam que seus companheiros favoritos continuarão a viver com eles embora eles já estejam</p><p>mortos. Um mercado significante foi identificado nesta área e empresas foram criadas para clonas</p><p>animais domésticos. Os clientes destas empresas podem ficar amargamente desapontados se a</p><p>saúde de seus bichinhos clonados começar a se deteriorar prematuramente, ou se eles morrerem ou</p><p>se simplesmente não forem estritamente similar aos seus genitores, como é o caso do gato clonado.</p><p>A clonagem é considerada uma forma ímpar de salvar espécies ameaçadas de extinção.</p><p>Tentativas de salvar o gauro (Bos gaurus) – um raro ruminante selvagem – por clonagem, usando</p><p>oócitos de vacas como recipientes, deu origem a um animal que não sobreviveu. Esta falha pode ser</p><p>devido à técnica de clonagem per se e não necessariamente ao fato de que duas espécies diferentes</p><p>contribuíram para a geração do clone. A mesma abordagem foi bem sucedida para outros</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>56</p><p>ruminantes selvagens. Células foram coletadas de muflões encontrados mortos na pastagem. Seus</p><p>núcleos foram transferidos para oócitos de ovelhas enucleados. Aparentemente um muflão normal</p><p>nasceu. Outras tentativas estão sendo aplicadas com outras espécies ameaçadas. A eficiência da</p><p>técnica de clonagem bem como o limitado apoio financeiro atualmente reduzem a chance desta</p><p>abordagem alcançar algum sucesso significativo.</p><p>6.3. Reprodução humana</p><p>O primeiro grande impacto na opinião pública após o nascimento da ovelha Dolly foi o de que</p><p>humanos adultos poderiam ser reproduzidos por clonagem. Embora a clonagem só tenha sido</p><p>alcançada em um número limitado de espécies, é difícil acreditar que seja impossível em humanos.</p><p>Tentativas de gerar embriões humanos por transferência nuclear foram feitas na Coréia e nos</p><p>Estados Unidos. Os resultados foram preliminares para serem convincentes. Em ambos os casos,</p><p>apenas alguns embriões começaram a se desenvolver após a transferência nuclear e pararam</p><p>rapidamente. Isso sugere que a clonagem em humanos pela transferência nuclear provavelmente</p><p>não será tão fácil como em outras espécies. Claramente, grandes esforços têm sido feitos para</p><p>aperfeiçoar a técnica de clonagem antes de se estender a humanos.</p><p>Além das dificuldades da técnica, a clonagem humana principalmente problemas éticos.</p><p>6.4. Clonagem terapêutica</p><p>Logo após o nascimento da Dolly, a questão da clonagem terapêutica ganhou impulso. A</p><p>terapia celular é uma técnica extremamente promissora para humanos. A ideia é transplantar células</p><p>diferenciadas em pacientes para recuperar um órgão lesionado. Essa prática</p><p>é muito comum em um</p><p>número limitado de casos. A transfusão de sangue é o exemplo mais popular. A regeneração de pele</p><p>in vitro a partir de células da pele do paciente é uma forma clássica de tratar vítimas que sofreram</p><p>queimaduras. A tentativa de transplantar células pancreáticas humanas em pessoas diabéticas não</p><p>teve sucesso até hoje por diversas razões técnicas. A implantação de células hepáticas humanas</p><p>para cura de hepatite fulminante tem tido sucesso limitado. Uma regeneração parcial do músculo</p><p>cardíaco após transplante de células do músculo esquelético homólogo tem sido alcançada</p><p>recentemente e parece ser uma técnica promissora.</p><p>Células meristemáticas são encontradas em um número limitado de órgãos. Elas são raras e</p><p>difícil de serem cultivadas na maioria dos casos. Por essas razões, o seu uso na terapia celular é</p><p>limitada até o momento.</p><p>Células meristemáticas potencialmente capazes de regenerar um órgão pode ter diferentes</p><p>fontes. Órgãos de adultos são, com certeza, uma fonte possível, embora limitada. Células</p><p>meristemáticas embrionárias em camundongos são conhecidas por se diferenciarem in vitro sob</p><p>influência de diversos indutores.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>57</p><p>Uma alternativa é gerar embriões por transferência nuclear usando células doadoras dos</p><p>pacientes. Nessas condições, as células pluripotentes e diferenciadas derivadas de embriões</p><p>clonados são, inerentemente, histocompatíveis com o paciente.</p><p>Esse protocolo foi chamado de clonagem terapêutica antes de ser implementado. Esse</p><p>método ainda é apenas teórico. Na verdade, condições experimentais para clonagem em humanos</p><p>são ainda essencialmente desconhecidas. Não se sabe se as células pluripotentes e diferenciadas</p><p>teriam as propriedades biológicas esperadas para recuperar o tecido lesionado. Os defeitos</p><p>observados em embriões clonados, que severamente alteram o seu desenvolvimento, podem não</p><p>ser problemas reais para a terapia celular. Na verdade, um número mais limitado de genes funcionais</p><p>é requerido para assegurar a atividade normal de uma célula diferenciada do que o desenvolvimento</p><p>completo de um embrião.</p><p>6.5. Transplante</p><p>O número de pacientes que precisam de células ou órgãos está crescendo e sabe-se que as</p><p>fontes de células e órgãos humanos são e continuarão sendo insuficientes. A ideia de utilizar órgãos</p><p>de animais surgiu a um século atrás. Essa ideia foi seguida por transplantes experimentais de órgãos</p><p>de diferentes espécies aos pacientes. Em diversos casos, os experimentos resultaram em</p><p>transplantes com sucesso seguidos de uma resposta de rejeição rápida e severa. Dois órgãos, os</p><p>testículos e a câmara interna do olho, foram rejeitados muito mais lentamente. Hoje, se sabe que</p><p>esses tecidos expressam uma molécula chamada ligante Fas na sua superfície, o qual induz a morte</p><p>de células imune ativadas.</p><p>Diferentes espécies animais foram testadas como fonte de órgãos humanos. Os primatas</p><p>incluindo os chimpanzés foram originalmente considerados os mais apropriados. Rapidamente, essa</p><p>escolha foi descartada. Órgãos de primatas são rejeitados. Os primatas são espécies protegidas e</p><p>seu melhoramento genético é extremamente caro. Além disso, primatas tem o maior risco de</p><p>transferir patógenos a humanos.</p><p>Após descartar os primatas como doadores, os porcos foram escolhidos por constituírem uma</p><p>espécie próxima aos humanos, serem onívoros e com tamanho similar. E ao mesmo tempo, serem</p><p>considerados tão diferentes dos humanos para transferirem seus patógenos. Além disso, o</p><p>melhoramento genético do porco pode ser realizado em condições livres de patógenos por um custo</p><p>moderado e ainda, o porco é utilizado com abundância como alimento para humanos, o que reduziria</p><p>o sacrifício adicional deste animal.</p><p>No futuro, a clonagem pode ser muito útil para gerar animais geneticamente idênticos. Os</p><p>indivíduos com o melhor genótipo para transplante em humanos pode ser obtido dessa forma.</p><p>Existem diferentes possíveis métodos de obtenção de células ou órgãos de humanos ou</p><p>porcos para o transplante em pacientes. Mas é impossível prever qual deles será o mais apropriado,</p><p>pois um método parecerá solucionar um determinado problema, enquanto outro método será mais</p><p>eficiente em outra questão.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>58</p><p>7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS</p><p>Folch, J., Cocero, M.J., Chesné, P., Alabart, J.L., Domínguez, V., Cognié, Y., Roche, A., Fernández-Arias, A.,</p><p>Martí, J.I., Sánchez, P., Echegoyen, E., Beckers, J.F., Bonastre, A.S., Vignon, X. (2009) First birth of an</p><p>animal from an extinct subspecies (Capra pyrenaica pyrenaica) by cloning. Theriogenology. 71(6):1026-</p><p>1034.</p><p>Houdebine, L. (2003) Animal Transgenesis and Cloning. John Wiley & Sons, Ltd. 212p.</p><p>Takahashi, K., Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult</p><p>fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126(4):663-76.</p><p>Biotecnologia Animal</p><p>59</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>1Bolsista UAB. Pós-graduanda em Biociências e Biotecnologia – CBB/UENF.</p><p>2Bolsista de extensão. Graduanda em Ciências Biológicas – CBB/UENF.</p><p>3Eng. de alimentos, Doutora, Professora Associada da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy</p><p>Ribeiro.</p><p>CAPÍTULO 3 - BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL</p><p>Aline Martins de Vita1</p><p>Vanessa de Souza Rodrigues2</p><p>Marília Amorim Berbert de Molina3</p><p>1. INTRODUÇÃO</p><p>O ramo da Biotecnologia voltado para a produção industrial é denominado Biotecnologia</p><p>Industrial. No seu sentido mais amplo, consiste no uso de microrganismos em processos</p><p>fermentativos visando à produção de uma grande variedade de compostos com aplicação em</p><p>diversos setores da economia. Compreende uma alternativa promissora e vantajosa às rotas</p><p>químicas de obtenção de produtos-chave para a saúde humana e animal, agricultura e meio-</p><p>ambiente, sendo também fundamental na produção industrial de diversos tipos de alimentos e</p><p>bebidas.</p><p>A Biotecnologia Industrial não é uma ciência recente. Ao contrário, como verdadeiras “fábricas</p><p>celulares”, os microrganismos têm sido explorados há muitos séculos pelo Homem, mesmo antes de</p><p>se ter consciência da sua existência, e hoje os produtos e processos biotecnológicos exercem um</p><p>profundo impacto na nossa vida diária. Três fases podem ser distinguidas ao longo da história da</p><p>Biotecnologia Industrial:</p><p>1. A primeira fase pode ser chamada de microbiologia industrial tradicional. Compreende o</p><p>conjunto de processos tradicionais seculares de fermentação para a preservação de leite e</p><p>vegetais ou para a obtenção de produtos como pão, queijos, vinagre, vinho, cerveja, aguardentes, e</p><p>outros produtos fermentados;</p><p>2. A segunda fase da microbiologia industrial, chamada de Fermentação Industrial moderna,</p><p>nasceu no início do século XX. É caracterizada pelo surgimento dos primeiros processos</p><p>fermentativos em grande escala, voltados para a fabricação de solventes, ácidos orgânicos,</p><p>vitaminas, enzimas e outros produtos. Em meados do século, entrou em cena a fermentação</p><p>para a produção e antibióticos, sendo desenvolvidos os processos de produção industrial de</p><p>penicilina e estreptomicina. As pesquisas sobre a ampliação de escala destes dois antibióticos</p><p>permitiu o nascimento de um novo campo da engenharia, que incorpora os conhecimentos da</p><p>microbiologia e da bioquímica para o desenvolvimento industrial de processos fermentativos,</p><p>chamado de engenharia bioquímica. O desenvolvimento científico na área de genética</p><p>microbiana foi também de grande importância neste período, sendo geradas novas tecnologias</p><p>para o melhoramento de cepas microbianas de interesse industrial;</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>61</p><p>3. A terceira fase é representada pela era revolucionária da tecnologia do DNA recombinante,</p><p>sendo designada como fase da Biotecnologia Industrial moderna. Após muitos anos de</p><p>descobertas em genética básica, o desenvolvimento das técnicas de manipulação de DNA</p><p>alcançado na década de</p><p>setenta em laboratórios da Universidade de Stanford e da Califórnia,</p><p>nos Estados Unidos, permitiu a criação de uma nova indústria de biotecnologia ao redor do</p><p>mundo. O impacto destes produtos está voltado principalmente para a área de saúde,</p><p>diagnósticos, agricultura e obtenção de produtos químicos, mas promete também fazer</p><p>incursões nas práticas de outras indústrias como petróleo, mineração, alimentos e meio</p><p>ambiente.</p><p>Diante do rápido desenvolvimento da Biotecnologia Industrial moderna, outros autores (Glazer</p><p>e Nikaido, 1995) propõem a divisão da história da Biotecnologia Industrial em apenas dois períodos:</p><p> A era pré-tecnologia do DNA recombinante, que compreende todo o período até 1982, no qual as</p><p>atividades metabólicas de alguns microrganismos eram exploradas para a produção de bebidas</p><p>alcoólicas e alimentos fermentados ou outras transformações microbianas (Tabela 1). Neste</p><p>período os produtos alimentícios representavam cerca de 80% do mercado de todas as</p><p>aplicações biotecnológicas.</p><p> A era pós- tecnologia do DNA recombinante, que compreende o período de 1982 até os dias de</p><p>hoje, é marcada pelo rápido desenvolvimento de proteínas de uso terapêutico pelo uso da</p><p>engenharia genética. O primeiro grande fruto da produção em larga escala de proteínas</p><p>codificadas por genes humanos clonados em microrganismos foi a insulina recombinante</p><p>humana, produzida através da inserção de genes humanos em plasmídeos e expressão destes</p><p>na bactéria Escherichia coli, aprovada para uso clínico em 1982. O segundo produto a chegar ao</p><p>mercado foi o hormônio de crescimento humano (hGH). Nos últimos anos cresce o número de</p><p>produtos de genes humanos expressos em bactérias e um número expressivo de produtos</p><p>voltados para a saúde humana vem sendo desenvolvidos, como será visto mais adiante. Mas, é</p><p>preciso destacar que, mesmo com os avanços da moderna biotecnologia industrial, a indústria</p><p>de alimentos continua a dominar economicamente o mercado biotecnológico e todos os produtos</p><p>listados na Tabela 1 continuam sendo importantes, embora os métodos de fabricação venham</p><p>sendo melhorados para incorporar avanços obtidos com a engenharia genética.</p><p>Tabela 1 – Principais produtos da Biotecnologia Industrial e suas aplicações antes do advento da</p><p>Engenharia Genética.</p><p>PRODUTO PRINCIPAIS APLICAÇÕES</p><p>Sucos fermentados e licores destilados Bebidas</p><p>Queijos Alimentos</p><p>Antibióticos Medicamentos</p><p>Álcool industrial Aditivo a combustível</p><p>Xaropes de frutose Adoçantes</p><p>Aminoácidos Aditivo de alimentos e rações; agentes</p><p>flavorizantes; adoçantes; preservantes de</p><p>alimentos</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>62</p><p>Levedura de panificação Aditivo alimentar; suplemento nutricional</p><p>Esteróides Agentes terapêuticos; promotores de</p><p>crescimento animal</p><p>Vitaminas Aditivos para alimentos e rações</p><p>Ácido cítrico Aditivo para alimentos</p><p>Enzimas Processamento de alimentos; detergentes para</p><p>roupa;</p><p>Vacinas Prevenção de doenças</p><p>Gomas (polissacarídeos) Emulsificantes de alimentos, espessantes e</p><p>estabilizadores</p><p>Adaptado de Glazer e Nikaido (1995).</p><p>Após os primeiros resultados experimentais das técnicas de DNA recombinante e o surgimento</p><p>das primeiras empresas de Biotecnologia nos EUA no final da década de 70, numerosas outras</p><p>empresas foram criadas, chegando a constituir um total de 1.100 empresas em 1991, com um</p><p>faturamento de US$2,9 bilhões. Em 2005 havia 4.200 empresas de Biotecnologia em todo o mundo,</p><p>com um mercado total de US$63bilhões. Números mais atuais apontam para um mercado ainda maior.</p><p>Alguns exemplos incluem a empresa holandesa DSM, que alcançou o marco de US$2 bilhões em</p><p>venda de produtos produzidos através da Biotecnologia Industrial em 2003. A americana DuPont</p><p>informou recentemente que já investiu US$500 milhões em uma planta de projetada para produzir</p><p>polímeros e ácido adípico, ambos usados na fabricação de fibras para uso na produção de têxteis. As</p><p>empresas Dow e Cargill investiram US$800 milhões na construção de uma planta industrial para</p><p>produção de polilactato (PLA) a partir de milho. PLA é um poliéster obtido pela polimerização de ácido</p><p>lático produzido por fermentação.</p><p>Em anos recentes, tanto o governo americano, quanto vários governos na Europa, têm aprovado</p><p>subsídios para estimular pesquisa e desenvolvimento na área de Biotecnologia Industrial. No Brasil,</p><p>diversas agências federais e estaduais de fomento à pesquisa também têm investido em diversos</p><p>campos da Biotecnologia, assim como várias empresas têm sido criadas.</p><p>2. PROCESSOS FERMENTATIVOS</p><p>O termo fermentação, do ponto de vista bioquímico, consiste em um processo de degradação</p><p>de um substrato, efetuado pela célula microbiana, a fim de produzir energia (ATP), sob condições</p><p>anaeróbicas. Do ponto de vista biotecnológico, as denominações “fermentação” ou “processo</p><p>fermentativo” são usadas para designar qualquer transformação intermediada por um</p><p>microorganismo através de uma seqüência de reações bioquímicas visando à obtenção de um</p><p>produto de interesse. Neste caso, as reações podem acontecer na presença ou ausência de</p><p>oxigênio. O processo é realizado em equipamentos chamados fermentadores ou biorreatores, que</p><p>são reatores onde ocorrem as reações químicas catalisadas pelos biocatalizadores, que são as</p><p>células microbianas vivas ou suas enzimas. Em termos industriais, portanto, são designados</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>63</p><p>processos fermentativos transformações envolvendo respiração microbiana, biossíntese e fotossíntese,</p><p>como segue:</p><p> Respiração - Maximização da produção de energia via ciclo de Krebs na utilização de</p><p>microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos como na produção de biomassa. Ex.:</p><p>produção de levedura de panificação (Saccharomycces cerevisiae).</p><p> Fermentação - Produção de energia por reações de oxirredução envolvendo substâncias</p><p>orgânicas. Ex.: produção de ácido lático por bactérias láticas (Ex.: Lactobacillus plantarum),</p><p>de acetona-butanol (Clostridium acetobutylicum) ou etanol (Saccharomyces cerevisiae).</p><p> Biossíntese - Obtenção de produtos finais do anabolismo, como vitaminas, antibióticos,</p><p>polissacarídeos, aminoácidos, enzimas e outras proteínas (diversas espécies microbianas).</p><p> Fotossíntese - Aplicações de microrganismos fotossintetizantes para conversão de energia</p><p>luminosa em energia química como a produção de biomassa alimentar com Scenedesmus,</p><p>Chlorella e Spirulina.</p><p>Dentre os microorganismos com aplicação industrial em processos fermentativos, destacam-se</p><p>as bactérias, os fungos filamentosos e as leveduras (fungos unicelulares). Para que um</p><p>microrganismo tenha um desempenho eficiente e adequado em qualquer processo fermentativo, é</p><p>importante que suas características sejam respeitadas. Ou seja, independentemente do gênero,</p><p>espécie ou linhagem microbiana empregada, é preciso fornecer um meio de cultivo que contenha os</p><p>nutrientes necessários para garantir tanto o seu crescimento quanto a formação do produto de</p><p>interesse. Com o mesmo objetivo, é também imprescindível fornecer as condições ambientais</p><p>propícias ao desenvolvimento microbiano, como temperatura, pH e suprimento de oxigênio.</p><p>Microrganismos utilizados na obtenção de produtos de interesse industrial, devem ainda</p><p>apresentar algumas características importantes. A cultura deve ser pura, geneticamente estável, ter</p><p>elevada eficiência na conversão do substrato em produto e não deve ser patogênica.</p><p>Considerando o metabolismo microbiano inerente de cada espécie empregada, os produtos</p><p>fermentativos podem ser divididos em metabólitos primários e secundários. Os metabólitos</p><p>primários constituem os produtos intermediários e finais do metabolismo anabólico, sendo usados</p><p>pelas células microbianas para a síntese de macromoléculas essenciais. São, portanto, essenciais</p><p>para o crescimento vegetativo das células microbianas. Já os metabólitos secundários são</p><p>compostos formados quando o crescimento microbiano entra na</p><p>fase de desaceleração, não tendo</p><p>nenhuma função na multiplicação celular. São produzidos por grupos taxonômicos restritos de</p><p>microrganismos. Na natureza, os metabólitos secundários são importantes para os organismos que</p><p>os produzem, funcionando como (i) os hormônios sexuais, (ii) ionóforos, (iii) proteção contra</p><p>competidores ou (iv) agentes de simbiose.</p><p>Os processos fermentativos podem ser divididos em dois tipos: processos submersos (ou</p><p>fermentação submersa ou em estado líquido) e processos em estado sólido (ou fermentação em</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>64</p><p>estado sólido). Os processos submersos são caracterizados pela presença de água livre no</p><p>biorreator e constituem a maioria dos processos industriais utilizados atualmente. O processo em</p><p>estado sólido é caracterizado pela ausência de água livre no meio, acarretando num menor teor de</p><p>umidade em comparação aos processos submersos. Neste caso, o cultivo do microrganismo é</p><p>realizado sobre ou dentro de partículas de matriz sólida, que pode ser o próprio substrato ou um</p><p>material inerte impregnado com nutrientes. O teor de umidade deve assegurar o crescimento e o</p><p>metabolismo microbiano, mas não exceder a capacidade de ligação da água com a matriz sólida. Em</p><p>geral este sistema é utilizado para a realização de processos envolvendo fungos filamentosos,</p><p>devido ao seu crescimento em condições aeróbicas e à sua forma de crescimento em micélios que é</p><p>favorecida nessas condições. É principalmente utilizado para a produção de enzimas, mas também</p><p>empregado para processos tradicionais como a produção de molho de soja (shoyo) e alguns tipos de</p><p>queijos, como o Gorgonzola e o Camembert.</p><p>A obtenção de produtos do metabolismo microbiano nem sempre é feita com o uso de células</p><p>íntegras dos microrganismos. Nos chamados Processos Enzimáticos, enzimas microbianas são</p><p>utilizadas para catalisar reações de transformação de diferentes substratos para obtenção de</p><p>diferentes produtos. As enzimas são catalisadores muito eficientes. Ao contrário dos catalisadores</p><p>inorgânicos, as enzimas têm alta especificidade, ou seja, formam produtos seletivamente. Esta é uma</p><p>característica muito útil nos processos industriais, uma vez que quantidades mínimas de produtos</p><p>secundários são formadas, trazendo benefícios econômicos e ambientais. Outras vantagens do ponto</p><p>de vista industrial incluem os rendimentos elevados alcançados e as condições brandas de operação. O</p><p>consumo energético requerido nos processos enzimáticos é também muito menor em comparação com</p><p>os de via química.</p><p>Produtos biotecnológicos podem também ser obtidos através de processos chamados</p><p>Bioconversões ou Biotransformações microbianas, que são muito semelhantes aos processos</p><p>enzimáticos. A diferença fundamental é que nas bioconversões a enzima (ou enzimas) responsável</p><p>pela transformação do substrato em produto não é separada da célula produtora. Neste caso, a</p><p>vantagem adicional é que as enzimas contidas nas células já estão naturalmente imobilizadas, o que</p><p>facilita sua recuperação e reutilização.</p><p>3. PRODUTOS DA BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL: APLICAÇÕES E BENEFÍCIOS</p><p>São inúmeros os produtos da Biotecnologia Industrial e suas aplicações. O crescente interesse</p><p>de pesquisadores e empresas por esta área, bem como o aumento de investimentos por parte de</p><p>governos e da iniciativa privada, tem ajudado a acelerar o ritmo em que o conhecimento científico é</p><p>acumulado e a ampliar a gama de aplicações comerciais para esta ciência, com inúmeros benefícios</p><p>para a sociedade. A Biotecnologia Industrial permite:</p><p>• O desenvolvimento de novos produtos;</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>65</p><p>• A melhora de processos industriais já existentes;</p><p>• A melhora da qualidade de produtos;</p><p>• A substituição de matérias-primas obtidas de petróleo;</p><p>• A economia de energia e água;</p><p>• A redução de resíduos industriais (tecnologias limpas).</p><p>3.1. Metabólitos primários e secundários e suas aplicações</p><p>3.1.1. Metabólitos primários</p><p>3.1.1.1. Aminoácidos</p><p>Um grande número de aminoácidos essenciais não é sintetizado por animais e pelo homem,</p><p>devendo ser introduzidos na alimentação humana e no enriquecimento de ração animal. Os</p><p>aminoácidos são também empregados na medicina como componentes de soluções usadas no</p><p>tratamento pós-operatório e como desintoxicantes nas disfunções hepáticas e gastrointestinais. São</p><p>empregadas como matéria-prima na indústria química para a produção de fibras e resinas, na</p><p>fabricação de cosméticos e como substâncias surfactantes. São utilizados para realçar o sabor de</p><p>um alimento ou conferir-lhe um sabor característico, caracterizando o chamado efeito flavorizante.</p><p>São exemplos de flavorizantes o ácido glutâmico, o ácido aspártico e L-alanina. Cerca de 725 mil</p><p>toneladas de glutamato monossódico são fabricadas anualmente por fermentação usando várias</p><p>espécies de bactérias dos gêneros Corynebacterium e Brevibacterium. A maior parte dos cereais</p><p>consumidos no mundo é deficiente em L-lisina e por isso este aminoácido essencial se tornou um</p><p>importante produto industrial. Cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum têm sido utilizadas na</p><p>sua produção.</p><p>O mercado mundial de aminoácidos chega a US$ 1,5 bilhão para L-glutamato e L-lisina, US$</p><p>198 milhões para a L-fenilalanina e US$ 43 milhões para L-aspartato (Demain e Adrio, 2008).</p><p>3.1.1.2. Vitaminas</p><p>Os fungos Eremothecium ashbyii e Ashbya gossypii são capazes de produzir Riboflavina</p><p>(vitamina B2) em concentrações acima de 20 g/L. Novos processos de produção foram</p><p>desenvolvidos nos anos recentes usando leveduras do gênero Candida, que produzem até 30 g/L de</p><p>vitamina B2. A vitamina B12, cujo mercado mundial é de mais de $70 milhões, é produzida</p><p>industrialmente por Propionibacterium shermanii e Pseudomonas denitrificans.</p><p>3.1.1.3. Nucleotídeos</p><p>O interesse comercial em nucleotídeos produzidos por fermentação está voltado para dois</p><p>produtos: ácido guanílico (GMP) e ácido iosínico (IMP), que agem como flavorizantes (realçadores de</p><p>sabor em alimentos). Cerca de 2.500 toneladas de GMP e IMP são produzidas anualmente no</p><p>Japão, com um mercado de US$ 350 milhões.</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>66</p><p>3.1.1.4. Ácidos Orgânicos</p><p>Os fungos filamentosos são largamente utilizados para a produção comercial de ácidos</p><p>orgânicos, mas algumas bactérias também são empregadas em processos industriais. Exemplos de</p><p>ácidos produzidos por microrganismos incluem:</p><p> Ácido cítrico: aproximadamente 450 mil toneladas deste ácido são produzidas anualmente</p><p>utilizando o fungo Aspergillus niger, com um mercado de US$ 2 bilhões. Processos alternativos</p><p>de produção com leveduras do gênero Candida vêm sendo desenvolvidos, principalmente a</p><p>partir de hidrocarbonetos.</p><p> Ácido lático: é produzido em escala industrial utilizando-se bactérias e diferentes fontes de</p><p>carboidratos (amido, sacarose, trigo, etc). Além de suas aplicações tradicionais como aditivo de</p><p>ração animal e de alimentos, novas aplicações incluem a produção de polilactideos (polímeros</p><p>ramificados de ácido lático - PLA) usados na produção de plástico biodegradável usado na</p><p>fabricação de inúmeros produtos (caneta, carcaça de monitor de computador, armação de</p><p>óculos, etc). Ácido lático também é empregado na produção de dermocosméticos.</p><p> Ácido succínico: é usado na indústria farmacêutica e de alimentos, mas é também um</p><p>intermediário para a produção de commodities químicas. É produzido por bactérias a partir de</p><p>diferentescarboidratos. O potencial de mercado para produtos baseados em ácido succínico é</p><p>estimado em 270 mil t por ano, e inclui os seguintes produtos: 1,4-butanodiol, tetrahidrofurano,</p><p>gama-butirolactona, ácido adípico e ésteres alifáticos.</p><p> Ácido ascórbico: A produção de ácido ascórbico (vitamina C) combina processos químicos e</p><p>biotecnológicos. Glicose é convertida em sorbitol (hidrogenação), este em sorbose</p><p>(bioconversão), ácido 2-ceto-L- glucônico (bioconversão),</p><p>e finalmente em ácido ascórbico</p><p>(ciclização química). Um processo puramente biotecnológico foi desenvolvido pelas empresas</p><p>Merck, BASF. Um grupo escocês está trabalhando em processo de produção em única etapa</p><p>com leveduras geneticamente modificadas. A produção global anual de ácido ascórbico em 2001</p><p>chegou a 80.000 t / ano (US$ 600 milhões) com um crescimento anual de 2-3%.</p><p> Ácido itacônico: Dentre outras coisas, ácido itacônico (AI) pode ser incorporados em</p><p>polímeros para melhorar as propriedades do produto final. Os campos de aplicação são</p><p>múltiplos: revestimentos, adesivos, capas, enchimentos, vidro sintético, etc. Mas, uma série de</p><p>outros produtos biologicamente ativos derivados de AI estão sendo desenvolvidos para</p><p>aplicação na indústria farmacêutica e na agricultura. Fungos do do gênero Aspergillus produzem</p><p>AI com altos rendimentos usando substratos como glicose, sacarose, amido hidrolisado ou</p><p>melaço. Aspergillus terreus é a espécie tradicionalmente empregada, mas linhagens com miaor</p><p>potencial de produção estão sendo isoladas. Atualmente, o mercado deste ácido é de cerca de</p><p>10.000-15.000 t/ano, sendo a maior parte voltada para a produção de polímeros.</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>67</p><p>3.1.1.5. Etanol</p><p>O etanol (álcool etílico) é produzido é produzido em processo fermentativo com leveduras</p><p>(Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis ou espécies de Candida) ou bactérias. A rota</p><p>clássica usando leveduras é conhecida há milhares de anos e representa um dos o mais antigos</p><p>processos biotecnológicos aplicados pela humanidade. Atualmente, todas as bebidas alcoólicas são</p><p>feitas por fermentação e etanol combustível produzido a partir de biomassa já é uma realidade em</p><p>vários países. O uso de bioetanol permite a redução da poluição do ar e não contribui para o efeito</p><p>estufa, mas a principal dificuldade para a sua comercialização como substituto integral da gasolina é</p><p>o custo relativamente elevado de produção. No entanto, avanços na engenharia química e na</p><p>genética têm permitido melhora em diferentes etapas de produção. As pesquisas estão voltadas para</p><p>o desenvolvimento de pré-tratamentos (hidrólise) da biomassa, visando a despolimerização para</p><p>obtenção de açúcares fermentescíveis, e para o uso da tecnologia do DNA recombinante para obter</p><p>microrganismos mais eficientes na produção de etanol.</p><p>Em 2001, a produção anual mundial de etanol chegou a mais de 30 bilhões de litros. No Brasil</p><p>o bioetanol da cana-de-açúcar tem sido usado há mais de 25 anos e o país desempenha um papel</p><p>de liderança no setor. Nos Estados Unidos a produção de etanol é feita principalmente a partir de</p><p>amido de milho ou trigo.</p><p>3.1.1.6. Enzimas</p><p>Mais de 500 produtos comerciais são feitos usando enzimas microbianas. Este mercado</p><p>abrange uma vasta gama de produtos enzimáticos, desde os de custo muito baixo, comercializados</p><p>em grandes volumes, como o malte para cervejaria e outras bebidas alcoólicas, até as preparações</p><p>altamente purificadas, de elevado custo, usadas com finalidade analítica, científica e médica. O preço</p><p>destes produtos pode variar de centavos/kg a milhares de dólares/g. O mercado mundial de enzimas</p><p>atingiu US$3,6 bilhões em 2004, divididos nas seguintes áreas de aplicação: alimentos, detergentes,</p><p>têxteis, couro, papel e celulose.</p><p>Alguns exemplos de aplicação industrial de enzimas podem ser citados:</p><p> Glicose isomerase bacteriana (xilose isomerase), α-amilases e glicoamilases fúngicas:</p><p>usadas para converter amido em mistura concentrada de glicose e frutose, conhecida como</p><p>''xarope de milho com alta concentração de frutose”.</p><p> Enzimas de levedura úteis na indústria de alimentos: invertase de K. fragilis, Saccharomyces</p><p>carlsbergensis e S. cerevisiae usadas na fabricação de doces e geléias; β-galactosidase</p><p>(lactase) de K. fragilis ou Kluyveromyces lactis para a hidrólise da lactose do leite ou soro de</p><p>leite.</p><p> Proteases: usadas na indústria de laticínios para a fabricação de queijos. Produzidas por</p><p>fungo (Mucor miehei) ou bactéria (Bacillus subtilis).</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>68</p><p> Proteases, lipases, amilases, oxidases, peroxidases e celulases: usadas como aditivos a</p><p>detergentes. Esta representa a maior aplicação de enzimas industriais em todo o mundo.</p><p>Proteases usadas em detergentes para lavagem de roupas representam 25% do total das</p><p>vendas mundiais de enzimas.</p><p> Lipases são comumente utilizados na produção de uma variedade de produtos que vão de</p><p>sucos de frutas, alimentos assados, fermentações de vegetais ao enriquecimento de produtos</p><p>lácteos. Gorduras, óleos e compostos relacionados são os principais alvos de lipases em</p><p>tecnologia de alimentos visando maximizar a produção de sabor e aroma.</p><p>As enzimas vêm sendo cada vez mais usadas nas indústrias de papel e têxtil, visando</p><p>processos mais limpos e redução do uso de matérias-primas e produção de resíduos. Um processo</p><p>enzimático alternativo na manufatura de algodão foi recentemente desenvolvido com base na enzima</p><p>pectato liase. O processo é realizado em temperaturas muito mais baixas e usa menos água do que</p><p>o método clássico. Outra aplicação de importância crescente é o uso de lipases para remoção de</p><p>componentes hidrofóbicos da madeira, principalmente triglicerídeos e ceras, na industrial de papel e</p><p>celulose. Lipase de Candida rugosa é usada para remover até 90% destes compostos. O uso de</p><p>enzimas como alternativas a produtos químicos no processamento do couro tem sido bem sucedido</p><p>para melhorar a qualidade do material e para redução de poluição ambiental. Lipases alcalinas a</p><p>partir de cepas de Bacillus ou neutras estão sendo usados atualmente nesta indústria.</p><p>3.1.2. Metabólitos secundários</p><p>3.1.2.1. Antibióticos</p><p>Os antibióticos são os metabólitos secundários mais conhecidos e mais amplamente</p><p>comercializados. São definidos como produtos naturais orgânicos de baixo peso molecular</p><p>produzidos por microrganismos e que são ativos em baixa concentração contra outros</p><p>microrganismos. Dos 12.000 antibióticos conhecidos em 1995, 55% eram produzidas pelo gênero</p><p>Streptomyces, 11% a partir de outros actinomicetos, 12% por bactérias não-filamentosas e 22% por</p><p>fungos filamentosos. A busca de novos antibióticos é contínua e tem os seguintes objetivos: obter</p><p>compostos voltados a combater patógenos em evolução, bactérias e fungos naturalmente resistentes</p><p>ou microrganismos anteriormente suscetíveis que desenvolveram resistência; melhorar a</p><p>propriedades farmacológicas; descobrir compostos mais seguros, mais potentes e de mais amplo</p><p>espectro. O mercado global de antibióticos inclui cerca de 160 antibióticos e derivados, chegando a</p><p>US$35 bilhões no ano 2000.</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>69</p><p>3.1.2.2. Agentes antitumorais</p><p>A maioria dos agentes anticancerígenos naturais é produzida por actinomicetos</p><p>(doxorrubicina, mitomicina, daunorrubicina, bleomicina). O Taxol, composto originalmente descoberto</p><p>em plantas, é também produzido pelo fungo Taxomyces andreanae. É usado no tratamento de</p><p>câncer de mama e de ovário, tendo a função de inibir a divisão das células cancerosas. O mercado</p><p>de Taxol, comercializado pela empresa Bristol Myers-Squibb, é de US$1,6 bilhão por ano.</p><p>Atualmente, encontram-se em testes clínicos substâncias chamadas epotilonas, produzidos por</p><p>myxobacterias, e que têm modo de ação semelhante ao Taxol, mas são ativos contra tumores</p><p>resistentes a este composto.</p><p>3.1.2.3. Agentes redutores de colesterol</p><p>As estatinas fúngicas (pravastatina, lovastatina e outras) têm alcançado grande sucesso</p><p>como inibidores da enzima reguladora da biossíntese do colesterol no fígado. A primeira a ser</p><p>descoberta foi a compactina, produzida por Penicillium brevicompactum e Penicillium citrinum. A</p><p>lovastatina é produzida por Monascus ruber e Aspergillus terreus. O mercado de estatinas em 2004</p><p>foi de US$15 bilhões.</p><p>3.1.2.4. Agentes usados no transplante de órgãos</p><p>A Ciclosporina</p><p>A foi originalmente descoberta como um peptídeo antifúngico de baixo</p><p>espectro produzido pelo fungo Tolypocladium nivenum (anteriormente Tolypocladium inflatum). A</p><p>descoberta de sua atividade imunossupressora resultou em enorme sucesso no campo de</p><p>transplante de órgãos, sendo empregada em transplantes de coração, fígado e rim. As vendas de</p><p>ciclosporina A atingiram US$1,5 bilhão em 2004. Outros importantes agentes para transplante</p><p>incluem o Sirolimus (rapamicina) e o tacrolimus (FK506) que são produzidos por actinomicetos.</p><p>Um antibiótico muito antigo de amplo espectro produzido por fungos, o ácido micofenólico, nunca foi</p><p>comercializado como um antibiótico, mas seu éster 2-morfolinoetilester foi aprovado como um novo</p><p>imunossupressor para transplante renal em 1995 e para transplantes de coração em 1998.</p><p>3.1.2.5. Agentes antiparasitários</p><p>Durante anos, os produtos terapêuticos mais importantes usados contra doenças parasitárias</p><p>não-microbianas em animais (por exemplo, os coccidiostáticos e anti-helmínticos) eram obtidos por</p><p>meio de síntese química. Apesar dos testes de milhares de tais compostos, apenas algumas</p><p>estruturas promissores foram descobertas. Hoje, poliéteres produzidos por microrganismos como</p><p>monensina, lasalocida e salinomicina dominam o mercado de coccidiostáticos e também são os</p><p>principais promotores de crescimento em uso para ruminantes. As avermectinas, um outro grupo de</p><p>produtos produzidos por estreptomicetos apresentam alta atividade contra helmintos e artrópodes,</p><p>tendo um mercado global anual de mais de US$1 bilhão.</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>70</p><p>3.1.2.6. Bioinseticidas</p><p>Muitos insetos são considerados pragas na agricultura e muitos são vetores de importantes</p><p>doenças para humanos. Pesticidas e inseticidas químicos sintéticos usados no controle destes</p><p>insetos têm sido usados indiscriminadamente, levando ao desequilíbrio nos ecossistemas, à</p><p>contaminação dos lençóis freáticos e do próprio solo. Outro problema é a capacidade destes insetos</p><p>de se adaptarem aos pesticidas e se tornarem resistentes, o que obriga a utilização de novos</p><p>produtos químicos, que são cada vez mais tóxicos e prejudiciais ao meio ambiente. O controle</p><p>biológico, utilizando-se bioinseticidas produzidos com bactérias, fungos e outros microrganismos</p><p>entomopatogênicos, representa uma importante e eficiente alternativa ao uso de controle químico.</p><p>Os microrganismos entomopatogênicos produzem substâncias que os tornam capazes de causar</p><p>algum tipo de dano a insetos específicos. A vantagem é que eles são quase sempre específicos, com</p><p>baixa ou nenhuma toxicidade para vertebrados e insetos benéficos.</p><p>O agente microbiano mais importante e mais amplamente utilizado no controle de vetores de</p><p>doenças e pestes agrícolas em todo o mundo é Bacillus thuringiensis (Bt). Esta bactéria produz</p><p>proteínas na forma de cristais que são altamente tóxicas para as larvas de insetos suscetíveis. Ao</p><p>contrário dos inseticidas químicos, os larvicidas produzidos com Bt são extremamente específicos</p><p>quanto à espécie-alvo, apresentando baixa ou nenhuma toxicidade para insetos benéficos e animais</p><p>vertebrados, incluindo pássaros e mamíferos. Preparações de Bt são altamente potentes: cerca de</p><p>300 vezes mais ativas que piretróides sintéticos e 80.000 vezes mais ativas que inseticidas</p><p>organofosforados. Constituem, além disso, uma alternativa viável ao problema do desenvolvimento</p><p>de resistência, por parte dos insetos, aos inseticidas sintéticos. Bioinseticidas à base de Bt têm sido</p><p>aplicados há décadas para controle de pragas agrícolas e insetos de importância para a saúde</p><p>pública, como Aedes aegypti, vetor da dengue, e Anopheles vetores da malária.</p><p>3.1.3. Produtos alimentícios e bebidas</p><p>Além de gerar diversos metabólitos primários para emprego como aditivos na indústria de</p><p>alimentos, os processos biotecnológicos também são voltados à produção direta de vários alimentos</p><p>e bebidas. Os exemplos incluem:</p><p>3.1.3.1. Biomassa microbiana</p><p>Utilizadas como culturas starter, ou seja, iniciadores (inóculos) de diferentes processos</p><p>fermentativos. São exemplos as culturas da levedura Saccharomyces cerevisiae usadas em</p><p>panificação e na fabricação de cerveja, as culturas de bactérias láticas usadas na fabricação de</p><p>queijos (Lactococus lactis e Lactococcus cremoris, por eexemplo) e iogurtes (Streptococcus</p><p>thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) e as culturas usadas como inoculantes</p><p>agrícolas (Bradyrhizobium e Rhizobium). Biomassa microbiana também é comercializada na forma</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>71</p><p>de SCP (single cell protein), ou seja, usada diretamente na alimentação humana ou na formulação de</p><p>ração animal como fonte de proteínas. Um exemplo de produto alimentício para consumo humano, o</p><p>Quorn, foi desenvolvido no Reino Unido e lançado no mercado em 1985, sendo constituído de</p><p>biomassa do fungo filamentoso Fusarium venenatum.</p><p>3.1.3.2. Queijos e leites fermentados</p><p>Todos os tipos de queijo são obtidos por processos enzimáticos e fermentativos, com</p><p>emprego de diferentes espécies bacterianas e de fungos. As espécies utilizadas, bem como a</p><p>tecnologia de produção, definem os diferentes tipos de queijos obtidos. Dentre os leites fermentados,</p><p>podemos citar o iogurte, o leites acidófilos (como a Yakult), o kefir etc.</p><p>3.1.3.3. Vegetais fermentados</p><p>Picles e chucrute são exemplos de alimentos obtidos por fermentação utilizando-se diferentes</p><p>espécies de bactérias láticas. Vinagres de frutas são obtidos com uso de bactérias acéticas do</p><p>gênero Acetobacter.</p><p>3.1.3.4. Bebidas alcoólicas</p><p>Cerveja, vinhos, aguardentes são exemplos de produtos biotecnológicos com grande impacto</p><p>no setor econômico. A cerveja, obtida por fermentação com a levedura S. cerevisiae, é a bebida</p><p>alcoólica mais consumida em todo o mundo. No Brasil, o setor emprega mais de 150 mil pessoas,</p><p>entre postos diretos e indiretos. Dentre todos os setores da economia que se dedicam a bens de</p><p>consumo, a cerveja é o produto de consumo que mais gera tributos indiretos no país. O faturamento</p><p>do país no setor em 2006 foi de R$ 17,2 bilhões.</p><p>3.1.4. Produtos voltados para o Meio Ambiente</p><p>A Biotecnologia Industrial terá um papel fundamental para a solução os desafios e problemas</p><p>ambientais em todo o mundo. Com novas regulamentações e metas para o controle de poluição</p><p>estabelecidas em protocolos internacionais (como o Protocolo de Kyoto, por exemplo), governos e</p><p>indústrias irão investir cada vez mais em tecnologias limpas, em processos industriais menos</p><p>agressivos ao meio ambiente e na busca de soluções alternativas aos produtos hoje obtidos pela</p><p>petroquímica. É constante a preocupação com o crescente aumento do preço do petróleo e seus</p><p>derivados, além de tratar-se de uma matéria-prima não renovável. O uso de combustíveis fósseis é</p><p>também uma das principais causas de liberação de gases do efeito estufa, principais responsáveis</p><p>pelas mudanças climáticas constatadas nos últimos anos.</p><p>3.1.4.1. Produção de compostos químicos a partir de matérias-primas renováveis</p><p>A Química teve e continua a ter um papel fundamental em quase todos os aspectos da</p><p>sociedade moderna. Porém, apesar de fornecer uma vasta gama de produtos úteis, a indústria</p><p>química vem sofrendo uma grande pressão devido à preocupação em relação à sua dependência</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>72</p><p>dos recursos fósseis, ao emprego de processos nocivos ao meio ambiente, à geração de</p><p>subprodutos tóxicos e de resíduos que não são facilmente recicláveis ou biodegradáveis após a sua</p><p>vida útil. Há uma crescente preocupação com a legislação no sentido de melhorar os níveis de</p><p>proteção da saúde humana e do ambiente em relação aos riscos químicos. A sustentabilidade da</p><p>indústria química, portanto, exige uma estratégia que integre benefícios sociais, saúde e segurança</p><p>ambiental com os objetivos tecnológicos e econômicos de suas atividades. O uso de microrganismos</p><p>na produção de compostos-chave a partir da biomassa vegetal (qualquer material orgânico</p><p>polimérico decorrente da fixação fotossintética) oferece inúmeras vantagens neste sentido. Enquanto</p><p>o preço de recursos fósseis, como o petróleo, continuará a subir, matérias-primas agrícolas se</p><p>tornam cada vez mais competitivas para a indústria de biotecnologia industrial. As fontes mais</p><p>importantes fontes de matérias-primas renováveis são as plantas oleaginosas, amiláceas (milho, trigo</p><p>etc), sacarinas (beterraba e cana-de-açúcar) e resíduos agrícolas (palhas, bagaço etc). Alguns</p><p>exemplos de produtos químicos obtidos por fermentação a partir de matérias vegetais são:</p><p>substâncias tenso-ativas para uso em detergentes e cosméticos, polímeros, ácidos orgânicos (lático,</p><p>succínico, ascórbico etc), solventes, vitaminas, aditivos de alimentos, enzimas, dentre outros.</p><p>3.1.4.2. Geração de energia: biocombustíveis</p><p>Atualmente, os combustíveis fósseis (carvão, petróleo, gás natural) suprem aproximadamente</p><p>80% das necessidades mundiais de energia primária, mas a projeção é que a demanda mundial de</p><p>energia aumente 49% até 2035. Mesmo que o consumo futuro de combustíveis fósseis fique limitado</p><p>às reservas comprovadas hoje, a queima desses combustíveis resultaria na liberação de mais do</p><p>dobro do carbono que já foi emitido na atmosfera até hoje, agravando o efeito estufa. Assim, a</p><p>substituição da gasolina por biocombustíveis, como o etanol, apresenta-se como uma solução</p><p>biotecnológica para evitar futuros problemas de carência de energia e de graves alterações</p><p>ambientais.</p><p>3.1.4.3. Produção de inoculantes agrícolas</p><p>Os inoculantes agrícolas são compostos com biomassa microbiana que, após inoculação em</p><p>plantas, têm a capacidade de colonizar suas raízes ou seus tecidos internos e gerar uma série de</p><p>benefícios, sendo o principal deles a fixação de nitrogênio. A principal característica desses</p><p>inoculantes é proporcionar aos plantios comerciais benefícios como o estimulo do crescimento</p><p>vegetal, a redução de fertilização artificial dos solos, a redução de danos causados por doenças, e a</p><p>redução de compostos xenobióticos pela decomposição de pesticidas depositados no solo. São</p><p>exemplos de microrganismos usados como inoculantes agrícolas bactérias dos gêneros</p><p>Bradyrhizobium e Rhizobium, que fazem simbiose com leguminosas como a soja e o feijão e fixam</p><p>nitrogênio atmosférico. Outro exemplo é o fungo micorrízico do gênero Pisolithus, que estabelece</p><p>associação mutualística com espécies arbóreas dos gêneros Pinus e Eucaliptus.</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>73</p><p>3.1.4.4. Produção de biopolímeros: plásticos biodegradáveis</p><p>A substituição de plásticos de origem petroquímica por plásticos produzidos por</p><p>microrganismos é uma alternativa para a prevenção da poluição ambiental. Os materiais plásticos</p><p>atualmente produzidos são de difícil decomposição, permanecendo no meio ambiente por várias</p><p>centenas de anos, enquanto os biopolímeros são materiais biocompatíveis e são degradados</p><p>rapidamente no ambiente. Poli-hidroxialcanoatos (PHA) são polímeros produzidos por algumas</p><p>bactérias como material de reserva, apresentando propriedades termoplásticas comparáveis às dos</p><p>plásticos de origem petroquímica, além de serem totalmente biodegradáveis. Essa propriedade</p><p>confere aos PHA grande relevância no que concerne à preservação ambiental, e, além disso, a</p><p>utilização de PHA contribuiria para o desenvolvimento sustentável, considerando que são produzidos</p><p>por microrganismos a partir de recursos naturais renováveis. A bactéria Cupriavidus necator</p><p>(anteriormente denominada Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha), é uma</p><p>excelente produtora de PHA.</p><p>3.1.5. Produtos obtidos por bioconversões microbianas</p><p>Os microorganismos são extremamente úteis na realização de processos de biotransformação ou</p><p>bioconversão nos quais um composto é convertido em um produto estruturalmente relacionado por uma ou</p><p>por um pequeno número de enzimas contidas nas células. Os processos de bioconversão são</p><p>caracterizados por rendimentos extremamente elevados (90-100%), condições brandas de reação,</p><p>especificidade e o acoplamento de reações usando várias enzimas de um microrganismo trabalhando em</p><p>série. A Bioconversão está se tornando essencial para a indústria de química fina. Um dos exemplos mais</p><p>bem sucedidos de produção biocatalítica de uma comomodity química é a produção de acrilamida por</p><p>conversão de acrilonitrila usando as bactérias Rhodococcus rhodochrous ou Pseudomonas chlororaphis.</p><p>Cerca de 20.000 toneladas deste composto são produzidas anualmente no Japão para uso como</p><p>floculante, componente de fibras sintéticas, condicionador do solo e agente de recuperação na indústria do</p><p>petróleo. Outro exemplo é o uso de bioconversão para produção de nicotinamida (vitamina B3), utilizando</p><p>células imobilizadas de R. rhodochrous, atualmente realizado na China.</p><p>3.1.6. Produtos da Biotecnologia Industrial Moderna</p><p>3.1.6.1. Biofármacos</p><p>As proteínas e outras moléculas biológicas recombinantes para uso terapêutico, como as</p><p>citocinas, fatores de crescimento, enzimas, imunoterápicos, esteróides, dentre outros, representam</p><p>hoje uma parcela importante da indústria farmacêutica mundial.</p><p>O desenvolvimento de um bioprocesso para produção de proteínas ou outras moléculas</p><p>recombinantes até a escala industrial passa por diferentes estágios. O primeiro deles está</p><p>relacionado à manipulação genética do microrganismo hospedeiro do gene exógeno, ou seja, aquele</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>74</p><p>no qual o gene (ou genes) originário de uma planta ou um animal será clonado (integrado ao seu</p><p>genoma). Os microrganismos receptores desses genes são chamados de sistema de expressão. A</p><p>engenharia genética aplicada para desenvolver esses microrganismos recombinantes é feita em</p><p>laboratórios por cientistas treinados em biologia molecular e bioquímica.</p><p>A tecnologia de DNA recombinante tem avançado notavelmente em consequência do</p><p>desenvolvimento de sistemas de expressão eficientes. Os seguintes microrganismos têm sido</p><p>empregados com os seguintes objetivos:</p><p> Escherichia coli</p><p>Escherichia coli tem sido amplamente utilizada como hospedeiro recombinante pelas seguintes</p><p>razões: facilidade e rapidez para modificar o genoma de forma precisa; rápido crescimento e</p><p>facilidade de obtenção de culturas em altas concentrações; facilidade de cultivo em meios</p><p>baratos. E. coli pode acumular proteínas heterólogas até 50% do seu peso seco de células. Os</p><p>seguintes produtos recombinantes são obtidos em E. Coli: insulina, hormônio de crescimento</p><p>humano, interferon ,  e , e fatores estimulantes de colônias de granulócitos (G-CSF).</p><p> Saccharomyces cerevisiae</p><p>Esta levedura pode ser cultivada rapidamente em meios de cultivo simples, com altas</p><p>densidades de células, podendo secretar várias proteínas heterólogas no meio de cultivo. Além</p><p>disso, o conhecimento sobre sua genética é mais avançado do que o de qualquer outro</p><p>eucarioto. Apesar destas vantagens, S. cerevisiae é considerado inadequado para produção em</p><p>larga escala de algumas proteínas de mamíferos por causa da formação de compostos que</p><p>podem causar resposta antigênica em pacientes. Genes humanos já foram clonados e</p><p>expressos em S. cerevisiae para produzir interferon, fator de crescimento epidérmico,</p><p>hemoglobina, superóxido dismutase e interleucina-6. O maior sucesso comercial usando</p><p>leveduras recombinantes a vacina contra hepatite B.</p><p> Pichia pastoris</p><p>Pichia pastoris tornou-se um dos sistemas de expressão mais amplamente utilizados, em função</p><p>das seguintes vantagens em relação à S. cerevisiae: capacidade de integrar múltiplas cópias do</p><p>DNA exógeno em seu DNA cromossômico, gerando transformantes estáveis; capacidade de</p><p>secretar altos níveis de proteínas exógenas. Exemplos de produtos recombinantes feitas em P.</p><p>pastoris incluem fator de necrose tumoral, toxina tetânica, proteína</p><p>do invólucro do HIV-1,</p><p>interleucina-2, albumina sérica humana e hirudina.</p><p> Hansenula polymorpha</p><p>Altos níveis de expressão de certos genes heterólogos têm sido alcançados com a levedura H.</p><p>Polymorpha. São exemplos os seguintes produtos: antígeno para hepatite B, albumina sérica</p><p>humana e hirudina.</p><p> Fungos filamentosos</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>75</p><p>O desenvolvimento de técnicas moleculares para a produção de proteínas recombinantes</p><p>heterólogas em fungos filamentosos contrasta acentuadamente com os excelentes resultados</p><p>alcançados em leveduras. A capacidade de introduzir ou eliminar genes é difícil, apesar de</p><p>alguns avanços na transformação de certas espécies, os níveis de produção de proteínas são</p><p>baixos. Alguns exemplos incluem: interleucina-6 humana, lisozima humana e lactoferrina</p><p>humana.</p><p>A Tabela 2 apresenta alguns exemplos de produtos obtidos com microrganismos</p><p>recombinantes e seus respectivos usos terapêuticos.</p><p>Tabela 2 – Exemplos de moléculas humanas clonadas em microrganismos e o uso terapêutico indicado.</p><p>PROTEÍNA USO TERAPÊUTICO</p><p>Hormônio de crescimento Nanismo, queimaduras, envelhecimento</p><p>Fator de crescimento fibroblástico (FGF)</p><p>Rejuvenescimento da pele; reparo de cicatrizes;</p><p>cura de ferimentos; estimula crescimento capilar</p><p>Fator de crescimento epidermal (EGF)</p><p>Cura de ferimentos; estimula a formação de</p><p>epitélio</p><p>Fator estimulante de colônias de granulócitos (G-</p><p>CSF)</p><p>Neutropenia (deficiência de glóbulos brancos</p><p>induzida por quimioterapia)</p><p>Fator estimulante de colônias de granulócitos e</p><p>macrófagos (GM-CSF)</p><p>Estimula crescimento de células brancas no</p><p>transplante de medula óssea</p><p>Fator de crescimento insulínico (IGF)</p><p>Crescimento capilar; cicatrização de úlcera</p><p>cutânea; Aumenta produção de colágeno e</p><p>elastina</p><p>Antígeno de superfície do vírus da hepatite B Vacina contra Hepatite B</p><p>Interferon </p><p>Verrugas genitais, sarcoma de Kaposi, antiviral,</p><p>hepatite B e C</p><p>Interferon  Esclerose múltipla</p><p>Interferon  Tratamento de doença granulomatosa</p><p>Interleucina 2 Câncer de células renais</p><p>Interleucina 11 Trombocitopenia decorrente de quimimioterapia</p><p>Hirudina Inibidor de trombina; anticoagulante</p><p>Superóxido dismutase Tratamentos cardíacos e transplantes</p><p>Outro conceito de biofármaco envolve o uso de microrganismos recombinantes administrados</p><p>por via oral. Ou seja, sua utilização como “veículos de entrega” de fármacos para o trato</p><p>gastrointestinal. Trata-se de um importante desafio para o desenvolvimento de medicamentos</p><p>inovadores. As potenciais aplicações médicas desta nova geração de biofármacos são numerosas:</p><p>por exemplo, a correção de deficiências enzimáticas, o controle da ativação de pró-droga a droga ou</p><p>a produção de proteínas terapêuticas, como vacinas, diretamente no trato digestivo. Por meio do</p><p>aumento da proteção do organismo contra xenobióticos ambientais, esses biofármacos podem</p><p>também oferecer uma forma inovadora para prevenir ou tratar doenças que escapam da ação de</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>76</p><p>drogas tradicionais, como o câncer ou outras doenças multifatoriais. As potenciais aplicações são</p><p>numerosas e algumas já foram avaliadas em bactérias e leveduras (Tabela 3).</p><p>Dois diferentes protocolos ou maneiras de administrar as células vivas estão sendo avaliadas:</p><p>a bioconversão ou a biossíntese.</p><p> Bioconversão</p><p>Três tipos de aplicação potenciais destes microrganismos recombinantes podem ser</p><p>considerados:</p><p> Fornecimento de enzimas deficientes no organismo hospedeiro, por exemplo para aumentar a</p><p>proteção do contra xenobióticos ambientais, particularmente aqueles veiculados pelos alimentos</p><p>(por exemplo, pesticidas e aditivos químicos). As células recombinantes também podem criar</p><p>vias alternativas para a desintoxicação, por exemplo, expressando proteínas anti-estresse</p><p>oxidativo, como a glutationa redutase ou glutationa peroxidase.</p><p> Expressão de enzimas digestivas heterólogas para corrigir erros do metabolismo resultantes</p><p>de deficiências enzimáticas gástrica ou intestinal (por exemplo, lipase, tripsina e lactase) ou</p><p>falência de órgãos (por exemplo, remoção de uréia em caso de insuficiência renal, ou de amônia</p><p>no caso de falência do fígado).</p><p> Controle da ativação do pró-medicamento para convertê-lo em medicamento ativo diretamente</p><p>no trato digestivo. Isto pode ser útil quando a droga, mas não o pró-medicamento, é tóxico em</p><p>altas concentrações ou é danificado por secreções digestivas.</p><p> Biossíntese</p><p>Várias proteínas terapêuticas, como a insulina, interleucinas, fatores de crescimento e fatores</p><p>de coagulação poderiam ser produzidos por microrganismos geneticamente modificados</p><p>diretamente no trato digestivo. Em comparação com os sistemas clássicos, tal sistema de entrega</p><p>seria vantajoso nos seguintes casos:</p><p>(1) para administrar medicamentos sensíveis à secreções digestivas;</p><p>(2) para direcionar os alvos específicos em toda a extensão do trato digestivo;</p><p>(3) para proporcionar efeitos terapêuticos com doses mais baixas.</p><p>Outra aplicação potencial é o desenvolvimento de vacinas orais, que são baseadas no uso de</p><p>microrganismos recombinantes que liberam antígenos diretamente no trato digestivo para estimular</p><p>uma resposta imune local (produção de imunoglobulinas) e prevenir doenças. Estes MGM poderiam</p><p>ser usados para vacinas contra bactérias patogênicas, toxinas bacterianas, vírus e parasitas ou</p><p>para controlar alergias alimentares (por exemplo, beta-lactoglobulina bovina, o maior alérgeno do</p><p>leite de vaca). Por exemplo, leveduras que expressam antígenos contra hepatite B têm sido</p><p>sugeridas como uma possível vacina oral contra o vírus.</p><p>Biotecnologia Industrial</p><p>77</p><p>Tabela 3. Exemplos de potenciais biomedicamentos produzidos com bactérias recombinantes.</p><p>Conceito Aplicação Exemplo Microrganismo</p><p>recombinante</p><p>Efeito</p><p>BIOCONVERSÃO</p><p>Biodetoxicação Remoção de</p><p>Benzopireno</p><p>E. coli, Diminuição do</p><p>efeito</p><p>mutagênico</p><p>Correção de erros</p><p>do metabolismo</p><p>Correção da</p><p>deficiência de</p><p>lipase</p><p>L. lactis, Aumento da</p><p>digestibilidade</p><p>de lipídeos</p><p>Correção da</p><p>deficiência de</p><p>urease</p><p>E. coli Diminuição do</p><p>ácido úrico</p><p>plasmático</p><p>BIOSSÍNTESE</p><p>Síntese de</p><p>mediador biológico</p><p>Secreção de</p><p>interleucina 10</p><p>L. lactis Redução dos</p><p>sintomas de</p><p>colite</p><p>Síntese de vacinas</p><p>orais</p><p>Vacina contra</p><p>tétano</p><p>L. lactis Indução da</p><p>resposta imune</p><p>Vacina contra</p><p>Streptococcus</p><p>pneumoniae</p><p>Salmonella</p><p>atenuada</p><p>Indução da</p><p>resposta imune</p><p>Adaptado de Blanquet et al. (2001).</p><p>4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS</p><p>Aquarone, E., Borzani, W., Lima, U.A.(2001) Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos.</p><p>São Paulo: Edgard Blücher, v.3.</p><p>Blanquet, S., Marol-Bonnin, S., Beyssac, E., Pompon, D., Renaud, M., Alric, M. (2001) The ‘biodrug’ concept:</p><p>an innovative approach to therapy. TRENDS in Biotechnology, v.19, n.10.</p><p>Bon, E.P.S., Ferrara, M.A., Corvo, M.L. (2008) Enzimas em Biotecnologia - Produção, Aplicação e Mercado. 1ª</p><p>edição.</p><p>Demain, A.L., Adrio, J.L. (2008) Contributions of Microorganisms to Industrial Biology. Molecular Biotechnology,</p><p>(38) 41-55.</p><p>Demain, A. L., Davies, J.E., Atlas, R.M. (ed.). (1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology.</p><p>Washington: American Society for Microbiology, 2nd edition.</p><p>Doran, P.M. (1995) Bioprocess Engineering Principles. Amsterdan: Elsevier Academic Press.</p><p>Glazer, A.N., Nikaido, H. (1995) Microbial Biotechnology: Fundamentals of Applied Microbiology. W. H.</p><p>Freeman.</p><p>Schenberg, A.C.G. (2010) Biotecnologia e desenvolvimento sustentável. Biotecnologia na agricultura. In: Faces</p><p>da Biotecnologia. Rev. Estudos Avançados, v.70.</p><p>Willke, Th. and Vorlop, K.-D. (2004) Industrial bioconversion of renewable resources as an alternative to</p><p>conventional chemistry. Applied Microbiology and Biotechnology, (66): 131-142.</p><p>Glossário</p><p>78</p><p>GLOSSÁRIO DE BIOTECNOLOGIA</p><p>Agrobacterium tumefaciens: agente causal do tumor</p><p>é tão</p><p>antiga quanto a história da humanidade, no entanto a manipulação possibilitada por técnicas de</p><p>engenharia genética data de 1971, com a manipulação do DNA/engenharia genética – técnicas que</p><p>permitem manipular o gene (pedaço ou unidade funcional do gene).</p><p>O anúncio, em 2001, da finalização de uma primeira versão de todo o genoma humano foi</p><p>saudado pela mídia com uma série de especulações sobre o significado desta informação, que iam</p><p>desde a vitória sobre o câncer até bebês fabricados geneticamente sob eliminação da obesidade e</p><p>juventude eterna. É claro que, para alcançar essas metas, é necessário muito mais do que apenas o</p><p>conhecimento do genoma humano.</p><p>Ao longo das últimas décadas houve uma intensa expansão da biotecnologia, em ambos,</p><p>aquisição de conhecimentos e desenvolvimento de processos tecnológicos e na sua aplicação nas</p><p>diferentes áreas (Tabela 1). Atualmente, destacam-se várias áreas dentro da biotecnologia, as quais</p><p>são frequentemente complementares:</p><p>- A biotecnologia voltada para a agropecuária e de produção de alimentos com estudos de</p><p>novos produtos alimentares, de aplicação de microrganismos geneticamente modificados, animais e</p><p>plantas transgênicos, bem como melhoria da qualidade de vegetais e animais relevantes para a</p><p>indústria. Essa área liga-se também à biotecnologia da preservação e melhoria ambiental e o estudo</p><p>da biodegradação de poluentes gasosos, líquidos e sólidos do solo. A biotecnologia que utiliza</p><p>biologia molecular, como a química combinatorial de biomoléculas, os processos de</p><p>biotransformação e aplicação de biocatalisadores, a tecnologia de ácidos nucléicos, a engenharia de</p><p>proteínas, a aplicação de moléculas menores em controles de metabolismo e em farmacologia. Suas</p><p>aplicações são essencialmente dirigidas para a área de obtenção de produtos industriais de alto valor</p><p>agregado. Na área de saúde, incluem-se nessa vertente a construção e produção de moléculas</p><p>recombinantes de ácidos nucléicos e de proteínas, usadas em vacinação humana e animal e em</p><p>terapia molecular na medicina, e de moléculas estruturais usadas em engenharia tecidual.</p><p>- A biotecnologia voltada para a biologia celular aplicada à medicina e saúde refere-se à</p><p>genômica, com extensão para a terapia gênica, o diagnóstico, o prognóstico, o tratamento e a</p><p>prevenção de doenças e de modulação de defeitos metabólicos. Uma área emergente da</p><p>biotecnologia médica é a engenharia de tecidos e órgãos, associada com a biologia estrutural e a</p><p>Introdução</p><p>2</p><p>biomimética. Essa área é profundamente ancorada em conhecimentos da biologia dos sistemas</p><p>supramoleculares, da biologia celular e tecidual, da biologia do desenvolvimento e da forma, bem</p><p>como dos sistemas integradores dos organismos superiores.</p><p>No século XXI, o DNA, que até algumas décadas atrás só poderia ser visualizado com uma</p><p>mente imaginativa, agora não só pode ser visto e fotografado, mas também manipulado de forma</p><p>precisa e planejada. Muitas questões que existiam na mente dos biólogos até algumas décadas atrás</p><p>deram espaço para questões mais aplicadas, e a biotecnologia deixou de ser apenas uma ciência</p><p>básica e passou a ser um empreendimento altamente promissor. Em 2000, a biotecnologia</p><p>movimentou mais de US$ 200 bilhões, apenas nos EUA. Oportunidades de emprego e de</p><p>investimento estão se materializando à medida que a biotecnologia coloca no mercado novos</p><p>produtos: medicamentos, variedades etc. e serviços: terapias, testes genéticos etc.</p><p>No Brasil, a biotecnologia representa hoje a base produtiva de diversos setores da economia,</p><p>os quais representam parte considerável do PIB e das exportações. O processo de ajuste estrutural</p><p>da economia brasileira tem influenciado na demanda por inovações tecnológicas nos principais</p><p>setores usuários de biotecnologias do país.</p><p>O termo Biotecnologia foi primeiramente definido por Karl Ereky no final da Segunda Guerra</p><p>Mundial, referindo-se a métodos intensivos de agricultura. Desde então, várias definições foram</p><p>sugeridas, associando a Biotecnologia, principalmente, ao uso de microrganismos na fabricação de</p><p>produtos de valor comercial. A Biotecnologia é formada por vocábulos de origem grega: "bio"</p><p>significa vida; "logos" significa conhecimento e "tecnos" designa a utilização prática da Ciência.</p><p>Trazendo para os dias atuais, a "bio" refere-se ao uso de processos biológicos e "tecnologia"</p><p>refere-se à fabricação de produtos e processos úteis e ao desenvolvimento de técnicas que levam à</p><p>solução de problemas, baseando-se em conhecimento científico.</p><p>A BIOTECNOLOGIA teve várias definições ao longo dos anos. Estas definições podem ser</p><p>simples às mais complexas. Dentre as definições mais simplificadas, podemos citar:</p><p>- "A utilização dos organismos vivos ou de seus constituintes nos processos industriais", definida por</p><p>OTA (Office of Technology Assessment – EUA, 1981);</p><p>- “A utilização dos sistemas celulares para obtenção de produtos ou desenvolvimento de processos</p><p>industriais", pelo CNPq (Programa Nacional de Biotecnologia – Brasil, 1981);</p><p>- “A aplicação de princípios científicos e técnicos à transformação de certas matérias por agentes</p><p>biológicos para produzir bens e serviços” (Organização para Cooperação e Desenvolvimento</p><p>Econômico, 1994);</p><p>- “O emprego de organismos vivos na geração de produtos benéficos para a espécie humana. É a</p><p>aplicação de seres biológicos em processos técnicos e industriais” (U.S. Environmental Protection</p><p>Agency, 1995);</p><p>- ”Um conjunto de técnicas biológicas, desenvolvidos a partir de pesquisas básicas, aplicadas à</p><p>pesquisa e ao desenvolvimento de produtos” (National Cancer Institute, NIH, USA, 2007).</p><p>Introdução</p><p>3</p><p>Dentre as definições mais completas, citamos:</p><p>- "A Biotecnologia trata da utilização das atividades biológicas no âmbito dos processos técnicos e da</p><p>produção industrial. Ela consiste em colocar em prática a Microbiologia e a Bioquímica em ligação</p><p>com a Química Industrial e a Engenharia de Processos" (Biotecnologie, Dechema, RFA, 1976);</p><p>- "A Biotecnologia compreende um vasto conjunto de técnicas que usam seres vivos, ou parte deles,</p><p>para produzir ou modificar produtos, aumentar o crescimento de plantas e animais ou, ainda,</p><p>desenvolver microrganismos para usos específicos" (Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia da</p><p>UFSC (1995);</p><p>- “A Biotecnologia é a aplicação controlada e intencional de agentes biológicos simples - células vivas</p><p>ou mortas ou componentes celulares - em operações tecnicamente úteis, tanto em processos</p><p>produtivos quanto em serviços” (Bu'Lock & Christiansen, 1987);</p><p>- "A Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer técnica que utiliza organismos vivos (ou</p><p>parte deles) para obter ou modificar produtos, melhorar plantas ou animais, ou desenvolver</p><p>microrganismos para usos específicos" (OTA, Office of Technology Assessment, EUA, 1984);</p><p>- “É o estudo ou a manipulação de um ou mais componentes básicos de organismos vivos: tecidos,</p><p>células, proteínas, genes ou DNA. Pode incluir a identificação e caracterização de genes, a</p><p>engenharia genética e o cultivo de células” (PCE – Parliamentary Commissioner for the Environment,</p><p>New Zeland, 2008);</p><p>- “É a ciência que usa organismos vivos ou seus componentes para produzir bens e serviços.</p><p>Envolve a manipulação e modificação de organismos, freqüentemente em nível molecular, para criar</p><p>novas e práticas aplicações para a agricultura, medicina e indústria”</p><p>(www.smartstate.qld.gov.au/strategy/strategy05_15/glossary.shtm, 2008);</p><p>- “É a aplicação da ciência e da engenharia para o uso direto ou indireto de organismos vivos, ou</p><p>parte deles ou seus produtos, na sua forma natural ou modificada” (www.cambridge.gov.uk/ccm/cms-</p><p>service/download/asset/, 2008);</p><p>Nestas definições, que englobam textos da década de 70 até os dias atuais, vemos que o</p><p>significado do termo Biotecnologia, feito de maneira mais ampla, envolve diferentes aspectos desta</p><p>ciência,</p><p>do colo em certas espécies vegetais, uma</p><p>doença que leva a formação de uma galha na coroa da planta. A bactéria é atraída por compostos</p><p>fenólicos secretados pela superfície ferida da planta, e daí um conjunto de genes bacterianos</p><p>(operon vir) é ativado, levando à transferência de um segmento de DNA do plasmídeo Ti</p><p>bacteriano para o genoma hospedeiro. O DNA bacteriano integrado à célula do vegetal (T-DNA)</p><p>sintetiza precursores e fitorreguladores (oncogenes), e o tecido afetado cresce, formando um</p><p>tumor. Linhagens desarmadas de A. tumefaciens (sem os oncogenes) são usadas, em laboratório,</p><p>para transferir genes exógenos para células vegetais e, mais raramente, para fungos.</p><p>Aclimatação: adaptação de um organismo (planta, animal ou microorganismo) a um ambiente que</p><p>lhe induz algum tipo de mudança fisiológica.</p><p>Adventícia: estrutura que surge em locais (sítios) diferentes do habitual, como a formação de raízes</p><p>na superfície de partes aéreas da planta.</p><p>Angiosperma: no reino vegetal, classe que inclui as plantas que florescem; plantas vasculares nas</p><p>quais ocorre fertilização dupla no saco embrionário, resultando no desenvolvimento de fruto com</p><p>sementes. Há duas subclasses: a de plantas monocotiledôneas e a de dicotiledôneas.</p><p>Apomixia: produção de um embrião na ausência de meiose. Plantas superiores apomíticas</p><p>produzem sementes derivadas de tecido materno.</p><p>Autoclave: câmara utilizada para esterilizar materiais diversos, incluindo vidrarias e meios de</p><p>cultura, usando-se vapor e alta pressão (em geral, 120 psi por 20 min.).</p><p>Auxina: grupo de reguladores de crescimento que estimula divisão e diferenciação celular,</p><p>organogênese e embriogênese, dominância apical e florescimento. Auxinas sintéticas, como 2,4-</p><p>D, estimulam resposta morfogênica in vitro.</p><p>Banco de germoplasma: local onde são armazenadas coleções do material genético de uma</p><p>espécie, constituídas de sementes ou outras partes da planta, como órgãos (tubérculos, por ex.)</p><p>ou embriões encapsulados.</p><p>Bioacumulação: conseqüência da acumulação de uma substância química estável, como um metal</p><p>pesado, em um ambiente natural. Em locais onde não existem agentes capazes de biodegradá-la,</p><p>as concentrações da substância podem aumentar ao longo da cadeia alimentar, e os organismos</p><p>superiores podem sofrer com seus efeitos tóxicos. A remoção de metais tóxicos de locais</p><p>contaminados se faz por biorremediação.</p><p>Biobalística: técnica para produzir células transformadas na qual o DNA é aderido a esferas de</p><p>tungstênio ou ouro, que são impelidas por pressão de gás (He, por exemplo), perfurando um</p><p>tecido-alvo. O DNA é integrado ao genoma da célula hospedeira ou de organelas (mitocôndrias e</p><p>cloroplastos), as quais são submetidas à seleção em meio de cultura contendo o agente</p><p>apropriado. Tem sido usada para transformar animais, plantas e fungos. São sinônimos os termos</p><p>bombardeio de micropartículas e biolística.</p><p>Biocombustível: fonte de combustão de origem biológica, como o álcool de cana-de-açúcar; energia</p><p>renovável.</p><p>Glossário</p><p>79</p><p>Biocontrole: controle de pragas ou doenças por meios biológicos. Qualquer procedimento que usa</p><p>organismos vivos deliberadamente introduzidos para conter o crescimento e o desenvolvimento de</p><p>outros organismos, como a introdução de insetos predadores ou a pulverização de esporos de</p><p>fungos em uma lavoura para controlar uma praga. O mesmo que controle biológico.</p><p>Bioconversão: conversão de uma substância química em outra por organismos vivos, à diferença</p><p>da conversão por enzimas isoladas, células fixadas ou processos químicos. Particularmente útil</p><p>para introduzir mudanças químicas pontuais em moléculas grandes e complexas.</p><p>Biodegradação: decomposição de substâncias complexas em outras mais simples por</p><p>microorganismos.</p><p>Biodiversidade: variabilidade presente nos organismos vivos; inclui a diversidade intra e</p><p>interespecífica e entre os diversos ecossistemas, i.e., terrestres, marinhos e outros complexos</p><p>ecológicos. O mesmo que diversidade biológica, diversidade ecológica.</p><p>Bioprocesso: qualquer processe que usa células vivas ou os seus componentes, como enzimas e</p><p>cloroplastos, para provocar mudanças físicas ou químicas desejadas.</p><p>Biorreator: 1. Tanque no qual células ou enzimas levam a termo de reação biológica. 2. Tanque</p><p>onde se processa a fermentação praticada por microorganismos. 3. Recipiente estéril no qual se</p><p>cultivam células, com agitação, para exploração comercial de seus metabólitos secundários. 4.</p><p>Recipiente usado para propagação de plântulas em larga escala.</p><p>Biorrecuperação: uso de microorganismos para recuperar metais ou compostos orgânicos a partir</p><p>de misturas complexas.</p><p>Biorremediação: processo que utiliza organismos vivos para remover contaminantes, poluentes ou</p><p>substâncias não desejadas no solo, da água ou do ambiente.</p><p>Biossegurança: matéria que estuda os riscos potenciais da biotecnologia para a saúde humana e</p><p>animal, bem como para o ambiente. Às Comissões de Biossegurança compete regulamentar e</p><p>monitorar esses riscos.</p><p>Biotecnologia: 1. Tecnologia que gera produtos e processos de origem biológica. 2.Espectro ou</p><p>conjuntos de tecnologias moleculares aplicadas ao estudo de microorganismos, plantas e animais.</p><p>BOD: sigla inglês para Demanda Biológica de Oxigênio; estufa de crescimento.</p><p>Calo: 1. Tecido protetor, constituído de células similares às de um parênquima e que se desenvolve</p><p>sobre ferimentos vegetais. 2. Massa não diferenciada de células desenvolvida in vitro por indução</p><p>(ou não) de fitorreguladores. A Auxina sintética 2,4-D induz a formação de calos embriogênicos a</p><p>partir de explantes imaturos ou tecidos embrionários, mormente em gramíneas.</p><p>Câmara de crescimento: espaço ou equipamento no qual luz, temperatura, umidade e o</p><p>crescimento de organismos podem ser controlados.</p><p>Câmara de fluxo laminar: câmara projetada para manipulações em culturas de c´clulas e tecidos</p><p>que requerem um ambiente estéril, alcançado por um fluxo contínuo e não-turbulento de ar</p><p>esterilizado sobre a área de funcionamento.</p><p>Carboidrato: o mesmo que açúcar, ose, polihidroxialdeído ou polihidroxicetona e seus polímeros.</p><p>Glossário</p><p>80</p><p>Carvão ativado: carvão tratado para remover os hidrocarbonos e aumentar suas propriedades de</p><p>adsorção. Age capturando um gás ou soluto sobre sua superfície. Usado em cultura de tecidos</p><p>para adsorver substâncias inibitórias, fitorreguladores em excesso, fenóis, e com isso evitar a</p><p>oxidação dos explantes.</p><p>Célula: unidade dos seres vivos. Em procariotos, é formada pro uma dupla membrana especializada</p><p>onde se processa a respiração. Contém um cromossomo principal, circular, unido à membrana</p><p>interna, podendo haver cópias de um DNA extra, também circular, dito plasmídeo. Em eucariotos,</p><p>a célula é formada por várias organelas, ou seja, compartimentos que respondem por funções</p><p>específicas, como o núcleo que guarda os cromossomos.</p><p>Célula somática: célula não envolvida na reprodução sexual, célula do corpo ou soma (em grego,</p><p>corpo), dos organismos.</p><p>Clonagem: propagação, multiplicação a partir de um indivíduo, uma célula ou molécula, gerando</p><p>uma população geneticamente idêntica.</p><p>Clone: do grego, klón, broto. 1. Parte da planta que dá origem a um novo indivíduo por brotação e,</p><p>por isso, é igual à planta-mãe. 2. Grupo de células ou indivíduos geneticamente idênticos e que</p><p>são resultado de reprodução assexual, ou por manipulação em laboratório. 3. Variedade derivada</p><p>da seleção de um ou poucos indivíduos e que dá origem, pro propagação vegetativa, a uma</p><p>população geneticamente uniforme, como ocorre em cana-de-açúcar e mandioca. 4. Conjunto de</p><p>células idênticas nas quais foi inserido um vetor ou um cromossomo hospedeiro. 5. Segmento de</p><p>DNA (inserto) do qual se obtêm múltiplas cópias por multiplicação das células transformadas com</p><p>o segmento.</p><p>Código genético: estabelece a correspondência entre as 64 possíveis trincas de ribonucleotídeos</p><p>do mRNA (4</p><p>nucleotídeos combinados 3 a 3 = 43 = 64) e os 20 aminoácidos, o códon de iniciação</p><p>e os três códons de parada. Linguagem da Genética Molecular que traduz o significado das</p><p>trincas de nucleotídeos.</p><p>Competência celular: habilidade da célula em responder a um estímulo exógeno. Em cultura de</p><p>tecidos, essa resposta leva a diferenciação e morfogênese.</p><p>Criopreservação: preservação de recursos genéticos em estado dormente, por armazenamento em</p><p>temperaturas extremamente baixas, por imersão em nitrogênio líquido. Método usado para</p><p>armazenar sementes, embriões somáticos ou zigóticos, grãos de pólen, microrganismos, esperma</p><p>animal, células e tecidos, que são submetidos ao tratamento com crioprotetores e à desidratação,</p><p>antes de serem criopreservados.</p><p>Crioprotetor: composto que previne o dano à célula durante o processo de congelamento e</p><p>descongelamento. Crioprotetores são agentes com alta solubilidade em água e baixa toxicidade,</p><p>como o DMSO.</p><p>CTNBio: Comissão Técnica Nacional de Biossegurança, comissão técnica interdisciplinar que</p><p>regulamenta a pesquisa e o uso comercial de OGMs na indústria e agropecuária brasileiras. É</p><p>uma instância colegiada multidisciplinar, criada com a finalidade de prestar apoio técnico ao</p><p>Governo Federal na formulação, atualização e implementação da Política Nacional de</p><p>Biossegurança relativa a OGM, bem como no estabelecimento de normas técnicas de segurança</p><p>e pareceres técnicos referentes à proteção de saúde humana, dos organismos vivos e do meio</p><p>ambiente, para atividades que envolvam a construção, experimentação, cultivo, manipulação,</p><p>Glossário</p><p>81</p><p>transporte, comercialização, consumo, armazenamento, liberação e descarte de OGM e</p><p>derivados. Consulte: http://www.ctnbio.gov.br/</p><p>Cultura axênica: cultivo livre de contaminantes externos e endofíticos. Difere de cultura asséptica.</p><p>Cultura contínua: cultivo em suspensão continuamente suprimida com nutrientes pelo influxo de</p><p>meio nutritivo fresco e cujo volume é mantido constante. Na cultura contínua fechada, as células</p><p>são mecanicamente separadas e retornam ao sistema de cultivo no qual o influxo de meio fresco</p><p>é equilibrado pelo correspondente do meio consumido.</p><p>Cultura de antera: cultivo de anteras imaturas que são desinfetadas e induzidas por fitohormônios</p><p>para regenerar brotos haploides a partir dos micrósporos, via androgênese.</p><p>Cultura de calo: cultivo em meio líquido ou sólido, iniciada a partir de explantes que originam uma</p><p>massa não-diferenciada de células. Usada para se obter organogênese, culturas de células ou</p><p>proliferação de embrióides. Pode ser mantida, indefinidamente, por subcultivos regulares.</p><p>Cultura de embrião: cultivo de embriões zigóticos em meio nutritivo.</p><p>Cultura de meristema: cultura derivada de ápices meristemáticos usada para a eliminação de vírus</p><p>e proliferação (clonagem) de brotos axilares.</p><p>Cultura de órgãos: cultivo asséptico de órgãos vegetais e de pequenos órgãos animais.</p><p>Cultura de pólen: cultivo in vitro de grãos de pólen para gerar plantas haploides.</p><p>Cultura de tecidos: nome genérico que se dá aos vários procedimentos de cultivo in vitro de células,</p><p>tecidos e órgãos vegetais em um meio nutritivo e em condições assépticas.</p><p>Cultura em suspensão: cultivo de células em meio líquido em agitação.</p><p>Densidade celular mínima efetiva: densidade de células abaixo da qual não dá multiplicação.</p><p>Desdiferenciação: processo pelo qual a célula vegetal especializada se torna meristemática. Ocorre</p><p>em certas regiões do explante (meristemóides), geralmente, por indução de um regulador de</p><p>crescimento. Este processo também pode dar origem a uma massa não-diferenciada de células,</p><p>dita calo, que pode se especializar para formar embriões somáticos (embriogênese) ou partes</p><p>aéreas (organogênese).</p><p>Desenvolvimento: sequência de eventos que levam à formação de um organismo. Processo de</p><p>crescimento e diferenciação.</p><p>Determinação: em Histologia, processo pelo qual uma célula não-diferenciada se torna determinada</p><p>a se desenvolver em um tipo celular específico, como neurônios, fibroblastos ou células</p><p>musculares.</p><p>Diferenciação: especialização; processo que leva células não-especializadas a desenvolverem</p><p>estruturas e funções de uma células diferenciada. É geralmente irreversível in vivo. Em cultura in</p><p>vitro, o termo é usado para descrever a formação de diferentes tipos de célula.</p><p>Divisão celular: 1. Uma das etapas do ciclo celular. 2. Formação de células-filha a partir de uma</p><p>única célula-mãe; divisão de células somáticas ou mitose; divisão que dá origem aos gametas ou</p><p>meiose.</p><p>http://www.ctnbio.gov.br/</p><p>Glossário</p><p>82</p><p>Eletroporação: indução de poros temporários em bactérias, protoplastos, células ou tecidos intactos</p><p>pela aplicação de um pulso elétrico, permitindo a entrada de DNA exógeno. Técnica usada</p><p>geralmente na transformação de células bacterianas.</p><p>Embrião nucelar: embrião vegetativo que se desenvolve a partir do tecido somático que envolve o</p><p>saco embrionário, e não a partir de fertilização.</p><p>Embrião somático: embrião morfologicamente semelhante a um embrião zigótico que é</p><p>diferenciado a partir de células somáticas.</p><p>Embriogênese direta: formação de embriões somáticos, em cultura in vitro, sem passar pela fase</p><p>de calo.</p><p>Embriogênese indireta: formação de embriões somáticos, em cultural in vitro, a partir de calos</p><p>oriundos de explantes.</p><p>Embriogênese somática: processo de diferenciação de embriões somáticos a partir de tecidos</p><p>vegetais ou, mais usualmente, de calos derivados de explantes, em geral embrionários; descrito</p><p>pela primeira vez por Levine, em 1947, em culturas de calos de cenoura. Via de regeneração de</p><p>plântulas de muitas gramíneas.</p><p>Embriogênese: desenvolvimento de um embrião em animais ou vegetais, in vivo ou in vitro.</p><p>Esterilização por filtragem: esterilização de um líquido pela sua filtragem em membranas porosas</p><p>(~0,22 μm de diâmetro) que não permitem a passagem de micróbios e esporos.</p><p>Esterilizar: 1. Desprover um indivíduo de sua capacidade reprodutiva. 2. Eliminar microrganismos do</p><p>ambiente, da vidraria de laboratório, usando-se altas temperaturas, radiação, filtração ou</p><p>substâncias químicas.</p><p>Fertilização: união de gametas de sexos opostos para formar um zigoto. Tipicamente, cada gameta</p><p>contém um complemento haploide de cromossomos (n) e o zigoto é diploide (2n).</p><p>Fitormônio: substância de origem vegetal ou sintética que estimula a divisão, o crescimento e a</p><p>diferenciação, bem como outros processos celulares. Há cinco classes de fitormônios: auxinas,</p><p>citocininas, giberelinas, ácido abscíssico e etileno. São moléculas pequenas, de fácil transporte</p><p>através das membranas celulares. O mesmo que fitorregulador, regulador de crescimento,</p><p>hormônio vegetal.</p><p>Friável: termo usado para descrever uma estrutura facilmente dissecada, e prontamente dispersada</p><p>em partes menores. Em cultura de tecidos vegetais, diz-se de calos ou massas celulares de</p><p>aspecto típico, não-compactos, com potencial morfogênico.</p><p>Gene marcador de resistência: gene marcador de seleção em transgenia, pois sua expressão</p><p>permite a sobrevivência de células transformadas na presença de agentes seletivos, como</p><p>antibióticos ou herbicidas. Estes genes foram usados no desenvolvimento dos primeiros</p><p>organismos transgênicos.</p><p>Gene repórter: gene cujo produto de expressão (peptídeo) pode ser detectado prontamente. Usado</p><p>com marcador para confirmar a transferência de um transgene em uma célula, órgão ou tecido,</p><p>pela sua expressão transiente.</p><p>Glossário</p><p>83</p><p>Habituação: estádio fisiológico das células em cultura no qual, depois de vários subcultivos, elas</p><p>podem crescer sem a adição de fatores anteriormente necessários.</p><p>In vitro: do latim, fora do organismo, ou em um ambiente artificial. Diz-se do cultivo de células,</p><p>tecidos ou órgãos em recipientes.</p><p>Inóculo: do latim, inoculum, pl., inocula; em Microbiologia, alíquota de uma cultura em suspensão é</p><p>transferida para</p><p>seu subcultivo; a quantidade de inóculo pode ser estimada por</p><p>espectrofotometria, por exemplo. Similarmente, em Cultura de Tecidos Vegetais, quantidade de</p><p>tecido, calo, explante ou células que dá início a uma cultura ou subcultura.</p><p>Meio de cultura: qualquer sistema usado no cultivo de células, bactérias, tecidos ou</p><p>microrganismos; normalmente, uma mistura complexa de nutrientes orgânicos e inorgânicos.</p><p>Meio salino: formulação de sais como fonte de macro e micronutrientes, sem suplementação de</p><p>orgânicos, i.e., vitaminas, fonte de aminoácidos e fitorreguladores. Para alguns autores, o mesmo</p><p>que meio basal.</p><p>Meio sólido: meio solidificação pela adição de ágar, agarose etc.</p><p>Monocotiledônea: classe de vegetais cujo embrião tem um único cotilédone. O milho, trigo, arroz,</p><p>lírio e a banana são monocotiledôneos.</p><p>Morfogênese: desenvolvimento por crescimento e diferenciação celular.</p><p>Morfologia: forma, estrutura ou arranjo.</p><p>Nutriente essencial: qualquer substância requerida para assegurar o crescimento e</p><p>desenvolvimento normais de um organismo.</p><p>Organogênese direta: desenvolvimento de órgãos diretamente a partir do tecido do explante, sem</p><p>passar por fase de calo.</p><p>Organogênese indireta: desenvolvimento de órgãos a partir de uma massa não diferenciada de</p><p>células, ou calo, derivado do explante.</p><p>Organogênese: 1. Processo que dá origem a órgãos em vegetais ou animais. 2. Em cultura de</p><p>tecidos vegetais, formação de órgãos in vitro a partir de meristemóides, processo, em geral,</p><p>estimulado por citocininas.</p><p>Oxidação: perda de elétrons de um átomo ou uma molécula, como ocorre quando o hidrogênio é</p><p>removido de uma molécula e o oxigênio é adicionado. Oposto de redução.</p><p>Oxidação fenólica: resposta típica observada em ferimentos e que se manifesta pelo escurecimento</p><p>do tecido vegetal.</p><p>pH: medida de acidez ou alcalinidade de uma solução.</p><p>Planta matriz: 1. Planta elite selecionada que pode dar origem a um clone, como em cultivos de</p><p>espécies florestais. 2. Planta doadora de explantes nos procedimentos de cultura in vitro.</p><p>Plasmídeo: 1. Molécula de DNA circular presente em muitos microrganismos, como bactérias e</p><p>leveduras, capaz de se duplicas autonomamente. Boa parte dos plasmídeos contém genes de</p><p>resistência de antibióticos, e certos microrganismos os transferem de uma célula a outra por</p><p>Glossário</p><p>84</p><p>conjugação. 2. Importantes vetores de clonagem e expressão gênica em procedimentos de</p><p>engenharia genética e biologia molecular.</p><p>Plasmídeo Ti: classe de plasmídeos conjugativos encontrados na bactéria de solo Agrobacterium</p><p>tumefaciens. Plasmídeos Ti possuem sequencias que são transferidas e integradas no genoma</p><p>vegetal como parte do processo de colonização. Formas desarmadas desse plasmídeo são</p><p>usadas na produção de plantas transgênicas.</p><p>Poliembrionia: produção de mais de um embrião a partir de um único zigoto. Os embriões são</p><p>geneticamente idênticos.</p><p>Polietilenoglicol (PEG): polímero cuja fórmula geral é HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH, disponível em</p><p>uma gama de pesos moleculares. Agente que promove aglutinação de células. PEG 4000 e 6000</p><p>são usados na fusão de protoplastos e para facilitar a absorção de DNA em procedimentos de</p><p>transformação.</p><p>Propagação: multiplicação ou reprodução assexuada ou vegetativa, sem fertilização.</p><p>Propagação clonal: propagação assexual a partir de um único indivíduo, sendo o genótipo da</p><p>progênie o mesmo do indivíduo que lhe deu origem.</p><p>Propágulo: qualquer estrutura capaz de dar origem a uma nova planta (esporo, semente, gene).</p><p>Protocolo de biossegurança: conjunto de procedimentos aceitos internacionalmente para proteger</p><p>a saúde humana e animal e o ambiente de potenciais riscos do uso da biotecnologia e de seus</p><p>produtos; Protocolo de Cartagena.</p><p>Regeneração: em cultura de tecidos, desenvolvimento de órgãos, embriões ou plântulas a partir de</p><p>um explante introduzido in vitro.</p><p>Região de terminação: sequência de DNA que sinaliza o final de transcrição.</p><p>Regulador de crescimento: composto sintético ou natural que, em baixas concentrações, induz e</p><p>controla respostas de crescimento; hormônio de crescimento.</p><p>Rejuvenescimento: 1. Reversão da fase adulta para a fase juvenil. 2. Técnica usada na</p><p>micropropagação de plantas arbóreas de ciclo longo.</p><p>Resposta morfogênica: em cultura de tecidos vegetais, resposta de um explante levando à</p><p>formação de estruturas (calos, embriões, raízes ou parte aérea), principalmente, devido à ação de</p><p>fitorreguladores.</p><p>Semente artificial: semente ou embrião somático encapsulado visando a sua conservação.</p><p>Sinalização: comunicação celular com o meio externo por moléculas de sinalização; estas são</p><p>sintetizadas e libertadas por células sinalizadoras e induzem a uma resposta específica em</p><p>células-alvo que contêm receptores.</p><p>Suspensão celular: cultura de células em meio líquido, sob agitação.</p><p>Tamanho mínimo do inóculo: volume mínimo crítico de inóculo exigido para se iniciar uma cultura.</p><p>Glossário</p><p>85</p><p>T-DNA: segmento de DNA do plasmídeo Ti, presente em Agrobacterium tumefaciens, que é</p><p>transferido e integrado no genoma da célula vegetal hospedeira, e responsável pela síntese de</p><p>precursores de reguladores de crescimento e opinas pela planta infectada.</p><p>Totipotência: atributo ou propriedade de célula de se dividir e desenvolver uma estrutura nova</p><p>diferenciada ou um organismo completo.</p><p>Transdução de sinal: em biologia celular, qualquer processo pelo qual são convertidos sinais</p><p>extracelulares em resposta celular.</p><p>Transformação: introdução e integração de DNA em uma célula hospedeira, descrita em bactérias</p><p>em 1932. Processo usual em laboratórios após o desenvolvimento da engenharia genética. O</p><p>mesmo que transformação genética.</p><p>Transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens: processo de transferência de DNA</p><p>para a célula vegetal via Agrobacterium tumefaciens.</p><p>Transformante: célula ou organismo que foi alterado geneticamente pela integração de um</p><p>transgene.</p><p>Transgene: gene exógeno integrado em um genoma hospedeiro por evento de transformação.</p><p>Transgênese: introdução de um gene exógeno em células animais ou vegetais.</p><p>Transgênico: indivíduo no qual um transgene foi integrado ao seu genoma.</p><p>Variabilidade: variação biológica entre indivíduos da mesma espécie. Em populações naturais, a</p><p>variabilidade deve-se, principalmente, aos fatores ambientais e genéticos.</p><p>Variação somaclonal: alteração de natureza genética ou epigenética decorrente de procedimento</p><p>de cultura in vitro.</p><p>Vetor de clonagem: veículo de clonagem; pequena molécula de DNA auto-replicativa na qual o DNA</p><p>exógeno é inserido. Há vários tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos e cromossomos artificiais de</p><p>bactéria (BAC) e levedura (YAC). Os vetores de clonagem podem ser usados como vetores de</p><p>transformação para inserir DNA exógeno em uma célula hospedeira.</p><p>Vetor: 1. Um organismo que transmite um patógeno. 2. Pequena molécula de DNA (plasmídeo, fago,</p><p>cromossomo artificial) que pode ser usada para introduzir DNA em uma célula hospedeira.</p><p>Vetores devem dar origem de replicação e conter sítios de clonagem para a inserção do DNA</p><p>exógeno, entre outras características.</p><p>Zigoto: célula diploide formada pela fusão de dois gametas haploides durante a fertilização em</p><p>organismos eucarióticos com reprodução sexual.</p><p>podendo ser destacados os seguintes fatores:</p><p>• O “sistema biológico” inclui não somente seres vivos e integrais, mas também parte deles ou</p><p>seus produtos;</p><p>• O “sistema biológico” compreende tanto organismos naturais quanto modificados;</p><p>• A manipulação dos sistemas biológicos é feita de maneira deliberada e controlada;</p><p>• A Biotecnologia inclui o conhecimento de várias disciplinas científicas;</p><p>• A Biotecnologia tem como objetivo final a geração de produtos úteis à espécie humana.</p><p>Introdução</p><p>4</p><p>Ou seja, para qualquer definição de Biotecnologia todos estes aspectos devem ser levados</p><p>em conta. Adicionalmente, a biotecnologia tem um caráter multidisciplinar, a qual tem por base vários</p><p>ramos do conhecimento, que podem ser divididos em 2 grupos:</p><p>FUNDAMENTAIS: o qual inclui a bioquímica, fisiologia, genética, microbiologia, biologia</p><p>molecular, virologia, botânica, zoologia, ecologia, matemática, física, entre outras.</p><p>ENGENHARIAS: principalmente a atuação da Engenharia Química.</p><p>Desta forma, a Biotecnologia apóia-se em várias disciplinas científicas - principalmente a</p><p>biologia molecular e celular, bioquímica, genética, microbiologia, imunologia, química, engenharia</p><p>industrial e informática. Seu campo é tão vasto que seria mais correto falar em “biotecnologias”, no</p><p>plural. Simples ou sofisticadas, baratas ou caras, elas abrangem processos tão antigos como a</p><p>fermentação a técnicas tão avançadas como a engenharia genética, que permite transferir certos</p><p>caracteres genéticos de um a outro organismo e assim criar vegetais, animais transgênicos e</p><p>microrganismos com as características desejadas.</p><p>De uma forma mais abrangente e na tentativa de englobar diferentes áreas do conhecimento</p><p>sobre o que é a biotecnologia pode-se definir este termo como “conjunto de técnicas e métodos</p><p>industriais que viabilizam a obtenção de BENS E SERVIÇOS de interesse para o ser humano, tendo</p><p>como agentes de transformação, de uma forma integral ou parcial, células animais e vegetais,</p><p>microrganismos e vírus” (OTA, Office of Technology Assessment, 1984; Pós-graduação em</p><p>Biotecnologia - UFSC, 1995).</p><p>Como BENS E SERVIÇOS, podemos citar:</p><p>a) Produtos – Temos vários produtos no nosso cotidiano que são oriundos tanto da</p><p>Biotecnologia clássica quanto da moderna. Pela Biotecnologia clássica temos vários alimentos,</p><p>bebidas fermentadas e fermento-destiladas, fármacos, enzimas para aplicações diversas,</p><p>combustíveis, ácidos orgânicos e outros químicos, pão, queijos, iogurte, chucrute, cogumelos,</p><p>biomassa microbiana, vinagre, vinho, cerveja, ácidos orgânicos (acético, cítrico, lático, etc), álcool</p><p>etílico, glicerol, n-butanol, aminoácidos (lisina, ácido glutâmico), vitaminas (C, B12, riboflavina),</p><p>antibióticos (penicilina, cefalosporina), metano, polissacarídeos (dextrana, xantana, alginatos),</p><p>vacinas bacterianas e virais (tuberculose, poliomielite, rubéola), enzimas (proteases, lipase, lactase,</p><p>lacase, pectinase, amiloglicosidase, glicose isomerase, inulinases), bioinseticidas, etc.</p><p>Pela Biotecnologia moderna incluem-se as novas tecnologias, geradas a partir de organismos</p><p>geneticamente modificados ou transgênicos. Pode-se citar a insulina e hormônio de crescimento</p><p>humano produzidos pela bactéria Escherichia coli geneticamente modificada; proteínas terapêuticas</p><p>(usadas na produção de fármacos) obtidas a partir do leite de animais (ovinos, bovinos e caprinos)</p><p>modificados geneticamente pela inserção, em seu genoma, de genes humanos que codificam estas</p><p>proteínas; plantas agronomicamente importantes (milho, soja, arroz, etc) alteradas geneticamente</p><p>pela inserção de genes de resistência a herbicidas e insetos, dentre outros.</p><p>Introdução</p><p>5</p><p>b) Processos – Como processos oriundos da biotecnologia destaca-se a biorremediação,</p><p>controle biológico, biolixiviação de metais, tratamento biológico de efluentes, entre outros.</p><p>c) Serviços – Dentre os serviços oriundos da Biotecnologia pode-se citar Kits para</p><p>diagnóstico de doenças, testes de DNA (determinação de paternidade, investigações forenses,</p><p>diagnóstico de doenças genéticas), kits enzimáticos para determinações analíticas (dosagem de</p><p>açúcares em líquidos biológicos, determinação de proteínas, etc), dentre outros.</p><p>Todas estas definições mostram, nitidamente, que a Biotecnologia tem por base vários ramos do</p><p>conhecimento. A biotecnologia animal, por exemplo, envolve as técnicas já estabelecidas para a</p><p>reprodução animal, como a inseminação artificial, incluindo os principais avanços em fisiologia</p><p>reprodutiva, desenvolvidos nas décadas recentes, tais como a fertilização in vitro e a transferência de</p><p>embriões. Além destes, a biotecnologia animal também inclui progressos relativamente recentes que</p><p>empregam a modificação genética, ou seja, a manipulação direta da composição genética de um</p><p>animal (transgênese animal) e a clonagem por transferência nuclear, tecnologia na qual o núcleo</p><p>integral de uma célula e os genes que ele carrega são transferidos para células receptoras</p><p>especialmente preparadas, cujos próprios cromossomos foram previamente removidos.</p><p>A biotecnologia vegetal está associada à vários setores, incluindo a cultura in vitro (ou cultura</p><p>de tecidos) de plantas e transformação genética, com reflexos sobre a agricultura, a indústria</p><p>alimentar, e o meio ambiente. Destaca-se a micropropagação de plantas de interesse econômico-</p><p>social e/ou ameaçadas de extinção, e a produção de plantas transgênicas com adaptações para</p><p>diferentes condições de estresse, resistência ao ataque de patógenos, plantas com níveis mais</p><p>reduzidos de compostos alergénicos ou tóxicos, ou com melhores qualidades para armazenamento</p><p>ou processamento, ou ainda melhores qualidades nutricionais, são alguns dos numerosos exemplos</p><p>de aplicações da biotecnologia vegetal.</p><p>A biotecnologia industrial é o ramo da Biotecnologia voltado para a produção industrial. No</p><p>seu sentido mais amplo, consiste no uso de microrganismos em processos fermentativos visando</p><p>à produção de uma grande variedade de compostos com aplicação em diversos setores da</p><p>economia. Compreende uma alternativa promissora e vantajosa às rotas químicas de obtenção de</p><p>produtos-chave para a saúde humana e animal, agricultura e meio-ambiente, sendo também</p><p>fundamental na produção industrial de diversos tipos de alimentos e bebidas.</p><p>Tabela 1. Quadro mostrando a evolução da biotecnologia desde a antiguidade até a presente data.</p><p>Período Descobertas e Avanços</p><p>10.000 – 8.000 a.C.</p><p>Primeiros agricultores no Oriente Médio, Ásia e Américas iniciam o processo de</p><p>domesticação das espécies vegetais.</p><p>4.000 a.C. Indícios mais antigos do uso da fermentação para produção de pão e cerveja.</p><p>1857-65</p><p>Louis Pasteur iniciou os estudos sobre o papel dos microrganismos na fermentação</p><p>e o processo de esterilização, hoje conhecido como “pasteurização”.</p><p>1859</p><p>Charles Darwin publica o livro “Origem das espécies”, no qual dedica um capítulo ao</p><p>estudo dos processos de seleção artificial em animais domésticos.</p><p>1866</p><p>O monge austríaco Gregor Mendel publica seus trabalhos sobre hereditariedade,</p><p>descrevendo como as características são passadas de uma geração a outra.</p><p>Introdução</p><p>6</p><p>1877</p><p>Moritz Traube propõe que fermentação e outras reações químicas são catalisadas</p><p>por substâncias tipo proteínas, que não são modificadas na reação.</p><p>1900</p><p>A mosca da fruta, Drosofila melanogaster, foi usada nos primeiros estudos de genes</p><p>1906</p><p>1906: surge o termo “genética”.</p><p>1908</p><p>Primeiro híbrido de milho é produzido por George H. Shull, no Instituto Carnegie,</p><p>EUA.</p><p>1914-19</p><p>Necessidade de glicerol para produzir munição (explosivos); óleos vegetais não</p><p>podiam ser importados. Bioquímicos e engenheiros alemães adaptaram processo</p><p>fermentativo com leveduras para converter açúcar em glicerol (> 100 ton/mês)</p><p>1919 O termo Biotecnologia foi cunhado pelo húngaro Karl Ereky.</p><p>1920 Descoberta da Penicilina - Penicillium notatum</p><p>1940 Descoberta</p><p>das propriedades antibacterianas e produção em escala durante 2ª</p><p>Guerra Mundial, desenvolvimento de biorreatores.</p><p>1944 Descoberto que DNA é a estrutura responsável pela transmissão das informações</p><p>genéticas</p><p>1953</p><p>Watson e Crick descrevem a hélice dupla do DNA, elucidando a estrutura</p><p>tridimensional dessa molécula. Demonstraram mecanismo para a cópia do material</p><p>genético responsável pela perpetuação das espécies. Explosão de pesquisas em</p><p>biologia molecular, com rápido avanço das “técnicas de DNA recombinante”</p><p>(engenharia genética).</p><p>1957</p><p>Francis Crick e George Gamov elaboraram o “dogma central” sobre como funciona o</p><p>DNA para produzir proteínas. Matthew Meselson e Frank Sthal demonstraram</p><p>mecanismo de replicação do DNA.</p><p>1960</p><p>Após décadas de trabalho, Norman E. Borlaug desenvolve o trigo semi-anão</p><p>iniciando a Revolução Verde, que salva milhões de pessoas de morte por fome.</p><p>1961</p><p>Marshall Nieremberg e Gobind Korana decifram o código genético, isto é, convertem</p><p>a informação contida no DNA em uma sequência de aminoácidos da proteína.</p><p>1970</p><p>Howard Temin e David Baltimore isolaram as enzimas de restrição - cortam a</p><p>molécula de DNA em regiões específicas. Abriu caminho para a clonagem molecular</p><p>dos genes com a criação de clones de bactérias.</p><p>1972</p><p>Paul Berg isolou e empregou uma enzima de restrição para cortar o DNA e a DNA</p><p>ligase para unir duas fitas de DNA e formar uma molécula circular híbrida. Esta foi a</p><p>primeira molécula de DNA.</p><p>1973</p><p>Cohen e Boyer fazem a primeira experiência de engenharia genética unindo dois</p><p>genes de dois organismos diferentes produzindo o primeiro Plasmídeo com DNA</p><p>recombinante, usando enzimas de restrição, o que dá início à biotecnologia</p><p>moderna.</p><p>1977</p><p>Walter Gilbert e Allan Maxam, na Universidade de Harvard e Frederick Sanger, na</p><p>Inglaterra, desenvolveram o método de sequenciamento de DNA. Genentech Inc.</p><p>mostrou a produção da primeira proteína humana (somatostatina) sintetizada em</p><p>uma bactéria.</p><p>1978 Boyer sintetiza a primeira versão recombinante do gene humano da insulina.</p><p>Gentech Inc. anunciou a produção do primeiro biofármaco produzido por bactérias –</p><p>a insulina humana - usando a tecnologia do DNA recombinante em laboratório.</p><p>1982 Produção da primeira planta transgênica, tabaco resistente a antibiótico.</p><p>A Gentech Inc. recebeu aprovação da FDA (Food and Drug Administration) para</p><p>comercializar insulina humana modificada geneticamente.</p><p>1983 Kary B. Mullis desenvolveu a técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) -</p><p>permite amplificar o material genético (genes) em tubos de ensaio. Aprovação de</p><p>patentes de plantas geneticamente modificadas.</p><p>1984 Foi clonado o vírus HIV e seu genoma foi totalmente sequenciado.</p><p>1985</p><p>Primeiros experimentos de campo como plantas transgênicas resistentes a insetos,</p><p>vírus e bactérias são realizados nos EUA.</p><p>1986</p><p>O EPA (United States Environmental Protection Agency) aprovou a liberação da</p><p>primeira planta de tabaco geneticamente modificada.</p><p>Foi produzida a primeira vacina recombinante para humanos contra hepatite B e a</p><p>primeira droga anticâncer produzida por meio da biotecnologia.</p><p>1987</p><p>Calgene Inc. obteve a patente da sequência de DNA da poligalacturonase de tomate</p><p>- usada para desenvolver técnica que aumenta o tempo de vida dos frutos.</p><p>Introdução</p><p>7</p><p>1990</p><p>Foi lançado o Projeto Genoma Humano.</p><p>1994</p><p>O Primeiro alimento geneticamente modificado (o tomate Flavr Savr) foi liberado</p><p>para comercialização/consumo humano no EUA pelo FDA (Food and Drug</p><p>Administration), tornando-se o primeiro alimento geneticamente modificado a chegar</p><p>às prateleiras dos supermercados americanos.</p><p>1995 O primeiro genoma, o de uma bactéria (Hemophilus influenzae), é completamente</p><p>seqüenciado.</p><p>1995-1996 Variedades transgênicas de soja e milho são aprovadas para liberação comercial</p><p>nos EUA, dando início à rápida adoção desta tecnologia por agricultores em</p><p>diferentes países.</p><p>1996</p><p>Conjuntamente, seis países plantam o primeiro milhão de hectares com</p><p>transgênicos.</p><p>Nasce o primeiro clone de mamífero, a ovelha Dolly, gerada a partir de células</p><p>somáticas adulta de uma ovelha adulta doadora.</p><p>1998</p><p>Descoberta das células-tronco embrionárias humanas.</p><p>Foi sequenciado o primeiro genoma completo de um organismo multicelular, o</p><p>nematoide Caenorhabditis elegans. As pesquisas sobre a biologia molecular e do</p><p>desenvolvimento de C. elegans começaram em 1974 (Sydney Brenner) e o</p><p>organismo tem sido extensivamente usado como modelo animal.</p><p>Quarenta milhões de hectares de culturas geneticamente modificadas são plantadas</p><p>no mundo - predominantemente soja, algodão, canola e milho. Liberação comercial</p><p>da soja transgênica tolerante a herbicida é concedida no Brasil.</p><p>1999</p><p>Cientistas suíços e alemães desenvolvem o arroz dourado, rico em beta-caroteno.</p><p>Precursor da vitamina A, importante na prevenção de alguns tipos de cegueira.</p><p>2000</p><p>Foi sequenciado o genoma da primeira espécie vegetal, Arabidopsis thaliana,</p><p>tornando-se um dos organismos modelo para o estudo de genética, em botânica. O</p><p>conhecimento do papel de cada gene na fisiologia da espécie leva ao conhecimento</p><p>da genética vegetal no seu todo.</p><p>Conjuntamente, 13 países atingem a marca de 25 milhões de hectares plantados</p><p>com variedades transgênicas, um aumento de 25 vezes a área cultivada em 1996.</p><p>2001</p><p>Sequenciamento completo do genoma de bactéria fitopatogênica (Xyllela fastidiosa)</p><p>por consórcio de pesquisadores brasileiros (192 cientistas). Esta bactéria é</p><p>causadora de doenças como a praga do amarelinho (Clorose Variegada de Citros -</p><p>CVC) que afeta laranjeiras.</p><p>Consórcio do Genoma Humano e o grupo Celera publicaram o genoma humano.</p><p>2003 A conclusão do seqüenciamento do genoma humano é anunciada.</p><p>A ovelha Dolly foi submetida a eutanásia após desenvolver um câncer de pulmão.</p><p>2004 Clonado primeiro animal de estimação: um gato.</p><p>Sequenciado o genoma do rato utilizado para pesquisas em laboratório.</p><p>2005 Foi publicado o genoma do cachorro da raça boxer, sequenciado pelo Whitehead</p><p>Institute/MIT Center for Genome Research (WICGR) – atualmente: Broad Institute.</p><p>A identificação de genes levou a compreensão das bases genéticas de doenças</p><p>comuns aos caninos.</p><p>2006 Arroz GM para consumo humano é liberado nos Estados Unidos.</p><p>Uvas geneticamente modificadas são testadas na África do Sul.</p><p>2007</p><p>Cientistas dos EUA anunciam a geração de células-tronco embrionárias a partir de</p><p>células da pele de macacos, o que deverá permitir o desenvolvimento da clonagem</p><p>terapêutica.</p><p>Liberação experimental de cana transgênica com alto teor de açúcar no Brasil pela</p><p>empresa Allelyx/Monsanto.</p><p>Liberação comercial de milho geneticamente modificado resistente a inseto e</p><p>tolerante a herbicida no Brasil.</p><p>2008</p><p>Pesquisadores australianos desenvolvem plantas com altos níveis de um ácido</p><p>graxo para produzir plásticos, tintas e cosméticos.</p><p>Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul geneticamente</p><p>modificada.</p><p>Liberação comercial de algodão geneticamente modificado tolerante a herbicida no</p><p>Brasil.</p><p>2009</p><p>Liberação comercial da soja geneticamente modificada tolerante a herbicida e</p><p>algodão resistente a inseto no Brasil.</p><p>Introdução</p><p>8</p><p>2010</p><p>Craig Venter cria a “célula sintética” a partir de um genoma sintetizado em</p><p>laboratório. Em 20 de Maio de 2010, pesquisadores do J. Craig Venter Institute</p><p>(JCVI), uma organização de pesquisa genômica sem fins lucrativos, publicaram os</p><p>resultados descrevendo a construção bem-sucedida da primeira célula sintética</p><p>bacteriana auto-replicante. A equipe sintetizou o cromossomo do genoma</p><p>modificado de Mycoplasma mycoides. A célula sintética é chamada Mycoplasma</p><p>mycoides JCVI-syn1.0 e é a prova do princípio de que o genoma pode ser projetado</p><p>no computador, quimicamente feito em laboratório e transplantado para uma célula</p><p>receptora para produzir uma célula auto-replicante nova controlada apenas pelo</p><p>genoma sintético.</p><p>REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS</p><p>Almeida, M.R., Borém, A.</p><p>(2004) Biotecnologia e Saúde. In: Biotecnologia e Saúde. Almeida, M.R., Borém, A.,</p><p>Franco, G.R. (Eds). UFV. Cap. 1, p. 9-30.</p><p>Borém, A., Santos, F.R. (2007) Entendendo a Biotecnologia. UFV. 342 p.</p><p>Ferreira, C., Aguiar, J.; Pessanha, L.; Rangel, P.; Berbert-Molina, M.; Flores, V. M. Q. (2009).</p><p>Valverde, S.R., Neiva, S.A., Soares, N.S. (2007) Biotecnologia e Competitividade das Plantações Florestais.</p><p>In: Biotecnologia Florestal. Borém, A. (Ed). UFV. Cap. 17, p. 363-374.</p><p>http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/Arabidopsis.html, acesso em 29/08/2011.</p><p>http://www.jcvi.org, acesso em 29/08/2011.</p><p>http://www.jcvi.org.</p><p>http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/Arabidopsis.html</p><p>Sasson, A., da Silva, E.J. (1994) Revista O Correio da Unesco, n.8.</p><p>Ferreira, C., Aguiar, J., Pessanha, L., Rangel, P., Berbert-Molina, M., Flores, V. M. Q. (2009).</p><p>Tópicos em Biotecnologia – Material de Consulta. CEDERJ-UENF.</p><p>http://www.jcvi.org/</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>1Bolsista UAB. Pós-graduanda em Biociências e Biotecnologia – CBB/UENF.</p><p>2Bolsista de extensão. Graduanda em Ciências Biológicas – CBB/UENF.</p><p>3Eng. Agrônomo, Doutor, Professor Associado da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.</p><p>4Eng. Agrônoma, Doutora, Professora Associada da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.</p><p>CAPÍTULO 1 - BIOTECNOLOGIA VEGETAL</p><p>Aline Martins de Vita1</p><p>Vanessa de Souza Rodrigues2</p><p>Nayara Justo Nogueira2</p><p>Vanildo Silveira3</p><p>Claudete Santa-Catarina4</p><p>Os ganhos que se podem atingir pela biotecnologia vegetal têm reflexo sobre a agricultura, a</p><p>indústria alimentar, os consumidores e, sobretudo, o meio ambiente. Por exemplo, a produção de</p><p>plantas recorrendo a menores gastos de energia, pesticidas, fertilizantes e água, ou a produção de</p><p>plantas com níveis mais reduzidos de compostos alergénicos ou tóxicos, ou com melhores</p><p>qualidades para armazenamento ou processamento, ou ainda melhores qualidades nutricionais, são</p><p>alguns dos numerosos exemplos de aplicações da biotecnologia vegetal.</p><p>Na biotecnologia vegetal, o domínio da cultura in vitro (ou cultura de tecidos) de plantas teve</p><p>importância crucial para a micropropagação de espécies de interesse econômico-social e ecológico,</p><p>especialmente as espécies ameaçadas de extinção.</p><p>Desde seu início, até a atualidade, a cultura de células e tecidos vegetais passou por</p><p>diferentes descobertas, que envolvem desde a biotecnologia clássica e também a moderna. Destaca-</p><p>se abaixo a sequência histórica:</p><p>- 1838 – Schleinden & Schwann: estabelecem a Teoria celular, na qual os pesquisadores</p><p>mostram que as células são capazes de se manterem viáveis quando isoladas do organismo íntegro.</p><p>- 1902 – Haberlandt demonstrou a Totipotencialidade celular em células isoladas, sendo</p><p>denominado o “pai da cultura de tecidos”. A Totipotencialidade está baseada na teoria celular</p><p>descrita em 1838.</p><p>- 1922 – Robbins & Kotté demonstraram o cultivo isolado de raízes de gramíneas.</p><p>- 1926 – Went realizou o bioensaio com coleóptile de aveia, demonstrando a descoberta das</p><p>auxinas.</p><p>- 1934 – White realizou a primeira cultura contínua de raiz de tomateiro em meio líquido com</p><p>sais inorgânicos, extrato de levadura e sacarose.</p><p>- 1934-7 – Gautheret estabeleceu a primeira proliferação de tecido cambial em plantas</p><p>lenhosas, demonstrando a importância de vitaminas do complexo B.</p><p>- 1939 – Gautheret também demonstrou o primeiro crescimento contínuo de células de</p><p>cenoura. Neste mesmo ano, White estabeleceu cultura de medula de Nicotiana tabacum, e</p><p>Nobecourt demonstrou a diferenciação de raízes em calos de cenoura.</p><p>- 1946 – Ball obteve cultura de ápices meristemáticos caulinares.</p><p>- 1949 – Morel mostrou a evidência de ausência de vírus em estruturas meristemáticas.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>10</p><p>- 1953 – Muir estabeleceu a primeira cultura contínua em suspensão celular e clonagem de</p><p>células isoladas (comprovação da totipotencialidade). Neste mesmo ano, Watson & Crick descrevem</p><p>a hélice dupla do DNA, elucidando a estrutura tridimensional dessa molécula. Demonstraram</p><p>mecanismo para a cópia do material genético responsável pela perpetuação das espécies. Explosão</p><p>de pesquisas em biologia molecular, com rápido avanço das “técnicas de DNA recombinante”</p><p>(engenharia genética).</p><p>- 1955 - Miller, Skoog, van Saltza & Strong publicaram a descoberta da Cinetina. Neste</p><p>mesmo ano, Skoog & Miller demonstraram o balanço auxina/citocinina e sua importância</p><p>fundamental a morfogênese vegetal in vitro.</p><p>- 1958 – Steward e colaboradores obtiveram a embriogênese somática em Daucus carota.</p><p>- 1960 – Bergman realizou o plaqueamento de células vegetais.</p><p>- 1960 – Cocking descreveu o iIsolamento de protoplastos.</p><p>- 1962 – Murashige & Skoog estabeleceram a formulação do meio de cultura MS, o meio de</p><p>cultura mais utilizado na atualidade.</p><p>- 1966 – Guha & Mahesshwari fizeram a haploidia a partir de cultura de antera.</p><p>- 1970 - Howard Temin & David Baltimore isolaram as enzimas de restrição - cortam a</p><p>molécula de DNA em regiões específicas. Abriu caminho para a clonagem molecular dos genes com</p><p>a criação de clones de bactérias.</p><p>- 1972 – Carlson, Smith & Desring descreveram a primeira fusão de células somáticas</p><p>(protoplastos). Paul Berg isolou e empregou uma enzima de restrição para cortar o DNA e a DNA</p><p>ligase para unir duas fitas de DNA e formar uma molécula circular híbrida. Esta foi a primeira</p><p>molécula de DNA.</p><p>- 1973 – Cohen & Boyer fazem a primeira experiência de engenharia genética unindo dois</p><p>genes de dois organismos diferentes produzindo o primeiro Plasmídeo com DNA recombinante,</p><p>usando enzimas de restrição, o que dá início à biotecnologia moderna.</p><p>- 1977 - Walter Gilbert e Allan Maxam, na Universidade de Harvard e Frederick Sanger, na</p><p>Inglaterra, desenvolveram o método de sequenciamento de DNA.</p><p>- 1982 – Foi descrita a produção da primeira planta transgênica, tabaco resistente a</p><p>antibiótico.</p><p>- 1983 - Kary B. Mullis desenvolveu a técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) -</p><p>permite amplificar o material genético (genes) em tubos de ensaio. Aprovação de patentes de plantas</p><p>geneticamente modificadas.</p><p>- 1985 - Primeiros experimentos de campo como plantas transgênicas resistentes a insetos,</p><p>vírus e bactérias são realizados nos EUA.</p><p>- 1986 - O EPA (United States Environmental Protection Agency) aprovou a liberação da</p><p>primeira planta de tabaco geneticamente modificada.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>11</p><p>- 1987 - Calgene Inc. obteve a patente da sequência de DNA da poligalacturonase de tomate</p><p>- usada para desenvolver técnica que aumenta o tempo de vida dos frutos.</p><p>- 1994 - O Primeiro alimento geneticamente modificado (o tomate Flavr Savr) foi liberado para</p><p>comercialização/consumo humano no EUA pelo FDA (Food and Drug Administration), tornando-se o</p><p>primeiro alimento geneticamente modificado a chegar às prateleiras dos supermercados americanos.</p><p>- 1995-1996 - Variedades transgênicas de soja e milho são aprovadas para liberação</p><p>comercial nos EUA, dando início à rápida adoção desta tecnologia por agricultores em diferentes</p><p>países.</p><p>- 1996 - Conjuntamente, seis países plantam o primeiro milhão de hectares com transgênicos.</p><p>- 2000 - Foi sequenciado o genoma da primeira espécie vegetal, Arabidopsis thaliana,</p><p>tornando-se um dos organismos modelo para o estudo de genética, em botânica. O conhecimento do</p><p>papel de cada gene na fisiologia da espécie leva ao conhecimento da genética vegetal no seu todo.</p><p>Conjuntamente, 13 países atingem a marca de 25 milhões de hectares plantados com</p><p>variedades transgênicas, um aumento de 25 vezes a área cultivada em 1996.</p><p>- 2001 - Sequenciamento completo do genoma de bactéria fitopatogênica (Xyllela fastidiosa)</p><p>por consórcio de pesquisadores brasileiros (192 cientistas). Esta bactéria é causadora de doenças</p><p>como a praga do amarelinho (Clorose Variegada de Citros</p><p>- CVC) que afeta laranjeiras.</p><p>- 2007 - Liberação experimental de cana transgênica com alto teor de açúcar no Brasil pela</p><p>empresa Allelyx/Monsanto. Ocorreu também a liberação comercial de milho geneticamente</p><p>modificado resistente a inseto e tolerante a herbicida no Brasil.</p><p>- 2008 - Liberação comercial de algodão geneticamente modificado tolerante a herbicida no</p><p>Brasil.</p><p>- 2009 - Liberação comercial da soja geneticamente modificada tolerante a herbicida e</p><p>algodão resistente a inseto no Brasil.</p><p>1. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS</p><p>A cultura de tecidos vegetais é a uma técnica biotecnológica que possibilita o cultivo de</p><p>células, tecidos ou órgãos vegetais isolados da planta-mãe em meio de cultura artificial, em</p><p>condições assépticas. Inclui várias técnicas e metodologias utilizadas para a pesquisa em diversas</p><p>áreas, como botânica, biologia aplicada, fitotecnia, silvicultura, entre outros, com vários objetivos ,</p><p>desde estudos básicos do metabolismo e desenvolvimento da morfogênese in vitro ao aplicado, na</p><p>produção de propágulos de alta qualidade, como clonagem, obtenção de plantas transgênicas, etc.</p><p>A partir deste conjunto de técnicas é possível a obtenção de respostas morfogenéticas in vitro</p><p>a partir de células ou tecidos vegetais, obtendo-se plântulas, resultado da expressão da</p><p>totipotencialidade. A totipotencialidade, demonstrada inicialmente por Haberlandt (1902), mostra que</p><p>cada célula possui o potencial genético para reconstituir um organismo inteiro. A totipotencialidade</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>12</p><p>está baseada inicialmente na Teoria Celular de Schleiden e Schwan (1838), os quais mostraram que</p><p>algumas células eram capazes de serem separadas do organismo de origem e continuar a crescer</p><p>independentemente.</p><p>Ao retirarmos um pedaço da planta utilizada para a cultura in vitro, chamado de explante,</p><p>obtem-se uma alteração da harmonia estabelecida, interrompendo parte do sistema sinais/</p><p>receptores e o sistema de controle da divisão celular e expressão gênica estabelecida, sendo</p><p>introduzindo novos sinais (reguladores de crescimento, por exemplo) no sistema, que permitirão a</p><p>expressão da totipotencialidade.</p><p>Dentre vários fatores importantes para a expressão da totipotencialidade destaca-se a o</p><p>balanço de auxina:citocinina, que modula as várias respostas morfogenéticas in vitro, obtendo-se</p><p>desde a formação de raízes in vitro e indução de culturas embriogênicas quando em maior</p><p>concentração de auxina, à obtenção de brotações quando em maior concentração de citocinina</p><p>(Figura 1). Desta forma, pode-se destacar que na cultura de tecidos vegetais a relação dos</p><p>compostos adicionados ao meio de cultura regula a resposta morfogenética in vitro.</p><p>Figura 1. Balanço de auxina e citocinina em diferentes respostas morfogenéticas na</p><p>cultura in vitro.</p><p>Na cultura de tecidos vegetais existem diferentes rotas morfogenéticas para a obtenção de</p><p>plântulas in vitro. Destaca-se aa 1) obtenção de culturas de tecidos desorganizados ou pouco</p><p>organizados (calos); e b) a obtenção de cultura de tecidos organizados, que pode ser através da</p><p>morfogênese direta via embriogênese somática (obtenção de embriões somáticos) ou organogênese</p><p>(cultura de estruturas meristemas, primórdio foliar, segmentos nodais), e a morfogênese indireta no</p><p>qual tanto na embriogênese somática quanto na organogênese, a obtenção de embriões somáticos,</p><p>gemas e eixos caulinares são induzidos e formados a partir de calos originado do explante inicial.</p><p>No crescimento organizado, estruturas organizadas de crescimento podem ser mantidas</p><p>continuamente in vitro, e inclui o isolamento asséptico de estruturas definidas, realizando:</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>13</p><p> Cultura de meristemas, na qual são utilizados ápices caulinares, consistindo do domo</p><p>meristemático apical com ou sem um ou os dois primórdios foliares.</p><p> Cultura de ápices caulinares.</p><p> Cultura de nós de gemas laterais separadas.</p><p> Cultura de raízes isoladas.</p><p> Cultura de embriões, na qual embriões zigóticos fertilizados ou não são obtidos de</p><p>sementes ou frutos e cultivados in vitro até se desenvolverem em plântulas, pela embriogênese</p><p>somática.</p><p>Já o crescimento desorganizado se refere a todo o tipo de cultivo de agregados de células</p><p>sem a formação de tecidos, sejam elas na forma de:</p><p> Calos – crescimento e manutenção de massas celulares desorganizadas, obtidas da</p><p>desdiferenciação a partir de pedaços de tecidos vegetais.</p><p> Suspensões celulares – populações de células isoladas dispersas em um meio de cultura</p><p>líquido aerado sob agitação.</p><p>O objetivo da propagação de plantas através da cultura de tecidos, também chamada de</p><p>micropropagação, é propagar plantas que são clones da planta que doou o material vegetal, ou seja,</p><p>a planta-matriz. As novas plantas derivadas da cultura de tecidos são obtidas de três formas (Figura</p><p>1):</p><p> A partir de gemas apicais ou gemas primordiais (meristemas) que são estimuladas a</p><p>crescerem e se proliferarem, via organogênese direta;</p><p> A partir da obtenção de novos brotos induzidos e diferenciados a partir de tecidos</p><p>desorganizados (calos) por organogênese indireta, ou diretamente sobre o tecido do</p><p>explante denominada de organogênese direta;</p><p> Através da formação de embriões somáticos que se assemelham a embriões zigóticos de</p><p>sementes de plantas intactas e são capazes de se desenvolverem em novas plântulas. Esse</p><p>processo é chamado de embriogênese somática, o qual pode também ser obtido por via</p><p>direta (formação de embriões somáticos diretamente sobre o explante de origem) ou indireta</p><p>(pela formação inicial de calo e posterior desenvolvimento de embriões).</p><p>Teoricamente, todas células, orgãos ou plantas inteiras podem ser clonados, produzindo</p><p>uma nova população de plantas em que todos os indivíduos possuem a mesma constituição</p><p>genética do parental.</p><p>A princípio vamos entender melhor a forma em que o material vegetal deve ser cultivado e</p><p>manipulado em laboratório para a propagação de plantas por métodos de cultura de tecidos e, em</p><p>seguida, serão descritas as principais técnicas que têm sido desenvolvidas para o isolamento e</p><p>cultivo in vitro do material vegetal, seja ele células, tecidos ou orgãos da planta.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>14</p><p>Figura 2. Principais métodos de micropropagação utilizados na cultura in vitro. (Modificado de George, 2008).</p><p>2. PARÂMETROS ESSENCIAIS PARA A MANIPULAÇÃO DAS CULTURAS DE TECIDOS</p><p>VEGETAIS</p><p>Vários são os fatores que afetam as respostas morfogenéticas in vitro, destacando-se o</p><p>explante, a assepsia deste para a introdução in vitro e o meio de cultura utilizado, bem como as</p><p>condições de cultura in vitro.</p><p>2.1. Explantes</p><p>A cultura de tecidos é iniciada a partir de partes de plantas inteiras, onde pequenos órgãos ou</p><p>pedaços de tecido que são excisados da planta-matriz, chamados de explantes, são introduzidos in</p><p>vitro.</p><p>A escolha do explante é uma etapa fundamental, representando um efeito importante no</p><p>sucesso da cultura de tecidos. Explantes podem ser dos mais variados tipos, e por isso, a escolha do</p><p>explante para ser iniciada uma cultura in vitro vai depender de:</p><p>a) do tipo de cultura a ser iniciada - para cada tipo de cultura um determinado tipo de</p><p>explante pode ser mais adequado;</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>15</p><p>b) do tipo de explante – geralmente os explantes com células menos</p><p>diferenciadas/especializadas (como meristemas e embriões zigóticos) podem resultar em melhor</p><p>esposta morfogenética.</p><p>c) Idade do explante – explantes com tecidos mais jovens são preferíveis pela menor</p><p>diferenciação dos tecidos.</p><p>d) Condições fisiológicas e fitossanitárias da planta matriz – determinante para maior</p><p>sucesso no estabelecimento in vitro da cultura. Explantes oriundos de plantas matrizes debilitadas</p><p>com doenças e sem qualidade fisiológica terão maior dificuldade para o estabelecimento de culturas</p><p>assépticas e de qualidade fisiológica.</p><p>d) das</p><p>espécies vegetais utilizadas – cada espécie possui uma necessidade</p><p>hormonal/nutricional específica, onde determinados explantes podem ter melhor resposta na</p><p>morfogênese in vitro.</p><p>2.2. Assepsia</p><p>As plantas cultivadas no ambiente natural são invariavelmente contaminadas com</p><p>microorganismos e pragas. Estes contaminantes estão presentes, principalmente, na superfície da</p><p>planta, embora, alguns microrganismos possam se encontrar distribuídos de forma sistêmica dentro</p><p>dos tecidos.</p><p>Os explantes são mantidos em meios de cultura nutritivos que também são favoráveis ao</p><p>crescimento desses microorganismos. Assim sendo, a cultura de tecidos vegetais deve ser</p><p>estabelecida e mantida em condições assépticas, uma vez que o crescimento de bactérias e fungos</p><p>estabelece uma competição com o crescimento do material vegetal in vitro.</p><p>Portanto, os explantes utilizados no cultivo in vitro devem ser o mais asséptico possível. Para</p><p>tanto, alguns cuidados devem ser tomados desde a planta-matriz ao estabelecimento da cultura in</p><p>vitro. Destaca-se a importância de manter as plantas matrizes, quando possível, em locais</p><p>adequados como estufas de crescimento para que se possa realizar o manejo fitossanitário</p><p>adequado para posterior coleta dos explantes.</p><p>Uma vez obtidos, os explantes passarão por um processo de assepsia antes de sua</p><p>transferência in vitro, em meio de cultura nutritivo. Para a assepsia utiliza-se a lavagem do explante</p><p>em água corrente e pequena quantidade de detergente, seguido de lavagem com substâncias</p><p>químicas como hipoclorito de sódio, hipoclorito de cálcio, peróxido de hidrogênio e etanol, utilizados</p><p>para eliminar os microrganismos superficiais presentes nos explantes, seguido de enxágüe com água</p><p>destilada autoclavada, em câmara de fluxo laminar, para a retirada destas substâncias químicas.</p><p>Adicionalmente, é importante a esterilização de todo o material utilizado no processo, como vidrarias,</p><p>objetos para manipulação das culturas e o próprio meio de cultura.</p><p>O trabalho de isolar e transferir o material vegetal cultivado é realizado geralmente em salas</p><p>especiais ou cabines (câmaras de fluxo laminar) que permitem a manuseio dos materiais sem a</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>16</p><p>presença de microorganismos. Essas cabines devem se localizar preferencialmente em uma sala de</p><p>inoculação ou transferência reservada para esse propósito.</p><p>2.3. Condições de incubação</p><p>A cultura de tecidos, uma vez iniciada é colocada em incubadoras ou salas de crescimento</p><p>onde luz, temperatura e umidade são controladas. A taxa de crescimento da cultura dependerá</p><p>diretamente das condições oferecidas.</p><p>A luz é um importante fator no crescimento de culturas in vitro, onde os três aspectos do foto-</p><p>ambiente que mais influencia no crescimento e morfogênese in vitro, são: comprimento de onda;</p><p>densidade de fluxo de fótons; duração da exposição à luz ou fotoperíodo. Cada um desses atributos</p><p>tem efeito sobre a fotomorfogênese e a fotossíntese. Em geral, a indução de culturas embriogênicas</p><p>é obtida na ausência de luminosidade, enquanto a presença de luz é essencial para a obtenção de</p><p>órgãos, como brotações. Em salas de crescimento é simulada a duração do dia, com 16 horas de luz</p><p>e 8 horas de escuro.</p><p>A temperatura é outro fator determinante para a cultura in vitro. Para a maioria dos</p><p>laboratórios, as culturas introduzidas in vitro são mantidas em câmaras de crescimento com</p><p>temperatura controlada, sendo a temperatura média constante de crescimento de 25 °C a</p><p>empregada para uma grande quantidade de espécies, com exceção à Arabidopsis thaliana, que tem</p><p>melhor crescimento a 22 °C.</p><p>Adicionalmente, a Umidade Relativa é um fator importante para a cultura in vitro. A umidade</p><p>de 70% é geralmente recomendada para salas de crescimento, sendo baixa umidade pode resultar</p><p>na desidratação dos meios de cultura e ou alta umidade pode resultar na presença de agentes</p><p>contaminantes no ambiente de cultura.</p><p>2.4. Meio de cultura</p><p>Para o seu crescimento, o material vegetal introduzido in vitro necessita de condições</p><p>nutricionais adequadas. Este meio de cultura consiste de uma solução salina suplementada com</p><p>macronutrientes, compostos encontrados em altas concentrações nas plantas, sendo eles nitrogênio</p><p>(N), potássio (K), cálcio (Ca), fósforo (P), magnésio (Mg) e enxofre (S); e micronutrientes, compostos</p><p>encontrados em pequenas concentrações nas plantas, são eles ferro (Fe), níquel (Ni), cloro (Cl),</p><p>manganês (Mn), zinco (Zn), boro (B), cobre (Cu), molibdênio (Mo). Além destes, as plantas</p><p>apresentam a necessidade de outros constituintes como vitaminas e aminoácidos, também</p><p>adicionados ao meio de cultura para promover o crescimento vegetal. Além destes compostos, é</p><p>adicionado ao meio de cultura o uma fonte de energia utilizada no metabolismo celular, sendo a</p><p>sacarose a mais utilizada para a maioria das espécies vegetais. O crescimento e desenvolvimento de</p><p>cultura de tecidos vegetais também dependem da adição de reguladores de crescimento vegetais ao</p><p>meio de cultura. Naturalmente, as plantas produzem os hormônios de crescimento vegetal que</p><p>apresentam diversas funções na morfogênese vegetal. Os reguladores de crescimento vegetais são</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>17</p><p>compostos sintéticos, que em pequenas concentrações são capazes de modificar o crescimento ou a</p><p>morfogênese da planta na cultura in vitro. Desta forma, designa-se hormônios de crescimento para</p><p>os produzidos naturalmente nas plantas, e reguladores de crescimento para os compostos sintéticos.</p><p>As principais classes de reguladores de crescimento vegetal são auxina, citocinina, ácido</p><p>abscísico, giberelinas e etileno. O balanço entre auxinas e citocininas é o mais importante e mais</p><p>utilizado na regulação do crescimento e morfogênese em culturas de tecidos ou órgãos vegetais</p><p>(Figura 1). Este balanço foi inicialmente demonstrado por Miller et al. (1955) e Skoog & Miller (1957),</p><p>mostrando o efeito do balanço de auxinas/citocininas na morfogênese in vitro de calos, raiz e</p><p>brotações.</p><p>Recentemente, outras classes de hormônios vegetais foram descobertas e vem sendo aos</p><p>poucos caracterizadas, tais como os brassinosteróides, o ácido jasmônico, as oligossacarinas, a</p><p>sistemina e as poliaminas, os quais também apresentam importâncias fisiológicas sobre a</p><p>morfogênese in vitro de plantas. A concentração e a combinação dos reguladores de crescimento</p><p>são ajustadas de acordo com a espécie da planta ou até mesmo em diferentes estágios do cultivo.</p><p>Além dos reguladores de crescimento, a fonte de carbono, mas o meio de cultura básico</p><p>geralmente permanece inalterado. Baseado nisso, foram desenvolvidas várias formulações de meios</p><p>de cultura ao longo das décadas, cada uma delas adaptada para as melhores respostas in vitro, e</p><p>atualmente, vários são os meios de cultura descritos para várias espécies, e com diferentes</p><p>finalidades. Um dos primeiros meios de cultura estabelecidos foi o meio White (White, 1942), o qual</p><p>continha menos K e N. Em 1962 foi estabelecido o meio de cultura MS de Murashige & Skoog</p><p>(1962), sendo este o meio de cultura mais amplamente utilizado atualmente para a maioria das</p><p>espécies vegetais, e para a maioria dos estudos morfogenéticos in vitro, incluindo a embriogênese</p><p>somática e micropropagação. Posteriormente, outros meios de cultura foram desenvolvidos, como o</p><p>meio WPM (Wood Plant Medium) (Lloyd & McCown, 1981), especificamente desenvolvido para</p><p>espécies arbóreas, com menor concentração de N comparado ao meio MS. Adicionalmente, outros</p><p>meios de cultura foram desenvolvidos em seguida especialmente voltados para a micropropagação</p><p>de coníferas, tais como LPm (Von Arnold & Eriksson, 1981), P6/2 (Gupta & Pullman, 1990), entre</p><p>outros.</p><p>Além da sua composição, os meios de cultura podem ser preparados de forma sólida,</p><p>denominado semi-sólido, ou líquido, em suspensão celular.</p><p>2.4.1. Meio de cultura semi-sólido</p><p>Para a obtenção do meio de cultura</p><p>em estado semi-sólido, é necessário adicionar um agente</p><p>geleificante para que ele torne-se geleificado, ou seja, semi-sólido. Esse tipo de meio de cultura é</p><p>utilizado para dar suporte ao estabelecimento do explante, empregado em culturas de calos ou</p><p>órgãos (incluindo micropropagação) e para manutenção de culturas a longo prazo. As culturas</p><p>mantidas em meio-sólido são estáticas e ficam em contato com a superfície do meio. Vários são os</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>18</p><p>agentes que promovem a geleificação do meio de cultura, dentre elas o Agar, sendo este o agente</p><p>solidificante mais comumente utilizado na cultura in vitro. Outros agentes como fitagel e agarose</p><p>também podem ser utilizados. Entretanto, devido ao algo grau de purificação, estes agentes</p><p>geleificantes são utilizado em menor concentração (faixa de 1,8 a 2,0 g.L-1) comparativamente ao</p><p>Agar (faixa de 6 a 8 g.L-1), dependendo da espécie vegetal e da marca do produto.</p><p>2.4.2. Meio de cultura líquido</p><p>Meios de culturas líquidos, sem agentes geleificantes, são utilizados para culturas em</p><p>suspensão celular, sejam culturas celulares embriogênicas ou brotações. O tipo de explante a ser</p><p>utilizado vai definir o tipo de aeração necessária para a manutenção do oxigênio no meio de cultivo.</p><p>Desta forma, pode-se destacar dentre as técnicas utilizadas para o cultivo em meio de cultura líquido:</p><p> Imersão total em meio líquido - fornecendo agitação por meio de equipamento de</p><p>rotação ou magnético. Sistema muito utilizado no caso de suspensões celulares de</p><p>culturas embriogênicas, onde as células são mantidas em agitação para que possa</p><p>manter a aeração. Este sistema pode ser realizado utilizando a agitação horizontal,</p><p>utilizando frascos tipo “Erlenmeyers” com as células em suspensão. Adicionalmente,</p><p>pode-se também utilizar o aparato de Steward (Steward e Shantz, 1956) também</p><p>chamado de “nipple flask”, que consiste em um frasco com várias cavidades laterais</p><p>voltados para a parte externa do mesmo. Estes frascos são fixos a uma roda que ao</p><p>rotacionar faz com que as células ao passar pelas cavidades sejam banhadas e drenadas</p><p>com a rotação, expondo as células ao ar de forma alternada quando mantidas nas</p><p>cavidades. Este tipo de frasco não é adquirido normalmente no mercado, sendo</p><p>necessário a sua fabricação com estas características específicas por especialista em</p><p>confecção de vidraria, tornando o seu custo elevado, sendo com isso menos utilizados</p><p>atualmente.</p><p> Imersão temporária em sistemas de biorreatores - Este sistema é muito utilizado para</p><p>o crescimento de brotações para várias espécies vegetais, onde os explantes são</p><p>temporariamente banhados com meio de cultura. . Neste sistema, as brotações são</p><p>colocadas em um recipiente e o meio de cultura num reservatório. O meio de cultura é</p><p>bombeado do reservatório para o recipiente com os explantes em intervalos de tempo</p><p>determinados (varia de 5 a 10 minutos). Esse sistema previne a anoxia e possui a</p><p>vantagem de que o meio pode ser facilmente trocado no reservatório, sem a necessidade</p><p>de manipular as culturas. Todo o sistema é realizado em condições estéreis, sendo um</p><p>sistema de imersão cada vez mais popular nas pesquisas para a micropropagação.</p><p> Cultivo sob ponte de papel – Este sistema é utilizado para o cultivo de explante,</p><p>geralmente tecidos pequenos como meristemas, em meio de cultura líquido utilizando</p><p>uma ponte de papel filtro para manter o explante na superfície do meio de cultura. O meio</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>19</p><p>de cultura chega até o explante por difusão, fornecendo os nutrientes necessários para o</p><p>desenvolvimento da morfogênese.</p><p>3. FATORES QUE INFLUENCIAM NO ESTABELECIMENTO DA CULTURA</p><p>Além dos fatores citados acima, outros fatores como oxidação fenólica e densidade mínima</p><p>para o início da cultura também são fatores importantes que influenciam o estabelecimento da cultura</p><p>in vitro.</p><p>3.1. Oxidação fenólica</p><p>Algumas plantas, particularmente espécies tropicais, contem altas concentrações de</p><p>substâncias fenólicas que são oxidadas quando as células sofrem algum dano ou se tornam</p><p>senescentes. O tecido isolado, então, torna-se marrom ou preto pela liberação destes compostos, os</p><p>quais impedem o crescimento. O escurecimento causado pela exsudação de fenóis consiste em um</p><p>sério problema na cultura de tecidos, sendo espécie dependente, e pode impedir o crescimento e</p><p>desenvolvimento da cultura in vitro a partir do explante utilizado. Este problema pode ser solucionado</p><p>de várias formas, tais como: a) transferindo-se os explantes inoculados para novo meio de cultura em</p><p>intervalos de 1 ou 2 dias durante as duas primeiras semanas de cultivo; b) adicionando-se ao meio</p><p>de cultura determinadas substâncias, como o carvão ativado, capazes de adsorver esses compostos</p><p>liberados pelo explante, e conseqüentemente, não atuará sobre a inibição do crescimento e</p><p>desenvolvimento do explante; c) incubação prévia dos explantes em solução contendo agentes</p><p>antioxidantes como ácido ascórbico e ácido cítrico antes de sua inoculação no meio de cultura; d)</p><p>adição de agentes antioxidantes (ácido ascórbico e ácido cítrico) no meio de cultura, sendo os</p><p>explantes mantidos neste meio de cultura com os agentes antioxidantes; e) manutenção dos</p><p>explantes no escuro durante 2 a 5 dias após a inoculação no meio de cultura, evitando o efeito da luz</p><p>na síntese dos compostos fenólicos.</p><p>3.2. Densidade mínima de inoculação</p><p>Estudos visando conhecer a densidade mínima para o melhor crescimento devem ser</p><p>realizados durante o estabelecimento das culturas. Esta densidade mínima a ser estabelecida é</p><p>variável com o tipo de explante e espécie utilizada. Não está claro qual o mecanismo que determina</p><p>o melhor crescimento em uma densidade mínima, porém é descrito que certas substâncias podem</p><p>ser liberadas pelas células em cultura, tais como alcalóides, aminoácidos, enzimas, substâncias de</p><p>crescimento e/ou vitaminas, que quando em densidade mínima de explante por unidade volume de</p><p>cultura, podem estimular o crescimento celular. No entanto, quando as células são inoculadas em um</p><p>meio de crescimento básico com uma baixa densidade populacional, a concentração essencial de</p><p>substâncias nas células e no meio pode se tornar inadequado para a sobrevivência da cultura. Desta</p><p>forma é necessário um tamanho mínimo do explante, ou quantidade de células, ou protoplastos</p><p>isolados, por unidade do volume da cultura que permita o melhor crescimento.</p><p>Biotecnologia Vegetal</p><p>20</p><p>4. MICROPROPAGAÇÃO</p><p>As plantas podem ser propagadas através de dois ciclos de vida: o sexuado e o assexuado.</p><p>No ciclo sexuado, novas plantas são originadas após a fusão dos gametas parentais desenvolvendo</p><p>os embriões zigóticos contidos dentro de sementes e frutos. Na maioria dos casos, ocorre a</p><p>polinização cruzada que resulta em plantas com variação genética, cada uma representará uma nova</p><p>combinação de genes, durante a formação de gametas (meiose) e sua fusão destes gametas. Por</p><p>outro lado, no ciclo assexuado, as características genéticas da planta individual selecionada para</p><p>propagação (também chamada planta-mãe ou planta-estoque) são mantidas nas plântulas formadas,</p><p>sendo os genes copiados de forma idêntica em cada divisão mitótica. Um grupo de plantas</p><p>reproduzidas assexuadamente é chamado de clones, tanto aquelas obtidas por métodos tradicionais</p><p>(por mergulhia, estaquia) ou na micropropagação utilizando a cultura in vitro.</p><p>Através da micropropagação pode-se obter a propagação clonal massal de um genótipo</p><p>selecionado por técnicas de cultura in vitro, sendo empregado para definir os processos de</p><p>propagação vegetativa (assexuada) na cultura de tecidos.</p><p>A micropropagação é utilizada para a propagação de plantas in vitro especialmente através da:</p><p> multiplicação de brotos a partir de gemas axilares.</p><p> formação de brotos adventícios e/ou embriões somáticos, tanto diretamente em pedaços de</p><p>tecidos ou órgãos</p>