Principos de analise instrumental (cap 28)

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CAPÍTULOVEINTIOCHO
Cromatografía 
de líquidos
En el inicio de la cromatografía de líquidos (LC), ésta
se llevaba a cabo en columnas de vidrio con diámetros
de 10 a 50 mm. Las longitudes rellenas de la columna
eran de 50 a 500 cm de partículas sólidas cubiertas con
un líquido adsorbido que formaba la fase estacionaria.
Para asegurar tasas de flujo razonables a través de este
tipo de fase estacionaria, las dimensiones de las partícu-
las sólidas se mantenía en más de 150 a 200 μm. Incluso
así, las tasas de flujo eran bajas, de un máximo de una
pocas décimas de mililitro por minuto. Por consiguien-
te, los tiempos de separación eran largos, a menudo 
de varias horas. Los intentos para acelerar el procedi-
miento clásico mediante la aplicación de vacío o por
bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumen-
to en la tasa de flujo originaba un aumento de la altura
de plato por encima del mínimo característico que se
observa en las gráficas de altura de plato contra tasa de
flujo (véase figura 26.8a) y el resultado era una menor
eficiencia.
En las primeras etapas de desarrollo de la cromato-
grafía de líquidos, los científicos se dieron cuenta de que
podían conseguir aumentar en forma notable la eficien-
cia de la columna al disminuir el tamaño de las partícu-
las del empaque. Sin embargo, fue apenas a finales de
los años sesenta cuando se perfeccionó la técnica ade-
cuada para producir y utilizar empaques de tamaño de
partícula tan pequeños como del orden de 3 a 10 μm.
Esta técnica requería instrumentos complejos para po-
der trabajar a altas presiones, lo que contrasta de ma-
nera notable con las sencillas columnas de vidrio de la
cromatografía de líquidos clásica cuyo flujo se debía a
la gravedad. Para diferenciar estos procedimientos más
nuevos de los métodos originales de flujo por gravedad
se empleó en un principio la denominación de croma-
tografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus
siglas en inglés). En la actualidad, toda la cromatogra-
fía de líquidos se efectúa con flujo presurizado y se uti-
lizan las siglas LC o HPLC sin distinción.1
28A CAMPO DE APLICACIÓN DE LA
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS 
DE ALTA RESOLUCIÓN
La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de
separación más ampliamente utilizada. Las razones 
de su popularidad son su sensibilidad, su fácil adapta-
ción a las determinaciones cuantitativas exactas, su ido-
neidad para automatizarla, su capacidad para separar
especies no volátiles o termolábiles, pero sobre todo,
su amplia aplicabilidad a sustancias que son impor-
E
n varios tipos básicos de cromatografía 
la fase móvil es un líquido. A menudo, 
estos tipos se clasifican de acuerdo con 
el mecanismo de separación o el tipo de fase 
estacionaria. Entre estos tipos están 
1) cromatografía de reparto; 2) cromatografía 
de adsorción o cromatografía líquido-sólido; 
3) cromatografía de intercambio de iones o 
cromatografía iónica; 4) cromatografía de 
exclusión por tamaño; 5) cromatografía por
afinidad y 6) cromatografía quiral. La mayor
parte de este capítulo trata sobre las aplicaciones
de estos importantes tipos de cromatografía en
columna. La última sección presenta una breve 
descripción de la cromatografía de líquidos en
plano, dado que esta técnica representa una forma
simple y barata de determinar condiciones óptimas
más probables para efectuar separaciones en
columna.
816
En todo el capítulo, este símbolo indica una 
oportunidad para estudiar en línea. Visite el sitio 
http:// latinoamerica.cengage.com /skoog, para revisar
clases interactivas, simulaciones y ejercicios.
1Consulte las siguientes obras si desea un análisis detallado sobre la cro-
matografía de líquidos de alta resolución L. R. Snyder y J. J. Kirkland, 
Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2a. ed., Nueva York: 
Wiley, 1979; R. P. W. Scott, Liquid Chromatography for the Analyst, Nueva
York: Dekker, 1995; S. Lindsay, High Performance Liquid Chromatogra-
phy, Nueva York: Wiley, 1992.
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tantes en la industria, muchos campos de la ciencia y
para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos
materiales son aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides,
plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organo-
metálicas y una variedad de sustancias inorgánicas.
En la figura 28.1 se pone de manifiesto que los dis-
tintos procedimientos que utilizan la cromatografía de
líquidos tienden a ser complementarios en lo que se re-
fiere a sus campos de aplicación. Por consiguiente, en
lo que toca a solutos con masas moleculares superiores
a 10 000 se utiliza a menudo la cromatografía de exclu-
sión por tamaño, aunque ahora también es posible tra-
tar estos compuestos mediante cromatografía de fase
inversa. En el caso de especies iónicas de masa molecu-
lar más pequeña, se suele utilizar la cromatografía de
intercambio iónico. Los métodos de fase inversa se
aplican a las especies poco polares pero no iónicas.
Además, estos procedimientos se utilizan muchas veces
para separar los integrantes de una serie homóloga. La
cromatografía de adsorción se usó en algún momento
para separar especies no polares, isómeros estructu-
rales y grupos de compuestos, como los hidrocarburos
alifáticos de los alcoholes alifáticos. Debido a proble-
mas con la reproductibilidad de la retención y a la ad-
sorción irreversible, la cromatografía de adsorción con
fases estacionarias sólidas ha sido reemplazada por la
cromatografía de fase normal (fase enlazada). Entre
las formas especializadas de LC, la cromatografía por
afinidad se utiliza mucho para aislar y preparar biomo-
léculas, y la cromatografía quiral se emplea para sepa-
rar enantiómeros.
28B EFICIENCIA DE LA COLUMNA EN 
LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
El análisis del ensanchamiento de banda de la sección
26C.3 se aplica en general a la cromatografía de líqui-
dos. En esta sección se ilustra el importante efecto del
tamaño de las partículas del relleno que forma la fase
estacionaria y se describen otras dos causas de la dis-
persión de zona, que a veces son de importancia nota-
ble en la cromatografía de líquidos.
28B.1 Efectos del tamaño de las partículas
del relleno
Un examen del coeficiente de transferencia de masa de
la fase móvil (véase tabla 26.3) revela que CM en la
ecuación 26.23 está relacionada directamente con el
cuadrado del diámetro dp de las partículas que constitu-
yen el relleno. Como consecuencia de ello, la efectivi-
dad de una columna de LC debería mejorar de manera
espectacular a medida que disminuye el tamaño de
partícula. La figura 28.2 es una demostración experi-
mental de este efecto y en ella se observa que una re-
ducción del tamaño de partícula de 45 a 6 μm origina
una disminución de 10 o más veces en la altura de
28B Eficiencia de la columna en la cromatografía de líquidos 817
Exclusión por tamaño
(permeación en gel)
Exclusión
por tamaño
(filtración
sobre gel)
Intercambio
iónico
y fase
inversa
(enlazada)
Fase
normal
(adsorción
o enlace)
Fase
inversa
(enlazada)
Molécula
pequeña
(permeación
en gel)
Fase
inversa
(enlazada)
Pares
de iones e
intercambio
iónico
Soluble en sustancia orgánica Soluble en agua
M
as
a 
m
ol
ec
ul
ar
100
1 000
10 000
100 000
Soluble en sustancia orgánica Soluble en agua
Hexano
Soluble en
MeOH THF No iónico Iónico
FIGURA 28.1 Selección de tipos de
cromatografía de líquidos. Los métodos 
se escogen con base en la solubilidad y la
masa molecular. En la mayoría de los casos
de moléculas pequeñas no iónicas 
(m � 2000), son apropiados los métodos 
de fase inversa. Las técnicas que están en la
parte inferior del diagrama son mejores para
las especies de alta masa molecular 
(m � 2000). (Adaptación de High Performance
Liquid Chromatography, 2a. ed., S. Lindsay 
y J. Barnes, eds., Nueva York: Wiley, 1992.
Con autorización.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 817
plato. Observe que ninguna de las gráficas de esta fi-
gura presenta el mínimo que predice la ecuación 26.23.
Deción de agua, como se muestra en el ejemplo 28.1. El
efecto de estas manipulaciones se muestra en los cro-
matogramas de las figuras 28.16a y 28.16b, donde la
muestra es una mezcla de seis esteroides. Con una mez-
cla de 41% de acetonitrilo y 59% de agua, k tiene un va-
lor de 5 y todos los analitos se eluyeron en un tiempo tan
corto (�2 minutos) que la separación resultó bastante
incompleta. Al aumentar el porcentaje de agua a 70%, la
elución tiene lugar en siete minutos, lo que dobla el
valor de k. En estas circunstancias el tiempo total de
elución es suficiente para permitir la separación, aun-
que el valor de a para los compuestos 1 y 3 no sea lo 
suficientemente grande para una buena resolución.
 P2¿ � 6.5
 �1.11 �
P2¿ � 8.7
2
� 0.5P2¿ � 4.35
5
64
� 10 1P2¿�8.7¿2 /2
P¿ � 10.30 � 5.1 2 � 10.70 � 10.2 2 � 8.7
Influencia de la fase móvil en las selectividades. En mu-
chos casos, ajustar k a un nivel adecuado es todo lo que
se necesita para una separación satisfactoria. Sin em-
bargo, cuando todavía se superponen dos bandas, como
en las figuras 28.16 a y b, se tiene que procurar aumen-
tar el factor de selectividad a para las dos especies.
Esta variación se puede llevar a cabo de manera con-
veniente al cambiar la naturaleza química de la fase
móvil mientras k mantiene más o menos el mismo valor.
El enfoque más aceptado para este tipo de mejoramien-
to se llama triángulo de selectividad del solvente.17 En
este caso se considera que los efectos de la fase móvil
que contribuyen a la selectividad son resultado del do-
nador de protones, del que los acepta y de las interac-
ciones dipolares. Los solventes que incorporan estas
interacciones son luego elegidos para experimentos
diseñados estadísticamente con el fin de determinar la
mezcla óptima de solventes.18
En el caso de la cromatografía en fase inversa, los
tres modificadores de los solventes son metanol, aceto-
nitrilo y tetrahidrofurano. El agua se emplea entonces
para ajustar la fuerza de la mezcla y de este modo con-
seguir un valor adecuado de k. Composiciones binarias
de tres solventes (agua más un modificador) definen los
tres vértices del triángulo de solventes, como se muestra
en la figura 28.17. Por lo regular, son suficientes de sie-
te a 10 experimentos para definir una composición de
solventes que produzca la mejor selectividad para un
intervalo satisfactorio de k. Se usan varios esquemas
de diseños estadísticos, como los factoriales comple-
tos, pero el enfoque del triángulo de solventes requie-
re pocos experimentos. También existen ya programas
de computación para ayudar a automatizar los esque-
mas para el mejoramiento de los solventes. Además se
usan ampliamente programas para simulación, como
el muy conocido DryLab,19 para perfeccionar y supe-
rar los métodos.
En la figura 28.16 se ilustra el enfoque sistemático
del triángulo de solventes en la separación de seis este-
roides por cromatografía en fase inversa. Los dos pri-
meros cromatogramas muestran los resultados de los
experimentos iniciales para determinar el valor míni-
mo de k que se requería. En este caso, el último com-
ponente de elución se utiliza para determinar k. Con
un k del componente 6 igual a 10 existe espacio sufi-
ciente en la escala de tiempo para los distintos picos;
sin embargo, en estas condiciones el valor de a para los
componentes 1 y 3 (y en menor grado para los 5 y 6) no
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834 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
0 5
Tiempo, min
a)
1,2,3
10 15
0 5
5
6
1
4
2
3
Tiempo, min
d)
0 5
5
3
2
1
4 6
Tiempo, min
e)
0 5
5
6
3
1
2
4
Tiempo, min
c)
4
5
6
1,3
2
4
5
6
30% CH3CN
70% H2O
k = 10
41% CH3CN
59% H2O
k = 5
11% CH3CN
12% THF
77% H2O
k = 10
49% CH3OH
51% H2O
k = 10
21% THF
79% H2O
k = 10
0 5
Tiempo, min
b)
FIGURA 28.16 Metodología sistemática para la separación de seis esteroides. En a) y en 
b) se muestra el uso de agua para ajustar k. Los efectos de la variación de a a k constante 
se muestran en b), c), d) y e). Columna: 0.4 � 150 mm rellena con una fase inversa unida
químicamente de C8 con partículas de 5 μm. Temperatura: 50
C. Tasa de flujo: 3.0 cm3/min.
Detector: UV 254 nm. THF � tetrahidrofurano. CH3CN � acetonitrilo. Compuestos: 
1) prednisona; 2) cortisona; 3) hidrocortisona; 4) dexametasona; 5) corticosterona; 
6) cortoexolona.
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son suficientemente grandes como para obtener una
resolución satisfactoria. Con el objetivo de encontrar
mejores valores de a se realizaron más experimentos;
en todos los casos se ajustó la proporción de agua para
obtener un k � 10 para el último componente en eluir.
En las figuras 28.16c y 28.16d se muestran los resulta-
dos que se obtuvieron en los experimentos con las mez-
clas metanol-agua y tetrahidrofurano-agua. Se ejecuta-
ron más experimentos variando en forma sistemática
los pares de tres solventes orgánicos (en cada caso k se
ajustaba a 10 mediante el agua). Para finalizar, se eligió
la mezcla que se muestra en la figura 28.16e como la
mejor fase móvil para la separación del grupo particu-
lar de compuestos.
En separaciones en fase normal se utiliza un trián-
gulo de solventes similar, en el cual los solventes para
el control de la selectividad son etiléter, cloruro de me-
tileno y cloroformo;20 para el ajuste de la fuerza del
solvente se utiliza n-hexano. Con estos sistemas de sol-
ventes es posible conseguir una mejora con un número
mínimo de ensayos.
28D.3 Aplicaciones de la cromatografía 
de reparto
Cuando se usan rellenos unidos químicamente en fase
inversa junto con solventes muy polares (a menudo
acuosos) se aproximan al sistema ideal y universal para
la cromatografía de líquidos. Debido a su amplia apli-
cabilidad, su conveniencia y la facilidad con que pueden
modificarse k y a al variar las fases móviles acuosas, es-
tos rellenos se aplican con frecuencia antes que todos
los otros en el caso de separaciones de exploración con
nuevos tipos de muestras.
En la tabla 28.3 se enumeran algunos ejemplos ca-
racterísticos de la gran variedad de aplicaciones de la
cromatografía de reparto en diversos campos. Se tiene
una idea más completa de la diversidad de aplicaciones
de esta técnica si se consultan los últimos artículos y li-
bros.21 En la figura 28.18 se ilustran dos de las miles de
aplicaciones de la cromatografía de reparto con fase
unida químicamente al análisis de materiales para el
consumo y la industria.
Formación de derivados
A veces, es útil convertir los componentes de una
muestra a un derivado antes o a veces después de la
separación cromatográfica. Tal tratamiento puede ser
deseable 1) para reducir la polaridad de la especie y
poder utilizar la división de columnas más que de la 
adsorción o intercambio de iones; 2) aumentar la res-
puesta del detector y así la sensibilidad, para todos los
componentes de la muestra; y 3) realzar selectivamente
el detector a ciertos componentes de la muestra.
En la figura 28.19 se ilustra el uso de derivados para
reducir la polaridad y aumentar la sensibilidad. La
muestra está constituida por 30 aminoácidos de interés
fisiológico. Con frecuencia, dicha separación se realiza-
28D Cromatografía de reparto 835
20Tome en cuenta que los solventes clorados están sujetos a regulaciones
ambientales rigurosas.
21Por ejemplo, véase L. R. Snyder, Anal. Chem., 2000, p. 72, 412A; J. G.
Dorsey et al., Anal. Chem., 1998, 70, p. 591R; HPLC: Practical and Indus-
trial Applications, J. K. Swadesh, ed., 2a. ed., Boca Ratón, FL: CRC Press,
2001; Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, S. Ahuja y M. W.
Dong, eds., San Diego, CA: Elsevier, 2005.
MeOH
1
(66.6, 16.2, 16.2)
8
(33.3, 33.3, 33.3)
4 (50, 50, 0) (50, 0, 50) 6
7
(16.2, 66.6, 16.2)
9
(16.2, 16.2, 66.6)
10
(0, 50, 50)
5
2
MeCN
3
THF
FIGURA 28.17 Triángulo de selectividad de solventes
para mejorar las separaciones en fase inversa. Diez mezclas
de los tres solventes orgánicos, metanol, acetonitrilo y
tetrahidrofurano, se muestran con las proporcionesortoftalaldehído de 30 aminoácidos de interés fisiológico. Columna:
de fase inversa, C18, 5 μm. Solvente A: 0.05 M Na2HPO4, pH 7.4, 96:2:2 CH3OH, THF, H2O. Detector de fluorescencia:
excitación a 334 nm; emisión a 425 nm. (Reimpreso con autorización de R. Pfiefer et al., Amer. Lab., 1983, 15 (3), p. 86.
Copyright 1983 por International Scientific Communications, Inc.)
26Un repaso sobre interacciones quirales está en M. C. Ringo y C. E.
Evans, Anal. Chem., 1998, 70, p. 315A.
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838 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
32.52
S
R
1.5
Tiempo de retención, min
10.50
FIGURA 28.21 Cromatograma de una mezcla racémica
del éster N-(1-naftil)leucina en una fase estacionaria
quiral de dinitrobenceno-leucina. Los enantiómeros R y
S se ven muy bien separados. Columna: 4.6 � 50 mm;
fase móvil, 2-propanol 20% en hexano; tasa de flujo 
1.2 mL /min; detector de UV a 254 nm. (Tomado de 
L. H. Bluhm, Y. Wang y T. Li, Anal. Chem., 2000, 72, 
p. 5201. Con autorización de la American Chemical
Society.)
1
2
3
4
a)
Columna: 
-Bondapak C18
(4 mm × 30 cm)
Solvente: MeOH y H2O con C7
sulfonato de alquilo
Tiempo, min
0 5 10 15 20
In
ye
cc
ió
n
1
2.4
3
In
ye
cc
ió
n
b)
Columna: 
-Bondapak C18
(4 mm × 30 cm)
Solvente: MeOH y H2O con C5
sulfonato de alquilo
Tiempo, min
0 5 10
1
2
3
4
In
ye
cc
ió
n
c)
Columna: 
-Bondapak C18
(4 mm × 30 cm)
Solvente: MeOH y H2O con mezcla
50/50 de sulfonatos de
alquilo C5/C7
Tiempo, min
0 5 10
FIGURA 28.20 Cromatogramas que ilustran la separación de mezclas de compuestos 
iónicos y no iónicos mediante cromatografía de pares iónicos. Compuestos: 1) niacinamida, 
2) piridoxina, 3) riboflavina, 4) tiamina. A un pH de 3.5, la niacinamida está fuertemente
ionizada, y la riboflavina es no iónica. La piridoxina y la tiamina están débilmente ionizadas.
Columna: μ-Bondapak, C18, 4 mm � 30 cm. Fase móvil: a) MeOH y H2O con sulfonato de
alquilo C7; b) MeOH y H2O con sulfonato de alquilo C5; c) MeOH y H2O con una mezcla 1:1 
de sulfonatos de alquilo C5 y C7. (Cortesía de Waters Associates, Inc.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 838
que se utilizan en la primera se aplican también en la
cromatografía de adsorción. De hecho, en muchas se-
paraciones en fase normal, los procesos de adsorción-
desplazamiento rigen la retención.
Las únicas fases estacionarias que se utilizan en la
cromatografía de adsorción son la sílice y la alúmina fi-
namente dividida. Se prefiere la sílice para la mayoría
de las aplicaciones debido a su mayor capacidad de
muestra. Las características de adsorción de las dos
sustancias son similares. Con ambas, los tiempos de re-
tención se vuelven más largos a medida que la polari-
dad del analito aumenta.
Se ha comprobado que el índice de polaridad P�, que
se explica en la sección 28D.2, puede servir también
como una guía aproximada de la potencia de los sol-
ventes en cromatografía de adsorción. Sin embargo, un
índice mucho mejor es la fuerza eluyente e 0, que es la
energía de adsorción por unidad de área del solvente.27
Este parámetro depende del adsorbente y los valores
de e0 para la sílice son de casi 0.8 veces los de la alúmina.
En la tabla 28.2, los valores de e 0 de la última columna
corresponden a la alúmina. Observe que las diferen-
cias de e 0 entre los solventes son parecidas a las que se
dan entre los valores de P�.
Debido a la versatilidad y disponibilidad de las fa-
ses estacionarias unidas químicamente, en los años re-
cientes ha disminuido el uso de la cromatografía de 
adsorción tradicional con fases estacionarias sólidas y
se ha favorecido la cromatografía en fase normal.
28F CROMATOGRAFÍA IÓNICA
La cromatografía iónica (IC) se refiere a los métodos
modernos y eficientes para separar y determinar iones
en columnas con relativamente baja capacidad de in-
tercambio iónico o aniónico. Las separaciones con 
intercambio iónico se han utilizado desde que se in-
ventaron las re-sinas de intercambio iónico a mediados
de los años treinta del siglo XX, la cromatografía iónica
tal como se practica en la actualidad se formuló a me-
diados de los años setenta cuando se demostró que las
mezclas de aniones o de cationes se podían separar en
columnas para HPLC rellenas con resinas de intercam-
bio aniónico o de intercambio iónico. Por entonces, la
detección se realizaba por lo general con mediciones de
conductividad, las cuales no son las ideales debido a
sus altas concentraciones de electrolito en la fase mó-
vil. La investigación sobre las columnas de baja capa-
cidad de intercambio facilitó el uso de fases móviles de
baja potencia iónica que podrían ser además desioni-
zadas (ionización inhibida) para permitir la detección
por conductividad de alta sensibilidad. En la actuali-
dad se dispone también de otros detectores para la
cromatografía iónica, como los espectrofotométricos y
los electroquímicos.28
La cromatografía iónica evolucionó al margen de la
cromatografía de intercambio iónico y durante el pro-
yecto Manhattan29 se perfeccionó para separar los ca-
tiones de las tierras raras estrechamente relacionados
mediante resinas de intercambio catiónico. Este espec-
tacular trabajo, en el cual se basa la teoría de las sepa-
raciones por intercambio iónico, se extendió tras la 
Segunda Guerra Mundial a muchos otros tipos de ma-
teriales y al final llevó a los métodos automáticos para
la separación y detección de aminoácidos y otras espe-
cies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la
HPLC moderna empezó a finales de los años sesenta,
pero su aplicación a la separación de especies iónicas se
retrasó debido a la falta de un método general y sensi-
ble para detectar las especies iónicas eluidas, como los
cationes alcalinos y alcalinotérreos, y aniones como 
los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se remedió
en 1975, cuando técnicos de la Dow Chemical Compa-
ny idearon una técnica de supresión del eluyente que
hace posible la detección conductimétrica de los iones
eluidos.30 Esta técnica se describe en la sección 28F.3.
28F.1 Equilibrios de intercambio iónico
Los procesos de intercambio iónico se basan en los equi-
librios de intercambio entre los iones de una solución
y los iones del mismo signo que están en la superficie
de un sólido de elevada masa molecular y esencialmen-
te insoluble. Durante varias décadas se han utilizado
intercambiadores iónicos naturales como las arcillas y
las zeolitas. A mediados de los años treinta se fabri-
caron por primera vez resinas de intercambio iónico
sintéticas para disminuir la dureza del agua, para la 
desionización de la misma y para la purificación de las
soluciones. Los sitios activos más comunes en las resi-
nas de intercambio catiónico son los grupos de ácido
sulfónico ¬SO3
�H�, un ácido fuerte, y los grupos del
ácido carboxílico ¬COO�H�, un ácido débil. Los in-
tercambiadores aniónicos contienen grupos amino ter-
ciarios fuertemente básicos ¬N(CH3)3
�OH� o grupos
amino primarios débilmente básicos ¬NH3
�OH�.
Cuando un intercambiador iónico de ácido sulfónico
se pone en contacto con un solvente acuoso que contie-
ne un catión M x�, se establece un equilibrio de inter-
cambio que puede expresarse mediante
xRSO3
�H� � Mx� Δ (RSO3
�)xMx� � xH�
sólido solución sólido solución
28F Cromatografía iónica 839
27Véase L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, cap. 8,
Nueva York: Dekker, 1968.
28Para una breve revisión de la cromatografía iónica véase J. S. Fritz, Anal.
Chem., 1987, 59, p. 335A; P. R. Haddad, Anal. Chem., 2001, 73, p. 266A. Si
desea monografías sobre el tema consulte J. S. Fritz y D. T. Gjerde, Ion
Chromatography, 3a. ed., Weinheim, Germany: Wiley-VCH, 2000; H.
Small, Ion Chromatography, Nueva York: Plenum Press, 1989.
29El Proyecto Manhattan fue un esfuerzo de Estados Unidos con la ayuda
de Canadá y del Reino Unido, durante la Segunda Guerra Mundial, para
crear armas nucleares.
30H. Small, T. S. Stevens y W. C. Bauman, Anal. Chem., 1975, 47, p. 1801.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 839donde RSO3
�H� representa uno de muchos grupos de
ácido sulfónico unidos a una gran molécula polimérica.
De forma semejante, un intercambiador de base fuer-
te interacciona con el anión A x� de acuerdo con la si-
guiente reacción
xRN(CH3)3OH� � Ax� Δ [RN(CH3)3
�]xA
x� � xOH�
sólido solución sólido solución
Como un ejemplo de la aplicación de la ley de acción
de masas a los equilibrios de intercambio iónico, consi-
dere la reacción entre un ion de una sola carga, B�, con
una resina de ácido sulfónico en una columna croma-
tográfica. A partir de una solución neutra, tiene lugar
la retención inicial de los iones B� en la cabeza de la
columna debido a la reacción
RSO3
�H�(s) � B�(ac) Δ RSO3
�B�(s) � H�(ac)
(28.5)
La elución con una solución diluida de ácido clorhí-
drico desplaza el equilibrio de la ecuación 28.5 hacia la
izquierda, lo que ocasiona que parte de los iones B� de
la fase estacionaria se transfieran a la fase móvil. Estos
iones descienden luego por la columna en una serie de
transferencias entre las fases estacionaria y móvil.
La constante de equilibrio Kex para la reacción de
intercambio que se muestra en la ecuación 28.5 adopta
la forma
Kex � (28.6)
En este caso, [RSO3
�B�]s y [RSO3
�H�]s son las con-
centraciones (actividades en sentido riguroso) de B�
y H� en la fase sólida. Al reacomodar los términos se
tiene
� Kex � (28.7)
Durante la elución, la concentración de iones hidró-
geno en la solución acuosa es mucho mayor que la con-
centración de los iones B� en la fase móvil. Asimismo,
el intercambiador tiene una gran cantidad de puntos
de intercambio en relación con el número de iones B�
que están siendo retenidos. Por consiguiente, las con-
centraciones totales de [H�]ac y de [RSO3
�H�]s no se
ven afectadas de manera importante por los despla-
zamientos del equilibrio 28.5. Por tanto, cuando
[RSO3
�H�]s � [RSO3
�B�]s y [H�]ac � [B�]ac el segun-
do miembro de la ecuación 28.7 es prácticamente cons-
tante y es posible escribir
� K � (28.8)
donde K es una constante que corresponde a la cons-
tante de distribución tal como se define con las ecua-
ciones 26.1 y 26.2. Todas las ecuaciones de la tabla 26.5
cS
cM
3RSO3
�B� 4 s3B� 4 ac
3RSO3
�H� 4 s3H� 4 ac
3RSO3
�B� 4 s3B� 4 ac
3RSO3
�B� 4 s 3H� 4 ac3RSO3
�H� 4 s 3B� 4 ac
(sección 26E) se pueden aplicar a la cromatografía de
intercambio iónico de la misma forma que a los otros
tipos que ya se trataron.
Observe que Kex en la ecuación 28.6 representa la
afinidad de la resina por los iones B� en relación con
otro ion (en este caso, H�). Cuando Kex tiene un valor
alto, la fase sólida tiene una gran tendencia a retener
los iones B� y cuando Kex es pequeña sucede lo contra-
rio. Al seleccionar un ion de referencia común como el
H�, se pueden comparar de manera experimental los
coeficientes de distribución de distintos iones para una
resina. Estos experimentos ponen de manifiesto que
los iones polivalentes están retenidos con mucho más
fuerza que las especies con una sola carga. Sin embargo,
dentro de un grupo con la misma carga, aparecen dife-
rencias relacionadas con el tamaño del ion hidratado y
con otras propiedades. Por consiguiente, para una resi-
na sulfonada de intercambio catiónico característica,
los valores de Kex disminuyen en el orden siguiente:
Tl� � Ag� � Cs� � Rb� � K� � NH4
� � Na� � H� �
Li�. En el caso de los cationes divalentes, el orden es
Ba2� � Pb2� � Sr2� � Ca2� � Ni2� � Cd2� � Cu2� �
Co2� � Zn2� � Mg2� � UO2
2�.
En lo que se refiere a los aniones, en las resinas de
base fuerte SO4
2�� C2O4
2�� I�� NO3
�� Br�� Cl��
HCO2
�� CH3CO2
�� OH�� F�. Esta sucesión de-
bería considerarse sólo como una aproximación, pues
depende en parte de la resina y de las condiciones de
reacción.
28F.2 Rellenos de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico siempre ha em-
pleado pequeñas cuentas esféricas y porosas que se
forman en la copolimerización del estireno y del divi-
nilbenceno en emulsión. La presencia de divinilbence-
no (por lo regular �8%) origina un entrelazamiento o
polimerización entrecruzada que confiere estabilidad
mecánica a las cuentas. Con el objetivo de activar el
polímero frente a los iones, a la estructura se le unen
químicamente grupos funcionales ácidos o básicos.
Los grupos más comunes son el ácido sulfónico y las
aminas cuaternarias.
La figura 28.22 muestra la estructura de una resina
de ácido fuerte. Observe que el entrelazamiento man-
tiene juntas las moléculas lineales de poliestireno. Los
otros tipos de resinas tienen estructuras similares, ex-
cepto en el grupo funcional activo.
Las partículas poliméricas porosas no resultan por
completo satisfactorias como rellenos cromatográficos
debido a la baja velocidad de difusión de las molécu-
las de analito a través de los microporos de la matriz
polimérica y también debido a la compresibilidad de la
matriz. Para superar este problema, se han elaborado
dos nuevos tipos de rellenos que se utilizan más que el
polímero poroso. Uno es el relleno de cuenta polimé-
840 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 840
rica en el que su superficie está cubierta con resina 
sintética de intercambio de iones. Un segundo tipo de
relleno se prepara cubriendo micropartículas porosas
de sílice, tal como las que se utilizan en la cromatogra-
fía de adsorción, con una delgada película del intercam-
biador. Los diámetros de las partículas varían entre 3 y
10 μm. Con cualquier tipo, la difusión más rápida en la
película de polímero aumenta la efectividad. Los re-
llenos de polímero tienen mayor capacidad que los 
rellenos de sílice y se pueden usar en un amplio inter-
valo de valores de pH. Los intercambiadores iónicos de
sílice son más eficaces, pero son estables en un interva-
lo de pH limitado e incompatibles cuando la detección
se basa en inhibidores (véase sección siguiente).
28F.3 Cromatografía de iones inorgánicos
La fase móvil en cromatografía de intercambio iónico
debe tener las mismas propiedades generales que se
requieren para los otros tipos de cromatografía. Es de-
cir, debe poder disolver la muestra, tener una fuerza
disolvente que proporcione tiempos de retención razo-
nables (valores de k adecuados) y debe interactuar con
los solutos de tal forma que favorezca la selectividad
(valores de a adecuados). En cromatografía de inter-
cambio de iones las fases móviles suelen ser soluciones
acuosas que pueden contener cantidades moderadas
de metanol u otros solventes orgánicos miscibles con el
agua; estas fases móviles a menudo contienen especies
iónicas en la forma de una solución amortiguadora. La
fuerza del solvente y la selectividad se determinan por
el tipo y la concentración de estos compuestos añadi-
dos. En general, los iones de la fase móvil compiten
con los iones del analito por los puntos activos del re-
lleno del intercambiador iónico.
En la actualidad se usan dos tipos de cromatografía
de iones, a saber, la basada en inhibidores y la de una
sola columna. Se diferencian en el método que se usa
para evitar que la conductividad del electrolito elu-
yente interfiera con la medición de las conductividades
del analito.
Cromatografía iónica con inhibidores
Como ya se señaló antes, la amplia aplicación de la cro-
matografía iónica para la determinación de especies
inorgánicas se detuvo por la falta de un buen detector
general que permitiera la determinación cuantitativa
de iones con base en las áreas de los picos cromatográ-
ficos. Los detectores de conductividad son una elec-
ción obvia para este objetivo. Son muy sensibles, son
universales para las especies cargadas y, como norma
general, responden de una manera predecible a los
cambios de concentración. Además, dichos detectores
son sencillos, de fabricación y mantenimiento baratos,
fáciles de miniaturizar y, por lo común, proporcionan
un servicio duradero y sin problemas. La única limita-
ción de los detectores de conductividad resultó ser un
grave problema que retrasó su uso generalizado. Esta
limitación proviene de la elevadaconcentración de
electrolito que se requiere para eluir la mayoría de los
iones del analito en un tiempo razonable. Por consi-
guiente, la conductividad de los componentes de la fase
móvil tiende a enmascarar la de los analitos, y por ello
se reduce de manera considerable la sensibilidad del
detector.
En 1975, el problema de la elevada conductancia de
los eluyentes se resolvió mediante la introducción de la
denominada columna inhibidora del eluyente inmedia-
tamente después de la columna de intercambio iónico.31
La columna inhibidora está rellena con una segunda
resina de intercambio iónico que convierte con eficacia
los iones del solvente en especies moleculares de ioni-
zación limitada, sin afectar la conductividad causada
por los iones del analito. Por ejemplo, cuando se sepa-
ran y determinan cationes, se elige en muchas ocasio-
28F Cromatografía iónica 841
31H. Small, T. S. Stevens y W. C. Bauman, Anal. Chem., 1975, 47, p. 1801.
SO3
–H+
CH CH2 CH2
CH2
CH2 CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH CH
CH CH CH CH
CH CH CH CH
SO3
–H+
SO3
–H+ SO3
–H+
SO3
–H+
SO3
–H+
FIGURA 28.22 Estructura de una resina 
de poliestireno de intercambio iónico 
con entrelazamiento. Se utilizan resinas
parecidas en las que los grupos ¬SO3
�H� se
sustituyen por grupos ¬COO�H�, ¬NH3
�OH�,
y ¬N(CH3)3
�OH�.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 841
Pantalla
regeneradora
Membrana
Pantalla del
eluyente
Membrana
Materiales
para juntas
Flujo
del eluyente
Pantalla abierta
Flujo
regenerador
Pantalla
regeneradora
M
M
0 0
00
Flujo
regenerador
nes el ácido clorhídrico como reactivo eluyente, y la
columna inhibidora es una resina de intercambio anió-
nico en la forma de hidróxido. El producto de la reac-
ción en la columna inhibidora es agua. Es decir
H�(ac) � Cl�(ac) � resina�OH�(s) S
resina�Cl�(s) � H2O
Los cationes del analito no son retenidos por esta se-
gunda columna.
Para la separación de aniones, el relleno inhibidor
es la forma ácida de una resina de intercambio catió-
nico y bicarbonato de sodio o carbonato como agente
eluyente. La reacción en la columna inhibidora es en-
tonces
Na�(ac) � HCO3
� (ac) � resina�H�(s) S
resina�Na�(s) � H2CO3(ac)
En este caso, el ácido carbónico muy poco disociado
que se forma no contribuye de manera importante a la
conductividad.
Un inconveniente de las primeras columnas inhibi-
doras era la necesidad de regenerarlas en forma pe-
riódica, casi siempre, cada ocho o 10 horas a fin de 
convertir los rellenos otra vez en la forma ácida o 
básica original. Pero en los años ochenta ya se pudo
contar con los inhibidores de micromembrana que 
operan en forma continua.32 En la figura 28.23 se ilus-
tra un inhibidor de micromembrana típico. En este
caso, el eluyente y la solución inhibidora fluyen en di-
recciones opuestas en ambos lados de las membranas
permeables de intercambio iónico señaladas con una
M. Para el análisis de aniones, las membranas son resi-
nas intercambiadoras de cationes, y para cationes, son
intercambiadoras de aniones. Por ejemplo, cuando se
trata de eliminar los iones sodio del eluyente, fluye de
manera continua ácido en la corriente inhibidora para
la regeneración. Los iones sodio procedentes del elu-
yente se intercambian con los iones hidrógeno de la
842 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
32Para una descripción de estos dispositivos véase G. O. Franklin, Amer.
Lab., 1985 (3), p. 71.
FIGURA 28.23 Inhibidor de micromembrana. El eluyente
fluye a través de un canal estrecho que contiene una
pantalla de plástico que reduce el volumen vacío y, 
al parecer, aumenta la velocidad de transferencia de
masa. El eluyente se separa de la solución inhibidora
mediante unas membranas de intercambio de 50 μm. 
El flujo del regenerador va en la dirección opuesta al 
flujo del eluyente. (Cortesía de Dionex Corporation,
Sunnyvale, CA.)
0 2 4 6 0 4 8 12 16
BrO3
–
NO2
–
Cl–
HPO4
2–
Br–
NO3
–
SO4
2–
F– (Li-Cs)
Mg2+
Ca2+
Sr2+
Ba2+
Tiempo, min Tiempo, min
a) b)
Concentraciones, ppm
F–
Formiato
BrO3
–
Cl–
NO2
–
HPO4
2–
Br–
NO3
–
SO4
2–
3
8
10
4
10
30
30
30
25
Concentraciones, ppm
Ca2+
Mg2+
Sr2+
Ba2+
3
3
10
25
F
or
m
ia
to
FIGURA 28.24 Aplicaciones características de la
cromatografía iónica. a) Separación de aniones en una
columna de intercambio aniónico. Eluyente: NaHCO3
0.0028 M-Na2CO3 0.0023 M. Tamaño de la muestra: 
50 μL. b) Separación de iones alcalinotérreos en una
columna de intercambio catiónico. Eluyente: diclorhidrato
de fenilenodiamina 0.025 M-HCl 0.0025 M. Tamaño de 
la muestra: 100 μL. (Cortesía de Dionex Corp., 
Sunnyvale, CA.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 842
membrana y migran entonces a través de ésta donde se
intercambian con los iones hidrógeno del reactivo re-
generador. El dispositivo tiene una velocidad de inter-
cambio notablemente alta; por ejemplo, es capaz de
eliminar en esencia todos los iones sodio de una solu-
ción 0.1 M de hidróxido de sodio cuando la tasa de
flujo del eluyente es de 2 mL/min.
En los instrumentos comerciales de diseño reciente,
la regeneración de las soluciones inhibidoras se realiza
en forma automática con iones hidrógeno o hidroxilo
que se generan por medios eléctricos, de tal manera que
no se requiere interrumpir el uso de los instrumentos
para la regeneración. La figura 28.24 muestra dos apli-
caciones de la cromatografía iónica en la que se utilizan
una columna supresora y la detección conductimétri-
ca. En cada caso, los iones están presentes en un nivel
de partes por millón y el tamaño de las muestras es de
50 μL en un caso y de 100 μL en el otro. El método es
de gran importancia para el análisis de aniones debido
a que en la actualidad no existe otro método tan rápido
y satisfactorio para el tratamiento de mezclas de este
tipo.
Cromatografía iónica con una sola columna
También están disponibles en el comercio equipos para
cromatografía iónica en los que no se utiliza una colum-
na inhibidora. Estos sistemas se basan en las pequeñas
diferencias de conductividad entre los iones de la mues-
tra y los iones del eluyente dominantes. Para aumentar
estas diferencias, se utilizan intercambiadores de baja
capacidad que hacen posible la elución con soluciones
que contienen bajas concentraciones de electrolito. Ade-
más, se escogen eluyentes de baja conductividad.33
28F Cromatografía iónica 843
33Véase R. M. Becker, Anal. Chem., 1980, 52, p. 1510; J. R. Benson, Amer.
Lab., 1985 (6), p. 30; T. Jupille, Amer. Lab., 1986 (5), p. 114.
0 5 10 15
S
eñ
al
 d
el
 d
et
ec
to
r
Á
ci
do
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sp
ár
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P
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 (
57
0 
nm
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L
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a
A
m
on
ia
co
A
rg
in
in
a
C
is
ti
na
20
Tiempo, min
25 30 35 40
FIGURA 28.25 Separación de
aminoácidos mediante una columna 
de intercambio iónico. Relleno:
intercambiador catiónico con un tamaño
de partícula de 8 μm. Presión: 2700 psi.
(Reimpreso con autorización de J. R.
Benson, Amer. Lab., 1972, 4 (10), p. 60.
Copyright 1972 por International 
Scientific Communications, Inc.)
La cromatografía iónica de una sola columna tiene
la ventaja de que no requiere equipo especial para la
inhibición, pero es un método menos sensible para de-
terminar aniones que los métodos de columna inhi-
bidora.
28F.4 Aplicaciones orgánicas y bioquímicas
de la cromatografía de intercambio de iones
Esta técnica se ha aplicado a una gran variedad de sis-
temas orgánicos y bioquímicos, como fármacos y sus
metabolitos, sueros, conservadores, mezclas de vitami-
nas, azúcares y preparaciones farmacéuticas. Un ejem-
plo de estas aplicaciones se muestra en la figura 28.25,
en la que se separan en una columna de intercambio
catiónico 1 � 10�8 moles de cada uno de los 17 aminoá-
cidos.
28F.5 Cromatografía de exclusión de iones
La cromatografía de exclusión de iones no es una for-
ma de cromatografía iónica debido a que son especies
neutrasy no iones los que se separan. De todos modos,
es conveniente estudiarla aquí porque al igual que en
la cromatografía iónica, se utilizan columnas de inter-
cambio de iones para realizar las separaciones.
La teoría y las aplicaciones de la cromatografía de
exclusión de iones se ilustran adecuadamente con la
separación de ácidos carboxílicos sencillos en el cro-
matograma que se muestra en la figura 28.26. En este
caso, la fase estacionaria es una resina de intercambio
catiónico en su forma ácida y la elución se lleva a cabo
mediante una solución diluida de ácido clorhídrico. La
columna analítica va seguida de la columna inhibidora
que está rellena con una resina de intercambio catió-
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 843
nico en la forma de plata. Los iones hidrógeno del elu-
yente se intercambiaron por los iones plata, que hacen
precipitar a los iones cloruro, eliminando así la contri-
bución iónica del eluyente. La forma no disociada de
los ácidos del analito se distribuye entre la fase móvil
en la columna y el líquido inmovilizado retenido en los
poros del relleno. Las constantes de distribución de 
los diferentes ácidos se relacionan principalmente con
el inverso de sus constantes de disociación, aunque
otros factores intervienen también en el grado al cual
diversas especies están distribuidas entre las dos fases.
La cromatografía de exclusión de iones tiene distin-
tas aplicaciones en la identificación y determinación de
especies ácidas en distintas muestras, como leche, café,
vino y otros productos manufacturados. Las sales de
los ácidos débiles también pueden ser analizadas dado
que se convierten en sus ácidos correspondientes en
presencia de los iones hidrógeno del intercambiador.
También se pueden determinar por cromatografía de
exclusión de iones las bases débiles y sus sales. En este
caso, la columna que se emplea es un intercambiador
aniónico en la forma hidróxido.
28G CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
POR TAMAÑO
La cromatografía de exclusión por tamaño, o de gel, es
una técnica muy valiosa que se aplica en particular a
especies de elevada masa molecular.34 Los rellenos
para la cromatografía de exclusión por tamaño son pe-
queñas partículas (�10 μm) de sílice o de polímeros que
contienen una red de poros uniforme en los que se
pueden difundir las moléculas del soluto y el solvente.
Las moléculas quedan atrapadas en los poros y son
eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de resi-
dencia medio en los poros depende del tamaño efec-
tivo de las moléculas del analito. Las que son más
grandes que el tamaño medio de los poros del relleno
son excluidas y, por consiguiente, no son retenidas,
tales especies son las primeras en ser eluidas. Las mo-
léculas cuyos diámetros son significativamente menores
que los poros pueden penetrar a través de ellos y así
pasan mucho tiempo atrapadas; éstas son las últimas
en ser eluidas. Entre estos dos extremos están las mo-
léculas de tamaño intermedio cuya penetración media
en los poros depende de su diámetro. Dentro de este
grupo tiene lugar la división, que está directamente re-
lacionada con las dimensiones de la molécula y, en
cierto modo, con la forma molecular. Observe que las
separaciones por exclusión por tamaño difieren de los
otros procedimientos que se han considerado en que
no hay una interacción química o física entre los ana-
litos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar
este tipo de interacciones dado que originan una baja
efectividad de la columna. Tenga en cuenta también
que, a diferencia de otros tipos de cromatografía, hay
un límite superior para el tiempo de retención, ya que
ningún analito es retenido más que aquel que atraviesa
por completo la fase estacionaria.
28G.1 Rellenos de columna
En cromatografía de exclusión por tamaño hay dos tipos
de relleno: cuentas poliméricas y partículas de sílice;
en ambos casos los diámetros oscilan entre 5 y 10 μm.
Las partículas de sílice tienen la ventaja de ser de gran
rigidez, lo que facilita el relleno y permite la aplicación
de presiones más elevadas, mayor estabilidad, lo cual
favorece el uso de una gran variedad de solventes, sin
olvidar el agua; un equilibrio más rápido al cambiar el
solvente y una buena estabilidad a elevadas tempera-
turas. Los inconvenientes de las partículas de sílice son
su tendencia a retener solutos por adsorción y su ca-
pacidad para catalizar la degradación de las moléculas
de soluto.
844 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
34Para monografías sobre este tema, véase Handbook of Size Exclusion
Chromatography, 2a. ed., C. S. Wu, ed., Nueva York: Dekker, 2004; Column
Handbook for Size Exclusion Chromatography, C. S. Wu, ed., San Diego:
Academic Press, 1999; S. Mori y H. G. Barth, Size Exclusion Chromato-
graphy, Nueva York: Springer, 1999.
0
Tiempo, min
34
In
ye
cc
ió
n
Maleico
Malónico
Láctico
Fórmico
Acético
Propiónico
SO4
2–
FIGURA 28.26 Cromatograma de exclusión de iones de
una mezcla de seis ácidos débiles.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 844
En un principio, la mayor parte de la cromatografía
de exclusión por tamaño se llevó a cabo utilizando fun-
damentalmente copolímeros estireno-divinilbenceno
enlazados en forma entrecruzada semejantes en es-
tructura (excepto que carecen de los grupos de ácido
sulfónico) a los que se muestran en la figura 28.22. El
tamaño del poro en estos polímeros se controla por el
grado de entrecruzamiento entre las cadenas poliméri-
cas y, por tanto, por la cantidad relativa de divinilben-
ceno presente durante su manufactura. Entonces, se
han comercializado los rellenos poliméricos con dis-
tintos tamaños promedio de poro. Originalmente los
geles de estireno-divinilbenceno eran hidrófobos y, de
este modo, sólo podían utilizarse con fases móviles no
acuosas. Pero en la actualidad se dispone de geles hi-
drófilos, que permiten usar solventes acuosos para la
separación de moléculas grandes y solubles en agua
como los azúcares. Por lo general, estos geles hidrófi-
los son divinilbencenos sulfonados o poliacrilamidas.
La cromatografía que se basa en los rellenos hidrófilos
se llamaba antes filtración en gel y las técnicas basadas
en los rellenos hidrófobos se denominaban penetración
sobre gel. En la actualidad ambas técnicas están com-
prendidas en los métodos de exclusión por tamaño. En
ambos tipos de rellenos se dispone de muchos diáme-
tros de poro. Por lo regular, un relleno aloja de 2 a 2.5
intervalos de década de masa molecular. La masa mo-
lecular promedio adecuado para un relleno en particu-
lar puede ser desde unos pocos cientos hasta varios
millones.
En la tabla 28.4 se proporcionan las propiedades de
algunos rellenos comerciales característicos de la ex-
clusión por tamaño.
28G.2 Teoría de la cromatografía 
de exclusión por tamaño
El volumen total Vt de una columna rellena con gel de
sílice o con un polímero poroso es
Vt � Vg � Vi � Vo (28.9)
donde Vg es el volumen que ocupa la matriz sólida del
polímero o del gel, Vi es el volumen del solvente rete-
nido en sus poros y Vo es el volumen libre exterior a las
partículas. Si se supone que no hay mezcla ni difusión,
Vo también representa el volumen teórico de solvente
que se necesita para transportar a través de la columna
los componentes que son demasiado grandes para en-
trar en los poros. Sin embargo, tiene lugar de hecho
cierta difusión y mezcla, y como consecuencia de ello los
componentes que no son retenidos aparecen en una
banda de forma gaussiana con una concentración má-
xima en Vo. En el caso de componentes muy pequeños
que entran sin problema en los poros del polímero o
del gel, los máximos de la banda aparecen al final de la
columna con un volumen de eluyente que corresponde
a (Vi � Vo). Por lo general, Vi, Vo y Vg son del mismo or-
den de magnitud y, por tanto, una columna de exclusión
por tamaño permite separar las moléculas grandes de
las pequeñas en una muestra con un volumen mínimo
de eluyente.
Las moléculas de tamaño intermedio tienen la ca-
pacidad de transferirse a una fracción K del solvente
queocupa los poros; el volumen de elución Ve para es-
tas moléculas retenidas es
Ve � Vo � KVi (28.10)
La ecuación 28.10 se aplica a todos los solutos presen-
tes en la columna. Para las moléculas que son demasia-
do grandes para entrar en los poros, K � 0 y Ve � Vo;
para las moléculas que pueden entrar en los poros li-
bremente, K � 1 y Ve � (Vo � Vi). Al deducir la
ecuación 28.10, se plantea la hipótesis de que no existe
interacción alguna, como la adsorción, entre las mo-
léculas del soluto y la superficie del polímero o del gel.
Si hubiera adsorción, aumentaría la cantidad de soluto
retenido intersticialmente; con las moléculas peque-
ñas, K tendrá entonces un valor mayor que la unidad.
28G Cromatografía de exclusión por tamaño 845
TABLA 28.4 Propiedades de los rellenos comerciales característicos para la cromatografía de exclusión por tamaño.
Tipo Tamaño de partícula, μm Tamaño promedio de poro, Å Límite de exclusión de masa molecular*
Poliestireno-divinilbenceno 10 100 700
1000 (0.1 a 20) � 104
104 (1 a 20) � 104
105 (1 a 20) � 105
106 (5 a �10) � 106
Sílice 10 125 (0.2 a 5) � 104
300 (0.03 a 1) � 105
500 (0.05 a 5) � 105
1000 (5 a 20) � 105
*Masa molecular por encima de la cual no se produce la retención.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 845
La ecuación 28.10 puede reordenarse como
K � (Ve � Vo)/Vi � cS /cM (28.11)
donde K es la constante de distribución del soluto
(véanse las ecuaciones 26.1 y 26.2). Los valores de K os-
cilan desde cero, para las moléculas grandes totalmen-
te excluidas, hasta la unidad, en el caso de las moléculas
pequeñas. La constante de distribución es un paráme-
tro valioso para comparar la información de distintos
rellenos. Además, hace posible la aplicación de todas
las ecuaciones de la tabla 26.5 a la cromatografía de ex-
clusión.
El intervalo útil de masa molecular para un deter-
minado relleno de exclusión por tamaño se ilustra en
forma satisfactoria por medio de una curva de calibra-
ción como la que se muestra en la figura 28.27a. En este
caso, la masa molecular, que está directamente relacio-
nada con el tamaño de las moléculas de soluto, se grafica
frente al volumen de retención VR, que es el producto
del tiempo de retención por la tasa de flujo volumétrico.
Observe que la escala en las ordenadas es logarítmica.
El límite de exclusión es la masa molecular máxima de
una especie que podrá penetrar en los poros. Todas las
especies cuya masa molecular es mayor que el límite de
exclusión son tan grandes que no quedan retenidas,
por lo que son arrastradas juntas para dar el pico A en
el cromatograma que se muestra en la figura 28.27b.
Por debajo del límite de penetración, las moléculas de
soluto pueden penetrar por completo en los poros. Por
debajo de esta masa molecular todas las moléculas del
soluto son tan pequeñas que son arrastradas y dan 
una sola banda, la marcada con D. A medida que las
masas moleculares disminuyen respecto al límite de
exclusión, las moléculas del soluto pasan cada vez más
y más tiempo, en promedio, en los poros que forman
las partículas y, por consiguiente, se mueven progresi-
vamente con mayor lentitud. Es en la región de pe-
netración selectiva donde tiene lugar el fraccionamiento
o división, lo que da lugar a picos de soluto individuales
como los B y C del cromatograma.
Las curvas de calibración experimentales, semejan-
tes en aspecto a la teórica de la figura 28.27a, se ob-
tienen por lo regular mediante patrones. En muchas
ocasiones los propios fabricantes de las columnas de
846 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
Región de penetración selectiva
Cromatograma
Límite
de exclusión
VR
A B C D
R
es
pu
es
ta
de
l 
de
te
ct
or
P
es
o 
m
ol
ec
ul
ar
b)
a)
107
106
105
104
103
102
Vo Vi
Límite de penetración
VR
FIGURA 28.27 a) Curva de calibración para
una columna de exclusión por tamaño. 
b) Cromatograma en el que se muestra el pico
A que contiene todos los compuestos con
masas moleculares mayores que el límite de
exclusión, los picos B y C que consisten en
los compuestos dentro de la región de
penetración selectiva y el pico D que contiene
todos los compuestos menores que el límite
de penetración.
Simulación: aprenda más acerca de la 
cromatografía de exclusión por tamaño.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 846
exclusión por tamaño suministran dichas curvas. Los
patrones de calibración de masa molecular deben ser
tan parecidos como sea posible a los componentes de
la muestra en cuanto a funcionalidad química.
28G.3 Aplicaciones de la cromatografía 
de exclusión por tamaño
Los métodos de filtración sobre gel y de penetración
sobre gel son complementarios porque el primero se
aplica a las muestras solubles en agua y la segunda 
se utiliza para sustancias en solventes orgánicos menos
polares. Una de las aplicaciones útiles del procedi-
miento de exclusión por tamaño es la separación de las
moléculas de elevada masa molecular, de productos
naturales de las especies de baja masa molecular y de
las sales. Por ejemplo, un gel con un límite de exclusión
de varios miles puede separar con claridad las proteí-
nas de los aminoácidos y de los péptidos de baja masa
molecular.
Otra aplicación útil de la cromatografía de penetra-
ción en gel es la separación de homólogos y oligóme-
ros. Estas aplicaciones se ilustran en los ejemplos que
se muestran en la figura 28.28. El primero muestra la se-
paración de una serie de ácidos grasos con masas mo-
leculares m entre 116 y 344 mediante un relleno de
poliestireno con un límite de exclusión por tamaño 
de 1000. El segundo es el cromatograma de una resina
epóxica comercial también mediante un relleno de po-
liestireno. En este caso, n se refiere al número de uni-
dades monoméricas (m� 264) en las moléculas.
Otra importante aplicación de la cromatografía de
exclusión por tamaño es en la determinación rápida 
de las masas moleculares o en la distribución de masas
moleculares en los grandes polímeros o en los produc-
tos naturales. La clave de tales determinaciones es una
calibración exacta de la masa molecular. La calibración
se puede conseguir mediante patrones de masa molecu-
lar conocida (véase figura 28.27) o por medio del méto-
do de calibración universal. Este último se basa en el
principio de que el producto de la viscosidad molecu-
lar intrínseca h y la masa molecularm es proporcional
al volumen hidrodinámico (volumen efectivo incluida
la cubierta de solvatación). Idealmente, las moléculas
se separan con la cromatografía de exclusión por ta-
maño de acuerdo con el volumen hidrodinámico. Por
tanto, una curva de calibración universal se obtiene al
graficar log (hm) contra el volumen de retención VR.
De otra manera, la calibración absoluta se puede alcan-
zar usando un detector molar sensible a la masa tal co-
mo el detector de dispersión de la luz en ángulo bajo.
Entre las ventajas más importantes de los proce-
dimientos de exclusión por tamaño están 1) tiempos de
separación cortos y muy bien definidos (todos los solu-
tos dejan la columna entre Vo y Vo � Vi en la ecuación
28.9 y la figura 28.27); 2) bandas estrechas, las cuales
ocasionan buena sensibilidad; 3) no hay pérdida de
muestra porque los solutos no interaccionan con la
fase estacionaria y 4) no se desactiva la columna por 
la interacción del soluto con el relleno.
Las desventajas son 1) sólo una cantidad limitada
de bandas se pueden acomodar porque la escala de
tiempo del cromatograma es corta y 2) inaplicabilidad
con muestras de dimensiones similares, como los isó-
meros. En general, se requiere una diferencia de 10%
en las masas moleculares para conseguir una resolu-
ción razonable.
28G Cromatografía de exclusión por tamaño 847
4 min
In
ye
cc
ió
n
P
en
et
ra
ci
ón
 t
ot
al
Tiempo de elución, min
a) b)
2520
20
16
14
15
12
10
8 6
4
n = 2
n = 6
n = 5
n = 4
n = 3
n = 2
n = 1
n = 0CH3(CH2)nCOOH
FIGURA 28.28 Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño. a) Separación de
ácidos grasos. Columna: poliestireno, de 7.5 � 600 nm, con un límitede exclusión de 1 � 103.
Fase móvil: tetrahidrofurano. Tasa de flujo: 1.2 mL /min. Detector: índice de refracción. 
b) Análisis de una resina epóxica comercial (n � número de unidades monoméricas en el
polímero). Columna: de sílice porosa 6.2 � 250 mm. Fase móvil: tetrahidrofurano. Tasa de
flujo: 1.3 mL /min. Detector: absorción UV. (Cortesía de BTR Separations.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 847
28H CROMATOGRAFÍA POR AFINIDAD
Para la cromatografía por afinidad se requiere el enla-
ce covalente de un reactivo, llamado ligando por afini-
dad, con un soporte sólido.35 Los ligandos por afinidad
característicos son anticuerpos, inhibidores de enzimas
u otras moléculas que en forma reversible y selectiva 
se enlazan a las moléculas del analito en la muestra.
Cuando esta última pasa por la columna, sólo son re-
tenidas las moléculas que se unen de manera selectiva
al ligando por afinidad. Las moléculas que no se unen
atraviesan la columna con la fase móvil. Después de
que se eliminan las moléculas indeseables, los analitos
retenidos pueden ser arrastrados cambiando las condi-
ciones de la fase móvil.
La fase estacionaria para la cromatografía por afini-
dad es un sólido como la agarosa o cuentas de vidrio
poroso en las que el ligando por afinidad está inmovi-
lizado. La fase móvil en la cromatografía por afinidad
desempeña dos papeles distintos. Primero, debe so-
portar el fuerte enlace de las moléculas del analito con
el ligando. Segundo, una vez que se han eliminado las
especies indeseables, la fase móvil debe debilitar o eli-
minar la interacción analito-ligando de modo que el ana-
lito pueda ser eluido. Con frecuencia se aprovechan los
cambios en el pH o la potencia iónica para modificar
las condiciones de elución durante las dos etapas del
proceso.
La principal ventaja de la cromatografía por afini-
dad es que es muy específica. Se utiliza de modo prin-
cipal para aislar con rapidez biomoléculas durante el
trabajo de preparación.
28I CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Entre los métodos de cromatografía en plano están la
cromatografía en capa fina (TLC) y la cromatografía en
papel (CP). En todos los casos se emplea una capa
plana y relativamente delgada de un material que a la
vez es el soporte, o bien, cubre una superficie de vidrio,
plástico o metal. La fase móvil se desplaza por la fase
estacionaria por acción capilar, a veces ayudada por la
gravedad o por la aplicación de un potencial eléctrico.
En la actualidad, la cromatografía en plano se cen-
tra en la técnica de capa fina, que es más rápida, tiene
mejor resolución y es más sensible que la cromatogra-
fía en papel. Esta sección se dedica sólo a los métodos
de capa fina.
28I.1 Campo de aplicación 
de la cromatografía en capa fina
Desde un punto de vista teórico, los tipos de fases mó-
viles y estacionarias, así como las aplicaciones de croma-
tografía en capa fina son muy similares a las de la 
cromatografía de líquidos. De hecho, las técnicas de 
la cromatografía en capa fina se aplican para desarro-
llar las condiciones para las separaciones en cromatogra-
fía de líquidos de alta resolución. En algún momento,
los métodos de cromatografía en capa fina se utilizaron
ampliamente en la industria farmacéutica. En la actua-
lidad, esas técnicas han sido reemplazadas por los mé-
todos de la cromatografía de líquidos, los cuales se
pueden automatizar con facilidad y son más rápidos.
La cromatografía en capa fina tiene amplio uso en los
laboratorios clínicos y es la estructura de apoyo de mu-
chos estudios bioquímicos y biológicos. Tiene también
muchas aplicaciones en los laboratorios industriales.36
Debido a sus muchas áreas de aplicación es que sigue
siendo una técnica importante.
28I.2 Fundamentos de la cromatografía 
en capa fina
Las separaciones en capa fina características se reali-
zan en placas de vidrio revestidas con una capa delga-
da y adherente de partículas finamente divididas; esta
capa constituye la fase estacionaria. Las partículas son
semejantes a las de la cromatografía por adsorción, de
reparto en fase normal y en fase inversa, de intercam-
bio iónico y de exclusión por tamaño. Las fases móvi-
les también son similares a las que se emplean en la
cromatografía de líquidos de alta resolución.
Preparación de las placas de capa fina
Una placa de capa fina se prepara extendiendo una le-
chada acuosa del sólido finamente pulverizado sobre
la superficie limpia de una lámina de vidrio o plástico
o sobre el portaobjetos de un microscopio. A menudo
se añade un aglutinante a la lechada para aumentar la
adhesión de las partículas sólidas al vidrio y entre las
mismas partículas. Luego se deja reposar la lámina
hasta que haya secado y las partículas estén muy bien
adheridas a la superficie; en algunos casos se calienta
en un horno durante varias horas. Hay empresas de
equipo para laboratorios químicos que ofrecen lámi-
848 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
35Para detalles sobre la cromatografía por afinidad consulte Handbook of
Affinity Chromatography, T. Kline, ed., Nueva York: Dekker, 1993; Ana-
lytical Affinity Chromatography, I. M. Chaiken, ed., Boca Ratón, FL: CRC
Press, 1987; R. R. Walters, Anal. Chem., 1985, 57, p. 1097A.
36Entre los libros dedicados a los fundamentos y aplicaciones de la croma-
tografía en capa fina están Handbook of Thin-Layer Chromatography, 3a.
ed., J. Sherma y B. Fried, eds., Nueva York: Dekker, 2003; B. Fried y J.
Sherma, Thin Layer Chromatography, 4a. ed., Nueva York: Dekker, 1999;
Practical Thin-Layer Chromatography, B. Fried y J. Sherma, eds., Boca
Ratón, FL: CRC Press, 1996. Revisiones más recientes están en J. Sherma,
Anal. Chem., 2006, 78, p. 3841; J. Sherma, Anal. Chem., 2004, 76, p. 3251;
J. Sherma, 2002, 74, p. 2653.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 848
nas precubiertas de varias clases. Los precios son de al-
gunos dólares por lámina. Las dimensiones comunes
en centímetros son 5 � 20, 10 � 20 y 20 � 20.
Las placas comerciales se presentan en dos catego-
rías: la ordinaria y la de alto rendimiento. La capa de la
primera es más gruesa (de 200 a 250 μm) con partícu-
las cuyas dimensiones son de 20 μm o más. Las placas
de alto rendimiento tienen por lo general películas de
unos 100 μm de espesor y partículas de un diámetro 
de 5 μm o menos. Las placas de alto rendimiento propor-
cionan mejores separaciones y en menos tiempo. Pero
tienen la desventaja de tener una capacidad significati-
vamente menor de carga que las láminas ordinarias.
Aplicación de la muestra
La aplicación de la muestra es tal vez el aspecto más
decisivo de la cromatografía en capa fina, sobre todo
cuando se trata de medidas cuantitativas. Por lo general
se aplica una solución de la muestra de 0.01% a 0.1%
como un punto a 1 o 2 cm del extremo de la placa. Para
una separación más eficaz, este punto o mancha debe
tener un diámetro mínimo, alrededor de 5 mm para un
trabajo cualitativo y menor para el análisis cuantita-
tivo. En el caso de soluciones diluidas, se realizan tres
o cuatro aplicaciones superpuestas secando la zona en-
tre aplicación y aplicación.
La aplicación manual de las muestras se efectúa por
contacto entre la placa y un capilar que contiene la
muestra, o con una jeringa hipodérmica. En el comer-
cio hay varios aplicadores mecánicos que mejoran la
precisión y exactitud de la aplicación de la muestra.
Desarrollo o creación de la placa
La creación de la placa es un proceso en el cual una
muestra es arrastrada a lo largo de la fase estacionaria
por una fase móvil; es similar a la elución en la croma-
tografía de líquidos. La forma más común de crear una
placa es depositar una gota de la muestra cerca de uno
de los extremos de la placa y marcar su posición con un
lápiz. Una vez que se ha evaporado el solvente en el
que estaba disuelta la muestra, se coloca la placa en un
recipiente cerrado y saturado con los vapores del sol-
vente con el que se efectuará el proceso. Uno de los 
extremos de la placa se introduce en el solvente de de-
sarrollo, pero se procura evitar el contacto directode éste con la muestra (figura 28.29). Una vez que el
solvente de desarrollo se desplazó la mitad o las dos
terceras partes de la longitud de la placa, se retira ésta
del recipiente y se seca. Las posiciones de los compo-
nentes de la muestra se determinan entonces por cual-
quiera de varios procedimientos.
Ubicación de los analitos en la placa
Se puede aplicar una diversidad de procedimientos pa-
ra localizar los componentes de la muestra después de
la separación. Dos de los métodos comunes, que se uti-
lizan con la mayoría de las mezclas de sustancias or-
gánicas, consisten en rociar sobre la placa una solución
de ácido sulfúrico o colocar la lámina en una cámara
que contiene algunos cristales de yodo. Ambos reacti-
vos son sensibles a los compuestos orgánicos que están
en la placa y dan productos oscuros. También se utili-
zan varios reactivos específicos como la ninhidrina para
localizar las especies separadas.
Otro método de detección se basa en la incorpora-
ción de un material fluorescente a la fase estacionaria.
Una vez que ha finalizado la creación, se examina la
placa con luz ultravioleta. Los componentes de la mues-
tra amortiguan la fluorescencia del material de tal for-
ma que toda la placa exhibe fluorescencia, excepto los
lugares donde se encuentran los componentes de la
muestra que no son fluorescentes.
La figura 28.30 muestra un esquema ideal de una pla-
ca tras la creación y el cromatograma correspondiente.
La muestra 1 estaba constituida por dos componentes
y la 2 contenía sólo uno. En muchas ocasiones las man-
chas reales sobre una placa presentan colas, lo que ori-
gina señales que no son tan simétricas como las de la
figura.
28I.3 Características de rendimiento 
de las placas de capa fina
La mayoría de los términos y ecuaciones desarrollados
para la cromatografía en columna de la sección 26B se
puede aplicar también, con ligeras modificaciones, a la
cromatografía en capa fina. Se requiere un nuevo tér-
mino, el factor de retardo o RF.
28I Cromatografía en capa fina 849
Muestra
a) b)
Solvente de desarrollo
Muestras
Mecha
Cubierta
FIGURA 28.29 a) Cámara para producir el ascenso
del flujo. b) Cámara para producir el flujo horizontal,
en este caso las muestras se colocan en ambos
extremos de la lámina y se desplazan hacia la parte
media, por lo que se duplica el número de muestras
que se pueden acomodar.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 849
Factor de retardo
La placa de capa fina creada para un solo soluto se
muestra en la figura 28.30a para la muestra 2. El factor
de retardo para este soluto es
(28.12)
donde dR y dM son distancias lineales medidas desde la
línea de aplicación. Los valores de RF tienen la capaci-
dad de variar desde 1 para los solutos que no se retrasan
hasta valores que se aproximan a 0. Tenga en cuenta
que si las manchas no son simétricas, como las de la fi-
gura 28.30a, la medida de dR se basa en la posición de
intensidad máxima.
Factor de retención
Todas las ecuaciones de la tabla 26.5 se adaptan a la
cromatografía en capa fina. A fin de poder aplicar estas
ecuaciones, sólo se necesita relacionar dR y dM como se
definen en la figura 28.30a con tR y tM, los cuales se de-
finen en la figura 26.4. Para establecer estas relaciones,
considere el soluto único que aparece en la muestra 2
de la figura 28.30a. En este caso, tM y tR corresponden
a los tiempos necesarios para que la fase móvil y el so-
luto recorran una distancia determinada, en este caso,
dR. Para una fase móvil, este tiempo es igual a la dis-
tancia que recorre dividida entre la velocidad lineal
u, es decir
RF �
dR
dM
tM � dR/u (28.13)
Sin embargo, el soluto no alcanza este mismo punto
hasta que la fase móvil no ha recorrido la distancia dM.
Por tanto,
tR � dM/u (28.14)
Al sustituir las ecuaciones 28.13 y 28.14 en la ecua-
ción 26.12 se obtiene
(28.15)
El factor de retención k también se puede expresar en
función del factor de retardo al reescribir la ecuación
28.15 en la forma
(28.16)
Los factores de retención deducidos de este modo
se pueden usar para perfeccionar métodos para la cro-
matografía en columna tal como se menciona en la sec-
ción 28D.2. Por otra parte, la obtención de factores de
retención por cromatografía en capa fina es más sen-
cillo y más rápido que a partir de los datos obtenidos
en experimentos en una columna.
Altura del plato
La altura de plato aproximada también se puede deter-
minar para un tipo determinado de relleno por croma-
tografía en capa fina. Por consiguiente, para la muestra
2 de la figura 28.30a, el número de platos teóricos se
obtiene mediante la ecuación
(28.17)
donde dR y W se definen en la figura. La altura de plato
es entonces
H � dR/N (28.18)
28I.4 Aplicaciones de la cromatografía 
en capa fina
El método de capa fina se puede aplicar tanto en la iden-
tificación cualitativa de compuestos como en el análisis
cuantitativo.
Cromatografía en capa fina cualitativa
Por lo general, los datos de un solo cromatograma no
proporcionan la información suficiente para identificar
las distintas especies presentes en una mezcla, debido
a la variabilidad de los valores de RF respecto al ta-
maño de la muestra, la placa de capa fina y las condicio-
nes existentes durante la creación. Además, siempre
N � 16 a dR
W
b 2
k �
1 � dR /dM
dR /dM
�
1 � RF
RF
k �
dM � dR
dR
850 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
Distancia de migración, cm
AB
S
eñ
al
 d
el
 d
et
ec
to
r
b)
a)
dM
dR
ΔZ
Muestra 2 Frente
del
solventeMuestra 1
Línea de aplicación
WAWB
W
FIGURA 28.30 a) Placa de capa fina después de la
creación. b) Cromatograma de capa fina para la muestra 1.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 850
existe la posibilidad de que dos solutos muy diferentes
puedan presentar valores de RF idénticos o casi idénti-
cos en ciertas condiciones determinadas.
Métodos de identificación. A veces se puede lograr
una identificación tentativa al aplicar a la placa solu-
ciones de especies purificadas que quizá se podrían en-
contrar en el analito. La coincidencia entre los valores
de RF proporciona una gran evidencia para la identifi-
cación de uno de los componentes. En otros casos, la
identidad de especies separadas se confirma mediante
la técnica de raspadura y solución. En esta técnica, la
zona que contiene el analito se raspa en la placa me-
diante una hoja de rasurar o con una espátula y se
colectan las raspaduras en un trozo de papel lustre.
Después de depositarlas en un recipiente adecuado, el
analito se disuelve con un solvente apropiado y se se-
para de la fase estacionaria mediante centrifugación o
filtración. Las técnicas espectroscópicas, como la es-
pectroscopía de fluorescencia, de absorción UV-visible,
de resonancia magnética nuclear o de IR de transfor-
mada de Fourier se aplican para identificar las espe-
cies. La cromatografía en capa fina también se acopla
ahora en línea a varias técnicas de detección espectro-
métricas. El acoplamiento de la cromatografía en capa
fina con los espectrómetros de masas es un campo ac-
tivo de investigación.37
Cromatografía en plano bidimensional. La figura 28.31
ilustra la separación de aminoácidos de una mezcla
mediante el desarrollo o creación en dos dimensiones.
La muestra se coloca en una de las esquinas de una
placa cuadrada y se realiza el desarrollo en dirección
ascendente con el solvente A. En seguida se elimina
éste por evaporación, se gira la placa 90 grados y se 
realiza ahora el desarrollo ascendente con el solvente
B. Tras la eliminación del solvente se determinan las
posiciones de los aminoácidos después de rociar la pla-
ca con ninhidrina, reactivo que forma con los aminoáci-
dos un producto de color rosa a púrpura. Las manchas
originadas se identifican al comparar sus posiciones
con las de los patrones. Las técnicas para obtención de
imágenes se utilizan en el análisis cuantitativo de se-
paraciones bidimensionales.38
Análisis cuantitativo
Se obtiene un cálculo semicuantitativo de la cantidad
de componente presente al comparar el área de la man-cha con la del patrón. Los mejores resultados se ob-
tienen si se raspa la mancha de la placa, se extrae el
analito del sólido que forma la fase estacionaria y se
determina el analito mediante algún método físico o
químico apropiado. Un tercer procedimiento consiste
en usar un densitómetro de barrido que puede medir
la fluorescencia o la absorción de la mancha.
Preguntas y problemas 851
37J. Sharma, Anal. Chem., 2006, 78, p. 3841. 38M. Medic-Saric et al., J. Planar. Chromatogr.-Mod. TLC, 2004, 17, p. 459.
1
x
Punto de
aplicación
de la
muestra
10
2
3
5
6
7 8
9
S
ol
ve
nt
e 
A
4
Solvente B
FIGURA 28.31 Cromatograma en capa fina bidimensional
(gel de sílice) de algunos aminoácidos. Solvente A:
tolueno, 2-cloroetanol, piridina. Solvente B: cloroformo,
alcohol bencílico, ácido acético. Aminoácidos: 1) ácido
aspártico, 2) ácido glutámico, 3) serina, 4) b-alanina, 
5) glicina, 6) alanina, 7) metionina, 8) valina, 9) isoleucina 
y 10) cisteína.
PREGUNTAS Y PROBLEMAS
* Las respuestas de los problemas marcados con un asterisco se proporcionan al final del
libro.
Los problemas que contienen este símbolo se resuelven mejor con hojas de cálculo.
28.1 Enumere los tipos de sustancias en los cuales son más aplicables los siguientes
métodos de cromatografía:
a) gas-líquido
b) absorción de líquidos
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 851
c) reparto líquido-líquido
d) reparto en fase inversa
e) intercambio iónico
f ) penetración en gel
g) gas-sólido 
h) filtración sobre gel
i) Pares iónicos
28.2 Describa tres métodos generales para mejorar la resolución en la cromatografía
de reparto.
28.3 Explique una forma de modificar el factor de retención de un soluto en la 
cromatografía de reparto.
28.4 ¿Cómo se puede modificar el factor de selectividad en a) la cromatografía de
gases y b) la cromatografía de líquidos?
28.5 Al preparar un gradiente con hexano-acetona para una columna de HPLC 
rellena de alúmina, ¿es deseable aumentar o disminuir la proporción de hexano
a medida que progresa la elución en la columna?
28.6 ¿Qué significa el intervalo de respuesta lineal de un detector?
28.7 Defina:
a) elución isocrática
b) elución con gradiente
c) inyección a flujo detenido
d) relleno de fase inversa
e) relleno de fase normal
f ) cromatografía de pares de iones
g) cromatografía iónica
h) detector de propiedades de la solución
i) detector de propiedades del soluto
j) purga
28.8 ¿Qué es la columna de protección en la cromatografía de reparto?
28.9 ¿En qué se parecen la cromatografía de reparto en fase normal y la 
cromatografía de adsorción?
28.10 ¿Cuál es el orden en que los compuestos siguientes saldrán de una columna para
HPLC que contiene un relleno de fase inversa?
a) benceno, dietiléter, n-hexano
b) acetona, dicloroetano, acetamida
*28.11 ¿Cuál es el orden de elución de los compuestos siguientes en una columna para
HPLC con relleno de fase normal?
a) acetato de etilo, ácido acético, dimetilamina
b) propileno, hexano, benceno, diclorobenceno
28.12 Enumere las diferencias fundamentales entre cromatografía de adsorción y 
cromatografía de reparto.
28.13 Enumere las diferencias fundamentales entre cromatografía de intercambio de
iones y cromatografía de exclusión por tamaño.
852 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
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28.14 ¿Qué tipos de especies se pueden separar con cromatografía de líquidos de alta
resolución pero no con cromatografía de gases?
28.15 Describa las diferentes clases de bombas que se usan en la HPLC. ¿Cuáles son
las ventajas y desventajas de cada una?
28.16 Señale las diferencias entre la cromatografía de una sola columna y la 
cromatografía iónica de columna inhibidora.
28.17 La espectrometría de masa es un sistema de detección extremadamente 
versátil para la cromatografía de gases. No obstante, acoplar un sistema de 
cromatografía de líquidos de alta resolución con un espectrómetro de masa es
una tarea a menudo difícil. Proporcione las principales razones por las que 
es más difícil combinar la HPLC con la espectrometría de masa que combinar la
cromatografía de gases con la espectrometría de masa.
28.18 ¿Cuál de los detectores de cromatografía de gases de la tabla 27.1 son 
apropiados para la HPLC? ¿Por qué algunos de los mencionados son inadecua-
dos para la HPLC?
28.19 Aunque la temperatura no afecta las separaciones en cromatografía de líquidos
de alta resolución como lo hace en las separaciones por cromatografía de gases,
puede desempeñar un papel importante. Analice cómo y por qué la temperatura
podría o no influir en las separaciones siguientes:
a) separación cromatográfica en fase inversa de una mezcla de esteroides.
b) una separación cromatográfica por adsorción de una mezcla de isómeros
muy relacionados.
*28.20 En una separación con cromatografía de líquidos de alta resolución dos compo-
nentes tienen tiempos de retención que difieren en 15 s. El primer pico eluye en
9.0 minutos y los anchos de los picos son casi iguales. El tiempo muerto tM es 
65 s. Mediante una hoja de cálculo determine la cantidad mínima de platos 
teóricos que se necesitan para alcanzar los siguientes valores de resolución Rs:
0.50, 0.75, 0.90, 1.0, 1.10, 1.25, 1.50, 1.75, 2.0, 2.5. ¿Qué tanto cambiarían los 
resultados si el pico 2 tuviera el doble de ancho que el pico 1?
*28.21 Se perfeccionó un método de cromatografía de líquidos de alta resolución para
separar y determinar ibuprofeno en muestras de plasma de rata como parte 
de un estudio del curso de tiempo del fármaco en los animales de laboratorio. 
Se sometieron a estudios cromatográficos varios patrones y se obtuvieron los 
resultados siguientes:
Concentración 
de ibuprofeno, Área relativa 
μg/mL del pico
0.5 5.0
1.0 10.1
2.0 17.2
3.0 19.8
6.0 39.7
8.0 57.3
10.0 66.9
15.0 95.3
Preguntas y problemas 853
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 853
Luego se administró por vía oral una muestra de 10 mg/kg de ibuprofeno a 
una rata de laboratorio. Se tomaron muestras de sangre en diferentes tiempos 
después de la administración del fármaco y se sometieron a análisis de HPLC.
Se obtuvieron los resultados siguientes:
Tiempo, h Área del pico
0 0
0.5 91.3
1.0 80.2
1.5 52.1
2.0 38.5
3.0 24.2
4.0 21.2
6.0 18.5
8.0 15.2
Determine la concentración de ibuprofeno en el plasma sanguíneo para cada
tiempo dado y grafique la concentración contra tiempo. En porcentaje, ¿durante
qué periodo de media hora (primero, segundo, tercero, etc.) se pierde la mayor
parte del ibuprofeno?
*28.22 En una columna de reparto en fase normal, se determinó que un soluto tiene un
tiempo de retención de 29.1 minutos y una muestra no retenida tiene un tiempo
de retención de 1.05 minutos cuando la fase móvil contiene 50% en volumen de
cloroformo y 50% de n-hexano. Calcule a) k para el soluto y b) la composición
de solventes que disminuiría a k a un valor de alrededor de 10.
Problema de reto
28.23 Suponga, para simplificar las cosas, que la altura H del plato en cromatografía de
líquidos de alta resolución se obtiene con la ecuación 26.23:
donde C � CS � CM.
a) Por medio del cálculo diferencial determine la H mínima y demuestre que la
velocidad óptima uopt se puede expresar como
b) Demuestre que lleva a una altura de plato mínima Hmín definida por
c) En algunas condiciones de la cromatografía, CS es insignificante en compara-
ción con CM. En el caso de columnas rellenas para cromatografía de líquidos
de alta resolución CM es
donde v es una constante adimensional, dp es el tamaño de la partícula del
relleno de la columna y DM es el coeficiente de difusión en la fase móvil. El
coeficiente B se puede expresar como
B � 2gDM
CM �
vdp
2
DM
Hmin � 21BC
uopt � BB
C
H �
B
u
� CS u � CM u �
B
u
� Cu
854 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
Hmín
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 854
donde g también es una constante adimensional. Exprese uopt y Hmín en fun-
ción de DM, dp, y las constantes adimensionales g y v.
d) Si las constantes adimensionales son del orden de la unidad,hecho, dichos mínimos se observan en la cromato-
grafía de líquidos (véase figura 26.8a) a tasas de flujo
que son demasiado bajas para la mayoría de las aplica-
ciones prácticas.
28B.2 Ensanchamiento de banda
extracolumna en cromatografía de líquidos
En la cromatografía de líquidos a veces tiene lugar un
ensanchamiento de banda significativo fuera del relle-
no de la columna propiamente dicho. Este ensancha-
miento de banda extracolumna se presenta cuando el
soluto se transporta a través de tubos abiertos como
los que se utilizan en los sistemas de inyección, en la
región de los detectores y en los tubos que conectan los
distintos componentes del sistema. El ensanchamiento
proviene de diferencias en las tasas de flujo de las ca-
pas de líquido adyacentes a las paredes del tubo y de
las capas del centro. Como consecuencia, la parte cen-
tral de una banda de soluto se mueve con más rapidez
que la periférica. En cromatografía de gases la difusión
compensa con creces la dispersión extracolumna. Sin
embargo, en los líquidos la difusión es significativamen-
te menor y, con frecuencia, este tipo de ensanchamiento
de banda es evidente.
Se ha demostrado que la contribución de los efectos
extracolumna a la altura total de plato Hex está dada
por2
(28.1)Hex �
pr2u
24DM
donde u es la velocidad del flujo lineal en (cm/s), r es el
radio del tubo en cm y DM es el coeficiente de difusión
del soluto en la fase móvil en (cm2/s).
Cuando se utilizan columnas de diámetro pequeño,
el ensanchamiento extracolumna puede ser muy im-
portante. En este caso, el radio de los tubos del sistema
externo a la columna se debe reducir a valores inferio-
res a 0.010 pulgada o menos y la longitud del tubo fue-
ra de la columna se hace tan pequeña como sea posible
para reducir al mínimo esta causa de ensanchamiento.
28C INSTRUMENTOS PARA
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Con el objetivo de alcanzar flujos razonables con relle-
nos de tamaño de partícula de entre 3 y 10 μm, que por
otra parte son comunes en la cromatografía de líqui-
dos moderna, se requieren presiones de bombeo de
varios cientos de atmósferas. Debido a estas presiones
elevadas, el equipo necesario para la cromatografía de
líquidos de alta resolución tiende a ser más complejo 
y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromato-
grafía. En la figura 28.3 se muestra un esquema de los
componentes fundamentales de un cromatógrafo de
líquidos característico.
28C.1 Recipientes para la fase móvil y
sistemas para el tratamiento del solvente
Un aparato moderno para cromatografía de líquidos
está equipado con uno o más recipientes de vidrio,
cada uno de los cuales contiene 500 mL o más de un
solvente. A menudo están equipados con un sistema
para eliminar los gases disueltos y el polvo de los lí-
quidos. Los gases disueltos ocasionan flujos inestables
818 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
2R. P. W. Scott y P. Kucera, J. Chromatogr. Sci., 1971, 9, p. 641.
0
0
A
lt
ur
a 
de
 p
la
to
 H
, m
m
1.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
k = 1.2 44.7 
m
 34.9 
m
 22.6 
m
 13.2 
m
 8.8 
m
 6.1 
m
2.0 3.0 4.0
Velocidad lineal, cm/s
FIGURA 28.2 Efecto del tamaño de las partículas del relleno y de la tasa de flujo sobre la altura de plato H en cromatografía
de líquidos. Dimensiones de la columna: 30 cm � 2.4 mm. Soluto: N,N�-dietil-p-aminoazobenceno. Fase móvil: mezcla de
hexano, cloruro de metileno y alcohol isopropílico. (Según R. E. Majors, J. Chromatogr. Sci., 1973, 11, p. 88. Con autorización.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 818
y ensanchamiento de bandas; además, las burbujas y el
polvo interfieren con el funcionamiento de la mayo-
ría de los detectores. Los desgasificadores pueden con-
sistir en un sistema de bombeo por vacío, un sistema 
de destilación, un dispositivo para calentar y agitar los
solventes o bien, como se muestra en la figura 28.3, 
sistemas de purga que permiten arrastrar los gases 
disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas
de un gas inerte insoluble en la fase móvil. Con fre-
cuencia, los sistemas también contienen un dispositivo
para filtrar los solventes y eliminar el polvo y las par-
tículas sólidas que estén en suspensión para evitar que
dañen la bomba o los sistemas de inyección u obturen
la columna. No es necesario que los desgasificadores 
y los filtros sean partes integrantes de los sistemas 
de HPLC como se muestra en la figura 28.3. Por ejem-
plo, una forma conveniente de tratar los solventes
antes de introducirlos en el recipiente, consiste en ha-
cerlos pasar al vacío a través de un filtro millipore.
Este tratamiento elimina los gases y la materia en sus-
pensión.
Una elución que utiliza un solo solvente o una mez-
cla de solventes de composición constante se denomina
elución isocrática. En la elución con gradiente se usan
dos sistemas de solventes y algunas veces más, que di-
fieren de manera notable en cuanto a polaridad y va-
rían en composición durante la separación. La relación
entre los dos solventes se hace variar de manera pro-
gramada, algunas veces en forma continua y otras en
una serie de etapas. Los instrumentos modernos para
la cromatografía de líquidos de alta resolución están
equipados a menudo con válvulas de alimentación que
introducen los solventes desde dos o más recipientes a
una velocidad que varía en forma continua (figura 28.3).
La relación de volumen de los solventes se puede mo-
dificar lineal o exponencialmente con el tiempo.
En la figura 28.4 se ilustra la ventaja de una elución
con gradiente en la separación de una mezcla de cloro-
bencenos. La elución isocrática con una mezcla meta-
nol-agua 50:50 (v/v) origina la curva de la figura 28.4b.
La figura 28.4a muestra la elución con gradiente, que
se inicia con una mezcla 40:60 de los dos solventes y au-
menta luego la concentración de metanol a una razón
de 8%/min. Observe que la elución con gradiente acor-
ta de manera notable el tiempo de separación sin sacri-
ficar la resolución de los primeros picos. Note también
que la elución con gradiente produce efectos similares
a los producidos por la programación de temperatura
en cromatografía de gases (véase figura 27.7).
28C.2 Sistemas de bombeo
Entre los requisitos para las bombas en cromatografía
de líquidos está 1) la generación de presiones de hasta
6000 psi (lb/in.2) o 414 bares, 2) salida libre de pulsos,
3) tasas de flujo de 0.1 a 10 mL/min, 4) reproducibilidad
del flujo de 0.5% relativo o mejor y 5) componentes re-
28C Instrumentos para cromatografía de líquidos 819
Fuente
reguladora de helio
Recipientes de
los solventes
Purga
Válvula para entregar los solventes
Al detector
Columna
Transductor
de presión
Bomba
Válvula del inyector
Filtro
de
entrada
Válvula de salida
unidireccional
Válvula de
entrada
unidi-
reccional
Amortiguador
de pulsos
Regulador de
contrapresión
Filtro
Jeringa para cebar
Al
desecho
Válvula de
drenaje
FIGURA 28.3 Diagrama de bloques que muestra los componentes de un aparato característico de CLAR. (Cortesía de
Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT).
Simulación: aprenda más acerca de la 
cromatografía de líquidos.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 819
sistentes a la corrosión a causa de la diversidad de sol-
ventes. Debe subrayarse que las presiones elevadas que
generan las bombas de cromatografía de líquidos no
constituyen un riesgo de explosión, porque los líquidos
no son muy compresibles. Por tanto, la rotura de un
componente del sistema sólo supone una pérdida de
solvente. Lo que sí es evidente es que ésta puede repre-
sentar un riesgo de incendio o de contaminación del
ambiente.
En cromatografía de líquidos se utilizan dos tipos
de bombas, a saber, la del tipo jeringa accionada por
tornillo y la del tipo reciprocante. Este último tipo de
bombas se usa en casi todos los cromatógrafos comer-
ciales modernos.
Bombas reciprocantes
Por lo regular, este tipo de bombas consiste en una pe-
queña cámara en la que el solvente es impulsado por el
movimiento de vaivén de un pistón accionado median-
te un motor (véase figura 28.5). Dosdemuestre que
uopt y Hmin se pueden expresar mediante
e) En las condiciones anteriores, ¿cómo se podría reducir la altura de plato en
un tercio? ¿Qué sucedería con la velocidad óptima en estas condiciones?
¿Qué sucedería con la cantidad de platos teóricos N para una columna de la
misma longitud?
f ) De acuerdo con las condiciones del inciso e), ¿cómo podría conservar la
misma cantidad de platos teóricos mientras reduce la altura de plato en un
tercio?
g) En el análisis anterior se supone que todo el ensanchamiento de banda
sucede dentro de la columna. Mencione dos factores que originen el 
ensanchamiento de banda extracolumna y que podrían contribuir también 
a la anchura total de los picos de la cromatografía de líquidos de alta 
resolución.
uopt �
DM
dp
 and Hmin � dp
Preguntas y problemas 855
y Hmín
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 855
	Principios de análisis instrumental 
	Sección Cinco. Métodos de separación 
	Capítulo Veintiocho. Cromatografía de líquidos 
	28A Campo de aplicación de la cromatografía de líquidos de alta resolución
	28B Eficiencia de la columna en la cromatografía de líquidos
	28C Instrumentos para cromatografía de líquidos
	28D Cromatografía de reparto
	28E Cromatografía de adsorción
	28F Cromatografía iónica
	28G Cromatografía de exclusión por tamaño
	28H Cromatografía por afinidad
	28I Cromatografía en capa fina
	Preguntas y problemasválvulas de globo
unidireccionales, que se abren y cierran de manera al-
ternada, controlan el flujo del solvente hacia dentro y
hacia afuera de un cilindro. El solvente está en contac-
to directo con el pistón. También se puede comunicar
la presión al solvente mediante un diafragma flexible,
el cual a su vez es bombeado hidráulicamente por un
émbolo de vaivén. Las bombas reciprocantes tienen la
desventaja de producir un flujo pulsado que se tiene
que amortiguar porque los pulsos se manifiestan como
ruido en la línea base del cromatograma. Los instru-
mentos modernos de LC están equipados con cabezas
dobles para las bombas o levas elípticas para reducir al
mínimo dichos pulsos. Entre las ventajas de las bom-
bas reciprocantes se pueden citar su pequeño volumen
interno (35 a 400 μL), sus altas presiones de salida
(hasta 10 000 psi), su fácil adaptación a la elución con
gradiente, su gran capacidad de solvente y sus flujos
constantes, que son prácticamente independientes de
la contrapresión de la columna y de la viscosidad del
solvente.
Bombas de desplazamiento
Por lo general, las bombas de desplazamiento consisten
en unas grandes cámaras similares a las de una jeringa,
equipadas con un émbolo que se activa por medio de
un mecanismo de tornillo accionado mediante un mo-
tor de etapas. Estas bombas también producen un flujo
que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la
820 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
0 30252015105
10
9
7
8
9
8
7
2
1
3
4
5
6
10
3
2
1
a)
Identificación de picos
Elución con gradiente
b) Elución isocrática
1. Benceno
2. Monoclorobenceno
3. Ortodiclorobenceno
4. 1,2,3-triclorobenceno
5. 1,3,5-triclorobenceno
6. 1,2,4-triclorobenceno
7. 1,2,3,4-tetraclorobenceno
8. 1,2,4,5-tetraclorobenceno
9. Pentaclorobenceno
10. Hexaclorobenceno4
5
6
Tiempo de retención, min
FIGURA 28.4 Mejora de la eficacia de la separación
mediante la elución con gradiente. Columna: 1 m � 2.1 mm
de diámetro interior, de acero inoxidable con calibre de
precisión; relleno: 1% Permaphase® ODS (C18). Muestra:
5 μL de bencenos clorados en isopropanol. Detector:
fotómetro UV (254 nm). Condiciones: temperatura, 60
C,
presión, 1200 psi. (Tomado de J. J. Kirkland, Modern
Practice of Liquid Chromatography, p. 88, Nueva York:
Interscience, 1971. Reimpreso con autorización de John
Wiley & Sons, Inc.) Motor
Émbolo
Sello
Columna
Solvente
Válvulas
de globo
unidireccional
Amortiguador
de pulsos
FIGURA 28.5 Bomba reciprocante para cromatografía de
líquidos de alta resolución.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 820
28C Instrumentos para cromatografía de líquidos 821
3Para mayor información consulte U. D. Neue, HPLC Columns: Theory,
Technology, and Practice, Nueva York: Wiley-VCH, 1997.
contrapresión. Además, el flujo que resulta está libre
de pulsos. Entre las desventajas están una capacidad de
solvente limitada (�250 mL) y muchas dificultades
cuando éste se tiene que cambiar.
Control de flujo y sistemas de programación
Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos
instrumentos comerciales están equipados con disposi-
tivos controlados por computadora que permiten me-
dir la tasa de flujo mediante la determinación de la
caída de presión a través de un constrictor colocado en
la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la
señal y un valor preestablecido se utiliza para aumen-
tar o disminuir la velocidad del motor de la bomba.
Asimismo, la mayor parte de los instrumentos puede
variar la composición del solvente sea de manera con-
tinua o en forma escalonada. Por ejemplo, el instru-
mento que se ilustra en la figura 28.3 contiene una
válvula de alimentación que permite mezclar hasta cua-
tro solventes en una forma previamente programada y
que varíe continuamente.
28C.3 Sistemas de inyección de muestra
A menudo, el factor limitante en la precisión de las me-
diciones en cromatografía de líquidos es la reproduc-
tibilidad con que se pueden introducir las muestras en
el relleno de la columna. El problema se acentúa por el
ensanchamiento de banda que acompaña al tapón o so-
brecarga de inyección. Por consiguiente, los volúmenes
de muestra que se emplean tienen que ser muy peque-
ños, de unas pocas décimas de microlitro hasta quizá
unos 500 μL. Además, lo apropiado es introducir la
muestra sin despresurizar el sistema.
El medio que más se usa para la introducción de las
muestras en la cromatografía de líquidos se basa en los
rizos de muestreo, como el que se ilustra en las figuras
28.6 y 27.5. Con frecuencia, estos dispositivos forman
parte del equipo cromatográfico y hay rizos intercam-
biables que permiten la elección de tamaños de mues-
tra desde 1 hasta 100 μL o más. Con rizos de este tipo
se puede introducir la muestra a presiones de hasta
7000 psi con una desviación estándar relativa de unas
décimas porcentuales.
La mayor parte de los cromatógrafos actuales se
venden con autoinyectores. Dichas unidades tienen la
capacidad de inyectar muestras en el cromatógrafo de
líquidos a partir de frascos que están en un carrusel o
desde placas microtituladoras. Por lo regular, contienen
rizos de muestreo y una bomba de jeringa para inyec-
tar volúmenes desde menos de 1 μL hasta más de 1 mL.
Algunos poseen medios controlados por temperatura
que facilitan el almacenamiento de la muestra y efec-
tuan reacciones de derivación antes inyectarla. La mayor
parte de los equipos se puede programar para facilitar
las inyecciones automáticas en el sistema de cromato-
grafía de líquidos.
28C.4 Columnas para cromatografía 
de líquidos de alta resolución
Las columnas3 para esta técnica se construyen de ordi-
nario con tubo de acero inoxidable de diámetro in-
terno uniforme. Algunas ocasiones las columnas para
cromatografía de líquidos de alta resolución se fabri-
can con tubos de vidrio de paredes resistentes o con
polímeros como el polieteretercetona. Además, también
hay columnas de acero inoxidable cuyo interior está re-
vestido con vidrio o polieteretercetona. Están disponi-
bles cientos de columnas de diversos precios y rellenos;
el costo de las que no son para un uso especial y cuyas
dimensiones son estándares varía entre 200 y más de
500 dólares. Las columnas para un uso especial, como las
quirales, pueden llegar a costar más de 1000 dólares.
A la columna
Desde la bomba
Salida
Rizo
Posición de inyección
de la muestra
A la columna
Desde la bomba
Salida
Rizo
Carga de la muestra
FIGURA 28.6 Rizo de muestreo para cromatografía de
líquidos. Con la válvula en la posición que se muestra a la
izquierda, la jeringa llena el rizo y la fase móvil pasa de 
la bomba a la columna. Cuando la válvula se coloca en la
posición que se muestra a la derecha, el rizo queda
insertado entre la bomba y la columna, de tal modo que la
fase móvil arrastra la muestra hacia la columna. (Cortesía
de Beckman-Coulter, Inc.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 821
Columnas analíticas
La mayoría de las columnas para cromatografía de lí-
quidos miden de 5 a 25 cm de largo. Invariablemente
se usan columnas rectas. A veces se pueden alargar aco-
plando dos o más de ellas. El diámetro interior de las
columnas analíticas es a menudo de 3 a 5 mm; los ta-
maños de las partículas de los rellenos más comunes
son 3 o 5 μm. Las columnas que más se utilizan miden
de 10 a 15 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro inte-
rior y están rellenas con partículas de 5 μm. Este tipo
de columnas generan de 40 000 a 70 000 platos/metro
(por lo regular, alrededor de 10 000 platos/columna).
En los años ochenta se fabricaron microcolumnas
cuyos diámetros interiores oscilaban entre 1 y 4.6 mm
y sus longitudes iban de 3 a 7.5 cm. Estas columnas,
que se rellenan con partículas de tamaño de 3 a 5 μm
alcanzan hasta 100 000 platos/metro y presentan la ven-
taja de la rapidez y del mínimo consumo de solvente.
La última propiedad es de considerable importancia,
puesto que los solventes de alta pureza que se requie-
ren en cromatografía de líquidos son muy caros y se
desechan después del uso. En la figura 28.7 se ilustrala
rapidez con la que se puede realizar una separación
con una columna de microdiámetro. En este ejemplo
se separan ocho componentes distintos en unos 15 s.
La columna mide 4 cm de largo y su diámetro interior
es de 4 mm; está rellena con partículas de 3 μm.
Precolumnas
Por lo regular, para aumentar la vida de la columna
analítica, se coloca una precolumna que elimina no sólo
la materia en suspensión y los contaminantes de los
solventes, sino también los componentes de la muestra
que se unen de manera irreversible a la fase estaciona-
ria. La composición del relleno de la precolumna de-
bería ser semejante al de la columna analítica, pero el
tamaño de partícula es mayor para minimizar la caída
de presión. Cuando la precolumna ya se contaminó, 
se vacía y se rellena de nuevo o se reemplaza por una
nueva del mismo tipo. Por tanto, se le sacrifica para
proteger a la columna analítica que es más cara.
Control de la temperatura de la columna
En muchas aplicaciones no se necesita un control ri-
guroso de la temperatura, por esa razón las columnas
trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, mu-
chas veces se obtienen mejores cromatogramas, más
reproducibles, cuando la temperatura de la columna se
mantiene constante. La mayoría de los instrumentos
comerciales modernos están equipados con calentado-
res que controlan la temperatura de la columna con
décimas de grado, desde la ambiental hasta 150
C. Para
poder controlar con precisión la temperatura, las co-
lumnas también se pueden colocar en camisas con agua
que provenga de un baño a temperatura constante.
Muchos operadores de cromatógrafos consideran que
el control de la temperatura es esencial para lograr se-
paraciones reproducibles.
28C.5 Tipos de rellenos de la columna
En cromatografía de líquidos se utilizan dos tipos bási-
cos de rellenos, pelicular y de partícula porosa. Las par-
tículas peliculares originales eran cuentas esféricas de
vidrio o de polímero no porosas cuyos diámetros carac-
terísticos eran de 30 a 40 μm. En la superficie de éstas
se depositaba una fina capa porosa de sílice, de alúmina
o de una resina sintética de poliestireno-divinilbence-
no, o bien, una resina de intercambio iónico. Las mi-
cropartículas porosas reemplazaron por completo a las
partículas peliculares. En los años recientes se han rein-
troducido rellenos peliculares de (�5 μm) para sepa-
rar proteínas y biomoléculas grandes.
Los rellenos de partículas porosas característicos
para cromatografía de líquidos están formados por mi-
cropartículas porosas cuyos diámetros varían entre 3 y
10 μm; para un tamaño de partícula dado es deseable
tener una distribución muy estrecha de dimensiones
de partícula. Las partículas son de sílice, alúmina, de
una resina sintética de poliestireno-divinilbenceno o
resinas de intercambio iónico. La sílice es el material
de relleno más común en cromatografía de líquidos; las
partículas se preparan aglutinando partículas de sílice
de dimensiones inferiores al micrómetro en condicio-
nes tales que se forman partículas mayores con diá-
metros muy uniformes. Las partículas que resultan se
recubren muchas veces con películas orgánicas que 
se unen química o físicamente a la superficie. El relle-
822 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
2
1
3
4
5 6 7 8
Tiempo, s
R
es
pu
es
ta
 d
el
 r
eg
is
tr
ad
or
en
 u
ni
da
de
s 
ar
bi
tr
ar
ia
s
151050
FIGURA 28.7 Separación isocrática de alta velocidad.
Dimensiones de la columna: 4 cm de longitud; 0.4 cm de
diámetro interno; relleno: spherisorb de 3 μm fase móvil:
4.1% de acetato de etilo en n-hexano. Compuestos: 
1) p-xileno, 2) anisol, 3) acetato de bencilo, 4) ftalato 
de dioctilo, 5) ftalato de dipentilo, 6) ftalato de dibutilo, 
7) ftalato de dipropilo, 8) ftalato de dietilo. (Tomado de 
R. P. W. Scott, Small Bore Liquid Chromatography
Columns: Their Properties and Uses, Nueva York: Wiley,
1984, p. 156. Reimpreso con autorización de John Wiley
& Sons, Inc.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 822
no de las columnas para modos cromatográficos es-
pecíficos se estudia más adelante en este capítulo.
28C.6 Detectores
No hay detectores para cromatografía de líquidos tan
universalmente aplicables como los detectores de ioni-
zación por llama y de conductividad térmica para cro-
matografía de gases que se describieron en la sección
27B.4. Los detectores de cromatografía de gases fueron
específicamente perfeccionados para medir pequeñas
concentraciones de analitos en flujos de gas. Por otro
lado, los detectores de cromatografía de líquidos han
sido instrumentos analíticos tradicionales adaptados
con celdas de flujo para medir concentraciones bajas
de solutos en flujos de líquidos. El problema principal
en el mejoramiento de la cromatografía de líquidos es
la adaptación y perfeccionamiento de dichos disposi-
tivos.4
Características del detector ideal
El detector ideal para cromatografía de líquidos de-
bería poseer todas las características que se mencio-
nan en la sección 27B.4 respecto a los detectores de
cromatografía de gases, con excepción de que un de-
tector de cromatografía de líquidos no requiere ser
sensible en un intervalo tan grande de temperaturas.
Además, un detector de HPLC debe tener un volu-
men interno mínimo con el fin de reducir el ensancha-
miento de banda (sección 28B.2) y ser compatible con
el flujo de líquidos.
Tipos de detectores
Los detectores para cromatografía de líquidos son de
dos tipos básicos. Los detectores basados en una pro-
piedad de la solución son sensibles a una propiedad de
la fase móvil, como el índice de refracción, la constante
dieléctrica o la densidad, la cual es modulada por la
presencia de solutos. En cambio, los detectores basa-
dos en una propiedad del soluto responden a alguna de
las propiedades de este último, como la absorbancia en
el UV, fluorescencia o corriente de difusión, que no
son inherentes a la fase móvil.
En la tabla 28.1 se mencionan los detectores de uso
más común en cromatografía de líquidos de alta re-
solución y algunas de sus propiedades más importan-
tes. Los detectores más ampliamente usados se apoyan
en la absorción de radiación UV o visible (véase la fi-
gura 28.8). Los detectores de fluorescencia, índice de
refracción y electroquímicos también son muy utiliza-
dos. Los detectores de espectrometría de masas tienen
gran aceptación en la actualidad. Sistemas como los de
cromatografía de líquidos-espectrometría de masas
representan una gran ayuda para identificar los anali-
tos que salen de una columna HPLC como se estudia
más adelante en esta sección.
Detectores de absorción UV-visible
La figura 28.8 muestra el esquema de una celda de flujo
en forma de Z para las mediciones de absorción de los
efluentes de una columna cromatográfica. A fin de mi-
nimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el
volumen de dichas celdas tiene que ser el menor posi-
ble. Los volúmenes de la celda representativa son de 
1 a 10 μL y las longitudes de trayectoria de la celda son
de 2 a 10 mm.
28C Instrumentos para cromatografía de líquidos 823
4Para un análisis más detallado véase R. P. W. Scott, Chromatographic De-
tectors, Nueva York: Dekker, 1996; R. P. W. Scott, Liquid Chromatography
Detectors, 2a. ed., Amsterdam: Elsevier, 1986.
TABLA 28.1 Características de los detectores en cromatografía de líquidos de alta resolución.
Límites de detección 
Detector HPLC Disponible comercialmente de masa* característicos Intervalo lineal† (décadas)
Absorbancia Sí 10 pg 3-4
Fluorescencia Sí 10 fg 5
Electroquímica Sí 100 pg 4-5
Índice de refracción Sí 1 ng 3
Conductividad Sí 100 pg–1 ng 5
Espectrometría de masas Sí �1 pg 5
IR de transformada de Fourier Sí 1 μg 3
Dispersión de la luz Sí 1 μg 5
Actividad óptica No 1 ng 4
Selectivo a elementos No 1 ng 4-5
Fotoionización No �1 pg 4
Fuentes: publicaciones de los fabricantes; Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, F. Settle, ed., Upper Saddle River, 
NJ: Prentice-Hall, 1997; E. S. Yeung y R. E. Synovec, Anal. Chem., 1986, 58, p. 1237A.
*Los límitesde detección de masa dependen del compuesto, el instrumento y las condiciones de HPLC, pero los proporcionados son valores 
representativos en sistemas comerciales cuando los hay disponibles.
†Valores representativos a partir de las fuentes mencionadas.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 823
Muchos detectores de absorción son dispositivos de
doble haz, en los que uno de ellos atraviesa la celda del
eluyente y el otro es de referencia. Para comparar las
intensidades de los dos haces se utilizan detectores fo-
toeléctricos contrastados. También se puede usar un
sistema de corte de haz semejante al que se muestra en
la figura 9.13b (véase también la figura 13.13b) en com-
binación con un solo fototransductor. En cualquier
caso, el cromatograma consiste en una gráfica de la ab-
sorbancia (logaritmo del cociente de las dos señales
transducidas) en función del tiempo. También se utili-
zan instrumentos de un solo haz. En este caso las me-
diciones de intensidad del solvente se almacenan en la
memoria de una computadora y al final se recuperan
para calcular la absorbancia.
Detectores de absorción ultravioleta con filtros. Los
primeros detectores de absorción fueron los fotóme-
tros de filtro con una lámpara de mercurio como fuente.
Lo más común era aislar la línea intensa a 254 nm por
medio de filtros; en algunos equipos también se podían
utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm con otros fil-
tros. Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza
sólo para aquellos solutos que absorben alguna de estas
longitudes de onda. Como se señala en la sección 14B,
varios grupos funcionales orgánicos y diversas especies
inorgánicas exhiben bandas de absorción anchas a una
o más de esas longitudes de onda del ultravioleta.
Las fuentes de deuterio o de filamento de tungste-
no con filtros de interferencia también proporcionan
una forma sencilla de detectar las especies absorben-
tes que salen de una columna. Algunos instrumentos
estaban equipados con dispositivos duales de longitud
de onda o con discos que contenían varios filtros que
se podían intercambiar con rapidez a fin de detectar
distintas especies a medida que salían. En la actuali-
dad, los instrumentos con filtros han sido reemplaza-
dos por completo por espectrómetros de barrido y de
arreglos de diodos.
Detectores de absorción con capacidad de barrido. La
mayoría de los fabricantes de instrumentos para croma-
tografía de líquidos de alta resolución ofrecen detecto-
res que consisten en un espectrofotómetro de barrido
con una red entre sus componentes ópticos. Algunos
se limitan a la radiación ultravioleta y otros abarcan la
radiación ultravioleta y la visible. Se pueden elegir va-
rios modos de operación. Por ejemplo, se puede obte-
ner el cromatograma completo a una sola longitud de
onda o también, cuando los picos del eluyente están
suficientemente separados en el tiempo, se puede ele-
gir distinta longitud de onda para cada pico. En este
caso debe emplearse el control por computadora para
seleccionar la mejor longitud de onda para cada elu-
yente. Cuando se desean los espectros completos con
fines de identificación, se puede detener el flujo del elu-
yente durante un tiempo suficiente que permita el ba-
rrido de longitudes de onda de la región de interés.
Los detectores espectrofotométricos de ultravioleta
más potentes son los instrumentos de arreglos de dio-
dos, como se señala en la sección 7E.3 y en la figura
13.25.5 Varios fabricantes ofrecen este tipo de instru-
mentos, los cuales permiten recoger los datos de un 
espectro completo en aproximadamente un segundo.
Por consiguiente, los datos espectrales de cada pico cro-
matográfico se pueden recoger y almacenar a medida
que aparecen al final de la columna. Una de las formas
de presentación de los datos espectrales, que resulta
útil para la identificación de las especies y para elegir
las condiciones de la determinación cuantitativa, con-
siste en un gráfico tridimensional tal como el que se
muestra en la figura 28.9. En este caso los espectros 
se obtuvieron a intervalos sucesivos de cinco segundos.
Es evidente la aparición y desaparición de cada uno de
los tres esteroides en el eluyente.
Detectores de absorción en el infrarrojo. Se ofrecen
comercialmente dos tipos de detectores en el infrarro-
jo. El primero es un instrumento con filtro similar en
cuanto a diseño al que se muestra en la figura 16.13. El
segundo, mucho más complejo, es un tipo que se basa
en los instrumentos de transformada de Fourier y es
similar a los descritos en la sección 16B.1. Varios fabri-
cantes de instrumentos IR con transformada de Fourier
ofrecen accesorios que permiten usarlos como detec-
tores en HPLC. Las celdas de los detectores del in-
frarrojo son semejantes a las de radiación ultravioleta,
excepto que las ventanas se construyen con cloruro de
sodio o fluoruro de calcio. Las longitudes de la trayec-
toria de la celda oscilan de 0.2 a 1.0 mm y los volúme-
nes de 1.5 a 10 μL.
824 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
5Véase R. P. W. Scott, Chromatographic Detectors, Nueva York: Dekker,
1996; Diode Array Detection in HPLC, L. Huber y S. A. George, eds.,
Nueva York: Dekker, 1993.
Ventanas
de cuarzo
Desde la columna
DetectorFuente UV
Al desecho
FIGURA 28.8 Celda de absorción de radiación UV-visible
para cromatografía de líquidos de alta resolución.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 824
La principal limitación del uso de los detectores de
infrarrojo radica en la baja transparencia de muchos
de los solventes que se utilizan. Por ejemplo, las anchas
bandas de absorción del infrarrojo del agua y de los al-
coholes impiden prácticamente el uso de este detector
en muchas aplicaciones. Asimismo, el uso de fases mó-
viles acuosas ocasiona un deterioro rápido de los ma-
teriales de la celda a menos que se utilicen ventanas 
especiales. Los deficientes límites de detección de mu-
chos solutos han limitado el uso de los detectores IR.
La introducción de los detectores espectrométricos de
masas para cromatografía de líquidos, que se tratan más
adelante, ha ocasionado una declinación espectacular
en las aplicaciones de la detección IR.
Detectores de fluorescencia
Los detectores de fluorescencia para HPLC son seme-
jantes en diseño a los fluorómetros y espectrofluo-
rómetros descritos en la sección 15B.2. En la mayoría
de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un
transductor fotoeléctrico colocado a 90
 respecto al haz
de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una
fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros
para aislar una banda de la radiación emitida. Los ins-
trumentos más complejos consisten en una fuente de
xenón y emplean un monocromador de red para aislar
la radiación fluorescente. La fluorescencia inducida por
rayo láser también se utiliza debido a su sensibilidad y
selectividad.
Como se subrayó en el capítulo 15, una ventaja inhe-
rente de los métodos de fluorescencia es su alta sensi-
bilidad, que resulta ser mayor por más de un orden de
magnitud que la de la mayoría de los procedimientos
de absorción. En cromatografía de líquidos se ha apro-
vechado esta ventaja para la separación y determina-
ción de los componentes fluorescentes de las muestras.
Tal como se analiza en la sección 15C.2, los compuestos
fluorescentes suelen estar relacionados con el análisis de
materiales de interés farmacéutico, productos natura-
les, muestras clínicas y productos del petróleo. Muchas
veces, la cantidad de especies fluorescentes aumenta si
se tratan antes las muestras con reactivos que originan
derivados fluorescentes. Por ejemplo, el cloruro de dan-
silo (cloruro de 5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonilo),
que reacciona con las aminas primarias y secundarias,
aminoácidos y fenoles para dar compuestos fluorescen-
tes, se utiliza ampliamente para detectar aminoácidos
en hidrolizados de proteínas.
Detectores de índice de refracción
En la figura 28.10 se muestra el esquema de un detec-
tor diferencial de índice de refracción, en el que el sol-
vente, en su camino haciala columna, pasa a través de
una mitad de la celda y el eluyente de la columna pasa
por la otra mitad. Los dos compartimentos están sepa-
rados por una placa de vidrio montada a un ángulo tal
que se produce una desviación del haz incidente si las
dos soluciones tienen distintos índices de refracción.
El desplazamiento resultante del haz respecto a la su-
perficie fotosensible de un detector causa una varia-
ción en la señal de salida, la cual, una vez amplificada
y registrada, proporciona el cromatograma.
La ventaja de los detectores de índice de refracción
es que responden a casi todos los solutos. Es decir, 
son detectores universales análogos a los detectores de
llama o de conductividad térmica en cromatografía 
de gases. Además, son confiables y no dependen de la
tasa de flujo. Sin embargo, son muy sensibles a los
28C Instrumentos para cromatografía de líquidos 825
0.004
220 230 240 250 260 270
Longitud de onda, nm
A
bs
or
ba
nc
ia
Corticosterona
Dexametasona
Cortisona
Tiempo, in
crementos de 5 s
280 290 300 310 320
0.046
0.096
0.146
FIGURA 28.9 Espectros de absorción del eluyente de una mezcla de tres esteroides tomados
a intervalos de cinco segundos. (Cortesía de Hewlett-Packard Co., Palo Alto, CA.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 825
cambios de temperatura y tienen que estar a tempera-
tura constante hasta unas pocas milésimas de grado
centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como
la mayoría de los otros detectores y son incompatibles
con los métodos de elución con gradiente. Este tipo de
detector se usa para determinar algunos analitos como
los azúcares.
Detector de la dispersión de la luz tras evaporación
Se trata de uno de los tipos más recientes de detectores
para HPLC. En este detector, el efluente de la colum-
na pasa a un nebulizador donde se transforma en una
fina niebla mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las
finas gotitas se conducen por un tubo a temperatura
controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase
móvil, lo que origina unas finas partículas de ana-lito.
La nube de partículas de analito pasa a través de un
haz láser. La radiación dispersada se detecta en direc-
ción perpendicular al flujo mediante un fotodiodo de
silicio.
Una de las principales ventajas de este tipos de de-
tector es que su respuesta es casi igual para todos los
solutos no volátiles. Además, es notablemente más sen-
sible que el detector de índice de refracción, ya que se
han establecido límites de detección de 0.2 ng/μL. La
desventaja es que las composiciones de la fase móvil
están limitadas sólo a componentes volátiles.
Detectores electroquímicos
En la actualidad los fabricantes de instrumentos ofre-
cen detectores electroquímicos de varios tipos.6 Estos
dispositivos se basan en la amperometría, la voltame-
tría, la coulombimetría y la conductimetría. Los tres
primeros métodos se estudian en los capítulos 24 y 25.
Aunque los procedimientos electroanalíticos no se
han explotado todavía tanto como los detectores ópti-
cos, en muchos casos parecen ofrecer las ventajas de
una elevada sensibilidad, sencillez, conveniencia y una
extensa aplicabilidad. Esta última propiedad se ilustra
en la figura 28.11, en la que se muestran los intervalos
de potencial en los que puede tener lugar la oxidación
o reducción de 16 grupos funcionales orgánicos. En
principio, las especies que contienen alguno de esos
grupos podrían detectarse mediante procedimientos am-
perométricos, voltamétricos o coulombimétricos. Sin
embargo, la principal limitación de los detectores elec-
troquímicos es que no son compatibles con la elución
con gradiente.
En las publicaciones especializadas se ha descrito
una gran variedad de celdas para la detección electro-
química en HPLC y varias ya están comercializadas.
En la figura 28.12 se ilustra un ejemplo de una celda de
flujo del tipo de capa fina para la detección amperomé-
trica (véase también la figura 25.17). En este caso, la
superficie del electrodo forma parte de la pared de un
canal formado al insertar una junta de Teflón de 50 μm
entre dos bloques moldeados de plástico de Kel-F. El
electrodo indicador es de platino, oro, carbón vítreo o
pasta de carbono. El electrodo de referencia y, a menu-
do, el contraelectrodo se colocan corriente abajo del
bloque en el que se encuentra el electrodo indicador.
El volumen de la celda es de 1 a 5 μL. Una modifica-
ción útil de esta celda, disponible ya comercialmente,
contiene dos electrodos de trabajo que pueden operar
en serie o en paralelo.7 La primera configuración, en la
que el eluyente fluye primero por un electrodo y lue-
go por el segundo, requiere que el analito experimente
una oxidación (o una reducción) reversible en el elec-
trodo que está corriente arriba. A continuación, el se-
gundo electrodo actúa como cátodo (o como ánodo)
para determinar el producto de la oxidación (o de la
reducción). Esta configuración aumenta la selectividad
del sistema de detección. Una aplicación interesante de
este sistema es la detección y determinación de los com-
ponentes en mezclas que contienen tanto tioles como
disulfuros. En este caso, el electrodo de mercurio co-
826 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
6Descripciones breves de detectores que se consiguen en el comercio se
encuentran en B. E. Erickson, Anal. Chem., 2000, 72, p. 353A; M. Warner,
Anal. Chem., 1994, 66, p. 601A.
7D. A. Roston, R. E. Shoup y P. T. Kissinger, Anal. Chem., 1982, 54, 
p. 1417A.
Fuente
de luz
Transductor
Espejo
Referencia
Muestra
Lente
Cero
óptico
Registro
Ajuste
del cero
Mascarilla
Amplificador y fuente
de alimentación
FIGURA 28.10 Esquema de un detector diferencial de índice de refracción. (Cortesía de
Waters Associates, Inc., Milford, MA.)
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 826
rriente arriba reduce los disulfuros a aproximadamen-
te �1.0 V. Es decir,
RSSR � 2H� � 2e� S 2RSH
Entonces, un electrodo de mercurio corriente abajo es
oxidado en presencia de los tioles que proceden de la
muestra original y también por aquellos que se han
formado en el electrodo corriente arriba. Es decir,
2RSH � Hg(l) S Hg(SR)2(s) � 2H� � 2e�
En la configuración en paralelo, los dos electrodos
están situados de tal modo que el eje entre ellos es de
90 grados respecto al flujo. Por consiguiente, los dos
pueden funcionar a potenciales distintos (en relación
con el electrodo de referencia corriente abajo), lo que
muchas veces da un indicio de la pureza del pico. Tam-
bién, un electrodo puede actuar como cátodo y el otro
como ánodo, lo que hace posible la detección simul-
tánea tanto de oxidantes como de reductores.
Los detectores voltamétricos, conductimétricos y
coulombimétricos ya se comercializan. Los detecto-
res conductimétricos se tratan en la sección 28F.3.
Detectores espectrométricos de masas
La combinación de la cromatografía de líquidos con la
espectrometría de masas parecería ser una fusión ideal
de separación y detección.8 Como en la cromatografía de
gases, un espectrómetro de masas puede ser de gran
ayuda en la identificación de especies a medida que
salen de la columna cromatográfica. Sin embargo, exis-
ten problemas mayores en el acoplamiento de las dos
técnicas. En el caso de la espectrometría de masas se
requiere una muestra en fase gaseosa, y la salida de la
columna de cromatografía de líquidos es un soluto di-
suelto en un solvente. Como primer paso, el solvente
se tiene que convertir en vapor. Cuando está vaporiza-
do, el solvente de cromatografía de líquidos produce un
volumen de gas que es de 10 a 1000 veces mayor que el
gas portador en cromatografía de gases. Por consiguien-
te, la mayor parte del solvente se tiene que eliminar.
Se han desarrollado varios dispositivos para resol-
ver los problemas del retiro del solvente y de la inter-
ferencia de la columna de cromatografía de líquidos. En
la actualidad, los procedimientos más comunes se apo-
yan en la técnica de ionización a presión atmosférica.
En la figura 28.13 se ilustra un diagrama de bloques de
un sistema típico de cromatografía de líquidos-espectro-metría de masas. El sistema de cromatografía de líqui-
dos de alta resolución es a menudo un sistema capilar
a nanoescala con tasas de flujo del orden de μL/min.
Por otro lado, algunas interfases permiten tasas de flu-
28C Instrumentos para la cromatografía de líquidos 827
8M. C. McMaster, LC/MS: A Practical User’s Guide, Hoboken, NJ: Wiley,
2005; W. M. A. Niessen, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, 2a.
ed., Nueva York: Dekker, 1999.
Oxidaciones Reducciones
Olefinas
Ésteres
Cetonas
Aldehídos
Ésteres conjugados
Éteres
Diazoderivados
Nitroderivados
Halógenos
+2.0 +1.0 0
E contra ECS, V
–1.0 –2.0
Hidrocarburos
Acinas
Amidas
Aminas
Fenoles
Hidroxilos aromáticos
Quinolinas
FIGURA 28.11 Detección amperométrica potencial de grupos funcionales orgánicos. Las
líneas horizontales indican el intervalo de los potenciales de oxidación o de reducción para el
caso de compuestos electroactivos que contienen los grupos funcionales señalados.
Bloques
moldeados
de Kel-F
Al electrodo de referencia
y al contraelectrodo Desde la columna
Separador de teflón
1 cm
Electrodo de trabajo
FIGURA 28.12 Celda del detector amperométrico de
capa fina en HPLC.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 827
10Para informarse sobre los mecanismos de retención en cromatografía de
fase unida químicamente, véase J. G. Dorsey y W. T. Cooper, Anal. Chem.,
1994, 66, p. 857A.
jo de hasta 1 a 2 mL/min, lo cual es característico de las
condiciones ordinarias de la cromatografía de líquidos
de alta resolución. Las fuentes de ionización más co-
munes son la ionización por electroaspersión y la ioni-
zación química a presión atmosférica (véase sección
20B). La combinación de cromatografía de líquidos de
alta resolución y la espectrometría de masas ocasiona
una alta selectividad porque los picos no resueltos se
pueden aislar al supervisar sólo una masa selecciona-
da. La técnica de LC-MS tiene la capacidad de pro-
porcionar huellas dactilares de un producto particular
sometido a elución en lugar de confiar en el tiempo de
retención como sucede en la HPLC ordinaria. La com-
binación también proporciona masa molecular, infor-
mación estructural y análisis cuantitativo exacto.9
En el caso de algunas mezclas complejas, la combi-
nación de cromatografía de líquidos y espectrometría
de masas no proporciona resolución suficiente. En años
recientes se volvió posible acoplar dos o más analiza-
dores de masas para formar espectrómetros de masas
en tándem (véase sección 20C.5). Cuando se combinan
con cromatografía de líquidos, los sistemas de espec-
trometría de masas en tándem reciben el nombre de
instrumento de cromatografía de líquidos-espectrome-
tría de masas-espectrometría de masas. Por lo general,
los espectrómetros de masas en tándem son sistemas
cuadrupolares triples o espectrómetros cuadrupolares
de trampa de iones. Con el fin de lograr una resolución
superior a la que se consigue con un cuadrupolo, el ana-
lizador de masas final, en un sistema de espectrometría
de masas en tándem, puede ser un espectrómetro de
masas de tiempo de vuelo. Los espectrómetros de ma-
sas de sectores también se pueden combinar para obte-
ner sistemas en tándem. Los espectrómetros de masas
de resonancia iónica de ciclotrón y de trampa de iones
pueden trabajar de tal manera que proporcionen no
sólo dos etapas de análisis de masa, sino n etapas. Di-
chos sistemas de MSn (véase sección 20C.5) proporcio-
nan de manera sucesiva las etapas de análisis dentro de
un analizador de masas sencillo. Éstos se han combi-
nado con sistemas de cromatografía de líquidos en ins-
trumentos de LC-MSn.
Los sistemas de LC-MS ya son invariablemente
computarizados. Mediante estos instrumentos se pue-
den obtener tanto cromatogramas de tiempo real como
los reconstruidos mediante computadora y los espec-
tros de los picos eluidos.
28D CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
El tipo de cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC) más ampliamente utilizado es la cromatogra-
fía de reparto, en la cual la fase estacionaria es un se-
gundo líquido que es inmiscible con la fase líquida
móvil. En el pasado, la mayoría de las aplicaciones se
refería a compuestos polares, no iónicos, de baja a
moderada masa molecular (por lo regular �3000). Sin
embargo, recientemente se han desarrollado algunos
métodos (derivación y formación de pares iónicos) que
han ampliado las separaciones de reparto a los com-
puestos iónicos.
Al principio, en la cromatografía de reparto se uti-
lizaban columnas del tipo líquido-líquido. En la actua-
lidad éstas han sido reemplazadas por columnas de fase
líquida unida en los sistemas de cromatografía de líqui-
dos modernos. En la cromatografía líquido-líquido, és-
tos se mantienen en su lugar mediante adsorción física.
Por otro lado, en la cromatografía de fase unida, están
ligados por medio de un enlace iónico, lo que da por
resultado rellenos muy estables e insolubles en la fase
móvil. Asimismo, las columnas de fase unida son com-
patibles con las técnicas de elución con gradiente. Por
tanto, el enfoque se centrará exclusivamente en la cro-
matografía de reparto con fases unidas por medios quí-
micos.10
28D.1 Columnas para cromatografía 
de fase unida químicamente
En cromatografía de reparto, los soportes para casi 
todos los rellenos de fases unidas químicamente se
preparan con sílice rígida o composiciones constituidas
básicamente por sílice. Estos sólidos están formados
por partículas mecánicamente resistentes, porosas y
uniformes, con diámetros de 1.5 a 10 μm, pero las par-
tículas de 3 a 5 μm son las más comunes. La superficie
de la sílice totalmente hidrolizada (hidrolizada por ca-
lentamiento con HCl 0.1 M durante uno o dos días)
828 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
9Para una revisión de los sistemas comerciales de LC-MS consulte B. E.
Erickson, Anal. Chem., 2000, 72, p. 711A.
Fuente
de iones
Sistema
HPLC
Analizador
de masas
Sistema de vacío
Detector
de iones
Sistema
de datos
FIGURA 28.13 Diagrama de bloques de un sistema 
LC-MS. El efluente de la columna de cromatografía 
de líquidos se introduce en una fuente de ionización 
a presión atmosférica, como un electroaspersor o una
fuente de ionización química. Los iones producidos se
clasifican mediante el analizador de masas y son
detectados por el detector de iones.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 828
está constituida por grupos silanol químicamente reac-
tivos. Es decir,
Las superficies características de sílice contienen cerca
de 8 μmol/m2 de grupos OH y sus áreas superficiales
son de 100 a 300 m2/g.
Los revestimientos de fase unida químicamente más
utilizados son los siloxanos que se forman por reacción
de la superficie hidrolizada con un organoclorosilano.
Por ejemplo,
donde R es un grupo alquilo o un grupo alquilo susti-
tuido.
El revestimiento de la superficie por silanización se
limita a 4 μmol/m2 o menos a causa de los efectos esté-
ricos. Por desgracia, los grupos SiOH que no han reac-
cionado proporcionan una polaridad indeseable a la
superficie, lo que origina picos cromatográficos con cola
en especial con solutos básicos. Para reducir este efec-
to, los rellenos de siloxano muchas veces se desactivan
por un proceso de bloqueo mediante reacción con clo-
rotrimetilsilano, el cual, debido a su pequeño tamaño,
puede unirse químicamente a muchos de los grupos
silanol que no habían reaccionado.
Si OH + Cl Si
CH3
CH3
R Si O Si
CH3
CH3
R
OH
Si
O
OH
Si
O
OH
Si
O
OH
Si
Rellenos de fase normal y de fase inversa
Con base en las polaridades relativas de las fases móvil
y estacionaria, se distinguen dos tipos de cromatogra-
fía de reparto. En un principio, la cromatografía de
líquidos utilizaba fases estacionarias de elevada polari-
dad, como el agua o el trietilenglicol; como fase móvil
se empleaba un solvente relativamente no polar, como
el hexano o el isopropiléter. Ahora a este tipo de croma-
tografía se le conoce como cromatografía en fase normal.
En la cromatografía en fase inversa, la fase estacionaria
es no polar, con frecuenciaun hidrocarburo, y la fase
móvil es un solvente relativamente polar, como agua,
metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano.11
En la cromatografía en fase normal, el componente
menos polar se eluye primero; al aumentar la polaridad
de la fase móvil ocasiona una disminución del tiem-
po de elución. En cambio, con la cromatografía de fase
inversa, los componentes más polares aparecen pri-
mero y un aumento de la polaridad de la fase móvil in-
crementa el tiempo de elución. Estas correlaciones se
ilustran en la figura 28.14. Como se puede ver en la figu-
ra 28.1, la cromatografía de reparto de fase normal y la
cromatografía de adsorción se traslapan en forma con-
siderable. En efecto, la retención en la mayoría de los
tipos de cromatografía en fase normal parece estar regi-
da por procesos de desplazamiento de la adsorción.12
Los rellenos de fase unida químicamente se llaman
de fase inversa cuando el revestimiento enlazado tiene
un carácter no polar, y de fase normal cuando el revesti-
miento contiene grupos funcionales polares. Se calcula
que tal vez más de las tres cuartas partes de todas las
separaciones mediante cromatografía de líquidos de
28D Cromatografía de reparto 829
11Más análisis de la CLAR en fase inversa en L. R. Snyder, J. J. Kirkland,
y J. L. Glajch, Practical HPLC Method Development, 2a. ed., Nueva York:
Wiley, 1997; A. M. Krstulovic y P. R. Brown, Reversed-Phase High Perfor-
mance Liquid Chromatography, Nueva York: Wiley, 1982.
12J. G. Dorsey et al., Anal. Chem., 1994, 66, p. 500R.
C
C B A A B C
B
Tiempo Tiempo
Fase móvil de polaridad media Fase móvil de polaridad media
Fase móvil de baja polaridad Fase móvil de polaridad elevada
Cromatografía en fase normal Cromatografía en fase inversa
a) b)
TiempoTiempo
Polaridades de los solutos: A > B > C
A A B C
FIGURA 28.14 Relación entre la polaridad 
y los tiempos de elución en cromatografía 
en fase normal y en fase inversa.
Clase interactiva: aprenda más acerca de 
cromatografía de reparto.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 829
14Para mayor información consulte L. R. Snyder, J. J. Kirkland y J. L. Glajch,
Practical HPLC Method Development, 2a. ed., Nueva York: Wiley, 1997.
alta resolución se llevan a cabo en la actualidad en co-
lumnas con rellenos de fase inversa. La principal ven-
taja de las separaciones en fase inversa es que el agua
se puede utilizar como fase móvil. El agua es barata,
no tóxica, es un solvente transparente a la radiación
UV y compatible con los solutos biológicos. Asimismo,
la transferencia de masas es rápida con fases estacio-
narias no polares, como el equilibrio de solvente des-
pués de la elución con gradiente. Lo más común es que
el grupo R del siloxano en estos revestimientos sea una
cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (n-octildecilo).
Hasta el momento no se conoce por completo el me-
canismo por el cual estas superficies retienen molécu-
las de soluto. Al parecer, el mecanismo de retención es
bastante complejo y muy diferente del reparto de la
mayor parte de la fase porque la fase estacionaria no
polar está anclada a un extremo.13 Sin considerar con
detalle el mecanismo de retención, un revestimiento en-
lazado se puede tratar como si fuera un líquido ordi-
nario retenido físicamente.
En la figura 28.15 se ilustra el efecto de la longitud
de la cadena del grupo alquilo sobre la eficacia. Como
era de esperar, las cadenas más largas originan rellenos
que muestran una mayor retención. Además, una ma-
yor longitud de la cadena permite una mayor cantidad
de muestra. Por ejemplo, el tamaño máximo de mues-
tra para un relleno de C18 es casi el doble que para uno
de C4 en condiciones similares.
En la mayoría de las aplicaciones de la cromatogra-
fía en fase inversa la elución se lleva a cabo con una fase
móvil de elevada polaridad, por ejemplo, una solución
acuosa que contiene concentraciones diversas de sol-
ventes como metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano.
De este modo, se debe poner especial cuidado en evi-
tar valores de pH mayores de, aproximadamente, 7.5
porque la sílice tiene la capacidad de formar especies
de silicato solubles, lo que ocasiona disolución de la
fase estacionaria. Asimismo, en soluciones alcalinas se
podría presentar la hidrólisis del siloxano, lo cual oca-
sionaría la degradación o destrucción del relleno. La
hidrólisis ácida del siloxano puede limitar el pH a casi
2.5 en las soluciones ácidas.
En el caso de rellenos comerciales de fase normal
unida químicamente, R en la estructura del siloxano es
un grupo funcional polar, como es el caso de los grupos
ciano: ¬C2H4CN; diol, ¬C3H6OCH2CHOHCH2OH;
amino, ¬C3H6NH2; y los dimetilamino, C3H6N(CH3)2.
Las polaridades de estos materiales de relleno varían
en un gran intervalo, siendo el tipo ciano el menos po-
lar y el tipo amino el más polar. Los rellenos de diol
son de una polaridad intermedia. Con los rellenos de
fase normal, la elución se realiza con solventes relati-
vamente no polares, como el etiléter, el cloroformo y
el n-hexano.
28D.2 Establecimiento del método 
en cromatografía de reparto
En la cromatografía de líquidos el establecimiento del
método tiende a ser más complejo que en cromatogra-
fía de gases, debido a que cuando la fase móvil es líqui-
da, los componentes de la muestra interaccionan con
la fase estacionaria y la móvil.14 Por el contrario, en la
830 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
13L. A. Cole y J. G. Dorsey, Anal. Chem., 1992, 64, p. 1317; L. A. Cole,
J. G. Dorsey y K. A. Dill, Anal. Chem., 1992, 64, p. 1324.
Tiempo, min
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
1
2
3
4 5
6
Octadecilo
86420
1 2 3
4 5
6
Metilo
Tiempo, min Tiempo, min
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Octilo
Identificación de pico
1. Uracilo
2. Fenol
3. Acetofenona
4. Nitrobenceno
5. Benzoato de metilo
6. Tolueno
1
2 3
4
5 6
FIGURA 28.15 Efecto de la longitud de la cadena en el desempeño de las columnas de siloxano en fase
inversa rellenas con partículas de 5 μm. Fase móvil: 50:50 metanol-agua. Tasa de flujo: 1.0 mL /min.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 830
cromatografía de gases la fase móvil simplemente lleva
los componentes de la muestra a través de la fase esta-
cionaria y no contribuye al proceso de separación. Es
decir, en cromatografía de gases que la fase móvil sea
helio, nitrógeno o hidrógeno no afecta de manera im-
portante la separación. En cambio, los resultados sa-
tisfactorios de una separación en cromatografía de
reparto dependen en forma determinante de que la fase
móvil sea acetonitrilo, hexano o dioxano, por ejemplo.
Selección de la columna en las separaciones 
por cromatografía de reparto
Una cromatografía exitosa con fases móviles interacti-
vas requiere un equilibrio adecuado entre las fuerzas
intermoleculares existentes entre los tres participantes
activos en el proceso de separación, a saber, el soluto,
la fase móvil y la fase estacionaria. Estas fuerzas inter-
moleculares se describen cualitativamente en términos
de polaridad relativa de cada uno de los tres reactivos.
Las polaridades de varios grupos funcionales del anali-
to se incrementan en el orden siguiente: hidrocarburos
� éteres � ésteres � cetonas � aldehídos � amidas �
aminas � alcoholes. El agua es más polar que cualquier
compuesto que contenga alguno de los anteriores gru-
pos funcionales.
Con frecuencia, al elegir una columna para una se-
paración por cromatografía de reparto, la polaridad de
la fase estacionaria apenas si se parece a la de los ana-
litos y para la elución se utiliza entonces una fase móvil
con una polaridad considerablemente distinta. Por lo
general, este procedimiento proporciona resultados
más satisfactorios que uno en el que las polaridades
del soluto y de la fase móvil se corresponden, pero di-
fieren mucho respecto a la fase estacionaria. En este
caso, a menudo la fase estacionaria no puede competir
de forma efectiva por los componentes de la muestra y
los tiempos de retención se vuelven demasiado cortos
para las aplicaciones prácticas. En el otro extremo, por
supuesto, se encuentra el casoen que las polaridades
del soluto y de la fase estacionaria sean demasiado
parecidas y totalmente distintas de las de la fase móvil.
En estas circunstancias, los tiempos de retención se ha-
cen excesivamente largos.
En resumen, si se desea obtener buenas separacio-
nes con cromatografía de reparto en un tiempo razona-
ble, entonces las polaridades del soluto, la fase móvil y
la fase estacionaria se deben combinar con todo cuida-
do. Por desgracia, las teorías que relacionan las inte-
racciones de la fase móvil y la fase estacionaria con una
serie determinada de componentes de una muestra son
todavía imperfectas y, en el mejor de los casos, el usua-
rio sólo puede elegir la fase estacionaria de una mane-
ra general. Una vez que se hace la elección, es necesa-
rio realizar una serie de experimentos de ensayo y error,
en los cuales se obtienen cromatogramas con varias
fases móviles hasta que se consigue una separación sa-
tisfactoria. No obstante, el alto grado de correlación
entre la composición de la fase móvil y los factores de
retención facilitan predecir los tiempos de retención
aproximados a partir de sólo unos experimentos de en-
sayo y error. Si la resolución de todos los componentes
de la mezcla resulta imposible, se tiene que elegir otro
tipo de columna.
Selección de la fase móvil en la cromatografía 
de reparto
En la sección 26D.4 se describen tres métodos para
mejorar la resolución de una columna cromatográfica;
cada uno de ellos se basa en la variación de uno de tres
parámetros (N, k y a) que relaciona la ecuación
26.26.15 En cromatografía de líquidos, el factor de re-
tención k es el que se puede manipular experimen-
talmente con más facilidad debido a que depende en
gran medida de la composición de la fase móvil. Tal
como se subrayó antes, para un funcionamiento óp-
timo, k debería estar en el intervalo ideal comprendido
entre 2 y 10; sin embargo, para mezclas complejas este
intervalo se tiene que ampliar tal vez de 0.5 a 20 para
que todos los picos de los componentes tengan tiempo
de aparecer.
En algunas ocasiones, el ajuste sólo de k es insufi-
ciente para obtener picos individuales sin superpo-
sición. En este caso, hay que recurrir a la variación del
factor de selectividad a. Una vez más, la forma más
simple de producir variaciones en a es modificando la
composición de la fase móvil, pero procurando man-
tener k dentro de un intervalo razonable. Asimismo, 
a se puede cambiar eligiendo un relleno de columna
distinto.
Influencia de la fuerza del solvente en los factores de
retención. A menudo a los solventes que interaccionan
fuertemente con los solutos se les denomina “fuertes”.
Los solventes fuertes son con frecuencia, pero no siem-
pre, polares. La fuerza del solvente depende de la na-
turaleza del analito y de la fase estacionaria. Se han
creado varios índices para describir de manera cuanti-
tativa la polaridad de los solventes. El más útil para la
cromatografía de reparto es el índice de polaridad P�,
desarrollado por Snyder.16 Este parámetro se basa en
mediciones de la solubilidad para la sustancia en cues-
28D Cromatografía de reparto 831
15Si desea mayor información acerca de las fases móvil y estacionaria con-
sulte L. R. Snyder, J. J. Kirkland y J. L. Glajch, Practical HPLC Method
Development, 2a. ed., Nueva York: Wiley, 1997.
16L. R. Snyder, J. Chromatogr. Sci., 1978, 16, p. 223.
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 831
tión en tres solventes: dioxano (un receptor de protones
de dipolo débil), nitrometano (un aceptor de protones de
dipolo intenso) y etanol (un donador de protones de di-
polo intenso). El índice de polaridad es una medida nu-
mérica de la polaridad relativa de varios solventes. En
la tabla 28.2 se da una relación de los índices de polari-
dad, así como otras propiedades, para varios solventes
que se utilizan en cromatografía de reparto. Observe que
el índice de polaridad varía desde 10.2 para el agua, alta-
mente polar, hasta �2 para los fluoroalcanos, que son
muy poco polares. Cualquier índice de polaridad que
se desee entre esos límites se puede conseguir por mez-
cla de dos solventes apropiados. Entonces, el índice de
polaridad P�AB de una mezcla de solventes A y B es
P�AB � fAP�A � fBP�B (28.2)
donde P�A y P�B son los índices de polaridad de los dos
solventes y fA y fB son las fracciones en volumen de
cada uno de los solventes A y B.
En la sección 26D.4 se subraya que la forma más fá-
cil de mejorar la resolución cromatográfica de dos es-
pecies es manipulando el factor de retención k, el cual
puede modificarse a su vez cambiando el índice de po-
laridad del solvente. En este caso, el ajuste de P� se
consigue con facilidad utilizando fases móviles que con-
sisten de una mezcla de dos solventes. Por lo común,
un cambio de dos unidades en P� origina (más o me-
nos) una variación de 10 veces en k. Es decir, para una
separación en fase normal
(28.3)
donde k1 y k2 son los valores inicial y final de k para un
soluto y P1� y P2� son los valores correspondientes de po-
laridad. En el caso de una columna en fase inversa
(28.4)
Hay que destacar que estas ecuaciones son válidas sólo
de forma aproximada. No obstante, pueden ser útiles,
como se demuestra en el ejemplo 28.1.
k2
k1
� 101P2¿�P1¿2 /2
k2
k1
� 101P1¿�P2¿2 /2
832 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos
TABLA 28.2 Propiedades de las fases móviles cromatográficas más comunes.
Índice de Viscosidad, Punto de Índice de Fuerza
Solvente refraccióna cPb ebullición, °C polaridad, P� eluyente,c E0
Fluoroalcanosd 1.27–1.29 0.4–2.6 50–174 �–2 �0.25
Ciclohexano 1.423 0.90 81 0.04 �0.2
n-Hexano 1.372 0.30 69 0.1 0.01
l-Clorobutano 1.400 0.42 78 1.0 0.26
Tetracloruro de carbono 1.457 0.90 77 1.6 0.18
i-Isopropiléter 1.365 0.38 68 2.4 0.28
Tolueno 1.494 0.55 110 2.4 0.29
Dietiléter 1.350 0.24 35 2.8 0.38
Tetrahidrofurano 1.405 0.46 66 4.0 0.57
Cloroformo 1.443 0.53 61 4.1 0.40
Etanol 1.359 1.08 78 4.3 0.88
Acetato de etilo 1.370 0.43 77 4.4 0.58
Dioxano 1.420 1.2 101 4.8 0.56
Metanol 1.326 0.54 65 5.1 0.95
Acetonitrilo 1.341 0.34 82 5.8 0.65
Nitrometano 1.380 0.61 101 6.0 0.64
Etilenglicol 1.431 16.5 182 6.9 1.11
Agua 1.333 0.89 100 10.2 Grande
aA 25°C.
bEl centipoise es una unidad típica de viscosidad; en unidades del SI, 1 cP � 1 mN s m�2.
cEn Al2O3. Al multiplicar por 0.8 se obtiene el e0 para la SiO2.
dLas propiedades dependen del intervalo de masa molecular de los datos que se proporcionan.
##
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 832
28D Cromatografía de reparto 833
17Para mayor información, véase J. C. Berridge, Techniques for the Auto-
mated Optimization of HPLC Separations, Chichester, UK: Wiley, 1985.
18Véase J. L. Glajch, J. J. Kirkland, K. M. Squire y J. M. Minor, J. Chroma-
togr., 1980, 199, p. 57; L. R. Snyder, J. Chromatogr. Sci., 1978, 16, pp. 223-234.
19DryLab forma parte ahora de Rheodyne, LLC, Rohnert Park, CA. Fue
perfeccionado por LC Resources, Inc., Walnut Creek, CA.
EJEMPLO 28.1
En una columna de fase inversa, un soluto tenía un
tiempo de retención de 31.3 minutos y una especie no
retenida requería de 0.48 minutos para la elución
cuando la fase móvil contenía un 30% en volumen de
metanol y 70% de agua. Calcule a) k y b) una compo-
sición de agua-metanol que produzca un k de aproxi-
madamente 5.
Solución
a) Al aplicar la ecuación 26.12 se obtiene
k � (31.3 � 0.48)/0.48 � 64
b) Para obtener P� para la fase móvil se sustituyen los
índices de polaridad del metanol y del agua de la
tabla 28.2 en la ecuación 28.2 y se obtiene
Al sustituir este resultado en la ecuación 28.4 se
llega a
Si se calculan los logaritmos de ambos miembros
de la ecuación se tiene que P2� es
Sea x la fracción de volumen de metanol en la nue-
va mezcla de solventes y si se sustituye de nuevo en
la ecuación 28.2, entonces
6.5 � (x � 5.1) � (1 � x) � 10.2
x � 0.73 o 73%
Con frecuencia, en las separaciones en fase inversa
se emplea una mezcla de solventes formada por agua y
un solvente orgánico polar. El factor de retención se
manipula entonces con facilidad al variar la concentra-demuestre que
uopt y Hmin se pueden expresar mediante
e) En las condiciones anteriores, ¿cómo se podría reducir la altura de plato en
un tercio? ¿Qué sucedería con la velocidad óptima en estas condiciones?
¿Qué sucedería con la cantidad de platos teóricos N para una columna de la
misma longitud?
f ) De acuerdo con las condiciones del inciso e), ¿cómo podría conservar la
misma cantidad de platos teóricos mientras reduce la altura de plato en un
tercio?
g) En el análisis anterior se supone que todo el ensanchamiento de banda
sucede dentro de la columna. Mencione dos factores que originen el 
ensanchamiento de banda extracolumna y que podrían contribuir también 
a la anchura total de los picos de la cromatografía de líquidos de alta 
resolución.
uopt �
DM
dp
 and Hmin � dp
Preguntas y problemas 855
y Hmín
SKOOG_CAP_28_4tas 3/25/08 10:00 AM Page 855
	Principios de análisis instrumental 
	Sección Cinco. Métodos de separación 
	Capítulo Veintiocho. Cromatografía de líquidos 
	28A Campo de aplicación de la cromatografía de líquidos de alta resolución
	28B Eficiencia de la columna en la cromatografía de líquidos
	28C Instrumentos para cromatografía de líquidos
	28D Cromatografía de reparto
	28E Cromatografía de adsorción
	28F Cromatografía iónica
	28G Cromatografía de exclusión por tamaño
	28H Cromatografía por afinidad
	28I Cromatografía en capa fina
	Preguntas y problemas