[Eletroforese Capilar] Aula

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12/06/2013
1
QFL238
�Recuperação 12/07/2013 (sexta-feira)
� Início: 18h00
�Permanência mínima até 19h00
�Turmas do diurno e do noturno
Eletroforese Capilar
Claudimir Lucio do Lago
IQ – USP
sala 1270
Eletroforese
� Técnica de separação 
baseada na migração 
diferenciada dos 
componentes de uma 
mistura sob um campo 
elétrico controlado.
� A eletroanalítica da ponte 
salina.
Arne Tiselius
Prêmio Nobel de Química 1948 
Eletroforese Capilar
� Capillary Electrophoresis (CE)
� Capillary Zone Electrophoresis (CZE)
� Separação eletroforética realizada em tubos de 
pequeno diâmetro interno (< 100 µm).
� Por que usar tubos capilares?
Equipamento básico de CE
Fonte de alta tensão
Eletrodo de metal nobre
Reservatório do 
eletrólito de corrida
Ambiente termostatizado
Reservatório da amostra
Detector
1987 – Perkin Elmer – Applied Biosystems
1989 – P/ACE – Beckman Coulter
1993 – P/ACE 5000
Equipamentos comerciais
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2
Agilent CE 7100
PA 800
Beckman Coulter
Equipamentos comerciais Eletroferograma
-0.600
-0.400
-0.200
0.000
0.200
0.400
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
time / min
ou
tp
u
t /
 
V
1
2
3
4
5
1
Mobilidade Iônica
Deslocamento em meio viscoso
peso
resistência
F = m · a
Deslocamento em meio viscoso
F(m,g)
F(η,v)
viscosidade
Mobilidade iônica
+ zeEFE =rvFF ηπ6−=
campo elétrico
FE – força exercida pelo 
campo elétrico
z – carga do íon
e – carga elementar
E – campo elétrico
FF – força exercida pelo solvente
η – viscosidade
r – raio iônico hidratado do íon
v – velocidade do íon
Válido para íons esféricos e pequenas moléculas de solvente.
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3
Mobilidade iônica
Quando FE = -FF :
r
zeE
v
ηπ6
=
r
ze
η
µ
π6
=
Ev µ=
zeEFE =
rvFF ηπ6−=
+
2+
Mobilidade iônica
r
ze
η
µ
π6
=
r
ze
⋅⋅=
ηpi
µ 1
6
constante
característica do meio
característica do íon
peso ou tamanho?
� “Eu separo proteínas de acordo com o peso 
delas...”
� Para compostos orgânicos:
� tamanho da cadeia é proporcional ao número de 
carbonos � r ∝ nC
� massa molar (M) é proporcional ao número de carbonos
� Logo... 
r
z
∝µ
Isto é uma aproximação!!!
M
z
∝µ
r
ze
⋅⋅=
ηpi
µ 1
6
Mobilidade de algumas espécies
espécie µ / 10-5 cm2 s-1 V-1
Li+ 40,1
Na+ 51,9
K+ 76,2
Ca2+ 61,7
Zn2+ 54,7
NH4+ 76,3
r
ze
⋅⋅=
ηpi
µ 1
6
Em água a 25 ºC
Mobilidade de algumas espécies
espécie −µ / 10-5 cm2 s-1 V-1
F- 57,0
Cl- 79,1
Br- 80,9
[Fe(CN)6]3- 105
[Fe(CN)6]4- 114
CH3COO- 42,4
r
ze
⋅⋅=
ηpi
µ 1
6
Em água a 25 ºC
Mobilidade do Próton
espécie |µ | / 10-5 cm2 s-1 V-1
H+ 362
OH- 206
Em água a 25 ºC
H+ O
H
H
H O H+
H
D. Marx et al., “The nature of the hydrated 
excess proton in water”, Nature 397 (1999) 
601-604.
N. Agmon, “The Grotthuss mechanism”, 
Chem. Phys. Letters 244 (1995) 456-462.
D. Marx et al., “The nature of the hydrated 
excess proton in water”, Nature 397 (1999) 
601-604.
N. Agmon, “The Grotthuss mechanism”, 
Chem. Phys. Letters 244 (1995) 456-462. Theodor von 
Grotthuss
(1785-1822) 
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2
Mobilidade Efetiva
Mobilidade efetiva
� A espécie A- tem mobilidade diferente de zero
� A espécie HA tem mobilidade igual a zero
� Qual delas devo considerar?
� Se as reações direta e reversa estão ocorrendo com cinética 
elevada :
� A mobilidade a ser considerada deve ser a média das mobilidades 
de cada forma ponderadas pelas respectivas frações do tempo.
HA(aq) � H+(aq) + A-(aq)
Mobilidade efetiva
HA(aq) � H+(aq) + A-(aq)
0 2 4 6 8 10 12
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
pKa
pH
α
HA A-
fração molar
Mobilidade efetiva
� Na verdade, a fração molar correspondente à 
fração do tempo em cada forma.
HA(aq) � H+(aq) + A-(aq)
∑= iieff µαµ
−−
+= AAHAHAeff µαµαµ
Mobilidade efetiva
Exemplo: Ácido Acético (pKa = 4,7)
µHAc = 0
µAc-= -42,4 10-5 cm2 V-1 s-1
−−
+= AcAcHAcHAceff µαµαµ
−−
= AcAceff µαµ
∑= iieff µαµ
0 2 4 6 8 10 12
-40
-30
-20
-10
0
µ e
ff
/ 
10
-5
 c
m
2
V-
1
s-
1
pH
Mobilidade efetiva ∑= iieff µαµ
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
m
o
bi
lid
a
de
 
/ 1
0-
5 
cm
2 
V-
1 
s-
1
pH
 alanina
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Mobilidade efetiva ∑= iieff µαµ
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
m
o
bi
lid
a
de
 
/ 1
0-
5 
cm
2 
V-
1 
s-
1
pH
 alanina
 tirosina
Mobilidade efetiva ∑= iieff µαµ
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
m
o
bi
lid
a
de
 
/ 1
0-
5 
cm
2 
V-
1 
s-
1
pH
 alanina
 tirosina
 ácido aspártico
Separação de aminoácidos
20 30 40 50 60
20
11 + 12
19
18
17
16
15
14
13
10
9
8
76
54
3
21
co
nd
ut
iv
id
a
de
tempo / minutos
Separação de aminoácidos em meio ácido: 1 mmol/L de (1) Lys, (2) Arg, (3) His, (4) 
Gly, (5) Ala, (6) Val, (7) Iso, (8) Leu, (9) Ser, (10) Thr, (11) Asn, (12) Met, (13) Gln, 
(14) Trp, (15) Glu, (16) Phe, (17) Pro, (18) Tyr (0,5mM), (19) Cys (0,5mM) e (20) 
Asp.
Eletrólito de corrida 2,7 mol/L de ácido acético (pH 2.1) com hidroxietilcelulose 
0,05%. Comprimento do capilar 82 cm (67 cm efetivos) e diâmetro interno de 
50 µm. Injeção por pressão a 30 s e potencial de corrida de 28 kV. Detector C4D 
1 MHz e 4 Vpp.
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Fluxo Eletroosmótico
Íons e moléculas sob ação do campo elétrico
+-
A superfície da sílica
silanol
siloxano
silanóis geminais
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A superfície da sílica
Si
O
OH
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
Si
O
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
Si
O
Si
O
O
O
Si
O
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
Si
O
Si
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Si
O
O
-
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
Si
O
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
Si
O
Si
O
O
O
Si
O
Si
O
O
O
SiO
Si
O
O
O
Si
O
Si
OH
OH
OH
O
-
O
-
O
-
silanolato
pH baixo pH alto
A solução eletrolítica na região da superfície da sílica
cátion livre
cátion adsorvido
silanol silanolato
cátions e ânions livres
O interior do capilar O interior do capilar
+-
Fluxo eletrosmótico
fluxo eletrosmótico X fluxo laminar
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Fluxo laminar
diâmetro interno do capilar: 100 µm comprimento do capilar: 60 cm
coluna d’água: 5 cm tempo em milissegundos
Fluxo eletrosmótico
diâmetro interno do capilar: 75 µm campo elétrico: 200 V/cm
tempo em milissegundos
Fluxo eletrosmótico
� A velocidade do EOF depende:
� do campo elétrico.
� da densidade de carga na superfície interna do capilar (pH 
e espécies adsorvidas);
� da espessura da dupla camada elétrica (força iônica);
� da viscosidade da região da dupla camada elétrica 
(solvente, aditivos, temperatura);
Mobilidade do fluxo eletrosmótico
dce
eo
E
v
η
εζ
= Ev eoeo µ=
veo – velocidade do EOF
ε – constante dielétrica
ζ– potencial zeta
E – campo elétrico
ηdce – viscosidade na região da dupla camada elétrica
dce
eo η
εζµ =
Mobilidade e mobilidade...
� Mobilidade Eletroforética
� Tem origem microscópica:
� carga, raio iônico, 
viscosidade...
� Manifestação macroscópica:
� bandas compostas pelos 
analitos se deslocando pela 
coluna...
� Modelo matemático:
� Mobilidade do Fluxo 
Eletrosmótico
� Tem origem microscópica:
� superfície interna do 
capilar...
� Manifestação macroscópica:
� bombeamento da solução de 
um reservatório para o 
outro...
� Modelo matemático:
dce
eo η
εζµ =
r
ze
η
µ
π6
=
Mobilidade aparente
fluxo do rio
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Mobilidade Aparente Mobilidade aparente
eoeffap µµµ +=
EOF
EOF
µµeo µap = µ + µeo
-µ
µeo µap = -µ + µeo
Ev eoeo µ=
Ev µ=
Ev
EEv
vvv
eoap
eoap
eoap
)( µµ
µµ
+=
+=
+=
mobilidade aparente
mobilidade efetiva
mobilidade do EOF
EOF com diferentes materiais
PYREX
SÍLICA
TEFLON
3 4 5 6 7 8
4
3
2
1
pH
M
O
B
IL
ID
AD
E 
EL
ET
R
O
O
SM
ÓT
IC
A
(10
-
4
c
m
2
V-
1
s
-
1 )
Controle do EOF pela modificação da 
superfície interna do capilar
� Ligação Covalente através de reações de silanização
� C8H17Si(OCH3)3C18H37SiCl3
� Alterações Dinâmicas pela adição de polímeros ou 
compostos iônicos que adsorvam sobre sílica.
� Álcool polivinílico (PVA) aumenta a viscosidade.
� Brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) ou Ca2+ permitem 
reverter o fluxo eletrosmótico.
Reversão do EOF Um pouco de prática
Ev apap µ=
T
ap
m
D
L
V
t
L µ=
Ev eofeof µ=
T
eof
eof
D
L
V
t
L µ=
eofeffap µµµ +=
Para o pico do analito: Para o pico de um marcador neutro:
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4
Modalidades de Eletroforese
Modalidades de eletroforese
� Modalidades a serem consideradas:
� Eletroforese de zona livre (CZE)
� espécies iônicas ou ionizáveis em geral
� Eletroforese em gel (CGE)
� macromoléculas (DNA, peptídeos...)
� Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC)
� compostos neutros
� Outras estratégias:
� Eletrocromatografia capilar (CEC)
� é praticamente HPLC... sem bomba
� Focalização isoelétrica (CIEF)
� separação de peptídeos
� Isotacoforese (CITP)
� se você não sabe o que é, tudo bem... ou quase
Resolução





 −
=
lenta
lentarápidaNR
µ
µµ
4
Quanto maior a diferença relativa de mobilidade, maior a resolução.
ab
r
E WW
tR
+
∆
=
2
Resolução prevista em função do número de pratos e mobilidades:
Eletroforese de Zona Livre (CZE ou CE)
mecanismo agente aplicação
ácido/base H+ ou OH– aminoácidos
complexação com espécie 
neutra
18-crown-6 K+ e NH4+
complexação com espécie 
iônica
B(OH)4- açúcares
solvatação diferenciada CH3OH Ca2+ e Na+
derivatização HSO3- aldeídos
18-crown-6
Eletroforese Capilar em Gel (CGE)
� A solução aquosa é substituída por gel.
� Uma adaptação da eletroforese em gel – muito 
popular em aplicações bioquímicas.
� Exemplos: agarose, poliacrilamida
� Mecanismo: peneiramento em gel, isto é, moléculas 
menores têm maior mobilidade.
r
ze
⋅⋅=
ηpi
µ 1
6
Válida para moléculas esféricas e desde que as 
moléculas do solvente sejam pequenas.
Cromatografia eletrocinética micelar 
(MEKC ou MECC)
� Técnica baseada na 
utilização de meio micelar.
� Micelas iônicas possuem 
mobilidade diferente de zero.
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Cromatografia eletrocinética micelar 
(MEKC ou MECC)
EOF
Uma espécie neutra na solução caminha em direção ao pólo negativo.
Retida em uma micela negativa, ela caminha em direção ao pólo positivo.
Detecção de Álcoois Alifáticos
Eletrólito de corrida: 50 mM fosfato de sódio, 50 mM SDS (pH 6,9).
Concentração dos analitos: 10 µL / mL
Detector: 600 kHz
(1) 2-propanol
(2) 1-propanol
(3) 2-methyl-2-propanol
(4) 2-butanol
(5) 2-methyl-1-propanol
(6) 1-butanol
(7) 2-methyl-2-butanol
(8) 3-methyl-1-butanol
(9) 1-pentanol4 5 6 7 8 9 10-0.20
-0.15
-0.10
-0.05
0.00
0.05
b
98
765
43
21
De
te
ct
o
r 
Re
sp
o
n
se
 
/ V
Time / min
Exemplo para o PeakMaster
NH2
CH3
NH2
CH3
NH2
CH3
NH2
CH3CH3
CH3
NH3
+
CH3
NH2
CH3
+ H+
pKa = 4,34 pKa = 4,68 pKa = 5,09 pKa = 4,38 5
Eletrólito Suporte
Breve revisão sobre circuitos elétricos
9 V
R1 R2 R3
1000 Ω 1500 Ω 500 Ω
corrente = 3 mA
ddp 3,0 V 4,5 V 1,5 V
Breve revisão sobre circuitos elétricos
9 V
R1 R2 R3
1000 Ω 1500 Ω 500 Ω
ddp 3,0 V 4,5 V 1,5 V
0,0 V
1,5 V6,0 V9,0 V
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Breve revisão sobre circuitos elétricos
9 V
R1 R2 R3
1000 Ω 10 000 Ω 100 Ω
corrente = 811 µA
ddp 0,811 V 8,11 V 81,1 mV
0 V
9 V
Extrapolando para eletroforese...
20 kV
R1 R2 R3
10 GΩ 10 kΩ 10 GΩ
corrente = 1,0 µA
Qual a d.d.p. sobre a região da amostra?
amostra
10 mV
água
Cálculo da velocidade de um íon
� Se a região da amostra compreender 2 mm de extensão, qual o 
campo elétrico para uma d.d.p. de 10 mV?
� 5 mV/mm ou 50 mV/cm
� Qual a velocidade do íon potássio sob este campo elétrico? 
(µK+ = 7,62 10-4 cm2 s-1 V-1)
� 0,05 V cm-1 x 7,62 10-4 cm2 s-1 V-1 = 0,000038 cm/s ou 1,4 mm/h.
� 20 kV em uma coluna de 50 cm � E = 400 V/cm
� K+ move-se a 0.3 cm/s ou 1 m/h.
� Como solucionar este problema?
A importância do eletrólito suporte
� Se o meio é uma solução de um eletrólito ao invés de água 
pura, a condutividade será maior. 
� � maior d.d.p. sobre a zona da amostra
� � maior campo elétrico sobre a zona da amostra 
� � maior velocidade dos íons de interesse
� Eletrólito suporte, eletrólito de corrida...(BGE – background 
electrolyte)
� Tampão de corrida (buffer) tem dupla finalidade:
� regular o campo elétrico
� regular o pH
6
Eficiência, Efeito Joule e 
Capilares
Base da eletroforese
� “A eletroforese, como técnica analítica, é uma eterna 
luta entre a migração diferenciada e a difusão”.
� Migração eletroforética ocorre somente durante o período 
em que o campo elétrico é aplicado.
� Difusão ocorre o tempo todo.
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Base da eletroforese
� O eletroferograma é um reflexo do que ocorre no 
interior da coluna.
� Um pico largo significa que a espécie está dispersa 
pela coluna.
banda larga ↔ pico largo 
Eficiência de Separação
� A eficiência está relacionada com a capacidade 
potencial de um sistema em resultar em boas 
separações (cromatográficas ou eletroforéticas).
� O parâmetro que determina a eficiência é o número 
de pratos “teóricos”.
� Quanto maior o número de pratos, melhor!
� O parâmetro definitivo sobre a qualidade de 
separação de dois analitos é a resolução.
� A resolução é função da eficiência, mas não apenas 
dela.
Difusão e largura de banda
Partindo de um injeção pontual e considerando a lei de Fick:
Dt
x
e
Dt
m
txc 4
2
4
),( −=
pi
c – concentração
x – posição relativa ao centro
t – tempo
m – número de mols/área 
inicialmente injetado
D – coeficiente de difusão
x
0
Número de pratos teóricos
tm e σt devem ser dados na mesma unidade:
segundos, minutos, cm, polegadas...
2






=
t
mtN
σ
Utilizando a largura a meia altura (W1/2)...
( ) σ⋅= 2ln222/1W
2
2/1
55,5 





=
W
tN m
2
16 





=
base
m
W
tNou considerando um pico 
triangular
2






=
σ
LN
Eficiência em eletroforese
eletrodoeletrodo injeção detecção
LT
V
TL
VE =
Ld
largura
∝ σ
2






=
d
dLN
σ
m
d
t
L
v =
Ev ⋅= µ
Eficiência
TL
VE =
md Dt2=σ
Considerando que a difusão 
longitudinal é a única causa 
de alargamento da banda
D – coeficiente de difusão
tm – tempo de migração
v
L
t dm = Ev ⋅= µ
Td
d
d
d
m
d
L
V
LD
L
L
E
D
L
Dt
LN ⋅⋅=⋅== µµ
222
222
DL
LVN
T
d µ
⋅⋅=
2
2






=
d
dLN
σ
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Eficiência
� Há uma dependência entre mobilidade e coeficiente de difusão: 
µ = ezD/kT � N = zeV/2kT
� Quanto maior a carga do íon, maior a eficiência
� V e T podem ser controlados
� Temperatura não pode ser amplamente variada.
� Quanto maior o potencial de corrida, maior a eficiência!!
� Parece que o número de pratos independe do comprimento do percurso.
Quanto maior o capilar, maior o trajeto de separação, porém menor o 
campo elétrico.
� Se o número de pratos independe do tamanho do capilar, por que utilizar 
um capilar tão longo?
D
VN µ⋅=
2DL
LVN
T
d µ
⋅⋅=
2
detecção na ponta 
do capilar
Eficiência
Dt2=σ
Modelo atual:
-Difusão longitudinal é o 
único fator que leva à 
dispersão
-Detecção pontual
-Injeção pontual
∑=+++=
i
i
22
3
2
2
2
1
2
... σσσσσ
Vários fatores contribuem para o alargamento do pico:
Remodelando a eficiência
� A largura do pico depende do processo de 
eletroforese (mobilidade, campo elétrico, difusão, pH 
do meio...).
� A largura do pico depende do equipamento (tamanho 
do detector, sistema e tamanho do plug de amostra).
...
2222 +++= detecçãoinjeçãodifusão σσσσ
Remodelando a separação
� 1ª correção: A injeção não é pontual.
tempo
material injetado
tempo
material injetado
eletroferograma hipotético (sem difusão)
Remodelando a separação
� 2ª correção: A detecção não é pontual.
tempo
tempo
eletroferograma hipotético (sem difusão)
região de detecção
região de detecção
Remodelando a eficiência
L
E
DL
v
D
difusão
⋅
==
µ
σ
222
...
2222 +++= detecçãoinjeçãodifusão σσσσ
V
LD
difusão
⋅
⋅⋅
=
µ
σ
2
2 2
( )
12
2
2 injeçãoinjeção
x∆
=σ
( )
12
2
2 detecção
detecção
x∆
=σ
∆xinjeção – comprimento do plug de amostra
∆xdetecção – comprimento da região de detecção
2






=
σ
LN
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Remodelando a eficiência
� Se a injeção e a detecção forem pontuais, a eficiência 
não dependerá do tamanho da coluna.
� Como as regiões de injeção e detecção são finitas, 
então
“Quanto maior a coluna, melhor”
( ) ( )
1212
2 222
2
detecçãoinjeção xx
V
DL
LN
∆
+
∆
+
=
µ
Tamanho da coluna
� Considerando o íon K+ (D = 1,96·10-9 m2s-1 e µ = 76,2·10-9 m2s-1V-1) e fonte de 
alta tensão a 25 kV.
( ) ( )
1212
2 222
2
detecçãoinjeção xx
V
DL
LN
∆
+
∆
+
=
µ
2






=
σ
LN
coluna de 50 cm coluna de 5 cm
σcoluna = 0,72 mm � N = 482 000 σcoluna = 0,072 mm � N = 482 000
coluna de 50 cm coluna de 5 cm
σcoluna = 0,72 mm � N = 370 000 σcoluna = 0,072 mm � N = 15 000
� ∆xinj = 0 mm e ∆xdet = 0 mm :
� σinj = 0,0 mm e σdet = 0,0 mm
� ∆xinj = 1 mm e ∆xdet = 1 mm :
� σinj = 0,29 mm e σdet = 0,29 mm
Tamanho da coluna
n
0 0.5 1 1.5 2 2.5
0
2 .105
4 .105
430000
0.79
� Para o exemplo dado, uma coluna de 80 cm apresenta 
90% da eficiência de uma coluna de 160 cm.
tamanho / m
N
Eficiência e Número de Pratos
( ) ( )
1212
2 22
2
detecçãoinjeçãoTD
D
xx
V
LDL
LN
∆
+
∆
+
=
µ
LT – comprimento total do capilar
LD – comprimento do capilar até o detector
D – coeficiente de difusão
µ – mobilidade
∆xinjeção – extensão da coluna preenchida 
com a amostra
∆xdetecção – extensão da coluna percebida 
pelo detector
V – potencial aplicado
LT
LD
∆xinjeção ∆xdetecção
Quanto menor o volume de injeção e detecção, melhor.
Eficiência e Número de Pratos
T
D
DL
VLN
2
µ
=
LT – comprimento total do capilar
LD – comprimento do capilar até o detector
D – coeficiente de difusão
µ – mobilidade
V – potencial aplicado
LT
LD
Quanto maior o percurso até o detector, melhor.
injeção detecção
( ) ( )
1212
2 22
2
detecçãoinjeçãoTD
D
xx
V
LDL
LN
∆
+
∆
+
=
µ
Eficiência e Número de Pratos
Daria para reduzir o coeficiente de difusão?
injeção detecção
D
VN
2
µ
=
D – coeficiente de difusão
µ – mobilidade
V – potencial aplicado
T
D
DL
VLN
2
µ
=
12/06/2013
15
Eficiência e Número de Pratos
Melhor:
-maior carga
-maior potencial
-menor temperatura
D
VN
2
µ
=
D – coeficiente de difusão
µ – mobilidade
V – potencial aplicado
kT
ezD
=µ
e – carga elementar
z – carga do íon
k – constante de Boltzmann
T – temperatura em Kelvin
Relação de Einstein:
kT
zeVN
2
=
Quanto maior o potencial, melhor.
O Aquecimento Joule
... ou o preço a ser pago pelo elevado 
potencial aplicado.
DL
VLN
T
D µ
⋅=
2 R
VP
2
=
R
Vi =
Aquecimento Joule
R
VP
2
=
calor gerado pelo efeito Joule
viscosidademobilidadecondutância iônica molar
condutividade da solução
resistência elétrica da solução






=
T
f 1η
diferença de temperatura 
entre interior e exterior
)(PfT =∆
r
ze
η
µ
π6
=
Fzµλ =
∑=
i
iiCλκ
A
LR T
κ
1
=
A questão do diâmetro do capilar
� Verdade: A redução do diâmetro da coluna diminui a quantidade do calor gerado.
� Mentira: Esta é a razão para utilizar coluna capilar (calor menor gerado em 
volume também menor).
A
LR T
κ
1
=
Tmcq ∆=
t
R
VPdtTmcq
2
==∆= ∫
t
mcR
VT
2
=∆
t
mcL
AVT
T
κ2
=∆
ALvolume T=
AL
m
volume
m
T
==ρ
ALm Tρ=
t
AcLL
AVT
TTρ
κ2
=∆ t
c
ET ρ
κ2
=∆
A questão do diâmetro do capilar
� Por que os mamíferos das regiões frias são grandes?
� Por que os elefantes têm orelhas grandes?
Superfície de contato e troca de calor
� A temperatura de equilíbrio é dada pela taxa de 
aquecimento e taxa de transferência de calor.
� A redução da área de secção de corte do meio 
melhora a troca de calor.
dLd
dL
T
T 4
4
volume
superfície
2 ==
pi
pi
Para um cilindro:
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16
Superfície de contato e troca de calor
d
4
volume
superfície
=Para um cilindro:
µm
ao invés de
mm
Capilares de sílica fundida
� Sílica (SiO2) – transparente no UV 
e visível
� Revestimento de poliimida para 
aumentar a resistência mecânica –
transparente, mas avermelhado
75 µm
36
0 
µm
Capilares de sílica fundida
Inner Diameter Wall temperature Temperature Difference
25 µm 26º C 0.53º C
50 µm 28.2º C 1.39º C
75 µm 31.2º C 3.14º C
100 µm 34.7º C 5.58º C
Pontos de atuação para minimizar o Efeito Joule
R
VP
2
=






=
T
f 1η
)1,(
d
PfT =∆
r
ze
η
µ
π6
=
Fzµλ =
∑=
i
iiCλκ
A
LR T
κ
1
=
•ventilação forçada
•refrigeração líquida
•coluna capilar
•espécies 
volumosas e 
monovalentes
•aumento da 
viscosidade
•baixa concentração
•redução do potencial �
7
Injeção de amostra
Equipamento para eletroforese
Fonte de alta tensão
Eletrodo de metal nobre
Reservatório do 
eletrólito de corrida
Ambiente termostatizado
Reservatório da amostra
Detector
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17
Injetando uma amostra no capilar
� Quanto maior o volume injetado, maior a área do pico
� Quanto maior o volume injetado, menor a eficiência
� Limite inferior: ∆xinj ≈ ∆xdet
� Limite superior: resolução dos picos e faixa linear do detector
� Devido às dimensões do capilar, válvulas injetoras são 
proibitivas.
� Estratégias mais empregadas:
� Injeção hidrodinâmica
� Injeção eletrocinética
( ) ( )
1212
2 222
2
detecçãoinjeção xx
V
DL
LN
∆
+
∆
+
=
µ
Modalidades de Injeção
� Injeção Hidrodinâmica:
� Pressurização do reservatório de amostra
� Despressurização do reservatório oposto
� Desnivelamento favorável ao reservatório da amostra
� Injeção Eletrocinética:
� Introdução de amostra sob ação de campo elétrico
Injeção Hidrodinâmica
reservatórios e capilar preenchidos com tampão de corrida
Injeção Hidrodinâmica
∆∆∆∆h
hgP ∆⋅⋅=∆ ρ
∆P – diferença de pressão
ρ – densidade do eletrólito de corrida
g – aceleração da gravidade
∆h – desnível entre os reservatórios
Alternativas: aplicar pressão positiva na amostra ou negativa na saída.
Injeção Hidrodinâmica
TL
tdP
volume
⋅⋅
⋅⋅⋅∆
=
η128
π
4
volume – volume injetado
∆P – diferença de pressão
d – diâmetro interno do capilar
t – tempo de injeção
η – viscosidade
LT – comprimento total do capilar
O volume injetado depende da temperatura.
Injeção eletrocinética
Fonte AT
25 kV
Fonte AT
amostra
5 kV
injeção: corrida:
12/06/2013
18
Injeção eletrocinética
tCrEQ
a
t
eo ⋅⋅⋅⋅





⋅+= 2π)(
κ
κµµ
Q – quantidade injetada (g ou mol)
µ – mobilidade eletroforética
µeo – mobilidade do fluxo eletroosmótico
r – raio interno do capilar
t – tempo de injeção
E – campo elétrico
κt – condutividade do tampão de corrida
κa – condutividade da amostra
C – concentração do analito (g/L ou mol/L)
A quantidade injetada depende da temperatura.
8
Sistemas de Detecção
Sistemas de Detecção
� São utilizadas várias técnicas já conhecidas e 
adaptadas às condições de eletroforese capilar.
� Muitas foram “herdadas” de HPLC
� Exemplos de detectores: espectrofotométrico (UV-
Vis), por fluorescência, eletroquímico, espectrometria 
de massas, ...
� Principal problema: 
� dimensões reduzidas � dificuldades mecânicas, baixa 
sensibilidade, isto é, baixa relação sinal/ruído (SNR).
Detecção espectrofotométrica
� Sílica é transparente
� A camada de poliimida absorve na região do UV-Vis.
� Remoção com ácido ou por aquecimento
Detecção espectrofotométrica
� Sílica é transparente
� A camada de poliimida absorve na região do UV-Vis.
� Remoção com ácido ou por aquecimento
Detecção espectrofotométrica
� Sílica é transparente
� A camada de poliimida absorve na região do UV-Vis.
� Remoção com ácido ou por aquecimento
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19
Detecção espectrofotométrica
� Sílica é transparente
� A camada de poliimida absorve na região do UV-Vis.
� Remoção com ácido ou por aquecimento
Detecção espectrofotométrica
Como ocorre a detecção?
picos positivos, picos negativos, sem 
picos...
Como ocorre a detecção?
0 10 20 30 40
0.00
0.04
20.0
20.1
K+Li+
Cl-
Na+
co
n
ce
n
tra
çã
o
 
/ m
M
posição / mm
Perfis de concentração ao longo dos 40 mm iniciais da coluna após 10 s
Condições: eletrólito NaCl20 mM Campo elétrico: 333 V/cm
Amostra: LiCl e KCl 50 µM ocupando inicialmente 6 mm na ponta.
Detector sensível a K+
0 10 20 30 40
0.00
0.04
20.0
20.1
K+Li+
Cl-
Na+
co
nc
e
nt
ra
çã
o 
/ m
M
posição / mm
0 10 20 30 40 50
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Re
sp
o
st
a
 
do
 
de
te
ct
o
r
posição / mm
eletrólito NaCl
analitos: K+ e Li+
Detector sensível a Na+
0 10 20 30 40
0.00
0.04
20.0
20.1
K+Li+
Cl-
Na+
co
nc
e
nt
ra
çã
o 
/ m
M
posição / mm
0 10 20 30 40 50
19.92
19.94
19.96
19.98
20.00
20.02
20.04
20.06
20.08
20.10
20.12
R
e
sp
o
st
a
 
do
 
de
te
ct
o
r
posição / mm
eletrólito NaCl
analitos: K+ e Li+
12/06/2013
20
Detector sensível a Cl-
0 10 20 30 40
0.00
0.04
20.0
20.1
K+Li+
Cl-
Na+
co
nc
e
nt
ra
çã
o 
/ m
M
posição / mm
0 10 20 30 40 50
19.98
20.00
20.02
20.04
20.06
20.08
20.10
Re
sp
o
st
a
 
do
 
de
te
ct
o
r
posição / mm
eletrólito NaCl
analitos: K+ e Li+
Detector Condutométrico
0 10 20 30 40
0.00
0.04
20.0
20.1
K+Li+
Cl-
Na+
co
nc
e
nt
ra
çã
o 
/ m
M
posição / mm
0 10 20 30 40
0.2528
0.2532
0.2536
0.2540
κ
 
/ S
 
m
-
1
position / mm
eletrólito NaCl
analitos: K+ e Li+
∑=
i
iii CzF µκ
( )++++−−++ +++= LiLiKKClClNaNa CCCCF µµµµκ
Formas de Detecção
� Exemplo:
� Eletrólito NaCl
� Amostra Li+ e K+
� O detector pode ser sensível ao:
� analito exclusivamente (Li+ e K+)
� co-íon presente no tampão (Na+)
� contra-íon presente no tampão (Cl–)
� conjunto de duas ou mais espécies
detecção indireta 9
Resumo
... e considerações finais
Recursos
PeakMaster 5.3: http://web.natur.cuni.cz/~gas/
Resumo
� A qualidade da separação eletroforética é altamente 
dependente do campo elétrico.
� O campo elétrico é dependente do potencial aplicado e do 
tamanho da coluna (E = V / L).
� A coluna necessita possuir um tamanho mínimo de ~ 100 
vezes o comprimento da região de injeção e detecção.
� O potencial deve ser tão elevado quanto possível.
12/06/2013
21
Resumo
� O calor gerado depende da ddp, da geometria da coluna e da 
condutividade do eletrólito de corrida (Aquecimento Joule).
� A diminuição do diâmetro do capilar leva à melhora da 
eficiência de dissipação de calor.
� A redução do diâmetro do capilar está limitada por:
� sensibilidade do detector
� efeito do fluxo eletrosmótico
� adsorção dos analitos
� problemas com entupimento
Resumo
� O eletrólito de corrida tem a função de regular o campo 
elétrico.
� A viscosidade do meio determina:
� a mobilidade das espécies,
� o fluxo eletrosmótico,
� o volume injetado
� e, em alguns casos, o comportamento do detector
� A viscosidade é altamente dependente da temperatura (em 
meio aquoso, ~ 2% / oC) � necessidade de controle da 
temperatura
Resumo
� O fluxo eletrosmótico está sempre presente e deve ser 
considerado (eliminado ou aproveitado).
� O EOF pode ser modificado por:
� pH
� silanização
� tensoativos
� polímeros solúveis
� força iônica
Resumo
� Durante o processo eletroforético, o perfil de concentração de 
todas as espécies iônicas (amostra + eletrólito) são alterados.
� É possível basear um sistema de detecção em sensores para:
� os analitos (detecção direta)
� o co-íon (detecção indireta)
� o contra-íon (detecção indireta)
� combinação deles
Resumo
� A detecção espectrofotométrica e por fluorescência 
são as técnicas de detecção mais utilizadas. Técnicas 
seletivas.
� A detecção condutométrica sem contato é uma 
técnica robusta e, apesar de ser uma técnica 
eletroquímica, não está sujeita aos efeitos do campo 
elétrico de separação. Técnica não seletiva.
Resumo
� A separação em eletroforese é conseguida quando as 
espécies possuem mobilidade iônica diferenciadas.
� O meio é importante para determinar o processo de 
separação:
� pH
� complexantes
� micelas (MEKC)
� gel (CGE)
� solventes orgânicos (NACE)