Revisão de Virologia Parte 1

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A1 e A2 - Propriedade geral dos vírus
O que são vírus?
São parasitas intracelulares celulares obrigatórios. Os vírus são estruturas
subcelulares, com um ciclo de replicação exclusivamente intracelular, sem nenhum
metabolismo ativo fora da célula hospedeira. Basicamente, uma partícula viral
completa, ou vírion, é composta por uma molécula de ácido nucleico circundado por
uma capa de proteína, podendo conter lipídios e açúcares. A função básica do vírion é
carregar o genoma viral para dentro da célula, a fim de ser replicado e amplificado. Esse
fato requer uma estrutura que contenha o ácido nucleico e o mantenha protegido,
juntamente com alguma proteína necessária para sua replicação, e ligantes na superfície
viral, que possibilitem sua entrada na célula hospedeira.
Estrutura e Composição dos vírus:
Podem ser feitos de DNA ou RNA.
Capsídeo: Em outras palavras, a ocorrência de subunidades proteicas similares obriga a
um arranjo simétrico entre elas, que são unidas por meio de ligações não covalentes. Tais
ligações têm a função de facilitar a liberação do ácido nucleico dentro da célula,
mas mantém as proteínas unidas para a manutenção da rigidez e estabilidade do
vírus fora da célula, a união de capsídeo e ácido nucleico se chama nucleocapsídeo.
Simetria: Helicoidal, Icosaédrica e Complexo
Envelope: Derivado das membranas celulares. A aquisição do envelope é realizada por
um processo denominado brotamento, e requer primeiramente o direcionamento de
proteínas virais (espículas) para uma membrana celular (local de brotamento) e,
posteriormente, ocorre a interação entre proteínas virais intracitoplasmáticas com
essas proteínas virais inseridas na membrana celular.
Biossíntese viral: A produção de vírions a partir de uma única partícula apenas pode
ocorrer se essa partícula viral encontrar uma célula que possa fazer o processo de
replicação. Alguns vírus podem infectar vários tipos celulares, enquanto outros são
bastante restritos quanto ao tipo celular que infectam. A Permissividade de uma célula
a determinado vírus, ou seja, a capacidade de uma célula replicar ou não
determinado vírus depende de uma série de fatores celulares. Se a maquinaria da
célula consegue não somente replicar o genoma viral, mas também ter como produto a
montagem de partículas virais infecciosas, dizemos que essa célula é permissiva à
replicação deste vírus. Vale salientar que o fato de uma célula replicar o genoma viral
não significa que partículas virais infecciosas vão ser produzidas. O processo de infecção
pode ser abortado a qualquer momento no ciclo de replicação, basta faltar algum
componente celular necessário para tal. Em geral, após a liberação do genoma viral
na célula (RNA ou DNA), as primeiras proteínas produzidas são aquelas que
asseguram a replicação do genoma (não estruturais); as proteínas que integram a
nova partícula viral sintetizada são produzidas em uma fase mais tardia e são
chamadas proteínas estruturais.
A3 - Replicação Viral (Etapas da biossíntese viral)
Fluxogramas da Replicação:
A3 - Replicação Viral:
1. Adsorção: A adsorção é a primeira etapa da biossíntese viral (ou ciclo de
replicação viral), na qual ocorre a ligação específica de uma ou mais proteínas virais
com proteínas na superfície celular. As estruturas formadas por proteínas celulares
que são reconhecidas pelas espículas virais são denominadas receptores – componentes
que desempenham funções na célula, mas também são utilizados pelas partículas virais
para esse primeiro contato vírus-célula.
2. Penetração e Desnudamento: A penetração ou internalização é um evento que
depende de energia e envolve a etapa de transferência do vírus para dentro da
célula. Durante a adsorção, mudanças conformacionais nas proteínas virais e receptores
celulares possibilitam a entrada do genoma viral ou do nucleocapsídeo na célula. Isso
pode acontecer por mecanismos distintos. São eles:
➢ Para alguns vírus envelopados, a adsorção expõe aminoácidos hidrofóbicos das
glicoproteínas virais, que facilitam a fusão entre o envelope viral e a
membrana plasmática celular (fusão direta), liberando o genoma viral para o
citoplasma celular.
➢ Alguns vírus são endocitados pela célula após a adsorção. Os vírus que
realizam esse processo podem ser envelopados ou não. Em geral, para os
vírus envelopados, a acidificação da vesícula endocítica facilita a fusão do
envelope viral com a membrana da vesícula endocítica (fusão dependente de
pH).
➢ Para os vírus não envelopados, existem mecanismos de lise da vesícula
endocítica para a liberação do genoma viral, podendo ou não depender de pH
ácido Formação de um poro na membrana plasmática celular e translocação
do genoma viral através do poro formado, com o restante da partícula viral
permanecendo no meio extracelular Passagem do vírus inteiro através da
membrana citoplasmática (penetração direta)
3. Replicação e Tradução: Para que a replicação viral seja bem-sucedida, é necessário
ultrapassar as barreiras impostas pela fisiologia celular. Um exemplo dessas
barreiras é a compartimentalização celular. As células apresentam vários
compartimentos, delimitados por membranas (p. ex., núcleo, complexo de
Golgi,lisossomas), cada um com seu microambiente específico em termos principalmente
de enzimas e outras proteínas. Devido a isso, a replicação da maioria dos vírus com
genoma de DNA ocorre no núcleo, pois é nesse local que a célula tem a maquinaria
necessária para a replicação do DNA. Do mesmo modo, a replicação de vírus de
RNA costuma ocorrer no citoplasma, pois é nesse ambiente que uma molécula de
RNA pode ser traduzida.
4 e 5. Morfogênese e Liberação: Na morfogênese, fazem parte a automontagem, a
maturação e a liberação do vírus das células infectadas. Após a síntese de proteínas
iniciais, geralmente regulatórias, a transcrição do ácido nucleico e a síntese de proteínas
estruturais, as partículas virais começam a etapa de automontagem, um processo que
culmina com a liberação dos vírions.
➢ Os vírus não envelopados podem ser montados no citoplasma (picornavírus,
reovírus) ou no núcleo (parvovírus, adenovírus). Os vírus não envelopados
dependem da lise da célula para sua liberação, embora, atualmente, existam
modelos, ainda bastante discutíveis, de liberação de alguns desses vírus, sem
necessariamente destruir a membrana celular.
➢ Os vírus envelopados adquirem o envelope nas membranas celulares,
citoplasmáticas, nucleares ou de algumas organelas ou vesículas
intracelulares. Nesses vírus, o processo de aquisição do envelope é
denominado brotamento, podendo ou não culminar com a liberação da
partícula viral; isso dependerá da membrana utilizada como local de
brotamento.
Curva de Replicação viral:
Classificação de Baltimore:
Classe I: O DNA genômico é transportado para o núcleo e imediatamente transcrito em
RNAm por enzimas celulares. A partir dessa transcrição, são traduzidas, primeiramente,
proteínas regulatórias de toda a síntese de proteínas e do genoma do vírus, assim como
proteínas que conferem vantagens para a produção de RNAm viral. Em uma etapa mais
tardia da biossíntese, são sintetizadas proteínas estruturais, para então começar a
montagem da partícula viral.
Classe II: Os vírus de DNA de fita simples (DNAfs) são agrupados na Classe II. Esses
vírus fazem uma fita complementar ao DNA genômico antes do início da replicação, uma
vez que o DNA polimerase apenas reconhece o DNA fd.
Classe III: Os vírus de RNA de fita dupla (RNAfd) são agrupados na Classe III. Para
que a replicação tenha início, é necessária a síntese de RNAm. Esses vírus trazem a
enzima RNA polimerase-RNA dependente como parte do vírus.
Classe IV: Na Classe IV, temos os vírus de RNA de fita simples de polaridade positiva
(RNAfs+), que servem como RNAm; essa é a maneira mais simples de replicação. Assim
que é liberado no citoplasma da célula-alvo, é reconhecido pela maquinaria de tradução
da célula, ocorrendo tradução de proteínas, que serão processadasposteriormente. Esse
vírus vai necessitar da enzima de RNA polimerase-RNA dependente para a replicação do
seu genoma, que é codificada pelo genoma viral.
Classe V: Os vírus de RNA de fita simples com polaridade negativa (RNAfs–)
correspondem à Classe V e não podem ser traduzidos diretamente in vivo ou in vitro.
Assim, seu genoma sozinho não é considerado infeccioso. Como no caso dos vírus de RNA
de fita dupla, é necessário que o genoma esteja associado a uma transcriptase viral
(RNA polimerase-RNA dependente), que irá primeiramente sintetizar uma fita
complementar positiva (RNAm), para somente então ser traduzido.A partir daí, maior
quantidade de proteínas virais e genoma será sintetizada para a montagem dos vírus.
Classe VI: Os retrovírus constituem a Classe VI; contém um genoma diplóide e, durante
o ciclo de replicação, sintetizam um DNA intermediário (transcrição reversa). Tal
transcrição é feita pela enzima transcriptase reversa, que tem atividade de DNA
polimerase-RNA dependente, que irá transcrever o RNA viral em DNA para ser
integrado no genoma da célula. Uma vez inserido no genoma celular, o genoma viral
recebe o nome de provírus, e a transcrição dos RNAm virais é feita por enzima RNA
polimerase-DNA dependente celular.
Classe VII: Na Classe VII, estão os vírus com genoma de DNAfd, com o envolvimento
de um intermediário RNA no ciclo replicativo. Esses vírus apresentam também uma
transcriptase reversa codificada em seu genoma, mas a sua produção de RNAm é
bastante similar à dos vírus DNAfd da Classe I.
A4 - Patogênese Viral
O que é Patogênese:
• Processo pelo qual a infecção viral conduz à doença
• A maioria das infecções virais são subclínicas. Não é interessante para o vírus
causar danos ou matar o hospedeiro
• As consequências da infecção viral dependem da interação vírus - hospedeiro
• Virulência = relacionada à severidade da infecção
Principais Portas de entrada: Em geral, os vírus penetram nos organismos pelo contato
com as células nas superfícies do corpo. Os sítios de entrada comumente utilizados por
vírus incluem as mucosas dos sistemas respiratório e urogenital, a conjuntiva, o trato
gastrointestinal e a pele.
Pele: Os vírus só podem penetrar no organismo pelo rompimento da integridade da pele,
produzindo lesões locais após penetração através de pequenas abrasões. Em geral, a
replicação é limitada ao local de entrada, porque a epiderme é destituída de vasos
sanguíneos ou linfáticos que poderiam facilitar a disseminação dos vírus.
Mucosa: As superfícies mucosas representam uma vasta área do corpo coberta por
barreiras epiteliais. Devido ao fato de as mucosas estarem em contato com o ambiente
externo e, portanto, em contato frequente com antígenos estranhos, esses tecidos são
imunologicamente ativos.
Mucosa do trato respiratório: O sistema respiratório é, provavelmente, a rota mais
comum de entrada dos vírus no organismo. Existem vários mecanismos de defesa do
hospedeiro que objetivam bloquear a infecção do sistema respiratório; no entanto,
muitos vírus penetram no organismo através desta via, pelo contato com perdigotos
(aerossóis) provenientes de tosse e espirro ou saliva de indivíduos infectados. Barreiras
mecânicas desempenham papel importante na defesa contra infecções virais que
acometem o sistema respiratório, como a camada de células ciliadas que recobre o tecido
das vias respiratórias, células secretoras de muco (goblet cells) e glândulas sub
epiteliais secretoras de muco.
Mucosa do trato gastrointestinal: A mucosa do trato gastrointestinal é uma rota
comum de entrada e disseminação de vírus. É um ambiente extremamente hostil devido a
acidez do estômago, alcalinidade do intestino, presença de sais biliares, enzimas
digestivas, camada de muco, anticorpos da classe IgA e células fagocitárias. Os vírus que
infectam o organismo por essa rota são resistentes a extremos de pH, proteases e sais
biliares. Os vírus que não apresentam essas características são destruídos quando
expostos às condições do trato gastrointestinal.
Mucosa do sistema urogenital: O sistema urogenital é bem protegido por barreiras
fisiológicas, incluindo muco e pH ácido. A atividade sexual pode resultar em abrasões no
epitélio vaginal ou na uretra, possibilitando a entrada de vírus que podem infectar o
epitélio e causar lesões locais. Outros vírus ganham acesso às células dos tecidos
adjacentes e podem causar infecções disseminadas.
Mucosa da conjuntiva: A mucosa conjuntiva é constantemente lavada pela secreção
ocular e pelo movimento das pálpebras. Dessa forma, a possibilidade de ocorrer infecção
viral através do olho é muito pequena, a menos que haja abrasão da mucosa. A infecção
viral no olho pode ocorrer durante procedimentos oftálmicos ou por contaminação do
ambiente como, por exemplo, pela contaminação da água de piscinas. Na maioria dos
casos, a replicação é localizada e resulta na inflamação da conjuntiva. É rara a
disseminação sistêmica do vírus a partir do olho, embora possa acontecer (p. ex., doença
paralítica após conjuntivite por enterovírus 70).
O que é Tropismo?
O tropismo é a capacidade do vírus para infectar alguns tecidos do hospedeiro e não
outros; por exemplo, um vírus enterotrópico é replicado no intestino, ao passo que um
vírus neurotrópico é replicado nas células do sistema nervoso. Alguns vírus são
pantrópicos, infectando diversos tipos de células e tecidos e sendo replicados neles. O
tropismo é determinado pela existência de receptores celulares (suscetibilidade), assim
como de constituintes intracelulares essenciais para a síntese viral (permissividade).
Contudo, ainda que a célula seja suscetível e permissiva, a infecção pode não ocorrer em
virtude da dificuldade de o vírus interagir diretamente com o tecido (acessibilidade).
Finalmente, a infecção pode não ocorrer ainda que a célula seja acessível, suscetível e
permissiva, devido às defesas imunológicas inatas presentes no local da infecção.
Como os vírus se disseminam pelo corpo?
Os vírus podem permanecer localizados na superfície do corpo na qual penetraram ou
podem causar infecções disseminadas. Para uma infecção se espalhar para além do sítio
primário, é necessário ultrapassar as barreiras físicas e imunológicas. Após cruzar o
epitélio, as partículas virais alcançam a membrana basal, comprometendo sua integridade
pela destruição das células epiteliais e pelo processo inflamatório. Abaixo da membrana
estão os tecidos subepiteliais, nos quais os vírus encontram fluidos teciduais, sistema
linfático e fagócitos. Todos apresentam papel importante na eliminação das partículas
estranhas; contudo, também podem disseminar os vírus a partir do sítio primário da
infecção.
Que tipo de danos celulares os vírus podem causar?
A5 - Diagnóstico Laboratorial
Por que o diagnóstico é importante:
Quais os tipos de diagnóstico?
As técnicas utilizadas para o diagnóstico laboratorial de uma virose podem ser
realizadas com base em 4 parâmetros:
• Isolamento e identificação do vírus
• Sorologia para detecção de antígenos e/ou anticorpos
• Detecção direta da partícula viral
• Amplificação de ácidos nucleicos virais.
Isolamento e identificação dos vírus: O isolamento viral comparado a outros métodos
de diagnóstico apresenta vantagens e desvantagens. As culturas de células amplificam a
quantidade de vírus, facilitando sua detecção e identificação; tornam possível a
produção de partículas infecciosas que podem ser caracterizadas estocadas para
estudos futuros; possibilitam o isolamento de diferentes tipos de vírus, incluindo aqueles
não considerados no momento da inoculação, e até mesmo vírus previamente
desconhecidos podem ser isolados. Esse último item é um contraste entre os métodos de
isolamento e os que se baseiam no diagnóstico imunológico, ou na detecção do ácido
nucleico, os quais normalmente detectam o vírus específico para o qual os reagentes
foram direcionados. O isolamento viral também apresenta desvantagens como método de
diagnóstico,incluindo: o sistema usado para o isolamento de certos vírus pode não estar
disponível ou ser muito complicado para a rotina laboratorial; o tempo necessário para
isolar certos vírus pode ser demorado, e não satisfazer à necessidade clínica, etc.Um
dos princípios mais importantes para o protocolo do isolamento viral é a escolha do
sistema de propagação para o vírus pesquisado. Uma vez inoculados no sistema
hospedeiro suscetível, os vírus provocam modificações fisiológicas nesse sistema, que
são observadas como efeitos consequentes da biossíntese viral.
A propagação de vírus em laboratório é feita em sistemas hospedeiros obrigatoriamente
vivos, que podem ser representados por animais de laboratório, ovos embrionados e/ou
culturas de células. Deve-se salientar que apenas o isolamento de um vírus em
determinado hospedeiro não representa a confirmação de que aquele vírus é o agente
etiológico da doença atual.
Propagação viral em animais de laboratório:
Propagação viral em ovos embrionados:
Propagação viral em culturas de células:
Observação dos efeitos citopáticos: O efeito citopático ou CPE se refere a alterações
na morfologia em células individuais ou grupos de células induzidas pela infecção viral, as
quais são observadas ao microscópio óptico. Dependendo do vírus e do tipo de cultura de
células, o CPE observado na cultura pode ser caracterizado pelo arredondamento celular,
células refráteis, picnose, vacuolização, granulação, formação de células gigantes,
degeneração granular onde o citoplasma torna-se refringente, formação de sincícios que
resultam da fusão de células, agregação, perda da aderência, ou lise.
Sorologia para detecção de antígenos ou anticorpos:
Teste de neutralização: O teste de neutralização (TN) está fundamentado no princípio
de que vírus infecciosos, quando interagem com o anticorpo específico, são neutralizados
e, por conseguinte, perdem a capacidade de infectar células permissivas. O teste é
realizado em 2 etapas: na primeira, o vírus infeccioso e o soro do paciente são
misturados e incubados para que ocorra a formação do imunocomplexo
(antígeno-anticorpo); na segunda etapa, alíquotas da mistura vírus-soro são inoculadas
em um hospedeiro permissivo, geralmente cultura de células. Após incubação apropriada,
a cultura é examinada para a observação do CPE. Se no soro do paciente houver
anticorpos específicos contra o vírus pesquisado,este irá se ligar ao vírus,
neutralizando-o na primeira etapa, e o vírus não irá infectar a cultura de células.
Consequentemente, o CPE não será observado. Caso os anticorpos do paciente não sejam
específicos para o vírus pesquisado, estes não se ligarão ao vírus na primeira etapa, o
qual permanecerá infeccioso e irá infectar a cultura de células produzindo CPE.
Teste de inibição da hemaglutinação: No teste de inibição da hemaglutinação (HI), a
capacidade de hemaglutinação de um vírus é bloqueada quando esse vírus reage com o
anticorpo específico. O teste de HI é executado em 2 estágios. No primeiro estágio, o
vírus hemaglutinante e o soro do paciente são misturados e incubados. Se o soro do
paciente possui anticorpos específicos para o vírus, haverá a formação do
imunocomplexo. No segundo estágio, são adicionadas hemácias à mistura do primeiro
estágio; o vírus complexado ao anticorpo não tem a capacidade de produzir a
hemaglutinação. Quando oanticorpo, no primeiro estágio, não é específico para o vírus,
não há formação do complexo vírus-anticorpo, e o vírus mantém a sua capacidade de
induzir hemaglutinação.
Detecção direta da partícula viral: Para a identificação do vírus isolado em culturas de
células ou ovos embrionados, colhe-se o sobrenadante da cultura e líquido alantóico ou
amniótico dos ovos, para execução de testes sorológicos clássicos, tais como teste de
neutralização, de fixação do complemento ou de inibição da hemaglutinação,
utilizando-se soros padrão contra os vírus pesquisados. No caso de animais de
laboratório, deve-se colher o cérebro, os órgãos ou os músculos infectados, para exames
histopatológicos, ou sangue, para realização de sorologia. É possível também a análise
dessas amostras em microscopia eletrônica, buscando diretamente a partícula viral.
Amplificação de ácidos nucleicos virais:
Reação em cadeia da polimerase: A reação em cadeia da polimerase (polymerase chain
reaction – PCR) é uma técnica de amplificação usada para sintetizar, in vitro, sequências
específicas de DNA. Inicialmente, um ácido nucleico-alvo (DNA ou RNA) é isolado de
tecidos, fluidos do paciente ou de cultura de células infectadas. Se o ácido nucleico-alvo
for RNA, este deve ser convertido primeiramente em DNA complementar (DNAc) por
transcrição reversa, antes de começar o processo de amplificação (RT-PCR). A partir
daí, o DNA é amplificado emzimaticamente por PCR.
PCR em tempo real: A metodologia da PCR em tempo real (real time PCR) foi
desenvolvida com o objetivo de automatizar a PCR, tornando-a mais eficiente, rápida e
segura. Nesse ensaio, é possível acompanhar visualmente o progresso da amplificação do
produto da PCR.
Primeiro o que é hibridização: A técnica baseia-se na identificação de sequências
específicas do ácido nucleico viral utilizando sondas marcadas. Sequências
complementares ao ácido nucleico viral, marcadas com enzimas,fluoresceína, ou
radioisótopos, são comercializadas. Essas sequências complementares marcadas são
chamadas de sondas e são capazes de hibridizar as fitas complementares de DNA ou
RNA. As Sondas podem ser usadas em diferentes formatos, em fase sólida ou líquida.
Hibridização in situ: O método de hibridização in situ, as células ou fragmentos de
tecidos são fixados em lâminas submetidos, mais frequentemente, ao aquecimento, para
promover a desnaturação do ácido nucleico-alvo, causando a separação das fitas. A
seguir, a sonda é adicionada, sendo hibridizada à sequência complementar. A reação é
lavada para remover as sondas que não se hibridizaram e no caso de asonda estar
marcada com uma enzima, o substrato é adicionado. Após a adição do substrato, o
esfregaço é examinado ao microscópio óptico para determinar se houve ou não
hibridização