Aula 2 - DNA

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GENÉTICA – AULA 2
DNA
O DNA é a macromolécula que carrega a nossa informação genética. O conjunto de DNA é o que nós chamamos de Genoma e cada um tem o seu próprio genoma e depois estruturas específicas e diferenças entre um indivíduo e outro mesmo sendo da mesma espécie. O DNA nas células eucariotas está contido no núcleo, já nas células procariotas o DNA não está protegido por membrana e fica disperso no citoplasma, sendo o DNA circular e chamado de nucleóide. O DNA também é encontrado em cloroplastos e mitocôndrias.
Então nós temos a sequência: Célula núcleo cromossomos genes sequencias de DNA.
Existe uma informação genética que diferencia um individuo do outro, o que é bem característico. O poder da hereditariedade nunca ninguém discutiu, mas como essa hereditariedade é transferida só foi descoberta em meados do século XX.
Como o nosso genoma (a sequencia de DNA) é muito grande, este material está organizado em proteínas que são chamadas de histonas. Nós temos 5 tipos de histonas que são nomeadas de h1, h2, h3, h4, 3 h5 que estão em posições diferentes no genoma e também de cromossomos. Como o DNA aberto é muito extenso ele acaba sendo colado nessas proteínas chamadas de histonas, então os cromossomos não são formados só por DNA e sim por DNA + histonas (proteínas), assim como os ribossomos tem RNA + proteínas. Então para organização dos cromossomos nós temos obrigatoriamente DNA + proteínas, dessa forma nós podemos organizar o genoma, organizar a molécula de DNA. A maior parte dessa molécula fica em estado silenciado. O que significa isso? Significa que ela fica realmente condensada. Primeiro porque a maior parte do nosso genoma nós não utilizamos, nós não ativamos. E segundo porque cada célula ativa pedaços específicos para sua informação, para ativar suas funções. Durante muito tempo falou de DNA lixo (DNA que a gente não usa), mas hoje nós sabemos que esse DNA trás informações evolutivas e que não necessariamente exerce uma função dentro das nossas células.
 Foram feitos no século XX muitos experimentos para tentar tirar alguma ideia de como era esse DNA. O experimento de Hershey-Chase conseguiu comprovar que o material responsável pela hereditariedade era o DNA. Na época eles tinham dúvida entre os ácidos nucléicos e as proteínas que existiam em grande quantidade nas células e que era as que expressavam realmente as características. Então eles fizeram um experimento com bacteriófagos que são vírus simples que possui no seu interior o material genético e fora disso possui uma cápsula de proteínas. Então eles marcaram o Envelope que eles sabiam que era proteico com o enxofre radioativo e marcaram o DNA do bacteriófago com fosfato radioativo. E separaram as colônias de bactérias e infectaram com o vírus (bacteriófago). Qual era a ideia? Já que os vírus são hospedeiros obrigatórios, o que permanecer dentro da célula é responsável pela replicação do vírus, o que for expelido pela célula não serve como forma de replicação. O primeiro grupo, o que foi marcado o envelope, quando chegou no final eles detectaram que as células praticamente não apareciam nada. O que aparecia? O que estava marcado? O meio em que elas estavam. Então imagina que você tem lá a plaquinha e nessa plaquinha tem células; em uma plaquinha aparecia a radiação do lado de fora, na outra a radiação no lado de dentro da célula. Eles conseguiram então ver que o envelope que foi marcado por fora do vírus, durante a infecção não entrou na célula, isso significa que a proteína (envelope proteico) não é responsável pela transferência da hereditariedade do meio. Já na placa 2 a gente tem o que ? O material genético na célula e isso significa o que? Que ele é utilizado para a replicação viral, hoje nós chamamos de material genético, mas antigamente eles chamavam de proteínas e ácidos nucléicos, simplesmente eram moléculas para eles. Foi esse experimento que definiu para a biologia molecular que o DNA era a molécula responsável pela transferência de hereditariedade.
Eles levantaram 3 propriedades que o DNA deveria ter
As características estruturais do DNA devem permitir uma replicação fiel. Por que dessa propriedade? Porque eles já sabiam que as células se dividiam e que uma célula mãe gerava duas células filhas e o vírus quando infectava formava outros vírus, e para eu ter cada vez mais DNA eu preciso copiar esse DNA, então esse material tem que ter uma estrutura que possibilite ser copiado.
O material genético deve ter um conteúdo informacional. Essa estrutura então deve trazer o roteiro da informação. Hoje a gente sabe que a sequencia de nucleotídeos dá pra gente uma informação, a informação aí para construção do RNA e posteriormente para a construção da proteína e isso é um conteúdo informacional, mas na época eles não sabiam disso.
 O material genético deve ser capaz de mudar em raras ocasiões. Então eles colocaram que essa estrutura deve sofrer modificações, que são as mutações que a gente conhece hoje. Talvez seja a característica mais fácil, por quê? Se todo mundo da mesma espécie tivesse o mesmo genoma ia todo mundo ser igual, se nós temos características diferentes significa que sofremos lesões diferentes e que foram selecionadas porções diferentes do genoma e que essas porções foram sendo modificadas ao longo do processo evolutivo.
 Watson e Crick que desvendaram a estrutura do DNA, eles mostraram uma estrutura tridimensional e descreveram o formato helicoidal do DNA. Ganharam o premio Nobel. Eles tinha uma única foto de um raio X de uma molécula que visto de cima eles viam duas fitas e as pontes e hidrogênio.
O DNA ele é formado por duas fitas que são colocadas de forma paralela e isso inclusive é uma forma de você apontar erros de DNA quando o DNA não esta paralela, quando ele tem bolhas, demostra uma lesão no DNA, é uma forma mais clara de se identificar lesões no DNA. Tanto uma fita quanto a outra é formada por moléculas que são chamadas de ácidos nucléicos e o conjunto dessas moléculas forma o DNA. Os nucleotídeos são formados por açucares que pode ser uma ribose ou uma desoxirribose + um fosfato + base nitrogenada. Nós temos 4 bases nitrogenadas no DNA, e no RNA ocorre a interação de mais de uma base nitrogenada. As bases nitrogenadas do DNA são: Adenina, Citosina, Guanina e Timina. É o contato de uma base nitrogenada de uma fita com a base nitrogenada da outra fita que dá o paralelismo da fita do DNA. A dupla fita ainda esta de forma torcida o que dá a forma da dupla hélice o DNA.
O nucleotídeo então, ele é formado pelo açúcar + fosfato + base nitrogenada. A base nitrogenada do DNA é uma desoxirribose que é diferenciada da ribose porque o carbono 2 da pentose do açúcar invés do OH, vai ter só o H, então por isso desoxirribose, é uma ribose que foi retirada um oxigênio. Onde? No carbono 2. Já a ribose vai ter o OH.
Todos os nucleotídeos tem um trifosfato, então o ATP nada mais é que um nucleotídeo da adenina, além do ATP nós vamos ter o GTP que é o nucleotídeo guanina, nós temos ainda o TTP e o CTP. Então todo nucleotídeo vem de uma molécula trifosfato. No momento da ligação ele perde o fosfato e gera energia para ele, com isso ele consegue se ligar fazer a ligação chamada aí o que nós chamamos de ligação fosfodiéster que é a ligação de um nucleotídeo e outro nucleotídeo, é uma ligação forte. Para desfazer uma ligação fosfodiéster você precisa de enzimas específicas, diferente das ponte de hidrogênio que basta você aquecer e você separa a dupla fita de DNA. Então aquecendo você pode até separar a dupla fita, é o que a gente fala de desnaturação do DNA, mas você não desfaz a ligação fosfodiéster, que é essas ligação de nucleotídeo com outro nucleotídeo, é uma ligação de um fosfato com uma açúcar de outro nucleotídeo.
Quanto as bases nitrogenadas nós temos as bases pirimídicas e as bases púricas. As bases pirimídicas vai ter apenas 1 anelzinho e as púricas 2 anelzinho, sempre o paralelismo é mantido por uma base pirimídica e uma base púrica, por isso que nós vamos ter um distanciamento sempre igualentre uma fita e outra. Quem são as bases pirimídicas? Citosina, Timina (no DNA) e a Uracila (no RNA). E as bases púricas são as Guaninas e as Adeninas. Sempre nós vamos ter o pareamento entre uma púrica e uma pirimídica, então guanina com citosina e adenina com timina e no RNA posteriormente adenina com uracila. Então sempre o pareamento de uma fica com a outra é entre uma base púrica com uma pirimídica.
As fitas de DNA e de RNA, de todos ácidos nucléicos, elas tem um sentido. A direção dessas fitas é dada de acordo com o posicionamento dos carbonos dentro das pentoses. Sempre a ligação vai ser entre o 5º carbono de uma pentose com o 3º carbono de outra pentose, é claro que vai ter o fosfato no meio, mas o sentido vai ser do 5 para o 3, isso da um sentido claro para a fita que é nomeada como ? ela vai ter uma extremidade 3’ e uma ponto do carbono 3 vai ficar sozinha e uma do carbono 5 vai ficar sozinha. Então se a ligação é sempre nesse sentido eu vou ter uma extremidade 3 e uma extremidade 5, para gerar aí paralelismo entre uma fita e outra. A segunda fita ela trás um sentido oposto vai ser 3 para 5. Enquanto uma fita sobe a outra desce, então nós temos uma fita que vai de 5 para 3 e a outra de 3 para 5, elas são inversas e isso proporciona que as duas fitas expõem as bases nitrogenadas na sua região interna, então essas bases consegue fazer as pontes de hidrogênio que mantem as estruturas paralela do DNA. 
Quando a gente tem o paralelismo entre guanina e citosina nesse momento é formada 3 pontes de hidrogênio. Na timina e na adenina forma duas pontes de hidrogênio. Por que não forma três pontes de hidrogênio? Eu tenho aqui hidrogênio, tenho oxigênio, poderia formar, mas a distancia, o posicionamento espacial dos átomos não permiti que eles compartilhem elétrons, então dá essa característica de forma apenas duas pontes de hidrogênio no paralelismo de timina e adenina e três pontes de citosina e guanina. Daí tem um sítio que é chamado de Tata Box que aonde se inicia aí a replicação e a transcrição das bactérias, o sítio é chamado de Tata Box, é uma sequencia de TA-TA onde vai ter timina e adenina sempre fazendo duas pontes. E considera-se então que o gasto de energia para abrir, quebrar duas pontes de hidrogênio é menor quando comparadas a quebra de três pontes, iniciando um processo aí de separação que separa a dupla fita, só que isso acontece aonde? Nas bactérias onde o momento da replicação todo DNA bacteriano é replicado, onde todo o DNA bacteriano é transcrito de uma vez só. Já nos eucariotos a transcrição vai ocorrer pontualmente, de acordo com a ativação das células, então vão ser transcritos alguns pontos do DNA, outros nunca serão transcritos e daí não segue essa regra que todo ponto de transcrição começa com timina e adenina porque vai ter uma menor força, uma menos energia será gasta. Pro Procarioto isso é verídico, pro eucarioto existem inicio de transcrição que vai começar com guanina-citosina sem problema nenhum, então não se teve durante o processo evolutivo essa preocupação com o gasto energético até mesmo porque esse gasto é mínimo.
O DNA pode ser desnaturado. O que isso significa? Que a estrutura dele pode ser desfeita, alguns fatos químicos podem fazer isso com alteração de PH e principalmente com aumento de temperatura, só que para proteína às vezes um aumento de 45° acaba desnaturando a proteína, mas agora o DNA precisa elevar mais a temperatura de 90° mais ou menos para você desnaturar bem o DNA, então você tem aí um aumento maior 60°, 90°. A proteína quando desnaturada ele não consegue voltar para seu estado original, elas não se renatura, ela não volta a ter sua estrutura tridimensional, ela não é enovelada novamente, provavelmente depois de desnaturada ela não consegue realizar sua função. Já o DNA ele consegue se desnaturar e depois renaturar, voltar o seu estado original.
Replicação: Cópia do DNA.
Ocorre na fase S do ciclo celular. A primeira característica dela é ser semiconservativa, o que é ser semiconservativa? Conserva-se uma parte e cria uma outra parte nova, então a partir da fita velha se constrói uma fita nova, então eu vou ter duas fitas de DNA que depois ao final do ciclo celular vão ser arrastadas e cada uma vai ser levada pra uma célula diferente, mas essa fita de DNA vai servir de molde para uma fita nova, eu vou ter então duas células onde a célula mãe vai ter uma fita velha e uma nova e a célula filha vai ter uma fita velha e uma nova, então isso é característica semiconservativa do DNA. 
Para que o DNA seja copiado ele precisa expor as suas bases e forma o que nós chamamos de Forquilha de Replicação. A forquinha de replicação é uma estrutura aberta no DNA, essa forquilha de replicação ela tem que ser mantida na sua fita velha para ser confiada a uma fita nova. Pra gente conseguir fazer isso existem proteínas que auxiliam essa replicação.
A topoisomerase é uma proteína que tem função de quebrar a tensão que a fita de DNA tem. A hora que você começa a desenrolar a fita pra começar a copiar a fita de DNA (pra copiar ela precisa estar aberta) ela começa a super enovelar na outra ponta, a topoisomerase vem então quebra essa tensão fita. O que ela faz? Ela corta a fita; com a ponta livre você consegue desenrolar a fita sem gerar tensão do outro lado da fita. Isso ocorre principalmente nas bactérias que possui DNA circular. Então a topoisomerase consegue dessa forma mate a fita aberta pra que ela seja copiada. E nos eucariotos? Eu posso pegar de um lado do cromossomo e ir abrindo e replicar todo cromossomo e chegar lá na outra pontinha? Como o genoma do eucarioto é muito grande vai abrir várias bolhas de replicação, então vai ser praticamente o mesmo. Então a topoisomerase mesmo nos cromossomos eucariotos vai ter a função de quebrar a tensão superficial.
Eu preciso manter essa fita esticada, para isso existem proteínas que são chamadas de SSB; são proteínas que estabilizam a fita aberta porque não adianta cortar, eu tenho que esticar e quem mantem essa fita esticada são as SSBs.
Outra proteína importante que é a proteína que separar a dupla fita é chamada de DNA Helicase, a DNA Helicase é uma proteína bem grande e ela entra em uma das fitas e vai separando por força mecânica mesmo, é claro que ela gasta energia pra correr pela fita, mas utiliza a força mecânica já que ela é bem grande em relação à fita de DNA. Para acontecer isso a topoisomerase tem que ir lá primeiro e cortar a fita, ela entra e separa, depois de separada quem mantem a fita aberta são as SSBs.
A partir do momento que eu corto a fita, consegui separar o que mantinha ela paralela, separar as pontes de hidrogênio e manter essa fita aberta, eu vou criar aí o que nós chamamos de Forquilha de Replicação. Não basta a Helicase separar, a SSB tem que manter a fita aberta se não ela enovela. 
No DNA procarioto se abre duas Forquilha DNA circular, uma para cada lado formando ao final 2 fitas de DNA. No eucarioto você vai ter abertura, apenas o inicio de uma forquilha dos dois lados, diferente aí dos procariotos. Como que funciona isso? A replicação do DNA sempre vai ser do sentido 3’ para o sentido 5’. O que significa? A DNA polimerase só polimeriza do sentindo 5’ 3’. Isso significa o que? Que ela só lê a fita do sentindo 35. 
Leitura: 35
Polimerização: 53
Quando o DNA polimerase chega na extremidade 3 – polimeriza, quando ela fez isso ela construiu uma fita 5-3. No caso da DNA polimerase vai ocorrer aí a formação do sentindo e vai e no outro sentindo volta – vai e volta! 
Os procariotos tem 3 polimerases: pol1, pol2 e pol3. Já eucarioto apresenta 5 polimerase que tem aí funções diferentes. Todas a polimerase são enzimas que constrói DNA, pode ser utilizada pra correção de DNA, pode ser usada pra edição da fita de DNA, mas de qualquer forma a função é construção de DNA, síntese de DNA.
Para iniciar a replicação é necessário um iniciador, então não basta só abrir a forquilha de replicação, existe a necessidade de um marcador e quem faz isso é uma enzima que se chama DNA Primase. Comofunciona isso? A gente tem a forquilha de replicação, a DNA primase vai lá e identifica a extremidade 3’ e coloca um primer. O que é um primer? É um pedacinho de RNA. A DNA polimerase identifica esse primer e começa agora a polimerização. A DNA Polimerase ela só vai iniciar a polimerização a partir que tiver esse RNA iniciador e por que um RNA? Por que vai chamar atenção, o RNA é diferente do DNA, então é o lugar que ela consegue identificar pra iniciar a polimerização. Posteriormente esse RNA vai ser trocado pelo DNA. 
A topoisomerase vai lá e quebra a tensão da fita, a helicase tem a função de separar de quebrar as pontes de hidrogênio e as SSBs segura a fita aberta. A fita esta aberta, quem chega? DNA primase vai lá na extremidade 3’ e coloca um pedacinho de primer RNA, tanto de um lado da forquilha quanto do outro lado da forquilha. Agora sim a DNA polimerase pode identificar a extremidade marcada e ela vai então iniciar a replicação.
 A DNA helicase ela vai correndo pela fita e vai abrindo, o que ela vai abrindo ela vai separando a dupla fita. No momento 1 abriu uma fita, no momento 2 abriu mais e no momento 3 a abertura esta ainda maior – conforme ela vai correndo pela fita a forquilha vai ficando cada vez maior.
Momento 1: Forquilha esta aberta, DNA primase vem coloca o primer de RNA na extremidade 3’ de uma fita e coloca um primer RNA na extremidade 3’ da outra fita; DNA polimerase vem identifica esse primer e polimeriza. 
Momento 2: A DNA polimerase quando chega no momento 2 a DNA Helicase abriu mais a fita, então a polimerase faz o que? Continua polimerizando, sempre no sentido 53, a DNA vem polimeriza e acabou ela se desliga da fita; a primase vem constrói outro primer de DNA na extremidade, a DNA polimerase vem identifica aquele primer e constrói novamente, ela chega e corrige também aquela porção de RNA, mas ela não liga uma extremidade com a outra ela simplesmente corrige o primer de RNA, mesmo assim fica uma abertura aí.
A fita contínua é chamada assim já que seu crescimento é continuo, a outra fita que é construída no sentindo aos pedacinhos sempre 53 mas aos pedacinhos é a fita descontínua ou retardada, esses pedacinhos tem um nome aí que se chama Fragmento de Okazaki. Então conforma a DNA helicase vai separando a dupla fita a forquilha vai crescendo, a fita contínua só dá continuidade no seu crescimento, enquanto a outra fita é construída aos pedacinhos então a DNA polimerase vem polimeriza o primeiro pedaço e se desliga; daí encontra o primer de iniciação e polimeriza de novo. A fita descontínua vai ter bastante iniciadores.
DNA primase marca a fita com primer, DNA polimerase identifica o primer e polimeriza. Ela corrige o primer, mas não tem capacidade de unir as fitas, de qualquer forma vai ficar aí fragmentos. Quando essa fita vai ser unida? Vai ser unida pela enzima que é chamada de DNA Ligase. A DNA ligase é a enzima que utilizando energia vai fazer a ligação de um fragmento de Okazaki com outro fragmento de Okazaki. A única coisa que falta pra manter a fita unida é o fosfato, o ATP então doa esse fosfato. Vão ser gastos 2 fosfatos para a reação: um fosfato que vai integrar na estrutura e o fosfato que é quebrado pra gerar energia. Então é uma reação que começa com ATP e termina com ANP, por quê? Foram gastos 2 fosfatos; Um entra na fita pra fazer a ligação fosfodiéster e o outro vai gerar energia pra que essa reação seja feita. Quem faz isso é a enzima ligase!
Como funciona a polimerase? Ela é descrita como uma “mãozinha” nessa mãozinha existe 2 sítio; um sítio de ligação e um sítio de edição. O que significa isso? A DNA polimerase ela não tem consciência de “há eu tenho aqui uma timina e preciso de uma adenina pra parear com ela” não existe essa conscientização! Por que então o pareamento é feito de forma correta? Qualquer nucleotídeo é pego pra construir o DNA, se ela vai ficar lá é outros “quinhentos”! A única coisa que o DNA polimerase pode fazer é manter a estrutura. Pareou, a estrutura está paralela – ela manda a fita seguir adiante pra colocar o próximo nucleotídeo. Não pareou, não conseguiu forma 3 ou 2 pontes de hidrogênio, a estrutura da fita não está paralela – ela manda a fita para o sítio de edição, é retirado o último nucleotídeo e volta para o sítio de polimerização e é colocado um novo nucleotídeo; pareou, a estrutura esta paralela – manda a fita embora no sentindo de colocar outro nucleotídeo, ela vai crescendo completando a fita. Então se ela colocar um nucleotídeo que vai ficar paralelo na fita para ela está certo. Como temos 4 bases as chances dela acerta é de 25%, então a polimerase polimeriza e “checa”, mas a checagem nem sempre é 100%.