AULA 8 DIAGNOSTICO COM REAGENTES NAO MARCADOS

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Imunodiagnóstico  com Reagentes não Marcados
Aparecida de Fatima Michelin
Sumário
Imunodiagnóstico: Interação antígeno-anticorpo​
Diagnósticos de infecções, outas doenças e outros determinações.​
Reação de aglutinação​
Reação de inibição da aglutinação​
Reações de precipitação​
Bibliografica​
Agradecimento​
Imunodiagnóstico
Diagnóstico laboratorial realizado por técnicas e conhecimentos imunológicos.
REAGENTES
MARCADOS
REAGENTES
NÃO MARCADOS
INTERAÇÃO 
ANTÍGENO-ANTICORPO
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Detecção de antígenos e anticorpos
Permite diagnosticar: infecções por agentes patogênicso, doenças autoimunes, neoplasias, alergias, outras enfermidadee e outras moléculas.
INFECÇÕES
(vírus, bactérias, protozoários ou outros parasitas)
DOENÇAS AUTOIMUNES
NEOPLASIAS
ALERGIAS
OUTRAS ENFERMIDADES
MOLÉCULAS
(hormônios, medicamentos, etc.)
Sistema Imune e Imunodiagnóstico
 Importante destacar que essas técnicas representam as reações e os mecanismos imunes que  poderiam acontecer naturalmente no organismo, isto é, in vivo, mas de forma induzida em laboratório = in vitro.
Assim, é possível estudar uma doença infecciosa, o estado imune do indivíduo ou obter outras informações para realizar diversos diagnósticos.
Uso de anticorpo monoclonal  - mab (monoclonal antibody): produzidos para diferentes antígenos
Imunodiagnósticos que não requerem o uso de marcadores (ou reagentes marcados)
Esses imunodiagnósticos se baseiam nos mecanismos envolvidos na reação entre antígenos e anticorpos, como a formação de complexos imunes ou redes.
Reação de aglutinação
Reação de neutralização
Reação de precipitação
Reação de aglutinação
Princípio imunológico de formação de complexos imunes: a ligação entre os antígenos e seus anticorpos específicos. 
Caracterísitca do antígeno:  é particulado, ou seja, é fixo a uma partícula, que pode ser bactéria, fungo, protozoário, hemácia, látex, entre outros.
Reação de aglutinação: IgM e bactérias. Os anticorpos IgM são mais eficientes: cada uma pode se ligar a várias bactérias.
Característica da reação de aglutinação
Aglomeração de partículas: formando complexos antígeno-anticorpo que se aglutinam. 
Aglutinação pode ser observada a olho nu, como no caso da ligação com hemácias, ou com o auxílio de microscópio óptico, no caso de antígenos particulados menores.
Sem aglutinação (acima).
Com aglutinação (abaixo). 
Com aglutinação ampliada.
Pode ser realizada em tubos, placas e lâminas.
Efeitos relacionados à proporção antígeno e anticorpo
Efeito pró-zona: concentração de anticorpos elevada no soro.
Zona de equivalência: concentrações de antígeno e anticorpo equivalentes.
Efeito pós-zona: baixa concentração de anticorpos no soro.
Pró-zona: zona de excesso de anticorpo
Há anticorpos em excesso na solução, e a quantidade de antígenos adicionada é pequena. 
Isso se deve ao uso de um antissoro que não esteja suficientemente diluído: apresenta título elevado e diluição baixa. 
Por isso, não é possível formar complexos com todos os anticorpos presentes na solução e não ocorre aglutinação.
Anticorpos em grande quantidade reagem com poucos antígenos.
Zona de equivalência
É o momento em que as quantidades de anticorpo e antígeno estão proporcionais.
A ligação entre eles é máxima, possibilitando a formação dos complexos imunes que são visualizados pela aglutinação.
Anticorpos e antígenos em quantidades equivalentes.
Zona de excesso de antígeno
Conforme o antígeno é adicionado à solução, sua quantidade supera a de anticorpos. Esse excesso interfere na estabilidade dos imunocomplexos, solubilizando-os e desfazendo-os. Com isso, a aglutinação não ocorre.
Anticorpos em pequena quantidade reagem com antígenos em excesso.
Reação de aglutinação: principais tipos
Negativo e Positivo
Positivo e Negativo
Reação de Aglutinação Direta, 
Reação de Aglutinação Indireta
Reação de Inibição da aAglutinação. 
Também podem ser consideradas:
Reação Qualitativa: ocorrência ou não de aglutinação.
Reação Semi-quantitativa: maior diluição do soro que é capaz de promover a aglutinação.
Reação de Aglutinação Direta 
Anticorpo se liga diretamente ao antígeno particulado, que pode ser bactéria, protozoário, hemácias, entre outros. 
Nesses casos, os epítopos ou determinantes antigênicos se encontram naturalmente na superfície da célula (antígeno).
Técnica bastante sensível, de simples realização.É bastante usada na tipagem sanguínea e no diagnóstico de diversas infecções.
Exemplo: determinação do tipo sanguíneo.
Hemaglutinação direta
A hemaglutinação é a aglutinação direta de hemácias que acontece devido à existência de antígenos naturais na superfície dessas células. Em contato com um soro antiantígeno específico, os anticorpos se ligam aos antígenos por meio de ligações cruzadas, de modo que uma aglutinação intensa ocorre e pode ser visualizada a olho nu.
Técnica de hemaglutinação possibilitou a descoberta dos diferentes tipos sanguíneos ou do sistema ABO.  Mais tarde, essa técnica passou a ser usada também na identificação dos fatores Rh do sangue.
Reação de Aglutinação Indireta ou Passiva
(a) Pesquisa de anticorpos
(b) Pesquisa de antígenos
Fundamento: fixação de um anticorpo ou um antígeno que se pretende estudar a uma célula ou partícula inerte (que não causa interferência na ligação antígeno-anticorpo).
Célula usada é a hemácia. Já as partículas utilizadas são geralmente de látex, poliestireno ou bentonita.
O complexo partícula/célula + antígeno ou partícula/célula + anticorpo é colocado para reagir com anticorpos ou antígenos, respectivamente. Se houver especificidade entre o antígeno e o anticorpo, ocorre a aglutinação.
Exemplo Hemaglutinação Indireta
Teste de Hemaglutinação
Fonte: Telelab
Teste de Hemaglutinação Indireto - Teste Quantitativo
Resultado reagente
(“véu”)
Resultado não reagente
(“botão”)
Entre reagente e não reagente = indeterminado
LEITURA
Vamos treinar a leitura?
Titulação em Imunoensaios
A titulação é um procedimento laboratorial comum, realizado com o objetivo de quantificar a concentração de um reagente.
Em imunoensaios, o TÍTULO é a última diluição de soro (em uma sequência crescente) com capacidade de gerar o resultado analisado.
Fonte: Telelab
Reação de Inibição da Aglutinação
Essa reação envolve alguns patógenos, como vírus e outros micro-organismos que apresentam uma particularidade: ao adentrar o organismo e chegar à corrente sanguínea, são capazes de se ligar às hemácias e de causar a aglutinação desses elementos.
Se o organismo hospedeiro possuir anticorpos, eles as revestem e as impedem de se ligar às hemácias. Assim, a aglutinação não ocorre.
A reação de inibição da aglutinação direta é bastante utilizada para detectar a presença de anticorpos contra vírus causadores de algumas doenças, como sarampo, rubéola, etc. 
Reação de Inibição da Aglutinação para o diagnóstico Imunosorológico da Rubéola.
Fonte: JoVE 
Reação de Inibição da Hemaglutinação
Reação de Neutralização ou Soroneutralização
Os anticorpos bloqueiam as estru- turas do vírus usadas para se aderir à membrana celular do hospedeiro ou os anticorpos impedem que o capsídeo do vírus seja desestruturado. Em ambas as situações, o vírus acaba sendo inativado (neutralizado).
Técnica imunológica usada para detectar a presença e a quantidade de anticorpos no soro.
Tem o objetivo de detectar os anticorpos que são capazes de neutralizardeterminado antígeno.
Em geral, esse antígeno é um vírus, mas pode ser também uma toxina de um agente infeccioso, sendo ambos capazes de gerar prejuízos às células ou levá-las à morte. 
Por isso, esses agentes precisam ser neutralizados para proteger o organismo.
Reação de Neutralização
Vírus da poliomielite (possui variações antigências):  tipo I, o tipo II e o tipo III. Em um primeiro momento, um diagnóstico imunológico pode indicar a presença de poliovírus na amostra de um paciente. 
Para identificar o tipo do vírus da poliomielite  (I, II ou III), realizar outras reações de neutralização no soro: antipólio I, antipólio II e antipólio III. Na reação em que o vírus for neutralizado, o soro específico usado nela determina qual variação do vírus está presente na reação.
A reação de neutralização também pode ser usada em diagnósticos de virologia, para detectar um vírus isolado. Nesse caso, os anticorpos são conhecidos, mas o vírus (antígeno) não.
Para isso, são utilizados soros de outros animais, como coelhos, que produzem os anticorpos específicos para determinado antígeno viral. Esse soro é considerado hiperimune a esse antígeno e, ao entrar em contato com o vírus isolado, neutraliza-o.
Reação de neutralização
É uma técnica imunológica que apresenta muitas vantagens. Baseia nos princípios da reação entre o anticorpo e o antígeno e, para que haja a neutralização do antígeno, é preciso que haja determinado anticorpo (o antígeno só será neutralizado por um anticorpo específico para ele). Por isso, a reação é altamente específica e sensível.
Além de ser um teste qualitativo, a possibilidade de determinar a concentração do anticorpo neutralizante faz com que esse teste seja também quantitativo. Por essas características, a reação de neutralização é comumente utilizada para conhecer o grau de imunidade de uma população a certos agentes infecciosos e determinar a capacidade imunológica da vacinação.
Bibliografia
Silva, Adeline Gisele Teixeira. Imunologia aplicada : fundamentos, técnicas laboratoriais e diagnósticos. 1. ed. São Paulo : Érica, 2014.
Podes ter de travar uma batalha mais de uma vez, para a vencer.
Margaret Thatcher
Obrigada!!!!
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