Pratica 2 invertase

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Licenciatura em Química 
 
Química V 
 
Roteiro de Aula Prática 
 
Prática 2 – Cinética enzimática 
 
As atividades que vamos desenvolver nesta aula prática têm como objetivo 
ilustrar os conceitos básicos da cinética enzimática, o estudo dos fatores que 
determinam as velocidades de uma reação catalisada por uma enzima. 
Nesta prática utiliza-se a enzima invertase, também chamada sacarase. Esta 
enzima produzida pelo epitélio mucoso do jejuno catalisa a hidrólise do açúcar da cana, 
a sacarose [O- -D-glicopiranosil-(1 2)--D-frutofuranosídeo], em glicose e frutose. A 
deficiência enzimática, presente em 10% dos esquimós da Groelândia, causa um 
distúrbio conhecido como intolerância à sacarose. 
 
Dosagem da atividade enzimática 
A determinação da atividade enzimática da invertase é feita pela dosagem dos açúcares 
redutores formados. 
Na estrutura da sacarose a glicose e frutose estão ligadas entre si pelos respectivos 
carbonos anoméricos, de maneira que o dissacarídeo resultante não é redutor. Glicose e 
frutose apresentam carbonos anoméricos livres e são, portanto, açúcares redutores. A 
dosagem dos açúcares redutores somente detecta, somente, os produtos da reação 
(frutose e glicose). Esta dosagem baseia-se na reação entre o ácido 3,5-dinitrosalicílico 
(DNS) e os açúcares redutores. Estes açúcares reduzem o DNS, gerando complexos de 
coloração marrom, os quais podem ser quantificados por espectrofotometria a 540 nm. 
 
Material utilizado: 
- Tampão acetato de sódio 0,02 M pH 4,7; 
- Invertase, diluída 1:50 a 1:100 em tampão acetato; 
- Solução de sacarose 0,2 M em tampão acetato; 
- Reativo DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico): 10 g de DNS são dissolvidos em 200 mL de 
NaOH 2M. A seguir, 300 g de tartarato duplo de sódio e potássio são dissolvidos em 400 
mL de água. As duas soluções são misturadas e o volume é completado com água até 
um litro. 
- Preparação da enzima: A invertase é obtida mantendo-se a levedura em uma solução 
de bicarbonato de sódio 0,1 M por 24 horas a 40o C. Com o choque térmico, a levedura 
secreta para o meio externo a enzima. O sobrenadante contendo a enzima é separado 
das células por centrifugação. A solução contendo a enzima pode ser estocada por 
algumas semanas a 4o C ou meses a 20o C. Nesta prática, a solução inicial da enzima 
será previamente diluída de 50 a 100 vezes em solução tampão (acetato 20 mM pH 4,7), 
em função de sua atividade biológica. 
 
Cuidado especial a ser tomado na execução da prática 
As pipetas estarão etiquetadas, a fim de evitar a troca e contaminação. TOMAR 
ESPECIAL CUIDADO COM A PIPETA DA ENZIMA, PARA NÃO CONTAMINAR AS DEMAIS 
SOLUÇÕES, O QUE LEVARIA A RESULTADOS FALSOS. 
 
Numerar os tubos identificando o experimento e a reação. Ex.: a reação 3 do 
experimento II deve marcada como Tubo II-3. 
 
EXPERIMENTO I - Efeito da concentração de enzima na velocidade inicial da reação 
1.Em uma estante, preparar 5 tubos de ensaio com as quantidades de tampão e enzima 
indicadas na tabela 1 (obs: realizar o ensaio em duplicata). 
2.Equilibrar a temperatura dos tubos a 30 oC no banho-maria por 5 minutos. 
3.Adicionar 0,4 mL da solução de substrato (sacarose) em cada tubo. Desta forma a 
concentração final de sacarose será de 80 mM ou 80 moles/mL. 
4.Incubar a 30o C no banho-maria por 10 minutos. 
5.Proceder ao método de dosagem de açúcares redutores: 
 
PROTOCOLO DE DOSAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES 
a)Adicionar a cada tubo de reação 1 mL do reativo DNS e homogeneizar. 
OBS: Não adicione água! 
b)Colocar os tubos em banho fervente por 5 minutos. 
c)Resfriar os tubos e adicionar 8 mL de água destilada. 
 
6.Anotar a absorvância a 540 nm de cada tubo na tabela 1. 
Não despreze o conteúdo dos tubos ainda. Eles ainda serão usados. 
 
Tabela 1 
Tubo Tampão (mL) Enzima (mL) Sacarose (mL) Absorvância 
(média das 
duplicatas) 
I-1 0,6 0,0 0,4 
I-2 0,5 0,1 0,4 
I-3 0,4 0,2 0,4 
I-4 0,3 0,3 0,4 
I-5 0,2 0,4 0,4 
 
Obs: 
1.Acertar a absorvância zero para o tubo I-1 (branco). 
2.Ler a absorvância dos tubos I-2 a I-5 em comprimento de onda de 540 nm. 
 
 
 
EXPERIMENTO 2- Determinação das velocidades da reação em função da concentração 
de substrato 
1.Em uma estante, preparar 7 tubos de ensaio com as quantidades de tampão e enzima 
indicadas na Tabela 2 (realizar o ensaio em duplicata). 
2.Equilibrar a temperatura dos tubos a 30oC por 5 minutos. 
3.Adicionar substrato. 
4.Incubar a 30 oC por exatamente 10 minutos. 
5.Proceder ao método de dosagem de açúcares redutores 
6.Anotar a absorvância a 540 nm na tabela 2. 
Não despreze o conteúdo dos tubos ainda. Eles ainda serão usados. 
 
Tabela 2 
Tubo Tampão (mL) Enzima (mL) Sacarose (mL) Absorvância 
(média das 
duplicatas) 
II-1 0,8 0,2 0,0 
II-2 0,7 0,2 0,1 
II-3 0,6 0,2 0,2 
II-4 0,5 0,2 0,3 
II-5 0,4 0,2 0,4 
II-6 0,3 0,2 0,5 
II-7 0,2 0,2 0,6 
 
Obs: 
1.Acertar a absorvância zero para o tubo II-1 (branco) em comprimento de onda de 540 
nm. 
2.Ler a absorvância dos tubos II-2 a II-7 e anotar os resultados na Tabela 7 . 
 
 
EXPERIMENTO 3- Determinação da curva padrão 
Uma curva padrão de concentrações crescentes de glicose e frutose e 
respectivas absorvâncias a 540 nm após reação com DNS deve ser construída. Esta curva 
padrão permitirá determinar a concentração de glicose e frutose formadas na hidrólise 
da sacarose pela invertase. Desta forma será possível determinar a taxa de formação de 
produtos por mL de reação em um determinado intervalo de tempo, ou seja, a 
velocidade da reação enzimática. 
 
Obtenção da curva padrão 
Preparar uma solução padrão com uma concentração de 0,9 mg/mL de glicose e frutose 
(5 mM de cada açúcar) ou 1,8 mg/mL de um dos açúcares. A solução é diluída em 
tampão, completando sempre um volume total de 1 mL, conforme a tabela abaixo. A 
cada tubo é adicionado o reativo DNS e a absorvância a 540 nm é determinada. O 
aumento da concentração dos açúcares redutores leva a um aumento correspondente 
da absorvância (realizar o experimento em duplicata). 
 
Preencha a Tabela 3 abaixo com os dados de absorvância lidos em aula. A partir destes 
dados, construa uma curva-padrão. Para isto, trace um gráfico contendo unidades de 
absorvância a 540 nm nas ordenadas em função da concentração de sacarose 
hidrolisada em moles/mL nas abscissas. 
Definição de unidade da enzima 
Uma unidade de invertase é definida como a quantidade de enzima que catalisa a 
hidrólise de 1 mol do substrato (sacarose) em produtos (glicose e frutose), por minuto, 
sob condição de pH, temperatura e concentração de substrato definidos. 
 
Conversão de absorvância em velocidade de reação 
Para converter a absorvância lida em velocidade inicial, utilize a curva-padrão. 
Transforme o valor da absorvância em moles/mL de sacarose hidrolisada e, a seguir, 
divida por 10 minutos (tempo da reação) para obter a velocidade de reação expressa em 
moles/mL/min. 
 
Tabela 3 
Tubo Tampão 
(mL) 
Solução padrão (mL) Sacarose hidrolisada 
(mmols/mL) 
Absorvância 
(média das 
duplicatas) 
III-1 1,0 0,0 0,0 
III-2 0,9 0,1 0,5 
III-3 0,8 0,2 1,0 
III-4 0,7 0,3 1,5 
III-5 0,6 0,4 2,0 
III-6 0,5 0,5 2,5 
III-7 0,4 0,6 3,0 
III-8 0,3 0,7 3,5 
III-9 0,2 0,8 4,0 
III-10 0,1 0,9 4,5 
 
Obtenção da curva padrão 
Construir uma curva padrão Absorvância X moles/mL de sacarose hidrolisada com os 
dados da Tabela 3. 
 
Determinação das velocidades de reação – Experimento I 
.A partir dos valores de absorvância lidos no espectrofotômetro (Tabela I), determinar, 
graficamente (através da curva padrão) para cada tubo, a quantidade de moles/mL de 
sacarose hidrolisada. Converter os valores de moles/mL de sacarose hidrolisada em 
valores de velocidade e anotar. 
Construir um gráfico de velocidade inicial de reação (em moles de sacarose hidrolisada 
por mL por min) em função do volume da preparação da enzima adicionado (em mL). 
 
 
Determinação das velocidades de reação - Experimento II 
A partir dos valores de absorvância lidos no espectrofotômetro (Tabela II), determinar, 
graficamente(através da curva padrão) para cada tubo, a quantidade de moles/mL de 
sacarose hidrolisada e anotar os resultados. Converter os valores de moles/mL de 
sacarose hidrolisada em valores de velocidade e anotar. 
Construir um gráfico de velocidade inicial de reação (em moles de sacarose hidrolisada 
por mL por min) em função da concentração de substato (sacarose (mM)). 
 
Relatório: 
1. Descrever, sucintamente, o objetivo da prática (não repita o experimental 
utilizado). 
2. Resultados a serem apresentados no relatório 
- Apresentar todas as tabelas completas com os resultados experimentais e cálculos 
- Apresentar o gráfico da curva padrão obtida (absorvância x [sacarose hidrolisada]) 
- Apresentar os gráficos da velocidade de reação em função do volume adicionado de 
enzima e de concentração de substrato (Gráfico V X [S] e de 1/V x 1/[S] e cálculo de KM 
e Vmax em cada gráfico). 
3. Questões a serem respondidas no relatório 
a.Que tipo de curva foi obtida quando se relacionou velocidade com a quantidade de 
enzima? Explique conceitualmente por que a elevação da concentração da enzima gera 
um aumento da velocidade inicial da reação. 
b.Com base nos resultados do experimento II, explique por que não ocorre um aumento 
significativo da velocidade inicial da reação, após determinada concentração de 
substrato. 
c.Existem diferenças entre os resultados de Vmáx e Km obtidos pelo gráfico de 
Michaelis-Menten e do duplo recíproco (Lineweaver-Burk)? Qual dos gráficos apresenta 
os resultados mais exatos? Por quê?