2 Estudo dirigido - bioquímica experimental

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2º Estudo Dirigido 
 
 
Bioquímica experimental 
 
 
 
 
Data: 27/08/2021 
 
 
 
 
 Determinação de Km e Vm 
A ordem dos reagentes é obrigatoriamente: tampão, enzima, DNS (reagente) e solução do 
substrato. Primeiramente, o tampão é adicionado para ajustar as condições do meio para as 
condições de operação da enzima, essa que vem logo em seguida. Entre a enzima e a solução do 
substrato vem o DNS, o motivo dessa escolha é a alta velocidade da reação. Caso o substrato fosse 
colocado antes, já haveria produto. Essa ordem é importante, pois o intuito é a formação de um 
branco. 
 
a) Protocolo para obtenção das soluções intermediárias: 
A partir da solução de substrato inicial 2M, alíquotas menores foram separadas da solução inicial 
e diluídas para concentrações menores, para a obtenção das concentrações finais desejadas, as 
concentrações das soluções intermediárias devem ser o dobro das concentrações finais. Portanto, 
para atingir uma concentração final de 0,10 M, onde se adicionam 0,5 mL da solução intermediária 
para um volume total de 1,0 mL essa mesma solução intermediária deve ter 0,20 M de 
concentração, por exemplo. 
 
b) 
Volume Final (mL) Conc. Final (M) Volume Inicial (mL) Conc. Inicial (M) 
1,0 0,10 0,5 0,20 
1,0 0,15 0,5 0,30 
1,0 0,25 0,5 0,50 
1,0 0,50 0,5 1,00 
1,0 1,00 0,5 2,00 
 
c) 
Tabela: Curva padrão de glicose dosada pelo método do DNS. 
[glicose] (0,01M) (mL) [glicose] (M) Abs (540nm) 
0,2 0,002 0,15 
0,4 0,004 0,31 
0,6 0,006 0,46 
0,8 0,008 0,59 
1,0 0,010 0,74 
SOMATÓRIO = 0,030 2,25 
 
Abs = K x [glicose] 
K = Σ Abs / Σ [glicose] 
Logo: K = 2,25 / 0,030 = 75 M-1 
 
Ao fazer o inverso de K, encontramos o fator da curva padrão: 
Fator CP = 1 / K = 0,0133 M 
 
Através do fator da curva padrão, determina-se a concentração do produto, [P], e os resultados 
obtidos são apresentados na tabela: 
 [P] = Abs x fator CP 
 
Já a velocidade inicial é igual a concentração do produto por 5 minutos (tempo reacional): 
Vi = [P] / 5 
 
[S] (M) Abs 
(540 nm) 
[P] (M) Vi (M/min) 1/Vi (min/M) 1/[S] (M-1) 
0,10 0,18 0,0024 0,0005 2000 10,00 
0,15 0,26 0,0035 0,0007 1429 6,67 
0,25 0,38 0,0051 0,0010 1000 4,00 
0,50 0,54 0,0072 0,0014 714 2,00 
1,00 0,70 0,0093 0,0019 526 1,00 
 
d) 
Gráfico: Vi x [S] 
 
Gráfico: 1/Vi x 1/[S] 
 
 
e) 
Gráfico: 1/Vi x 1/[S] Extrapolado 
 
A equação obtida para o gráfico acima é igual a: 
 y = 161,88x + 367,57 
Realizando a extrapolação, consegue-se obter os valores que cortam os eixos 1/Vi e 1/[S]: 
1/Vm = 367,62 
1/[S] = -2,27 
 
 
f) Já que Vm = 0,0027 M/min | Km = 0,4405 M 
A Equação de Lineweaver-Burk fica da seguinte forma: 
 
 
Influência da natureza do catalisador e da temperatura na velocidade da reação de hidrólise 
da sacarose 
 
a) 
Velocidade (M/min) = Δ Produto (M) / Tempo (min) 
Tempo: 5 minutos 
 
Tabela 3 - Hidrólise da sacarose catalisada pela enzima invertase 
Tubo Temperatura (°C) Produto formado (M) Velocidade (M/min) 
1 8 0,0004 8,00x10-5 
2 20 0,0015 3,00x10-4 
3 30 0,0030 6,00x10-4 
4 37 0,0048 9,60x10-4 
5 45 0,0073 1,43x10-3 
6 50 0,0088 1,76x10-3 
7 55 0,0100 2,00x10-3 
8 60 0,0082 1,64x10-3 
9 70 0,0019 3,80x10-4 
10 80 0,0003 6,00x10-5 
11 100 0,0001 2,00x10-5 
 
Tabela 4 - Hidrólise da sacarose catalisada por HCl 
Tubo Temperatura (°C) Produto formado (M) Velocidade (M/min) 
1 8 0,0000 0,00 
2 30 0,0000 0,00 
3 37 0,0002 4,00x10-5 
4 55 0,0003 6,00x10-5 
5 70 0,0017 3,40x10-4 
6 80 0,0058 1,16x10-3 
7 90 0,0180 3,60x10-3 
8 100 0,0338 6,76x10-3 
 
b) 
Gráfico Temperatura x Vinicial referente a Tabela 3 
 
Gráfico Temperatura x Vinicial referente a Tabela 4 
 
 
c) Em ambos os gráficos gerados o aumento da temperatura leva a um aumento na velocidade, mas 
no primeiro gráfico esse aumento só acontece até um certo ponto, onde se atinge a velocidade 
máxima. Isso acontece porque a partir de um certo ponto a enzima começa a desnaturar pela 
temperatura elevada o que faz com que a reação não esteja mais sendo catalisada, portanto a 
velocidade de reação começa a decrescer. No entanto, isso não acontece no caso do HCl, o aumento 
da temperatura ocorre diretamente proporcional a velocidade inicial. 
 
d) Primeiramente, ocorre a protonação do oxigênio que está ligado às duas cadeias cíclicas. A 
etapa seguinte é lenta, na qual a ligação desse oxigênio com o carbono da cadeia com 5 átomos é 
quebrada, formando dois compostos diferentes: um possui uma cadeia com 6 átomos (sendo um 
deles oxigênio que se encontra deficiente em elétrons) que adquiriu uma hidroxila a mais e o outro 
possui uma cadeia com 5 átomos (sendo um deles oxigênio) onde o carbono que estava ligado ao 
oxigênio central encontra-se deficiente em elétrons. Posteriormente, adiciona-se água que protona 
as duas moléculas, fazendo com que não haja mais nenhum átomo deficiente em elétrons. Os 
compostos obtidos são: glicose (cadeia cíclica com 6 átomos) e frutose (cadeia cíclica com 5 
átomos).