4. Proteínas

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Proteínas
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Características gerais
 São as macromoléculas biológicas mais abundantes nas células.
 Apresentam grande diversidade de função biológica.
 São instrumentos moleculares dos quais a informação genética é expressa.
 As proteínas são formadas por aminoácidos.
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Dogma central da Biologia:
DNA
RNA
Proteína
Armazena as informações
Exerce as funções celulares
Mensageiro das informações
TRANSCRIÇÃO
TRADUÇÃO
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As proteínas apresentam inúmeras funções
Função transportadora: se ligam e carregam moléculas ou íons de um órgão para outro:
 
Hemoglobina
Transporta O2 nas hemácias
Mioglobina
Transporta O2 nos músculos
Lipoproteínas
Transportam lipídios do fígado para outros órgãos
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Função nutricional: estão na dieta
Caseína
 Principal proteína do leite
Ovalbumina
 Principal proteína da clara do ovo
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Função de defesa: os anticorpos são proteínas altamente específicas que reconhecem e se combinam com substâncias estranhas (vírus, bactérias, etc)
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Função reguladora (hormonal): algumas proteínas auxiliam na regulação da atividade celular ou fisiológica
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Actina e Miosina
Contração muscular
Função contratil ou de motilidade: algumas proteínas habilitam células e organismos com a capacidade de contrair-se, de mudarem de forma ou de se deslocarem no meio ambiente
Cílios e flagelos
Locomoção celular
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Colágeno
Queratina
Proteína formadora do cabelo
Função estrutural: fornecem resistência ou proteção às estruturas biológicas
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Função catalisadora: as enzimas são o grupo de proteínas mais variado e mais altamente especializado, sendo capazes de acelerar reações químicas nas células. 
Enzimas Hepáticas
Metabolismo, destoxificação, etc...
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As proteínas são formadas por aminoácidos
 Toda proteína é um polímero de aminoácidos
 Características comuns dos 20 aminoácidos:
		α-aminoácidos
		grupo carboxila
		grupo amino
 Cada aminoácido tem uma cadeia lateral com propriedade química distinta
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Classificação dos aminoácidos pela cadeia lateral
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Abreviatura dos aminoácidos
 1 MFPTIPLSRL FDNAMLRAHR LHQLAFDTYQ EFEEAYIPKE QKYSFLQNPQ TSLCFSESIP
 61 TPSNREETQQ KSNLELLRIS LLLIQSWLEP VQFLRSVFAN SLVYGASDSN VYDLLKDLEE
121 GIQTLMGRLE DGSPRTGQIF KQTYSKFDTN SHNDDALLKN YGLLYCFRKD MDKVETFLRI
181 VQCRSVEGSC GF
Sequência de aminoácidos do hormônio de crescimento humano
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Outros tipos de aminoácidos:
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Aminoácidos como sistemas tampão: propriedades ácido-básico dos aminoácidos, curvas de titulação, pK e pI dos aminoácidos
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Aminoácidos como sistemas tampão: propriedades ácido-básico dos aminoácidos, curvas de titulação, pK e pI dos aminoácidos
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A ligação peptídica
 Formada a partir de uma reação de condensação entre o grupamento alfa carboxil de um aminoácido com o grupamento alfa amino do outro aminoácido.
 Em condições biológicas, o equilíbrio desta reação favorece a reação de hidrólise. 
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Representa-se uma proteína (ou um peptídeo) iniciando pelo aminoácido que possui o grupamento amino-terminal livre.
Orientação de uma proteína
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“Tamanho não é documento”: Mesmo os menores peptídeos podem ter efeitos biológicos importantes
Ex: Hormônios 
Ocitocina (9 resíduos de aminoácidos): secretada pela hipófise para fazer contração muscular no parto e produção de leite;
Glucagon (29 resíduos de aminoácidos): manutenção da glicemia sanguínea.
Glucagon
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Características moleculares de algumas proteínas
Proteínas conjugadas
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As proteínas diferem quanto ao tamanho e a composição de aminoácidos
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Estrutura das proteínas
1. Estrutura Primária
2. Estrutura Secundária
3. Estrutura Terciária
4. Estrutura Quaternária 
Visão geral dos arranjos estruturais das proteínas
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Estrutura primária:
Sequência de aminoácidos recém-sintetizada na célula, unidos por ligações peptídicas e pela localização das pontes dissulfeto.
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Enovelamento de uma proteína
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Estrutura secundária:
Estrutura das proteínas insolúveis em água.
α-Hélice
 Esqueleto polipeptídico gira ao redor de um eixo longitudinal imaginário.
 Os grupos R projetam-se para fora do esqueleto helicoidal.
 Unidade de repetição – uma volta de hélice com 5,4 Å de extensão, onde cada volta contém 3,6 resíduos de aminoácidos.
 Estabilizado por pontes de hidrogênio entre os grupamentos amino (N-H) e carboxil (C=O) dos aminoácidos distantes 4 resíduos entre si.
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Estrutura secundária:
Super-hélices
Colágeno
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Estrutura secundária:
 A folha beta é bem diferente da alfa hélice, pois é quase totalmente distendida ao invés de enrolada.
 A folha beta pregueada é estabilizada por pontes de hidrogênio entre grupos N-H e C=O em fitas beta adjacentes, enquanto que nas alfa hélices as pontes de hidrogênio entre grupos N-H e C=O são no mesmo filamento.
Folha - β
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Estrutura terciária:
 Estrutura das proteínas solúveis em água.
 É o arranjo tridimensional total de todos os átomos na proteína.
 Os resíduos de aminoácidos que estão distantes na sequência primária da proteína, em estruturas secundárias distintas podem interagir na estrutura terciária.
 São conhecidas como estruturas enoveladas ou globulares.
Interação eletrostática
Interação hidrofóbica
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Estrutura quaternária:
Hemoglobina
Interação não covalente de 2 ou mais estruturas terciárias
Capsídeo viral
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As proteínas perdem a estrutura e consequentemente a função quando desnaturadas.
Alguns agentes desnaturantes são:
Alteração extrema no pH
Alta temperatura
Solventes orgânicos
Detergentes
Radiações
Agentes redutores
Alta concentração de sais
Metais pesados
Estresse mecânico
Desnaturação das proteínas
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Trabalhando com as proteínas: separação, purificação e identificação
 
	Para estudarmos uma proteína, devemos fazer o seu isolamento e utilizar técnicas que permitam determinar suas propriedades.
 - Qual a fonte de proteínas? 
Tecidos ou microorganismos.
 - Primeiro passo → rompimento das células, para liberação das proteínas.
Essa solução contendo esse “pool” de proteínas é chamada de extrato bruto ou total.
O extrato total pode ser submetido a uma centrifugação diferencial para preparar frações subcelulares ou isolar organelas específicas.
 
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Cromatografia – Uma ferramenta poderosa para purificação de proteínas
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Cromatografia – Uma ferramenta poderosa para purificação de proteínas
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia de gel filtração
Cromatografia de afinidade
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Cromatografia – Uma ferramenta poderosa para purificação de proteínas
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Eletroforese – ferramenta para separação e caracterização de proteínas
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Eletroforese – ferramenta para separação e caracterização de proteínas
Eletroforese bidimensional
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ENZIMAS
Alguns aspectos importantes sobre as enzimas:
 Catálise de reações de degradação de nutrientes, conservação e transformação de energia química, síntese de macromoléculas biológicas a partir de precursores simples, etc...
 Algumas doenças são causadas pela ausência de uma ou mais enzimas. Outras pelo excesso de atividade de uma determinada enzima.
 Muitos medicamentos exercem seu efeito biológico através da interação com enzimas.
 Algumas enzimas são utilizadas como diagnóstico de doenças através da medida da sua atividade.
 São ferramentas importantes na indústria química, no processamento de alimentos e na agricultura.
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Enzimas comumente dosadas na clínica
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Classificação das enzimas
 As enzimas são classificadas de acordo com as reações que catalisam em 6 classes.
 Muitas são chamadas pela adesão do sufixo “ase”
ao nome do seu substrato ou a palavra que descreve a sua atividade.
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1 - Óxido-redutases – catalisam a reação de óxido redução
Oxidação do etanol pela álcool desidrogenase
2 - Transferases – transferem grupos funcionais entre doadores e aceptores. Os grupos amino, acil, fosfato, carbono e glicosil são os principais resíduos transferidos.
Reações catalisadas por uma aminotransferase
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3- Hidrolases – esse grupo pode ser considerado uma classe especial de transferases, na qual um grupo doador é transferido para água. A reação generalizada envolve a clivagem hidrolítica de ligações C-O, C-N, O-P e C-S. 
4- Liases – adicionam ou removem os elementos da água, de amônia ou de dióxido de carbono.
Reação catalisada pela enzima fumarase
Quebra de moléculas acrescentado água
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5- Isomerases – catalisam isomerizações de vários tipos, entre elas as interconversões cis-trans e aldose-cetose. 
Epimerases e racemases catalisam a reação de inversão em átomos de C assimétricos
6- Ligases – envolvidas em reações de síntese, nas quais 2 moléculas são unidas, às custas do ATP.
Reação da piruvato carboxilase
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- Substrato – moléculas sobre as quais agem as enzimas. 
 Sítio ativo – local onde ocorre a catálise, interior dos limites de uma cavidade ou fenda, na estrutura molecular da enzima.
As enzimas afetam a velocidade das reações, mas não o equilíbrio químico delas.
Reação enzimática simples:
E + S ES EP E + P
Qualquer reação desta natureza S P pode ser descrita por um diagrama de coordenadas de reação. É uma representação gráfica do curso energético da reação. 
Como as enzimas funcionam ?
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Modelos de interação enzima-substrato
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Requerimentos para a atividade das enzimas
 Temperatura ideal
 pH ideal
 Substrato
 Cofator e/ou coenzima
Perfil de atividade enzimática em relação a dependência do pH
Atividade das enzimas humanas dependente de temperatura
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Auxílio de um cofator na atividade enzimática
Os cofatores alteram o sitio ativo da enzima ou finalizam o encaixe correto do substrato
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 Como as enzimas aumentam a velocidade das reações?
 Qual a fonte de energia para diminuição da energia de ativação das reações catalisadas por enzimas?
Papel da energia de ligação na catálise
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A concentração de substrato influencia 
a velocidade das reações (cinética enzimática)
Efeito da concentração de substrato na velocidade inicial catalisada por uma enzima
Vmax: velocidade máxima da reação enzimática.
Km: concentração de substrato necessária para a enzima trabalhar na metade da Vmax.
Equação de Michaelis-Menten
Km = [S], quando V0 = ½ Vmax
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Valor de Km para algumas enzimas e seus substratos
Quanto menor o Km, maior é a afinidade da enzima pelo substrato.
Hexoquinase de cérebro Km: 0.1 mM
Glicoquinase de fígado Km: 10 mM
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Inibição enzimática
Inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise, diminuindo ou parando as reações enzimáticas.
 Existem duas grandes classes de inibidores: reversíveis e irreversíveis. 
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Inibição Reversível: diminui a atividade enzimática por meio de interação reversível. A interação é não-covalente entre inibidor e enzima.
	Competitiva: o inibidor é semelhante ao substrato e compete com este pelo sitio ativo da enzima. Comparado com uma reação sem inibidor, a cinética tem aumento de km sem alterar a Vmax. Ex: sulfanilamida (antibiótico), AZT, ddI e ddC (anti-HIV), diclofenaco e ibuprofeno (antiinflamatórios) etc...
	Não competitiva: o inibidor não se assemelha ao substrato, portanto não se liga ao sitio ativo da enzima, porem ao se ligar em outro local da enzima, provoca uma distorção no sitio ativo da enzima, inativando-a. Comparado com uma reação sem inibidor, a cinética tem diminuição de Vmax sem alterar o Km. Ex: efavirenz e nevirapina (anti-HIV)
	Mista: o inibidor se liga tanto ao sitio ativo quanto em outro local da enzima. Comparado com uma reação sem inibidor, a cinética tem alteração tanto de km quanto de Vmax Ex: ions metálicos
Inibição Irreversível: também chamado de inativador suicida, se liga tão fortemente a enzima (ligação covalente) que bloqueia permanentemente a atividade enzimática. Envolve modificações químicas na enzima levando a uma inativação definitiva. Ex: aspirina (analgésico e antitérmico), penicilina (antibiótico), paration (inseticida), sarin (gas) etc... 
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Exemplos de inibição reversível
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Cinéticas enzimáticas na ausência e na presença de inibidores reversíveis
Inibição competitiva
Inibição não-competitiva
Curvas azuis: reação normal; curvas vermelhas: reação na presença do inibidor
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Inibição irreversível
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Regulação enzimática
	Algumas enzimas podem ter suas atividades reguladas, atuando assim como reguladoras do metabolismo celular. Esta regulação (reversível) é essencial na coordenação dos inúmeros processos metabólicos celulares. Existem 2 modelos de regulação enzimática:
Regulação covalente: ocorre quando há modificação covalente da enzima, com conversão entre formas ativa e inativa.
Regulação alostérica: 
 Ocorre nas enzimas que possuem um sitio de regulação (sitio alostérico), onde uma molécula se liga de forma não-covalente, podendo atuar como reguladora positiva ou negativa.
 A ligação do regulador induz modificações conformacionais na enzima, diminuindo a sua afinidade com o substrato.
 Um modelo comum de regulação alostérica é a retroalimentação (feed-back), onde o próprio produto da reação enzimática inibe momentaneamente a enzima.
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Regulação por modificação covalente
A fosforilação é o tipo mais comum de modificação covalente 
Regulação da atividade da enzima glicogênio fosforilase por modificação covalente
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Conversão da L-treonina a L-leucina é catalisada por uma sequência de cinco enzimas
Regulação por retroalimentação (feed-back)