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Biofísica Membranas e Mecanismos de Transporte MEMBRANA CELULAR Composição e ultra-estrutura das membranas: • Envolve a célula e define seus limites • Mantém ≠s essenciais entre citosol e M.E.C. • Endomembranas – Organelas mantém ≠ças entre conteúdos de cada organela e citosol • Membranas FUNÇÕES ≠s + compartilham estrutura geral comum: filme fino de moléculas (LIPDS + PTNS) lig. não-covalentes. • Dinâmica e Fluida Composição e ultra-estrutura das membranas: MEMBRANAS • Bicamada de lipídios embebida de proteínas 5 nm de espessura (5 milionésimo de milímetro) LIPÍDIOS: • Lipídios insolúveis em água (Polar e Inorgânico) dissolvem-se em solventes orgânicos • 50% massa das membranas quase todo restante = Proteínas • Células animal pequena +/- 1000000000 moléculas lipídicas • ANFIPÁTICAS extremidade HIDROFÓBICA + HIDROFÍLICA • + abundantes FOSFOLIPÍDIOS (1 cabeça polar + 2 caudas apolares) A – Fosfolipídio (símbolo) C – Bicamada Lipídica Seus arranjos e ligações afetam fluidez da membrana B – Fosfolipídio (fórmula) • Quando lipídios são circundados por água tendem a agregar-se: • caudas hidrofóbicas ocultas no interior • cabeça hidrofílica expostas à água. Podem fazer isso de 2 formas: A - Micela B – Bicamada Lipídica Fluidez da membrana Lipídios são capazes de se difundirem-se dentro da membrana: • Moléculas de fosfolipídios migram de uma monocamada de um lado par outro flip-flop • Trocam de lugar com suas vizinhas difusão lateral rápida • Rodam em torno de seu eixo maior rotação • Caudas são flexíveis flexão Fluidez da membrana • 3 classes principais de lipídios: Fosfolipídios, Colesterol (diminui permeabilidade a pequenas moléculas hidrossolúveis) e Glicolipídios • Glicolipídios lipídios + açúcares superfície de membranas Composição e ultra-estrutura das membranas: MEMBRANA • Fosfolipídios organização estrutural básica das membranas PROTEÍNAS: • Proteínas executam funções específicas das diferentes membranas das células • 2 classes: – Integrais (Transmembrana) diretamente dentro da bicamada – Periféricas não inseridas na bicamada • Maioria das Transmembrana EUCARIOTOS carboidratos expostos na superfície Interações celulares MECANISMOS DE TRANSPORTE Introdução Células vivas: – Composição química constante Equilíbrio c/ meio – Troca entre substâncias do MEC e MIC (mecanismo complexo) regulado pela semipermeabilidade da membrana – Funcionamento, crescimento e multiplicação celular: • Substs. adequadas selecionadas e transferidas p/ dentro da célula • Substs. desnecessárias impedidas de penetrar ou, então, eliminadas do citoplasma – Células metabolicamente ativas (Procarióticas e Eucarióticas) • Apesar de enorme diversidade anatômica e funcional Estruturas semelhantes que delimitam fisicamente (Membrana Plasmática) – Membrana Plasmática bicamada lipídica embebidas por proteínas Figura: Modelo de mosaico fluido da membrana Mecanismo de Transporte: • Transporte Passivo: – Difusão simples (livre ou por canais) – Difusão facilitada (por proteínas carreadoras) – Osmose • Transporte Ativo: – Bomba de sódio/potássio – Bomba de cálcio – Endocitose e exocitose • Sentido do fluxo: – Uniporte – Acoplados: • Simporte (Cotransporte) • Antiporte (Contratransporte) Mecanismo de Transporte: • Permeabilidade seletiva pequenas moléculas permite que a célula controle e mantenha composição interna • Só moléculas pequenas e sem cargas (O2, H2O, Etanol...) difusão livre DIFUSÃO SIMPLES • Moléculas maiores polares e não-carregadas (Glicose) ou carregadas (íons) independente do tamanho (H+) não podem DIFUSÃO FACILITADA Proteínas (Transportadoras): – Canais poros (ex.: canais de Ca+) abre e fecha em resposta a sinais extracelualres – Carreadoras ligam-se seletivamente e transportam pequenas moléculas específicas (ex.: Glicose) REFORÇOS DA MEMBRANA 2.Parede bacteriana é um envoltório externo de muitas bactérias e tem como principal função a manutenção da forma específica de cada bactéria, protegendo-as das variações osmóticas do meio. 3.Parede celular é o envoltório característico das células vegetais. Ela possui uma composição química complexa e atua principalmente como estrutura esquelética. TRANSPORTE ATRAVÉS DAS MEMBRANAS a. FUNÇÕES: • Incorporação de novas substâncias para o metabolismo celular (nutrição); • Eliminação de restos metabólicos (excreção); • Eliminação de substâncias especiais para o metabolismo extracelular (secreção). • E também funções especiais como: polarização de membrana (pela bomba de sódio e potássio) e • Defesa celular (pela fagocitose em leucócitos). • Equilíbrio hídrico e • Controle da turgescência celular também estão presentes (pela difusão ou osmose) Mecanismo de Transporte: • Barreira (Membrana) transferência de moléculas de modo a: – Ingerir nutrientes essenciais – Excretar resíduos do metabolismo – Regular [ ] iônicas intracelulares • Moléculas apolares pequenas (O2, CO2) difundem-se rapidamente (DIFUSÃO SIMPLES) • Moléculas polares pequenas sem carga (H2O, etanol, uréia) difundem-se rapidamente (OSMOSE / DIFUSÃO SIMPLES), mas no caso do Glicerol, já não é tão rápido • Moléculas polares grandes sem carga (Glicose) quase não se difunde • Moléculas carregadas (íons) totalmente impermeáveis Mecanismo de Transporte: • 2 tipos de proteínas transportadoras: – Carreadoras ligam um soluto específico a ser transportado sofrem mudança de conformação – Canais não ligam o soluto poros hidrofílicos (abertos / fechados) maior velocidade que carreadoras • Ambas permitem aos solutos cruzarem a membrana PASSIVAMENTE TRANSPORTE PASSIVO (ou DIFUSÃO FACILITADA): – Soluto sem carga: a favor do gradiente de [ ] – Soluto carregado: a favor do gradiente de [ ] + potencial de membrana GRADIENTE ELETROQUÍMICO • Quando célula transporta contra gradiente eletroquímico TRANSPORTE ATIVO (só carreadoras) ATIVO OU PASSIVO SEMPRE PASSIVO Figura: Possível mecanismo do poro transmembrana. Mecanismo de Transporte: • Sentido do fluxo: – Uniporte 1 soluto de um lado para outro – Acoplados: • Simporte transferência simultânea de 2 solutos na mesma direção • Antiporte transferência simultânea de 2 solutos em direções opostas • Exemplo: – Células animais captam somente GLICOSE do L.E.C. (alta [ ]) para citosol (baixa [ ]) ATIVO OU PASSIVO?? / UNIPORTE OU ACOPLADO?? – Células intestinais e renais captam GLICOSE da luz intestinal e dos túbulos renais (baixa [ ]) ATIVO OU PASSIVO?? É preciso que o Na+ também seja transportado UNIPORTE OU ACOPLADO?? Osmose • Movimento dos solventes • Membrana plasmática muito permeável à água ≠ ças de [ ] de moléculas impermeáveis produzir grande fluxo de água entre os meios. Figura: Osmose: movimento ocorre do meio com menor [ ] p/ meio com maior [ ], tendendo a igualar em ambos os lados. TRANSPORTE ATIVO • BOMBA DE SÓDIO/POTÁSSIO • BOMBA DE CÁLCIO Este transporte leva a movimentação de soluto CONTRA gradiente de [ ] ou eletroquímico energia Na+ K+ Bomba de Na+/K+ • Células eucarióticas [ ] extracelular de Ca2+ é maior mantida por BOMBAS transportam Cálcio ativamente para fora Exemplo: MÚSCULOS • Contração libera Cálcio (Retículo Sarcoplasmático) • Relaxamento captação de Cálcio pelo R.S. através da Bomba BOMBA DE Ca2+ BOMBA DE Na+ - K+ • [ ] de K+ dentro da célula 10 a 20 x maior no interior • [ ] de Na+ maior exterior • Antiporte transporta SÓDIO p/ fora e POTÁSSIO para dentro • Sai 3 Na+ e entra 2 K+ Diferenças mantidas pela BOMBA Canais de K+ Canais de K+ são os canais mais usualmente abertos na membrana plasmática de neurônios em repouso. Assim há saída de íons K+, o que deixa um excesso de carga negativa no interior da célula. Membrana Sensor de voltagem Exterior Canal aberto Canal fechado K+ Interior celular Um potencial de ação é uma súbita variação no potencial de membrana, que dura aproximadamente 1 ms, são conduzidos ao longo do axônio de um neurônio para outro. Num neurônio de vertebrados o potencial de ação apresenta uma ação saltatória, que será discutida mais adiante. Potencial de Ação wfdaj.sites.uol.com.br BIOFÍSICA Morfologia do neurônio Dendritos Axônio Pericário 4. SINAPSES • LOCAIS DE CONTATO ENTRE UM AXÔNIO DE UM NEURÔNIO COM OS DENDRITOS OU PERICÁRIO DE OUTROS NEURÔNIOS; • FENDA SINÁPTICA – MEMBRANA PRÉ-SINÁPTICA • ARMAZENA E LIBERA O NEUROTRANSMISSOR – MEMBRANA PÓS-SINÁPTICA • RECEBE O NEUROTRANSMISSOR 4. SINAPSES • ELÉTRICAS – MEMBRANAS PLASMÁTICAS SE TOCAM – CORRENTE DE ÍONS • QUÍMICAS – DEPENDE DE MOLÉCULAS MEDIADORAS, OS NEUROTRANSMISSORES 4. SINAPSES • QUÍMICAS – DEPENDE DE MOLÉCULAS MEDIADORAS, OS NEUROTRANSMISSORES; – POLARIZADAS; – VESÍCULAS SINÁPTICAS; 4. SINAPSES • QUÍMICAS – SINAPSES QUÍMICAS NEUROEFETUADORAS • JUNÇÕES NEUROEFETUADORAS • AXÔNIOS DOS NERVOS PERIFÉRICOS E UMA CÉLULA EFETUADORA NÃO NEURONAL • JUNÇÕES NEUROEFETUADORAS – SOMÁTICA » PLACA MOTORA » CÉLULAS MUSCULARES ESTRIADAS ESQUELÉTICAS – VISCERAL » SISTEMA NERVOSO AUTÔNOMO SIMPÁTICO E PARASSIMPÁTICO » CÉLULAS MUSCULARES LISAS » CÉLULAS MUSCULARES CARDÍACAS » CÉLULAS GLANDULARES 5. MECANISMO DE TRANSMISSÃO SINÁPTICA • POTENCIAL DE MEMBRANA – INTEROR DA CÉLULA É NEGATIVO E O EXTERIOR É POSITIVO – TRANSMISSÃO INTERCELULAR DE SINAIS ELÉTRICOS – CANAIS IÔNICOS • ESTRUTURAS PROTÉICAS QUE TRANSPASSAM A MENBRANA CELULAR E PERMITEM A PASSAGEM SELETIVA DE ÍONS • SÓDIO,POTÁSSIO,CLORO E CÁLCIO – POTENCIAL DE AÇÃO • ESTTÍMULO EXCITATÓRIO FORTE QUE CAUSA MODIFICAÇÃO NO POTENCIAL DE MEMBRANA 5. MECANISMO DE TRANSMISSÃO SINÁPTICA IMPULSO Células de Schwann Bainha de mielina Célula da Schwann Axônio Nodo de Ranvier Neurilema Transmissão de sinais neurais para o Sistema Nervoso Figura: Bomba Sódio/Potássio – Transporte ativo. Potencial limiar Potencial de repouso Tempo(ms) Os canais de Na+, dependentes de voltagem, da membrana plasmática do axônio são os responsáveis primários pelo potencial de ação. Podemos pensar no potencial de ação como um evento “tudo ou nada” e auto-regenerante. Potencial de Ação V(mV) 50 0 -70 Sinapses e Comunicação Sinapses: São junções estruturalmente especializadas, em que uma célula pode influenciar uma outra célula, diretamente por meio do envio de sinal químico ou elétrico. A forma mais comum de sinapse é a sinapse química. Na sinapse temos a participação das células pré-sináptica e pós-sináptica. Célula pré-sináptica: É a célula que envia o sinal nervoso. Célula pós-sináptica: É a célula que recebe o sinal da célula pré-sináptica. Membrana pré-sináptica Vesícula de acetilcolina Autoreceptor Neurotransmissor Membrana pós-sináptica Fenda sináptica Receptor Canal de cálcio Sinapses Excitatórias e Inibitórias Sinapses excitatórias: São sinapses onde a membrana pós-sináptica é despolarizada, como por exemplo as sinapses entre neurônios motores e o músculo esquelético. Sinapses inibitórias: São sinapses onde há hiperpolarização da membrana pós- sináptica. Os neurotransmissores mais comuns em sinapses inibitórias de vertebrados são o ácido -aminobutírico (GABA) e glicina. As células pós-sinápticas das sinapses inibitórias apresentam canais de cloro dependentes ligantes. Quando esses canais são ativados por um neurotransmissor, eles podem hiperpolarizar a membrana pós- sináptica. Assim há uma probabilidade menor de lançamento de um potencial de ação. Membrana plasmática No repouso (VK = -75mV) Portão m fechado Portão h aberto Após a despolarização (VK = 50 mV) Portão m aberto Portão h aberto 5 ms depois da despolarização (VK = -50 mV) Portão m aberto Portão h fechado A) B) C) Potencial de Ação Canais de sódio. Os canais de sódio são um tipo especializado de canal iônico depentente de voltagem. Sua abertura está condicionada ao aumento do potencial de membrana, acima de um valor limite de voltagem o canal abre-se, permitindo o influxo de íons de sódio na célula. O canal permanece aberto por poucos milisegundos. O tempo suficiente para elevar o potencial de membrana para 50 mV. O canal de sódio possui dois portões distintos, portões m (de ativação) e h (de inativação). O portão h fecha-se após a despolarização e permanece fechado, não permitindo o início de um novo potencial de ação (período refratário). Canais de potássio. Esse canal abre-se imediatamente após a despolarização, o que permite a saída de carga positiva da célula, na forma de íons de potássio. O canal fica de potássio fica aberto durante toda a fase de repolarização, onde o potencial de membrana será trazido a valores negativos, chegando a ficar mais negativo que o potencial de repouso, durante a fase seguinte a repolarização, chamada de fase de hiperpolarização. Membrana plasmática No repouso (VK = -75mV) Canal de potássio fechado Após a despolarização (VK = 50 mV) Canal de potássio fechado 5 ms depois da despolarização (VK = -50 mV) Canal de potassio aberto Potencial de Ação A) B) C) Fonte: http://psych.hanover.edu/Krantz/neurotut.html Vejamos atentamente essa animação do funcionamento dos canais durante as fases de despolarização e repolarização. Os canais de Na+, dependentes de voltagem abrem-se, permitindo a elevação do potencial, gráfico ao lado. Vemos claramente os íons do Na+ (cargas positivas) entrando na célula, e o potencial de membrana respondendo a essa entrada no gráfico. Despolarização Canal de Na+ Potencial de Ação V o lt a g e m ( m V ) Tempo(ms) Potencial de repouso Neurotransmissores Fonte: Purves et al., Vida A ciência da Biologia. 6a. Ed. Artmed editora, 2002 (pg. 787). Receptor de Acetilcolina Acetilcolina Subunidades Membrana celular Sinapses Elétricas As sinapses elétricas têm participação minoritária no sistema nervoso, contudo estão presentes inclusive no cérebrode mamíferos. São diferentes das sinapses químicas porque acoplam neurônios eletricamente. Nesse tipo de sinapse as membranas das células pré-sináptica e pós-sináptica estão separadas por 2 a 3 nm. As membranas dos dois neurônios pré e pós-sinápticos estão bem próximas, e estão conectados por uma junção comunicante (gap junction). Essas junções apresentam pares canais precisamente alinhados nos neurônios pré e pós-sinápticos, de forma que cada par forma um poro, conforme o diagrama abaixo. Esse poros são maiores que os poros dos canais dependentes de voltagem. Proteínas específicas de membrana, chamadas conexons ligam os dois neurônios, formando um túnel molecular entre as duas células. As sinapses elétricas funcionam permitindo o fluxo passivo de corrente iônica através dos poros de um neurônio para outro. O arranjo da sinapse elétrica permite que ela seja bidirecional. Sinapses Elétricas O estudo da sinapse elétrica em crayfish determinou a rapidez da sinapse elétrica, quando comparada com a sinapse química (Furshpan & Potter, 1959). Um sinal pós- sináptico é observado em uma fração de milisegundo, após a geração do potencial de ação pré-sináptico. No caso do crayfish, as inteconecções das sinpases elétricas, permitem uma rápida resposta ao ataque de um predador. Sinapses elétricas também são usadas para sincronizar a atividade de populações de neurônios, como em neurônios de secreção de hormônio localizados no hipotálamo de mamíferos. Referência: Furshpan, E. J. & Potter, D. D. (1959). J. Physiol. 145:289-325. Sinapses Elétricas • POTENCIAL DE REPOUSO = -65 mV DENTRO - / FORA + POLARIZAÇÃO – Canais de K+ mandam K+ p/ fora. Como há poucos canais de Na+ abertos, sai mais K+ + fora. – Bomba de Na+ e K+ também auxilia bombeia 3 Na+ p/ fora da célula ([ ] extra > que intra) e 2 K+ p/ dentro ([ ] intra > que extra). • Estimulo abre canais de Na+ entra Na+ DENTRO mais + que FORA DESPOLARIZAÇÃO +30mV fecha canais Na+ e abre canais K+ (saída de K+) recupera Potencial de Repouso fecha canais de K+ • Despolarização até retorno ao Potencial de Repouso POTENCIAL DE AÇÃO Potenciais de Membrana Tetrodoxina (TTX) A toxina tetrodoxina (TTX) é encontrada no peixe baiacu (puffy fish). Essa toxina, de origem não protéica, tem a capacidade de bloquear canais de sódio e foi encontrada pela primeira vez no peixe fugu no mar do Japão, onde é servido como iguaria. Essa toxina bloqueia os canais de sódio, como uma rolha fecha uma garrafa, sendo um veneno mortal, mil vezes mais potente que cianeto de potássio. O envenenamento por TTX causa parada respiratória, há diversos relatos de envenenamento acidental devido ao consumo do fugu. Interação de Peptídeos Tóxicos com a Membrana Celular A membrana celular animal apresenta uma bicamada lipídica de aproximadamente 60 Å de extensão, o que possibilita que proteínas como o centro de reação fotossintético atravessem a membrana, contudo peptídeos pequenos, como os mastoparanos e o anoplin, possuem comprimento de 21 e 15 Å, respectivamente, não permitindo que esses peptídeos atravessem a membrana celular. Resta a questão sobre a forma de ação desses peptídeos, visto que evidências experimentais indicam que os mesmos atuem na membrana celular, desestabilizando-a. Uma possível forma de ação desses peptídeos, é por meio do desmonte da camada externa da membrana, o que levaria à sua desestruturação e consequente quebra da membrana celular. A forma exata da ação dos peptídeos tóxicos com a membrana celular é ainda matéria de debate. Um possível modelo de interação do peptídeo com a bicamada está mostrado nos slides seguintes. Interação de Peptídeos Tóxicos com a Membrana Celular Streptolisina A toxina streptolisina é uma proteína produzida pelo Streptococcus pyrogenes de massa molecular 65 kDa. Essa toxina liga- se à membrana celular, que apresenta colesterol na sua superfície. Depois de ligar-se à membrana a streptolisina polimeriza-se, formando poros na membrana celular (figura ao lado). Esses poros transmembranas podem ter até 350 Å de diâmetro. Os diagramas esquemáticos nos próximos slides ilustram os principais passos na formação dos poros. Referência: Bhakdi, S., Tranum-Jensen, J., & Sziegoleit, A. (1985). Infec. Immun. 47:52-60. a) Membrana de eritrócito lisadas por streptolisina. b) Oligômeros de streptolisina, mostrando diversas estruturas de bastões. a) b) Processo de formação de poros pela streptolisina. 4) Há formação de um poro transmembrana. 1 2 3 4 Referência: Bhakdi, S., Tranum-Jensen, J., & Sziegoleit, A. (1985). Infec. Immun. 47:52-60. Streptolisina Representação esquemática do dano causado na membrana pela ação do oligômero de streptolisina. Referência: Bhakdi, S., Tranum-Jensen, J., & Sziegoleit, A. (1985). Infec. Immun. 47:52-60. Streptolisina Toxinas da vespa solitária Anterhynchium flavormarginatum micado. Essa vesta injeta seu veneno em lagartas e deposita seus ovos próximos à vítima. Devido à ação tóxica de seu veneno a lagarta fica paralisada, mas viva. Ao eclodirem, as jovens vespas terão um banquete fresco e vivo. Tal comportamento, indicou que o veneno da A. flavormarginatum micado, poderia ser uma rica fonte de moléculas com atividades antimicrobianas. Podemos imaginar o veneno dessas vespas como um coquetel de moléculas. A questão é: qual ou quais moléculas apresentam atividades biológicas? Mastoparanos Foto: Cortesia do Dr. K. Konno. Anoplin. O veneno da A. samariensis é uma possível fonte de moléculas com atividades biológicas. O peptídeo Anoplin, uma decapeptídeo com o C- terminal amidado e sequência, GLLKRIKTLL, foi identificado no veneno da A. samariensis. Testes de atividade biológica mostraram ação antimicrobiana desse peptídeo, sendo o menor peptídeo que se tem notícia a apresentar tal ação. A versão sem o C- terminal não-amidado apresenta atividade antimicrombiana reduzida, quando comparada com o Anoplin-NH2. Foto: Cortesia do Dr. K. Konno. Anoplin
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