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Professor(a) Dr. Aline José Maia MICROBIOLOGIA GERAL E BIOSSEGURANÇA 2023 by Editora Edufatecie. Copyright do Texto C 2023. Os autores. Copyright C Edição 2023 Editora Edufatecie. O conteúdo dos artigos e seus dados em sua forma, correção e confiabilidade são de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial da Editora Edufatecie. Permitido o download da obra e o compartilhamento desde que sejam atribuídos créditos aos autores, mas sem a possibilidade de alterá-la de nenhuma forma ou utilizá-la para fins comerciais. REITORIA Prof. Me. Gilmar de Oliveira DIREÇÃO ADMINISTRATIVA Prof. Me. Renato Valença DIREÇÃO DE ENSINO PRESENCIAL Prof. Me. Daniel de Lima DIREÇÃO DE ENSINO EAD Profa. Dra. Giani Andrea Linde Colauto DIREÇÃO FINANCEIRA Eduardo Luiz Campano Santini DIREÇÃO FINANCEIRA EAD Guilherme Esquivel COORDENAÇÃO DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO Profa. Ma. Luciana Moraes COORDENAÇÃO ADJUNTA DE ENSINO Profa. Dra. Nelma Sgarbosa Roman de Araújo COORDENAÇÃO ADJUNTA DE PESQUISA Profa. Ma. Luciana Moraes COORDENAÇÃO ADJUNTA DE EXTENSÃO Prof. Me. Jeferson de Souza Sá COORDENAÇÃO DO NÚCLEO DE EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Prof. Me. Jorge Luiz Garcia Van Dal COORDENAÇÃO DE PLANEJAMENTO E PROCESSOS Prof. Me. Arthur Rosinski do Nascimento COORDENAÇÃO PEDAGÓGICA EAD Profa. Ma. Sônia Maria Crivelli Mataruco COORDENAÇÃO DO DEPTO. DE PRODUÇÃO DE MATERIAIS DIDÁTICOS Luiz Fernando Freitas REVISÃO ORTOGRÁFICA E NORMATIVA Beatriz Longen Rohling Carolayne Beatriz da Silva Cavalcante Caroline da Silva Marques Eduardo Alves de Oliveira Isabelly Oliveira Fernandes de Souza Jéssica Eugênio Azevedo Louise Ribeiro Marcelino Fernando Rodrigues Santos Vinicius Rovedo Bratfisch PROJETO GRÁFICO E DIAGRAMAÇÃO Bruna de Lima Ramos Carlos Firmino de Oliveira Hugo Batalhoti Morangueira Giovane Jasper Vitor Amaral Poltronieri ESTÚDIO, PRODUÇÃO E EDIÇÃO André Oliveira Vaz DE VÍDEO Carlos Henrique Moraes dos Anjos Pedro Vinícius de Lima Machado Thassiane da Silva Jacinto FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais de Catalogação na Publicação - CIP M217m Maia, Aline José Microbiologia geral e biossegurança / Aline José maia. Paranavaí: EduFatecie, 2024. 115 p.: il. Color. 1. Microbiologia. 2. Biossegurança. 3. Microbiologia médica 4. Olhos – Fisiologia. I. Centro Universitário UniFatecie. II.Núcleo de Educação a Distância. III. Título. CDD: 23. ed. 579 Catalogação na publicação: Zineide Pereira dos Santos – CRB 9/1577 As imagens utilizadas neste material didático são oriundas do banco de imagens Shutterstock . 3 AUTORA Doutora em Agronomia pela Universidade Estadual de Maringá (UEM) — área de concentração Proteção de Plantas. Possui mestrado em Agronomia pela Universidade Estadual do Centro Oeste (UNICENTRO) — área de concentração Produção vegetal. É formada em Agronomia pela Universidade Estadual do Centro Oeste (UNICENTRO). Amplo conhecimento laboratorial, manutenção básica de laboratório, segurança no laboratório, esterilização e técnicas de assepsia, tipos de meio de cultura, preparo de meio de cultivo de fungos e bactérias, condições de crescimento de patógenos, métodos de isolamento de fungos e bactérias, Postulado de Koch (regras de prova de patogenicidade), técnicas de inoculação, manutenção e preservação de culturas, controle de microrganismos in vitro. E também atua nos seguintes temas: proteção de planta, propagação, fruticultura, controle fitossanitário e manejo orgânico em videiras. Informações e contato: Currículo Plataforma Lattes: http://lattes.cnpq.br/4683408883039820 Professor(a) Dr. Aline José Maia http://lattes.cnpq.br/4683408883039820 4 APRESENTAÇÃO Seja muito bem-vindo(a)! Caro(a) aluno(a)! Seja bem-vindo à disciplina de microbiologia. Esta disciplina abordará diversos assuntos a respeito dos microrganismos. Os microrganismos são seres que não são observados a olho nu, nós precisamos de ferramentas para observá-los, para verificar suas diversas formas, reprodução, aspectos bioquímico-fisiológicos e seu relacionamento com o hospedeiro sendo benéfica ou prejudicial. Para estudarmos o mundo dos organismos microscópicos, nosso curso será dividido em quatro unidades: Na unidade I apresentaremos conceito de microbiologia, um breve histórico e marcos da microbiologia. Nesta unidade, também estudaremos a classificação dos seres vivos e as características gerais dos microrganismos como bactérias, protozoários, fungos e vírus, bem como os microrganismos no cotidiano. A unidade II abordaremos a caracterização e controle dos microrganismos, entendendo como obtém uma cultura pura e quais os meios são utilizados para o cultivo de microrganismos, bem como os elementos químicos e condições físicas necessários para o cultivo de microrganismos. Para termos sucesso no isolamento é necessário saber como é feito o preparo dos microrganismos para serem visualizados no microscópio e vamos ver também como é feito o controle dos microrganismos. Na unidade III e IV vamos tratar dos principais grupos de microrganismos. Ao longo da unidade III, vamos destacar A organização celular, reprodução, crescimento, variabilidade genética e principais grupos de bactérias, assim como as principais características dos protozoários. Na unidade IV, vamos estudar as principais características morfológicas, fisiológicas, reprodutivas e a classificação de fungos e as principais características dos vírus. Que você alcance junto conosco, bons resultados ao percorrer esta jornada de conhecimento e que juntos consigamos alcançar os maiores sucessos em multiplicar os conhecimentos sobre tantos assuntos abordados em nosso material. Esperamos contribuir para seu crescimento pessoal e profissional. Abraços e excelente estudo! 5 SUMÁRIO Principais grupos de microrganismos Principais grupos de microrganismo Caracterização e controle dos microrganismos Introdução a microbiologia Professor(a) dra. Aline José Maia INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIA1UNIDADEUNIDADE PLANO DE ESTUDO 7 Plano de Estudos • O que é microbiologia e sua aplicação; • Histórico da microbiologia; • Classificação dos seres e característica geral dos microrganismos; • Microrganismos no cotidiano. Objetivos da Aprendizagem • Compreender as principais características da microbiologia como ciências. • Conhecer a perspectiva histórica da microbiologia. • Diferenciar célula eucarionte de procarionte • Caracterizar os principais grupos de microrganismo • Exemplificar a função dos microrganismos no ambiente INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 8 INTRODUÇÃO Prezado(a) aluno(a), nesta primeira unidade do livro você será apresentado a microbiologia como ciências. No primeiro tópico a ser tratado, traz a compreensão que a microbiologia estuda organismos pequenos, que não são visíveis a olho nu pelo homem, somente com a ajuda do microscópio. Este foi um tópico elaborado com o intuito de sensibilizá-lo(a) sobre a importância da microbiologiaem sua posição mais alta. Agora, olhando através da ocular, com os dois olhos abertos e utilizando o parafuso macrométrico, desça lentamente a mesa até que o material a ser observado seja visto. Corrija a focalização utilizando o parafuso micrométrico. Após percorrer o campo, passe para objetiva de aumento médio (10X) e corrija a focalização utilizando o parafuso micrométrico. Observe o campo atentamente procurando percorrê-lo totalmente utilizando os parafusos da Charriot. Feito isso, passe para objetiva de 40X. Verifique se a focalização modifica, se você abrir ou fechar o diafragma. A atividade ao microscópio é estritamente dinâmica. A postura correta, além dos dois olhos abertos, inclui o fato de a mão direita ficar nos parafusos do “Charriot”, e a mão esquerda do parafuso micrométrico. Assim você poderá percorrer e estudar o campo todo da preparação. Terminando a observação, encaixe a objetiva de menor aumento, abaixe a mesa (ou platina) com o auxílio do macrométrico, desligue a luz e retire a lâmina. 2.4 Preparações microscópicas Para visualizar a maioria dos microrganismos, é necessário prepará-los para que possam ser observados ao microscópio. O preparo deve ser de acordo com o interesse de observação: se for para visualizar os caracteres morfológicos, certos detalhes de estrutura celular, alguma função fisiológica na célula, são várias as técnicas que são utilizadas para a observação de microrganismos. Estas preparações podem ser simples (sem coloração) e trabalhosas (fixadas e coradas. As preparações simples são: sem coloração e com coloração. As preparações sem coloração são: Lâminas e Lamínulas e microcultivo. As preparações com lâminas e lamínulas consiste em uma lâmina limpa, colocar uma gota do material a ser observado e cobrir com lamínula. Se o material ainda não estiver em suspensão, colocar primeiro uma gota de água e, em seguida, com a alça de repicagem, colocar uma pequena quantidade do material e cobrir com lamínula. O Microcultivo é um microrganismo que é cultivado em um pequeno pedaço de meio de cultura colocado em uma lâmina limpa e coberto com lamínula. O conjunto (lâmina + BDA com microrganismo + lamínula) é, então, depositado em câmara úmida e incubado por, aproximadamente, 7 dias. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 41 As preparações com coloração podem facilitar a observação tornando a célula mais visível. Em preparações a fresco entre lâminas e lamínulas, geralmente são utilizados corantes vitais que não comprometem a vitalidade das células, sendo destituídos de ação tóxica. Utilizado principalmente para observação de estruturas fúngicas. As preparações fixadas e coradas são preparações utilizadas na verificação das características morfológicas das bactérias. As etapas essenciais nesta preparação são: preparo do esfregaço: com a alça de platina, coletar uma amostra da suspensão bacteriana e esfregá-lo (espalhar) no centro de uma lâmina limpa e flambada; a fixação: após o esfregaço, a fixação é feita passando a lâmina três vezes diretamente sobre a chama do bico de Bunsen; e a coloração: a coloração pode ser simples (direta ou indireta) ou diferencial. Contudo, a coloração simples direta, o esfregaço fixado e corado utilizando-se apenas um tipo de corante (cristal violeta ou fucsina). Neste tipo de coloração a bactéria adquire a cor do corante e contrasta com o fundo claro (transparente) da lâmina. A coloração simples indireta: é também denominada de coloração negativa; o esfregaço fixado é coberto com uma fina camada de tinta da China ou nanquim. Nesta coloração a bactéria permanece incolor e contrasta com o fundo escuro da lâmina. E a coloração diferencial é realizada com a aplicação de mais de uma solução corante. Ex: coloração de Gram; coloração de esporos bacterianos; coloração de flagelos, etc. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 42 Caro aluno(a), quando estamos trabalhando com o manuseio de microrganismos, seja em um laboratório, um hospital, uma indústria, dependemos de conhecer de como controlar os microrganismos no ambiente onde se encontram. Vários são os métodos que podem manter os microrganismos em uma população estável e a melhor a ser escolhida depende do que você quer destruir. Então neste tópico vamos discutir como iniciou o controle dos microrganismos, algumas determinações de uso corrente, as condições que podem influenciar na morte e o padrão de morte dos microrganismos. Vamos iniciar! O conceito de microbiologia é relativamente novo, no entanto, o controle dos microrganismos já era realizado a centenas de anos atrás. O cozimento dos alimentos é um dos métodos de preservação dos alimentos mais antigo e que é empregado até hoje com algumas modificações. Durante a quebra da teoria da geração espontânea, os cientistas da época comprovaram que a fervura poderia matar muitos microrganismos, embora bactérias esporulantes pudessem sobreviver devido à sua resistência ao calor. Os cientistas descobriram que os microrganismos poderiam ser mortos quando expostos a várias substâncias químicas ou de serem removidos do ar, ou de um líquido utilizando filtros especiais. Todas essas descobertas foram aplicadas na produção industrial de vinhos, cervejas, e produtos alimentícios. Para o controle de fermentação, deterioração de alimentos foram utilizados filtros de algodão e elevadas temperaturas. No século XIX, estes mesmos conceitos foram aplicados em hospitais, onde alguns médicos defendem as técnicas de limpeza, esterilização dos equipamentos cirúrgicos, entre outros. FUNDAMENTOS DE CONTROLE DOS MICRORGANISMOS3 TÓPICO CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 43 As substâncias antimicrobianas, são aquelas que matam ou inibem o crescimento dos microrganismos. Dependendo do microorganismo afetado se tornam específicos como: antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoários e antiviral. Os agentes antimicrobianos que matam os microrganismos são denominados de microbicidas. As denominações bactericidas e fungicidas indicam o tipo de microrganismo destruído. E quando ocorre a destruição de todos os microrganismos presentes em um material é denominado de esterilização. No entanto, tem os agentes que inibem o desenvolvimento do microrganismo, que são chamados microbiostáticos, e claro que muitas definições podem surgir, sendo os mais utilizados fungistático e bacteriostático. Os agentes microbianos podem ser agentes físicos e químicos, que serão discutidos no próximo tópico. Neste tópico vamos discutir aspectos fundamentais que se aplicam às duas classes de agentes de controle, incluindo: o padrão de morte da população microbiana, as condições que influenciam a eficácia de uma agente de controle e a forma pela qual as células microbianas podem ser lesionadas. Na microbiologia, o critério de morte do microrganismo é a sua capacidade de reproduzir, ou seja, o termo morte é definido como a perda de capacidade de reprodução. Quando avaliamos a eficácia de um agente físico ou químico em uma determinada amostra contamos o número de microrganismos que sobrevivem e a capacidade destes em se multiplicarem. Os microrganismos não são mortos instantaneamente ao contato com os agentes. O tempo que leva para a morte depende do tamanho da população microbiana. Os microrganismos morrem em uma relação constante, em um dado período de tempo. (Morte exponencial), como apresentado na tabela 1, a qual, mostra que a taxa de morte é normalmente constante, ou seja, a cada 1 minuto - 90% da população microbiana morre. TABELA 1: PADRÃO CARACTERÍSTICO DE MORTE DOS MICRORGANISMOS LEVANDO EM CONSIDERAÇÃO O TEMPO, CÉLULAS MORTAS E AS CÉLULAS QUE SOBREVIVEM Tempo (min) Células mortas Sobreviventes 0 0 1.000.000 1 900.000 100.000 2 90.000 10.000 3 9.000 1.000 4 900 100 5 90 10 6 9 0 Fonte: Adaptado de Pelczar Jr, M.J. et al. (1996). CARACTERIZAÇÃO ECONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 44 À medida que o tempo vai passando o número de células vai diminuindo, então jamais teremos certeza que a última célula será atingida pelo agente de controle. Um exemplo clássico é a exposição de esporos de Bacillus anthracis ao fenol a 5%, sendo que o número de esporos sobreviventes diminui com o aumento do tempo de exposição ao fenol a 5%. Estes resultados são obtidos em condições ambientais controladas, inclusive as condições fisiológicas do microrganismo tratado. Os agentes de controle dos microrganismos podem sofrer grande influência de vários fatores ambientais, bem como as características biológicas do microrganismo. Dentre as variáveis de maior importância a serem consideradas quando se quer avaliar a eficácia de um agente antimicrobiano são: o tamanho da população microbiana; Intensidade ou concentração do antimicrobiano; tempo de exposição ao agente microbiano; temperatura que os microrganismos são expostos ao agente antimicrobiano; natureza do material que contém microrganismos e característica do microrganismo presente. Em relação ao tamanho da população, quanto maior for, mais tempo vai levar para morrer. Quanto menor for a intensidade ou a concentração do antimicrobiano, mais tempo se leva para destruir uma população de microrganismos. E quando se leva em consideração o tempo de exposição, quanto maior for o tempo maior será o número de células mortas. Em relação à temperatura, quanto mais alta for, mais rápido a população é morta. Várias são as características do material que contém o microrganismo que podem afetar o índice de morte das células. Por exemplo, pode-se utilizar o calor úmido para esterilizar meio de cultura. Entretanto, conservas de alimento requerem temperaturas menores. Os microrganismos também podem variar quanto à sua resistência aos agentes físicos e químicos. Por exemplo, bactérias gram positivas (vamos estudar no próximo capítulo) são mais resistentes ao calor que as gram-negativas. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 45 Você percebe, caro aluno(a), a importância de fazer o controle de microrganismos? Vejam, Louis Pasteur (1859), colocou em prática noções de esterilização e assepsia. Ele começou a incrementar métodos que evitam a propagação de doenças, deixando o ambiente estéril, um ambiente livre destes microrganismos. Como ele propôs que as doenças fossem causadas por microrganismos, ele também propôs formas de evitá-las, sendo desta forma a esterilização de equipamentos para matar os microrganismos deixando o material livre deles. Bom, pensando em evitar o desenvolvimento de microrganismos, precisamos saber o conceito de assepsia, antissepsia, desinfecção e esterilização. A assepsia é o conjunto de medidas usadas para impedir a entrada do microrganismo no ambiente que não os têm, ou seja, um lugar asséptico é aquele ambiente que está livre de infecção. Quando seu objetivo é realizar um conjunto de medidas para inibir o crescimento de um microrganismo ou removê-lo de um determinado ambiente, podendo ou não o destruí-lo, denominamos de procedimentos antissépticos. A ocorrência da redução do número de microrganismos por meio de um método físico ou químico é denominado de desinfecção. A esterilização é a destruição de todas as formas de vida microbiana (fungos, bactérias e vírus) seja por meio da aplicação de um método físico ou químico. Entre os agentes físicos temos: o calor, a flambagem, a filtragem e a radiação. CONTROLE FÍSICO E QUÍMICO DOS MICRORGANISMOS4 TÓPICO CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 46 4.1 Calor O Calor é utilizado para esterilizar materiais que não alteram sua forma, ou o peso quando expostos a altas temperaturas. A esterilização via calor pode ser o vapor ou o calor seco. 4.1.1 Calor úmido O Vapor Saturado ou calor úmido emprega-se a autoclave (Figura 4). Na falta deste equipamento pode utilizar uma panela de pressão com um termostato. A temperatura e o tempo de esterilização úmido são menores que a esterilização a seco. Porque seu poder de penetração é maior levando a morte dos microrganismos que se dá por meio da coagulação de proteínas. O tempo e a temperatura de autoclavagem varia de acordo com seu grau de contaminação e depende do tipo de material. Normalmente usa-se o binômio 10-15 minutos a 121 graus ou 20 minutos a 115 graus, isso para baixo grau de contaminação. Para grau de contaminação mais elevado procede-se 2 a 3 autoclavagem sucessivas com intervalo de 24 horas a 121 graus por duas horas. A autoclavagem é recomendada para autoclavar meio de cultura, água, solo, entre outros similares. No entanto, produtos oleosos não podem ser autoclavados, pois a esterilização é superficial, devendo ser esterilizada pelo calor a seco ou filtragem. Alguns compostos termolábeis como compostos voláteis, hormônios, antibióticos, fungicidas são parcialmente ou totalmente inativados quando expostos a altas temperaturas, razão pela qual devem ser adicionados ao meio de cultivo após a autoclavagem e serem submetidos a filtragem. A alta temperatura causa alterações no meio de cultura, razão pelo qual deve ser autoclavado pelo tempo mínimo exigido, as mudanças mais comuns são mudança no pH, por isso deve ser aferido após autoclavagem, hidrólise parcial dos carboidratos, reações entre açúcares e aminoácidos formam substâncias inibitórias aos microrganismos e sucessivas autoclavagens hidrolisam o ágar e inibem o crescimento microbiano. FIGURA 4: AUTOCLAVE (LADO ESQUERDO) E AS ESPECIFICAÇÕES DE USO (LADO DIREITO). Fonte: A autora. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 47 Antes de iniciar um processo de autoclavagem é necessário tomar alguns cuidados que são listados a seguir. • Verificar o nível da água; • Não deve empilhar material dentro da autoclave, pois impede a passagem da circulação do vapor, o que impede a autoclavagem perfeita. • Não encher os frascos, com mais de 2/3 de sua capacidade, pois durante a autoclavagem o líquido ferverá, podendo transbordar e também não deve vedar por completo o frasco, pois pode com a fervura dar pressão e ocorrer o derramamento da amostra. • Os recipientes vazios devem ser autoclavados deitados para o vapor circular adequadamente. • Ao ligar a autoclave deixe sair bastante vapor para que ocorra a completa remoção do ar, assim as temperaturas internas se mantêm constantes mantendo adequada a pressão fornecida pelo manômetro. • Quando desligar deixe sair o vapor lentamente, assim não corre o risco do líquido entrar em ebulição e extravasar. Após a saída do vapor, o que fazer? Retira-se imediatamente o material? O material deve permanecer no mínimo de 15 a 45 min para secagem. E o que fazer quando não se tem autoclave? O meio de cultivo pode ser esterilizado em banha maria por 30 a 60 min com intervalo de 24 horas por três dias consecutivos. 4.1.2 Calor seco A esterilização a seco é utilizada para vidrarias, metais e alguns óleos e outros compostos estáveis em altas temperaturas. Este tipo de esterilização consiste em aumentar a temperatura do ambiente para matar o microrganismo oxidado, ou seja, desidratação do seu núcleo celular. O calor tem poder de penetração menor por isso é necessário empregar temperaturas e tempos maiores quando comparado com a esterilização via calor úmido, sendo o tempo inversamente a temperatura. Os binômios mais usados são 1 hora a 180 graus; duas horas a 170 graus; 4-6 horas a 140 graus e 12-16 horas 120 graus. O tempo deve ser contado logo que a temperatura atinja o valor desejado. Os equipamentos utilizados para esterilização por calor a seco são: estufa de circulação e ar forçado e estufa com circulação de ar por gravidade. A estufa de circulação de ar por gravidade demora mais tempo para atingir a temperatura. Quais são os cuidados a serem tomados para a esterilização a calor seco? Os cuidados são os seguintes: Verificar otipo de material a ser esterilizado, pois tem material que entra em combustão quando CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 48 exposto a altas temperaturas. Não deve ser esterilizado material graduado, pois pode ocorrer alteração que afetam a precisão volumétrica das medidas. Quando o material é envolvido por papel não se deve abrir a porta da estufa durante ou imediatamente após o processo de esterilização, o ideal é esperar 30 min para abrir a porta da estufa, pois o papel pode entrar em combustão quando em contato com o ar. E não colocar material em contato com as paredes internas para facilitar a circulação do calor. Todo o material a ser esterilizado por meio do calor seco deve ser embrulhado no papel Kraft, ou alumínio, ou acondicionados em caixas de inox para evitar contaminação após ser esterilizado. 4.2 Flambagem A flambagem é usada para esterilizar utensílios metálicos como agulhas, pinças, alças de platinas ou vidros durante o processo de isolamento e repicagem de microrganismos. Para fazer a flambagem desses utensílios é necessária uma lamparina com álcool ou o bico de Bunsen. A temperatura ideal é acima de 45 graus, no entanto, na prática ao flambar o metal considera-se que essa temperatura é atingida no momento que o material fica vermelho (figura 5), e quando o utensílio é de vidro deve ser passado várias vezes pela chama. FIGURA 5: FLAMBAGEM DA ALÇA DE PLATINA, CONSIDERADA FLAMBADA QUANDO A PONTA DO METAL FICA VERMELHA Fonte: A autora. 4.3 Filtragem A filtragem é a separação física de microrganismos, células, fragmentos orgânicos, porém não é eficiente para vírus. É utilizada para esterilizar soluções aquosas, orgânicas, óleos e produtos termolábeis (sensíveis a altas temperaturas) como vitaminas e hormônios. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 49 Vários são os tipos de filtros empregados na filtragem: • Membrana celulose: mais utilizadas em virtude de sua praticidade e baixo custo. O diâmetro do poro é de 0,22 micras. • Filtro de vidro: é a fusão de pequenos fragmentos de vidro, a vantagem é que pode ser reutilizado. • Filtros de amianto: quanto maior a quantidade de amianto, maior a eficiência. Entretanto, é um produto carcinogênico que deve ser evitado. Para realizar a esterilização por filtragem é necessária pressão para a passagem do líquido, normalmente usa uma bomba a vácuo. E todo o material usado na filtragem deve ser autoclavado. 4.4 Radiação A radiação também pode ser utilizada na esterilização do material, podendo ser de dois tipos: radiação ultravioleta e radiação gama e beta. A radiação ultravioleta interfere diretamente no desenvolvimento do microrganismo. A luz germicida atua nos ácidos nucleicos, provocando rearranjo no material genético, induzindo a mutação no microrganismo. Para obter esse tipo de radiação utilizam-se germicidas que emitem raios ultravioleta com baixo comprimento de onda que vai de 250 a 260 nanômetros que tem alto poder germicida. 4.4.1 Será que as lâmpadas germicidas são iguais a lâmpadas fluorescentes? O princípio de funcionamento, sim, mas as lâmpadas germicidas são revestidas de quartzo que transmite 93% de raios ultravioletas, enquanto que as lâmpadas fluorescentes são revestidas de vidro, transmitem pouquíssimo ultravioleta. Este tipo de esterilização é utilizado em câmara de fluxo laminar (Figura 6), ou sala de assepsia devido seu baixo poder de penetração. O tempo mínimo é de 20 a 30 minutos. E sempre tomar cuidado para evitar o contato com a pele e os olhos. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 50 FIGURA 6: CÂMARA DE FLUXO COM A LUZ GERMICIDA LIGADA. Fonte: A autora. A radiação gama ou beta trata-se de um método de esterilização a baixa temperaturas com alto poder de penetração. É empregado em materiais termossensíveis como luvas, seringas, gazes e outros produtos. Este método é empregado também em frutos. Seu custo é relativamente alto, o que limita seu uso. 4.5 Métodos químicos Os métodos químicos utilizam substâncias que têm capacidade de matar ou inibir o crescimento de um microrganismo. Dentre os métodos químicos, podemos citar os gases tóxicos e as soluções desinfetantes. Os gases tóxicos são utilizados para materiais que têm propriedades que não permitem esterilizar pelo método físico. Sua vantagem é que o processo de esterilização pode ser realizado a baixa temperatura e umidade e pode ser aplicável em uma grande quantidade de material de uma vez, alimentos, por exemplo. E não exige equipamentos para ser aplicado, o material pode ser acondicionado em sacos plásticos ou caixas seladas. A grande desvantagem é o custo elevado. Comumente usa-se óxido de etileno, formaldeído e óxido de propileno. O óxido de etileno é um gás com grande poder de penetração, é extremamente tóxico mesmo em baixa concentração é explosivo quando entra em contato com o ar, por isso tem que tomar cuidado com seu manuseio. A esterilização é rápida cerca de 3h a temperatura ambiente. Geralmente utilizado para esterilizar produtos médico-hospitalares, solos e solução aquosa. O formaldeído é um excelente micro biocida. Seu uso é restrito devido à alta toxicidade, alta capacidade de difusão ao ar e baixo poder de penetração. Para esterilizar CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 51 câmaras de crescimento costuma-se colocar um pedaço de algodão embebido em formaldeído dentro por 24 horas. A câmara de crescimento deve ser utilizada após 72 horas para eliminar qualquer resíduo do produto. Para manusear o produto deve usar luva, máscara e pinça. O óxido de propileno é menos efetivo que o óxido de etileno, no entanto, é utilizado para esterilizar placas de Petri e porções vegetais empregadas em meio de cultivo para induzir a esporulação de fungos. Entre as soluções desinfetantes mais utilizadas nos laboratórios de microbiologia podemos citar: o álcool 70%, ou hipoclorito de sódio e o peróxido de hidrogênio. O álcool 70% é amplamente utilizado na obtenção do microrganismo em cultivo puro, como também em superfícies de trabalho e câmara de fluxo. Quando utilizamos o álcool 70% para desinfetar fragmentos estes ficam de 30 a 60 segundos mergulhados no álcool 70%. O hipoclorito de sódio ou cálcio é eficiente para eliminar microrganismos oportunistas da superfície dos tecidos. O hipoclorito de sódio ou cálcio é utilizado nas concentrações de 0,05 a 0,1%. E o peróxido de hidrogênio é usado na concentração de 5% (pv). E para finalizarmos a nossa unidade é necessário saber como é feita a higienização de um laboratório. Quando trabalhamos com microrganismos. Temos que estar atentos a vários cuidados de assepsia e o material a ser utilizado, pois qualquer corpo estranho pode levar a risco todo o trabalho, experimento ou resultado de uma pesquisa. Por isso devemos seguir algumas normas que ajudam a obter sucesso no nosso trabalho. Primeiro de tudo, não é permitido varrer a seco o piso nas áreas de manipulação de microrganismos, pois ao varrer estará levantando partículas de poeira que ficam no ar, principalmente em ambientes onde se encontra a câmara de fluxo. Essas partículas podem servir de contaminantes. Um aspecto prático e importante é a compartimentalização do laboratório, tais como: sala de recebimento das amostras, sala de triagem, sala dos preparos de meios de cultivo, sala do fluxo laminar, sala de esterilização. Todos estes compartimentos devem ser bem distribuídos para diminuir os riscos de contaminação. Em relação às vidrarias como placas de Petri, tubos de ensaio e Elermeyers, contendo colônias de microrganismos, devem ser previamente autoclavadas a 121 graus por 20 minutos e em seguidas lavadas com água e sabão e enxaguadas três vezes em água destilada e secadas em estufas. A lâminas e lamínulas são colocadas em um frasco contendo água e detergente para posteriormente serem lavadas e enxaguadas em água destilada. CARACTERIZAÇÃOE CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 52 Quando estamos trabalhando em um laboratório, tanto na entrada como na saída costuma-se higienizar as mãos, pois as mãos são veículos de disseminação de microrganismos, justificando sua contínua necessidade de higiene. Em pesquisas desenvolvidas por pesquisadores da Universidade Federal do Piauí, foi demonstrado a higienização das mãos com clorexidina a 2% apresentou qualitativamente maior potencial para redução de microrganismos quando comparado com o álcool 70% e iodopovidona 10%, substâncias estas com ação antimicrobiana. Fonte: BATISTA, de Sousa, É., MOREIRA, W. C., de ALENCAR Rego, A. P. de Sá, M. R. (2021). Eficácia de produtos de higienização das mãos: estudo quase-experimental. Revista de Enfermagem da UFPI, 10 (1). REFLITA O ágar tem origem no Japão por volta de 1658, sendo introduzido nos países produtores de algas agarófitas. E somente em 1882, na Europa, passou a ser usado em meios de cultura bacteriológicos. As algas são usadas como matéria-prima para a produção de ágar. A gelificação, fusão e suas frações (agarose e agaropectinas) baseiam-se em pontes de hidrogênio. O ágar apresenta diversas aplicações, indústrias alimentícia, cosmética, farmacêutica, biomédica e de biotecnologia. Os géis de ágar são importantes nas preparações alimentícias com alto teor de fibra bruta solúvel, pois o ágar é o aditivo alimentar com maior teor dessa fibra, superior a 94%. Ultimamente foi iniciada a produção de ágares mais facilmente solúveis em água em temperaturas abaixo do ponto de ebulição, o que se mostra ter vantagens notáveis para algumas de suas aplicações. Fonte: Armisen, R., & Gaiatas, F. (2009). Agar. In Handbook of hydrocolloids. (pp. 82-107). Woodhead Publishing. Fonte: Lee, W. K., Lim, Y. Y., Leow, A. T. C., Namasivayam, P., Abdullah, J. O., & Ho, C. L. (2017). Biosynthesis of agar in red seaweeds: A review. Carbohydrate polymers. 164, 23-30. SAIBA MAIS CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 53 É importante que, com o término do conteúdo da unidade, venha também um encerramento, para que se concluam as propostas realizadas na Introdução e para que se retome criticamente tudo o que foi trabalhado durante o desenvolvimento. Isso auxilia o aluno a fixar o conteúdo já trabalhado e organizar melhor a informação em sua linha de raciocínio. Caro aluno(a), estamos finalizando a Unidade II de nosso livro didático de microbiologia. Assim, torna-se importante salientar algumas discussões que foram propostas. Nesta unidade, abordamos como caracterizar e controlar os microrganismos. Iniciamos nossa discussão falando de como obter uma cultura pura de microrganismo dando enfoque nos principais meios de cultivo utilizados para obter a colônia pura de diversos microrganismos. Na sequência, abordamos a Microscopia e preparação microscópica, item esse de suma importância, pois por meio do microscópio conseguimos visualizar os microrganismos. Você percebeu que foi adicionado exemplos de como é possível visualizar estruturas de microrganismos no microscópio ótico. No terceiro item que abordamos os fundamentos para o controle dos microrganismos, uma etapa que foi discutido a morte dos microrganismos que não ocorre de imediato, tornando cada vez mais difícil acertar o alvo (microrganismo) e as condições que interferem na eficácia dos agentes antimicrobianos. E como último assunto discutido nesta Unidade II, não menos importantes, estão agentes antimicrobianos que são fundamentais para manter a população microbiana estável em qualquer local de pesquisa, trabalho, entre outros. E é muitas vezes a busca dos pesquisadores por agentes antimicrobianos cada vez mais eficazes. Finalizando esta unidade, passemos para a unidade III. CONSIDERAÇÕES FINAIS CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 54 Olá, aluno(a), leia as literaturas abaixo, que lhe ajudará a entender os métodos que auxiliam no controle de microrganismos que podem ocasionar danos à saúde humana. Estas três literaturas também ajudam a conceitualizar métodos de controle dos microrganismos. • RODRIGUES, D. G., da SILVA, N. B. M., REZENDE, C., JACOBUCCI, H. B., & FONTANA, E. A. (2011). b. Avaliação de Dois Métodos de Higienização Alimentar. Saúde e Pesquisa. 4(3). • GONÇALVES, B. M., & dos Santos TORIANI, S. (2021). Hábitos relacionados à higiene alimentar em tempos de COVID-19: uma pesquisa com estudantes de uma instituição de ensino superior privada de Joinville (SC). Brazilian Journal of Development, 7(2), 18799-18811. • CAVALCANTE, R. R., & de ASSIS, R. C. (2020). Utilização de ácidos orgânicos como alternativa para higienização de alimentos: uma revisão integrativa. Holos Environment, 20(3), 335-351. LEITURA COMPLEMENTAR CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 55 MATERIAL COMPLEMENTAR FILME/VÍDEO • Título: Videoaula 01 - Boas Práticas em Fabricação de Alimentos • Ano:2018; • Sinopse: Este vídeo mostra as boas práticas de fabricação de alimentos. Este vídeo mostra como monitorar a saúde do manipulador. No YouTube, estão disponíveis mais três vídeos referentes às boas práticas de fabricação, roteirizada pelo SENAR/AGROFORT. Os vídeos abordam os seguintes assuntos: Fabricação de alimentos, higiene pessoal, indústria alimentar, transporte alimentar, alimentos, legislação sanitária, Armazenamento e Agroindústria. • Link do Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=-bLaRBAyMLI LIVRO • Título: Manual de aulas práticas em Microbiologia • Autores: Kátia Regina Shwan-Estrada (UEM), Julio Cesar Tocacelli Colella (UniFatecie) e Bruna Broti Rissato (UEM); • Editora: Universitária EduFatecie; • Sinopse: O livro foca as normas gerais de um laboratório de microbiologia, limpeza, como acondicionar vidrarias e outros materiais, modo de preparo de meios de cultura, como montar as preparações microscópicas, metodologia de isolamento de bactérias e fungos. odo, com personagens marcantes e situações do fim deste ciclo. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 https://www.youtube.com/watch?v=-bLaRBAyMLI Professor(a) Dra. Aline José Maia PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMO3UNIDADEUNIDADE PLANO DE ESTUDO 57 Plano de Estudos • Organização celular de bactérias; • Reprodução, crescimento e variabilidade genética de bactérias; • Principais grupos de bactérias; • Principais características de Protozoários. Objetivos da Aprendizagem • Reconhecer a forma, arranjo das células bacterianas; • Compreender a diferença entre as paredes celulares de bactérias gram-positivas e gram-negativas; • Discutir a estrutura e a função das organelas encontradas em protozoários. PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 58 Estimado aluno(a), a unidade III do nosso livro didático tem por finalidade apresentar a você as diferentes estruturas que fazem parte de células microbianas, nesta unidade, daremos início a discussão das estruturas de microrganismos procariotos e eucariotos. O primeiro tópico aborda a célula bacteriana, na qual tem uma diversidade de estruturas funcionando em conjuntas, sendo que algumas destas estruturas são encontradas externamente fixadas à parede celular, enquanto que outras são internas. Com a combinação de estruturas internas e estruturas sobre a bactéria é possível desenhar a estrutura típica de uma célula bacteriana. Na sequência estudaremos a Reprodução, Crescimento e Variabilidade Genética de bactérias de forma a apresentar o processo de reprodução assexuado, o padrão de crescimento das células e as três vias pela qual o material genético pode ser transferido de uma célula bacteriana para outra. No terceiro tópico serão apresentadas as principais diferenças dos grupos: Eubactérias e arqueobactérias, sendo que algumas das diferenças são fundamentadas na parede celular, presença de fosfolipídeos e síntese proteica. Ainda, serão apresentados nesta unidade, as principais estruturas que caracterizam os protozoários.Estruturas estas, que comprovam que o protozoário é um organismo eucarioto, o que o diferencia das bactérias que são procariotas. Vamos às nossas discussões! INTRODUÇÃO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 59 Tendo por base as nossas unidades I e II, caro(a) aluno(a), a partir de agora, vamos conhecer a morfologia e a estrutura das células bacterianas e protozoários. Começaremos, neste primeiro tópico, pela morfologia e estrutura das células bacterianas (figura 1). FIGURA 1. ESTRUTURA DA CÉLULA BACTERIANA. Fonte: Shutterstock ORGANIZAÇÃO CELULAR DE BACTÉRIAS1 TÓPICO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 60PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 As bactérias são microrganismos procariontes, o núcleo não é delimitado por membranas. A maioria é formada por uma única célula e apesar dos seus 3, 5 bilhões de anos durante os quais têm evoluído a célula bacteriana é simples se observarmos em um microscópio ótico sua forma, tamanho e arranjo. Na verdade, por trás desta simplicidade se esconde uma maquinaria altamente complexa no seu interior, se observarmos em um microscópio eletrônico moderno, vamos ver estruturas que raramente poderiam ser vistas ou sequer imaginadas pelos primeiros micologistas. A associação das bactérias com seus hospedeiros pode ser parasitária e simbiótica. Estas relações envolvem a entrada da bactéria nos tecidos do seu hospedeiro, porém a parasitária causa mal as células do hospedeiro, por exemplo, Corynebacterium diphtheriae, que causa difteria em humanos, Xanthomonas vasicola pv. vasculorum que causa doenças em planta de milho. A relação simbiótica causa benefício para a bactéria e para seu hospedeiro, como, por exemplo, as bactérias fixadoras de nitrogênio, Bradyrizobium e Azospirilum em raízes de plantas. Vamos tratar aqui as características principais da célula bacteriana começando com a morfologia da bactéria (figura 1). As bactérias são invisíveis ao olho humano. As células bacterianas variam em tamanho dependendo da espécie, de modo geral medem de 0,5 a 1 micrômetro em diâmetro. A característica distinta das bactérias é a relação área de superfície e volume celular, ou seja, existe uma grande superfície através da qual os nutrientes podem entrar em relação a um pequeno volume de substâncias para ser alimentado. Essa característica pode explicar a alta atividade metabólica e o rápido crescimento das bactérias. As bactérias podem apresentar três formas: esféricas, cilíndricas e espiraladas. As esféricas, são denominadas de cocos, são geralmente arredondadas, podendo ser ovoides ou achatadas em um dos lados, quando aderidas umas às outras. As células cilíndricas ou em forma de bastão são chamadas de bacilos. E as espiraladas ou helicoidais assemelham-se a um saca rolha e são denominadas de espirilos. Ainda tem as bactérias que não tem uma forma definida, são chamadas de Pleomórficas. E estas formas sofrem modificações, ou seja, quando observamos a bactéria no microscópio elas estão acopladas umas às outras. As bactérias podem crescer em arranjos, por exemplo: • Cocos: diplococos (duas células); estreptococos (forma uma cadeia); Sarcinas (pacote cúbico com oito células) e estafilococos (agrupadas em forma de um cacho de uva). • Bacilos: lado a lado (duas células); estreptobacilos (forma em cadeia); cocobacilos (bastonete muito curto, cuidado para não confundir com bacilos). Filamentosos 61PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 ramificados: são aquelas bactérias que formam hifa e esporangiósporos, é uma exceção. Exemplo Actinomicetos. Agora, caro(a) aluno(a) vamos discutir as estruturas externas das bactérias. As bactérias apresentam no seu exterior as seguintes estruturas (Figura 1). • Flagelos: permite às bactérias se movimentarem para um meio mais favorável. Os flagelos são filamentos finos, para serem observados no microscópio ótico é necessário usar substâncias que deixam o flagelo mais espesso, forma helicoidal, que se estendem da membrana plasmática e atravessam a parede celular e propulsiona a bactéria através de líquidos, são muitas vezes mais longos que a célula bacteriana e é formado por três partes: gancho, corpo basal, e filamento. O fancho é ligado ao corpo basal e este ao filamento que é responsável pela movimentação de rotação devido à rotação do gancho que é parecido com o motor de um barco, que empurra a bactéria em um meio aquoso a curtas distâncias. A rotação do ganho ocorre por uma força de próton motiva e o sentido da rotação se dá por uma cascata de sinalizadores na parede celular e no citoplasma. Estas proteínas ativam a movimentação horária e anti-horária do gancho. O estímulo direcional se dá por fatores ambientais: quimiotaxia (componentes químicos), aerotaxia (oxigênio) e fitotaxia (luz). Nem todas as bactérias apresentam flagelos, por exemplo, cocos raramente tem essa organela. Enquanto que bacilos e espirilos, o número de flagelos são utilizados para classificar em grupos taxonômicos em presença ou ausência de flagelos: atríquias (sem flagelos), monotríquias (um par de flagelos), lofotríquias (conjunto de flagelo polares) e peritríquias (flagelo distribuído no corpo todo da bactéria. • Fímbrias e pelos: são filamentos mais curtos e finos que os flagelos, são numerosos e visíveis somente em microscópio eletrônico. As fímbrias são localizadas ao redor da célula bacteriana formadas por uma proteína fimbrina ou pilina. É observada em colônias que se desenvolvem em ambientes ricos em oxigênio. A função das fímbrias é a adesão da célula bacteriana a diversas superfícies e a transferências genéticas por conjugação, neste caso a fímbria envolvida é denominada de pelo sexual, e as células precisam ser compatíveis entre si, na qual uma célula é doadora e a outra receptora. • O glicocálice: também denominada de cápsula ou exopolissacarídeo, é uma camada viscosa que recobre a célula bacteriana. Ela tem diversas funções, esta camada viscosa permite aderência da célula a várias superfícies, seja pedras, dentes e raízes de plantas. Protege a célula contra dessecamento temporário, favorecendo a sobrevivência da célula em condições adversas na superfície do 62PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 hospedeiro devido à formação de uma mucilagem nesta superfície. Na indústria de alimentos esta camada é responsável pela formação do lodo, afetando a qualidade do produto final. Agora caro(a) aluno(a) vamos discutir o envelope, que designa um conjunto formado por: parede celular, membrana interna e membrana externa. A parede celular é uma estrutura rígida, responsável pela forma da célula, protegendo-a do ambiente externo e está envolvida no processo de crescimento e divisão celular. A parede celular circunda toda a célula bacteriana externamente ao citoplasma. A rigidez protege a membrana plasmática e o conteúdo celular interno, evitando o extravasamento do citoplasma ou rompimento da célula. Essa rigidez também se deve a presença de peptidoglicano. O peptidoglicano é um heteropolissacarídeo que forma uma malha como se fosse uma treliça, dando uma maior rigidez à parede celular. A espessura de peptideoglicano na parede celular pode classificar as bactérias em duas categorias: As Gram + e as Gram -. As bactérias Gram+ apresentam por 50% de peptidoglicano por peso e ácido teicóico que tem a função no crescimento celular e na especificidade antigênicas (capacidade de se combinar com outras moléculas) e o ácido lipoteicóico (promove aderência). As bactérias Gram — apresentam 10% de peptidoglicano por peso, no entanto, apresenta membrana externa a camada de peptidoglicano. Essa membrana externa é formada por uma camada dupla de fosfolipídios e lipopolissacarídeos (LPSs) mais um conjunto de proteínas confere a esse tipo de bactéria propriedade patogênica específica, Os LPSs são pobremente neutralizados pelos anticorpos, fazendo que as bactérias gram- são mais resistentesaos antibióticos e suscetíveis ao rompimento mecânico uma vez que tem menor quantidade de peptideoglicano. Entretanto, as bactérias gram+ são suscetíveis ao antibiótico e muito mais resistentes aos danos mecânicos. Agora, caro(a) aluno(a) que você conhece a estrutura e composição química da parede celular procariótica, é fácil compreender os mecanismos de coloração de Gram, uma das mais importantes técnicas para diferenciar as bactérias. A técnica foi descrita pela primeira vez por Christian Gram, na Dinamarca. Esta ‘técnica consiste no esfregaço bacteriano que é tratado por reagentes na seguinte ordem: o corante púrpuro cristal de violeta, a solução iodo (um mordente, que é uma substância que fixa o corante no interior da célula), o álcool (agente descolorante que remove o corante de certas bactérias) e o corante vermelho safranina. As bactérias Gram – positivas, que retém o corante cristal de violeta e aparecem coradas de violeta-escuro; e as bactérias 63PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 Gram-negativas, que perdem o cristal de violeta quando tratadas com álcool. As bactérias Gram negativas são coradas com o corante safranina e aparecem coradas de vermelho. Caro(a) aluno(a), agora você consegue responder a seguinte pergunta: Por que as bactérias Gram-negativas são coradas em vermelho? A resposta parece estar relacionada com a espessura de suas paredes celulares que durante o processo de coloração Gram as células tratadas com cristal de violeta, em seguida com uma solução iodo, resulta em um complexo cristal violeta-iodo (CVI) dentro da célula. Quando uma bactéria Gram-negativa é tratada com etanol, o lipídio da membrana externa é dissolvido e removido. Isso rompe a membrana externa e aumenta a permeabilidade. Assim o complexo pode ser removido, descorando a bactéria Gram-negativa que pode ser tingida com safranina. A bactéria Gram- positiva, o etanol faz com que os poros de peptideoglicano se contraiam e o complexo corante CVI permaneça no interior da célula. As estruturas internas ao envelope estão nas regiões delimitadas pela parede celular e membrana plasmática (Figura 1). Iniciaremos caro (a) aluno (a) pela área citoplasmática que é onde ocorrem as reações metabólicas capazes de gerar energia. É na região citoplasmática que é sintetizado os pigmentos como, por exemplo, os pigmentos amarelos (xanthomonadinas) produxidos pelas Xanthomonas, pigmentos carotenóides produzidos pelas Clavitobacter e Pectobacterium e pigmentos fluorescentes produzidos pelas Pseudomonas. O material genético dos procariotos não é delimitado por membranas, ele permanece em contato direto com os demais componentes citoplasmáticos, geralmente ocupa a porção próxima ao centro da célula, local que inicia a divisão celular e está ligado ao sistema de membrana citoplasmática, o mesossomo. O nucleoide carrega o cromossomo que tem informações hereditárias (que passa de uma geração para outra). Os ribossomos são responsáveis pela síntese proteica, formados por subunidades de tamanha diferente, a subunidade 50S e a subunidade 30S que formam a ribossomo 70S. Os ribossomos são estruturas alvos dos antibióticos que inibem a síntese de proteínas. As inclusões ou grânulos é onde fica depositado os materiais de reserva que servem como fonte de energia para a célula, a Poli-β-hidroxibuterato (PHB), reserva de carboidrato presente em Pseudomonas e Agrobacterium. Os mesossomas são extensões da membrana plasmática que se desenvolvem no citoplasma com a função de auxiliar atividade respiratória, durante a divisão celular, durante a formação do septo divisional e na esporulação, pois as células procariontes não têm 64PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 mitocôndrias como os eucariotos, e também auxilia na secreção de enzimas que ajudam a degradar os antibióticos, como, por exemplo, as penicilinases que degradam as penicilinas. O plasmídeo é um material genético independente do cromossomo, são filamento de DNA circular que carregam somente informações de patogenicidade, não carregam determinantes genéticos vitais para as células. Estão envolvidos em determinantes sexuais, no processo de conjugação, na promoção de promotores de antibiose e na resistência a compostos químicos. Em Agrobacterium, o plasmódio Ti, é responsável pelos tumores em raízes de plantas. Algumas espécies de bactérias produzem formas latentes chamadas de esporos ou cistos que podem sobreviver em condições adversas, sendo resistentes ao dessecamento pelo calor, tornando-se metabolicamente inativos, o que não significa que não estão crescendo, quando em condições ideais podem germinar e tornar-se uma célula vegetativa metabolicamente ativa que cresce e se multiplica. Os cistos apresentam parede celular espessa, bactérias do gênero Azotobacter produz este tipo de estrutura. O esporo denominado de endósporo é exclusivo de bactérias, é altamente resistente a mudanças bruscas do ambiente, o gênero Clostridium e Bacillus apresentam este tipo de esporo. Os conídios não são estruturas de resistência, são usados como estruturas de reprodução das bactérias Actinomicetos. 65 Conhecida as formas e as estruturas que estão presentes externamente e internamente à célula bacteriana, apresentarei agora a você aluno(a) como se dá a reprodução, crescimento e variabilidade genética das bactérias. Vamos iniciar com a reprodução! Por muito tempo pensava-se que os microrganismos não se reproduziam, pois se acreditava que os microrganismos surgiam do nada. Hoje sabe-se que os microrganismos são capazes de se reproduzir. Falamos que as bactérias são unicelulares e que elas podem se agrupar e fica a dúvida: Como as bactérias se reproduzem? Geralmente a reprodução das bactérias é assexuada, onde um único indivíduo é responsável em gerar outro, ele não depende de mais um outro organismo. No processo assexuado não ocorre variabilidade genética, originando clones. A célula bacteriana pode se reproduzir por diferentes maneiras: fissão binária, brotamento, exósporo e fragmentação, sendo mais comum a fissão binária. A fissão binária, cissiparidade ou bipartição é quando a célula se divide individualmente em duas células filhas. A célula duplica seu material genético, divide-se ao meio dando origem a outras duas novas células (Figura 2). Estas células têm o mesmo material genético, com as mesmas características da célula mãe. Estas células são geneticamente iguais, algumas vezes podem apresentar variações devido ao processo de mutação. Então a variabilidade genética é pouca, somente quando ocorre o processo de mutação, assim as células são verdadeiros clones, ou seja, idêntica à célula que a originou. REPRODUÇÃO, CRESCIMENTO E VARIABILIDADE GENÉTICA DE BACTÉRIAS2 TÓPICO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 66PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 A divisão do conteúdo celular é um crescimento ordenado dos constituintes químicos do organismo. Primeiro temos a célula parental. Segundo ocorre o alongamento da célula, à medida que a célula parental aumenta, a membrana plasmática se estende e o material nuclear se separa. Terceiro ocorre a invaginação da parede celular (septo) e distribuição do material nuclear. Quarto passo, ocorre a formação da parede celular transversa e se tem a distribuição organizada do material genético em duas células. Obtendo duas células que sofrem a separação em duas células idênticas e cada uma segue a repetir este processo. Exemplo é Escherichia coli. O brotamento também conhecido como gemiparidade é quando uma pequena protuberância cresce na extremidade da célula, aumentando de tamanho, ocorre a divisão dos núcleos, e um dos núcleos aproxima-se da borda celular sendo envolvido por uma parte do citoplasma e forma uma célula uma pouco menor da qual a originou e torna-se uma nova célula com todos os constituintes celulares e então separa em duas. Um exemplo de bactériaque se reproduz por brotamento é Rhodopseudomonas palustris. Caro(a) aluno(a), até o momento discutimos sobre a reprodução por fissão binária e brotamento. Outro tipo de reprodução é o fragmento, quando a célula produz um crescimento filamentoso, e o núcleo se divide várias vezes, o qual se fragmenta em pequenas células coloidais ou em forma de bastão, sendo que cada fragmento dá origem a um novo crescimento. A bactéria, do gênero Nocardia, se reproduz por fragmentação. E tem a formação de exósporo, conhecida como esporogêneses. O endósporo, no qual o cromossomo se duplica e fica envolto por uma membrana plasmática, após formar-se uma parede espessa ao redor da membrana, formando assim o endósporo, que é o esporo de resistências. O conídio, o cromossomo se duplica formando uma cadeia de esporos, conídios, que se desenvolvem formando um septo na determinação da hifa. Cada conídio pode desenvolver um novo indivíduo. As bactérias do gênero Streptomyces se reproduzem por esporos. Agora, caro(a) aluno(a), vamos abordar o crescimento bacteriano que é o aumento ordenado de todos os constituintes celulares, ou seja, o aumento da população. E o aumento da população depende das condições nutricionais, ambientais e enzimáticas. Caro(a) aluno(a) você percebeu que a reprodução das bactérias é simples. E pode ser rápida se tiver as condições favoráveis. Os nutrientes mais importantes, como já visto na unidade II, são o carbono, hidrogênio, oxigênio e o fósforo para elaborar seu protoplasma e seu material estrutural. 67PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 As condições como temperatura pode influenciar a velocidade de todas as reações químicas ligadas ao processo de crescimento, podendo serem classificadas em: • psidrófilas = bactérias que se desenvolvem a 20 até 30 graus • mesófilas = bactérias que se desenvolvem 30 a 45 graus • termófilas = bactérias que se desenvolvem de 45 a 70 graus E o que determina a velocidade de crescimento é a disponibilidade de água, umidade. E as bactérias podem ou não depender do oxigênio. As bactérias anaeróbicas que crescem na ausência de oxigênio livre as anaeróbicas e as bactérias que crescem na presença de oxigênio. 2.1 Mas a pergunta é: Como se dá o aumento da população bacteriana? A resposta é que durante o crescimento ativo de uma cultura (quando não ocorre a morte celular) a população de células bacterianas cresce exponencialmente por meio de uma progressão geométrica 2n, no qual n é o número máximo de células produzidas em cada cultura. No entanto, cada cultura de microrganismo requer um tempo para duplicar o seu número. Esse intervalo de tempo é denominado tempo de geração. Assim, o crescimento de uma bactéria em cultura pode ser caracterizado em termos quantitativo por meio do número de gerações que tem se desenvolvido em um período de incubação, tempo de geração e taxa de crescimento (número de gerações por horas). Estes números podem trazer informações importantes sobre a natureza bacteriana. Podemos comparar o crescimento de duas bactérias, por exemplo: Bradyrhizobium tem o crescimento lento quando comparada com E. coli que tem o crescimento muito rápido. Veja caro (a) aluno (a), assim conseguimos controlar o crescimento do microrganismo, pois: 1 células = N0 que é igual a 1X2n, onde N é população final, n é o número de gerações e o número 1 é o inoculo inicial (N0). Só que o inóculo inicial de bactérias no tempo zero não é 1 e sim milhares, então por meio da matemática chegou-se à seguinte fórmula é: n = (log N- log N0)/0,31. Vamos realizar um exercício, onde a população inicial é 10.00 células, a população final é 1.00.000.000 células, qual é o número de gerações (n)? • n = (log 1.00.000.000 – log 1000)/0,301 • n = (8-3)/0,301 • n = 5/0,301 68PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 • n = 16,6 gerações, vamos supor que 16,6 gerações ocorrem cinco horas, qual é o tempo de geração (g)? O tempo que uma população leva para dobrar o seu número? • g= n/t • g= 16,6/5 • g = 3,3 horas. Agora se pensarmos em um sistema fechado, quando a bactéria se desenvolve em um frasco contendo meio de cultivo, no qual não é acondicionado mais nada, e nem removido nenhum metabólito. Veja caro(a) aluno(a), quando adicionamos células bacterianas no sistema fechado, ocorre a reprodução binária, onde o número de células aumenta por um período de tempo, e eventualmente quando acabam os nutrientes ou quando a excreção metabólica se acumula em quantidade suficiente para que o crescimento seja posteriormente rompido. Neste caso tem se um período de crescimento ativo, no qual a população bacteriana em uma taxa constante tem o crescimento de natureza exponencial e este crescimento exponencial da bactéria representa uma única fase de crescimento em sistema fechado chamado de crescimento balanceado. 2.2 Então caro(a) aluno(a), o que é o crescimento balanceado? O crescimento balanceado é um crescimento ordenado em todos os constituintes de cada célula e depois de um certo tempo a população máxima é atingida, ocorre a exaustão dos nutrientes, intoxicação dos produtos excretados e eventualmente a reprodução é inibida e os microrganismos começam a morrer. Todas essas etapas de crescimento conseguimos construir uma curva (figura 3), que pode ser traçada quando incubamos em meio de cultivo um número de células conhecidas, o que determina a população microbiana em um intervalo de tempo. 69PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 FIGURA 2. CURVA DE CRESCIMENTO. FASES DE TRANSIÇÃO EM RELAÇÃO AO TEMPO: A (FASE LAG), B (FASE LOG), C (FASE ESTACIONÁRIA) E D (FASE DECLÍNIO). Fonte: Adaptado de Pelczar Jr, M.J. et al. (1996). Em cada uma das fases tem um período de transição, que corresponde ao tempo que leva para todas as células entrarem em uma nova fase. No período inicial não há crescimento em termos de aumento do número de células, embora as células estejam com metabolismo ativo, elas somente estão fazendo reparos, ocasionados por danos celulares, e também estão sintetizando enzimas. Em seguida tem um período rápido de crescimento balanceado denominado de fase logarítmica. Na sequência tem a fase estacionária, não há crescimento de novo. E por fim ocorre o declínio populacional, até que todas as células morram. Alguns métodos são utilizados para medir o crescimento bacteriano como, por exemplo, lâminas de microscópio com grades, no qual se faz a contagem das células bacterianas presentes em uma suspensão. Outra forma de medir o crescimento bacteriano é a contagem em placas que determina o número de organismos viáveis, obtendo unidades formadoras de colônias. Outro ponto importante das bactérias, caro(a) aluno(a) é a variabilidade genética, que está associada a duas propriedades fundamentais para os microrganismos. As propriedades fenotípicas e genotípicas. A primeira, representa o genoma potencial que está sendo expresso por uma célula, por exemplo, a cor e o tamanho da célula bacteriana. Essas características podem alterar de acordo com as condições do ambiente. Por exemplo, bactérias do gênero Azomonas na presença de açúcar na colônia são grandes e viscosas. Na ausência de açúcares as colônias são pequenas e não viscosas. Embora a bactéria tenha capacidade de produzir colônias viscosas, a presença ou ausência de açúcares que vai determinar se esta característica é expressa ou não. 70PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 Contudo, as propriedades genotípicas, referem-se à capacidade genética que inclui o DNA cromossomo e o DNA plasmidial (enquanto que as células eucariontes incluem o DNA cromossômico e DNA mitocondrial). Então caro (a) aluno (a) as alterações genotípicas são resultantes de alterações que ocorrem no DNA, como resultado de uma mutação, que é a alteração na sequência de nucleotídeos de um gene ou a recombinação, processo que leva uma nova combinação de genes em um cromossomo. A mutaçãopode ocorrer em qualquer microrganismo vivo, na natureza as mutações são raras, e podem ocorrer por acaso, sem uma causa aparente. Em bactérias as mutações são espontâneas em uma proporção de uma mutação em uma população de milhões de células. A recombinação genética ocorre a troca de material entre dois cromossomos homólogos. Como as células procariontes têm um único cromossomo antes da recombinação genética, parte deste cromossomo deve ser transferido de uma bactéria doadora para uma bactéria receptora que pertence a uma mesma espécie. Em bactérias, a transferência de gene que leva a uma recombinação pode ocorrer de três maneiras diferentes: transformação, conjugação e transdução. A transformação é a maneira mais simples de transferir o gene. Em meio de cultivo, as bactérias doadoras do DNA, quando as células morrerem, sofrem a lise e liberam seu DNA. As bactérias aceptoras absorvem pequenos fragmentos do DNA do doador e incorporam em seu próprio DNA cromossomo. Assim a bactéria passa a ter características hereditárias da bactéria doadora. As células aceptoras devem estar no seu estado de crescimento receptivo para que possam incorporar o DNA doador, então caro(a) aluno(a) as células devem estar na fase de crescimento log. O DNA plasmodial é muito difícil de ser transferido por transformação, no entanto, é necessário adicionar um composto químico (cloreto de cálcio) para permitir a entrada do DNA plasmodial nas células aceptoras. A transdução é a transferência de genes de uma bactéria para outra por meio de um bacteriófago. 2.3 O que é um bacteriófago? ◦ É um vírus que ataca bactérias. É formado por ácido nucleico (DNA) envolvido por uma capa proteica, apresenta apêndices que vão fixar o bacteriófago na superfície da bactéria hospedeira. 2.4 E o que vai acontecer? O fago após fixar-se na bactéria vai injetar o DNA na célula hospedeira. O DNA fago é replicado rapidamente enquanto que o DNA bacteriano é degradado. O DNA fago 71PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 é direcionado para a síntese de novas proteínas denominadas proteínas fágicas. De cada 20min, novas moléculas de DNA fago combina com a proteína fágica para a formação de fagos completos que são liberados quando a célula hospedeira se desintegra. Durante essa montagem do fago dentro da célula bacteriana, qualquer fragmento de DNA bacteriano que tenha exatamente o mesmo tamanho do DNA fago pode ser incorporado em uma nova cabeça fago. E este fago, que carrega tal fragmento, é chamado de fago transdutor, pois este fago infecta uma outra bactéria, ele injeta o fragmento de DNA bacteriano em um novo hospedeiro. E como o fago não contém todo o DNA viral, ele não mata a nova célula hospedeira. O fragmento pode então sofrer recombinação com a parte correspondente do cromossomo do novo hospedeiro e tornar-se uma parte permanente do mesmo. E para finalizar a discussão sobre a variabilidade genética das bactérias, vamos conversar sobre a conjugação na qual a célula doadora fornece o material cromossômico ou plasmidial para a célula receptora. O que difere da transformação e transdução é a distinção da célula doadora e receptora que se dá devido à presença de plasmídeo conjugado e também por que requer o contato célula-célula. E como resultado da conjugação, o DNA pode ser transferido diretamente de uma bactéria para outra. Isso é diferente da reprodução sexuada dos eucariotos, pois não ocorre fusão entre os gametas para formar uma nova célula. Em alguns tipos de conjugação somente o plasmídeo pode ser transferido da bactéria doadora para bactéria receptora. É diferente da transformação e transdução, devido estes serem pequenos fragmentos de cromossomos que podem ser transferidos de uma célula para outra. O plasmídeo F (fertilidade) é um pequeno fragmento de DNA circular de fita dupla, que não faz parte do cromossomo bacteriano, replicando-se independentemente. Ele controla a formação do apêndice filamentoso que denominamos de “pelo sexual”, que tem células referidas como células F+ e são doadoras e as células receptoras, que não tem este plasmídeo e são denominadas de F. Os plasmídeos são raros em eucariotos, presentes em bactérias. E estas células bacterianas que têm a presença do plasmídeo podem matar outras células bacterianas e resistir à ação dos antibióticos. Os plasmídeos conjugados podem ser transferidos por conjugação para outra bactéria. Os plasmídeos não conjugados, não são transmitidos pela conjugação, podendo ser transferidos pela transformação e transdução. Os plasmídeos bacteriacenogenicos, estes contêm um gene que capacita a célula hospedeira a sintetizar uma substância denominada de bactericina, substância que mata a célula bacteriana. Também pode-se encontrar plasmídeos que carregam os genes de resistência. Cada gene de resistência ao antibiótico do plasmídeo R codifica uma enzima que destrói ou inativa um determinado antibiótico. 72 Tendo por base a organização, reprodução e variabilidade genética da célula bacteriana, caro(a) aluno(a), vamos conhecer os principais grupos de bactérias que são divididas em dois grandes grupos: Eubactérias e Arqueobactérias, cujas diferenças estão apresentadas na tabela 1. TABELA 1: PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENCONTRADAS ENTRE AS EUBACTÉRIAS E ARQUEOBACTÉRIAS Estrutura Eubactérias Arqueobactérias Parede celular Ácido murânico D-Aminoácido Proteínas Polissacarídeos Membrana citoplasmática Fosfolipídios Fitanóis Síntese proteica Formilmetionina metionina Fonte: Adaptado de Pelczar Jr, M.J. et al. (1996) As bactérias que pertencem ao domínio Eubactérias, podem ser divididas em três grupos que estão de acordo com a presença ou ausência e a composição da parede celular: Eubactérias Gram Negativas, Eubactérias Gram Positivas e Micoplasmas. PRINCIPAIS GRUPOS DE BACTÉRIAS3 TÓPICO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 73PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 As eubactérias gram-negativas, são as que apresentam a parede celular complexa, com presença de uma membrana externa que é recoberta por uma camada delgada de peptidioglucano e muitos gêneros que causam doenças e benefícios em humanos, plantas e animais pertencem a esse grupo. Alguns exemplos que pertencem a esse grupo: • Bacilos encurvados – são helicoidais em forma de vibrião ou anel, móveis com flagelo polar ou imóveis, vivem na água ou no solo. Exemplo: gênero Azospirillum (vivem em raízes de plantas de arroz e milho fixando nitrogênio atmosférico). • Cocos e Bacilos anaeróbico – são bastonetes ou cocos, vivem na água ou no solo e parasitam plantas. Exemplo: Xanthomonas – causam cancro cítrico em laranjas; Agrobacterium – causa tumores em plantas; Acetobacter - importante na produção de vinagre; Rhizobium e Azotobacter - fixam nitrogênio atmosférico em plantas de soja, alfafa, etc. • Bacilos anaeróbico facultativos – podem crescer tanto em ambiente aeróbico como anaeróbico, são bastonetes ou vibriões, patogênicos a homens, animais e plantas. Exemplo: Pectobacterium – causam podridão mole em plantas; Salmonella – causam febre tifoide gastrointestinal. • Bactérias deslizantes – são bastonetes ou filamentos sem flagelos, deslizam pela superfície úmida, o ciclo de vida é complexo e forma corpo de frutificação e tem grande importância para a indústria, pois são bactérias capazes de degradar polímeros como celulose, quitina e pectina. • Quimiolitotróficos – são aquelas bactérias que obtêm energia pela oxidação da amônia, nitrato e compostos sulfurados, não são patogênicas, vivem no solo ou na água. Exemplo: Nitrobacter – converte amônia em nitrato. As eubactérias gram-positivas apresentam parede celular mais espessa e não possuem membrana externa. Alguns exemplos pertencentes a esse grupo: • Bactérias esporuladas – altamente resistentes à dessecação, radiação e ao calor. Exemplos do gênero Bacilos anaeróbicos facultativos: Bacillus subtilis (controle biológicode pragas e doenças em plantas) e Clostridium botulinum, bactéria patogênica, causa intoxicação alimentar) • Bacilos regulares – são bastonetes não esporulantes, são anaeróbicas facultativas e aeróbicas. Exemplo são os Lactobacilos presentes em iogurtes e fermentados lácteos. 74PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 • Actinomicetes – são bactérias que tendem a formar micélio, conidióforos, conídios (resistentes a dessecação). Exemplo é o gênero Frankia (fixam nitrogênio em raízes do arroz) e Streptomyces (causa podridão em tubérculos de batata). As bactérias micoplasmas, assim denominadas por serem incapazes de formar parede celular, apresentando somente membrana plasmática mais o envoltório. Quando realizado o teste de coloração Gram se comporta como Gram-negativa. Sua célula pode apresentar diferentes formas, pois tem muita plasticidade por isso podem assumir várias formas. Ao contrário das bactérias, micoplasmas apresentam esterol em sua membrana plasmática, normalmente somente células eucarióticas possuem esteróis. Exemplos pertencentes a este grupo de bactérias são: Mycoplasma pneumoniae (causa pneumonia em humanos), Ureaplasma urealyticum (causa uretrites) e membros do gênero Spiroplasmas que causam doenças em plantas cítricas e são disseminados por insetos. As arqueobactérias, como um grupo, apresentam características morfológica e fisiológica variadas. São quatro principais grupos de arqueobactérias conhecidos. Os três primeiros incluem indivíduos que possuem parede celular: Os produtores de metano (metanogênicas), as Halobactérias e as arqueobactérias dependentes de enxofre. O quarto grupo contém organismos que não possuem parede celular, os termoplasmas. As bactérias Metanogênicas, são unicelulares, conhecidas por produzirem metano. Com base na coloração de Gram, são Gram-positivas como, por exemplo, as células de Methanosarcina e Gram-negativa Methanospirillum. As bactérias halofílicas extremas, dependem de altas concentrações de sais, o ambiente ideal para seu crescimento é 17 a 23 por cento de NaCl (cloreto de sódio). Para as arqueobactérias dependentes de enxofre predominam em águas termais com 50 a 80 graus. Já as termoplasmas diferem dos micoplasmas por terem habilidade de se desenvolverem em altas temperaturas sob condições ácidas. A temperatura ótima é de 55 a 59 graus e pH 2. 75 Chamo aqui a atenção, estimado aluno(a), as características gerais dos protozoários, iniciando com a definição do nome Protozoários, que é uma palavra derivada do latim e significa: Proto = primitivo e Zoon = animal, ou seja, “Primeiros animais”. Os protozoários já foram classificados como animais por serem heterotróficos, no entanto, eles são classificados como eucariotos por apresentarem as seguintes característica: são seres unicelulares (uma única célula que exerce todas as funções normais que há nos multicelulares; são heterotróficos e são complexos, pois, apresentam sistema reprodutor, digestivo e de locomoção. O modo de vida dos protozoários é de forma livre (associados em colônias ou sozinho) ou parasitas (causando doenças em homens, animais e plantas). E são encontrados em água doce, salgada e terra úmida. Outro ponto bastante importante é que os protozoários reagem muito rápido a mudanças bruscas do ambiente e com isso podem ser indicadores de qualidade do ambiente. Essa reação se dá, pois, o protozoário possui um tempo de geração muito curto e por serem pequenos e sensíveis ao estresse. Eles também decompõem a matéria orgânica. Em solos onde existe matéria orgânica em decomposição os protozoários estão presentes colaborando com a limpeza do meio ambiente. Observamos assim, caro(a) aluno(a) a importância da presença de muitos protozoários que indica um ambiente ecologicamente saudável. Tratei até aqui das características gerais dos protozoários. Agora caro(a) aluno(a), vamos discutir a classificação dos protozoários. PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DE PROTOZOÁRIOS4 TÓPICO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 76PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 Os protozoários apresentam uma grande quantidade de formas e estruturas diferentes. Então é comum que a forma de locomoção seja utilizada para a classificação destes microrganismos. Os principais grupos de protozoários de interesse dos microbiologistas podem ser separados em Flagelados, amebas, protozoários e ciliados. Vamos discutir as características que diferem um grupo do outro, iniciando pelos flagelados, do subfilo Mastigophora, estes locomovem-se pelos flagelos, que ao bater fazem com que o protozoário se locomova. Os flagelados podem ser de vida livre, parasitas ou mutualistas, gêneros representativos: Leishmania, Trypanosoma, Giardia e Trichomonas. As amebas, subfilo Sarcodina, o movimento ameboide se dá por meio de pseudófobos, que significa prolongamento celular do citoplasma e assim consegue se esticar e locomover-se. Esses prolongamentos também auxiliam na alimentação. As amebas podem ser de vida livre ou parasitas. Gênero representativo: Amoeba. Os esporozoários, do subfilo Apicomplexa, geralmente não são móveis, mas a locomoção de organismos maduros pode ser dar pela flexão do corpo, deslizamento ou ondulação. Gêneros representativos: Toxoplasma e Plasmodium. No grupo dos ciliados, o maior filo é Ciliophora. Todos os protozoários deste grupo possuem cílios ou estruturas ciliares que servem para a locomoção e também auxiliam na captura de alimentos. Em relação à locomoção, os ciliados são muito mais rápidos que os protozoários flagelados por conta do maior número de estruturas ciliares presentes na sua superfície. Gêneros representativos: Didinium, Paramecium. Quanto à estrutura celular, os protozoários apresentam o corpo composto por uma única célula, a qual apresenta grande variabilidade morfológica conforme a fase evolutiva e as condições que o microrganismo esteja adaptado. Então as células podem ser esféricas, onduladas ou alongadas, algumas espécies apresentam fases definidas dependendo da atividade fisiológica. As fases são: trofozoíto, cisto e gametas. A trofozoíto é a forma ativa do protozoário, na qual ele se alimenta e se reproduz. O cisto é a forma de resistência, fase dormente, apresenta parede celular mais espessa. E a forma de gameta é a sexuada que tem o gameta feminino, macrogameta, e o gameta masculino, o microgameta. Esta estrutura corpórea do protozoário é delimitada por Membrana plasmática, que é uma barreira seletiva entre o citoplasma e o meio externo que está estruturalmente e funcionalmente associada à mobilidade e nutrição destes organismos. Alguns protozoários possuem uma camada externa das suas membranas, a cutina, que é suficientemente rígida para garantir a integridade e forma da célula. Contudo, estes organismos podem se dobrar 77PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 e retorcer ao se movimentarem em seus ambientes. Nos protozoários o citoplasma também é diferenciado em camada externa (Ectoplasma) que é transparente, e a camada interna (Endoplasma) contendo as organelas. De modo geral, os protozoários têm organelas típicas das células eucarióticas. Os protozoários têm o retículo endoplasmático liso, que é responsável pela síntese de esteroide, e a retícula endoplasmática rugosa que está envolvido na síntese proteica. O complexo de Golgi está em anexo ao retículo endoplasmático e está envolvido na síntese de substâncias como carboidrato e secreções proteicas. Esta organela é bem desenvolvida nos flagelados, reduzida nos ciliados e ausente em amebas. A mitocôndria em protozoários apresenta estrutura e função similar a das células animais superiores, sendo a sede da respiração celular. Essa organela possui DNA, RNA e Ribossomo a de estrutura análoga aos procariontes. A maioria dos protozoários tem mitocôndrias, exceto as amebas. Os plastídios, pigmentos fotossintéticos, quando presentes, estão contidosem organelas membranosas e tem função similar a cloroplastos da célula vegetal. Os vacúolos contráteis são bolsas membranosas que têm a função de eliminar a água do interior dos protozoários para o meio externo. Nas amebas e flagelados o vacúolo contrátil é formado pela fusão de vesículas menores e nos ciliados além da absorção de água por osmose ocorre também por ingestão forçada de água através do citóstomo que tem um complexo de vesículas e microtúbulos. Os protozoários heterotróficos apresentam vacúolos digestivos que são bolsas membranosas transitórias que nos ciliados formam-se na base da citofaringe, enquanto que nos flagelados os vacúolos se formam próximo do sítio de ingestão dos alimentos. Outra estrutura bastante importante é o citoesqueleto, que apresenta diversas funções tais como: manter a forma da célula, dar suporte a membrana plasmática, permitir a adesão da célula ao substrato, auxilia na sua locomoção, confere resistência mecânica à célula e serve como via de tráfego e posicionamento das organelas. Está localizado bem abaixo da membrana celular, logo o citoesqueleto e a membrana celular e juntos formam o que chamamos de “película” que é uma parede corporal destes organismos. O filamento proteico, micro túbulos e vesículas compõem o citoesqueleto e podem apresentar os diferentes arranjos. O filamento proteico com actina forma uma malha densa no citoplasma, bem próxima da superfície do microrganismo. Geralmente esta estrutura é formada em resposta a fatores externos, que necessitam de uma mudança rápida na organização 78PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 dos filamentos, como uma contração muscular. Os micros túbulos, quando formados por tubulinas, se arranjam formando uma espécie de colete. Os micros túbulos podem originar-se nos corpos basais do flagelo e se espalharem por todo o esqueleto. Estes são importantes para a manutenção da estrutura e morfologia celular, para a formação dos pseudópodos e são responsáveis pela estrutura e funcionamento axial. Os micros túbulos também podem irradiar-se a partir do centro da célula e projetar seus raios para a superfície do organismo. Os protozoários também têm as estruturas alveolares ou vesículas que estão localizadas logo abaixo da membrana celular. As vesículas são achatadas e formam uma camada abaixo da membrana formando alvéolos. Os alvéolos vazios podem ser ficar túrgidos e dar sustentação à célula, bem como armazenar cálcio ou ter placas de celulose secretadas no seu interior formando um exoesqueleto rígido. Quanto a estrutura de locomoção têm os Flagelos, que são estruturas permanentes para a locomoção dos flagelados, sendo que o número pode variar conforme a espécie, como, por exemplo, o Tripanossomo possui um único flagelo enquanto que a Giardia possui 4 ou mais. Outra estrutura de locomoção é os cílios presentes nos Ciliados que ocorre em um grande número na superfície celular desses organismos o que gera uma grande velocidade de deslocamento no ambiente aquático. Os flagelos e cílios origina-se nos microtúbulos basais no interior da célula E para finalizarmos as estruturas vamos comentar sobre o núcleo. Nos protozoários, o núcleo tem estrutura e função similares as das células animais e vegetais, sendo delimitado por membranas, envoltório nuclear. Entretanto, o número de núcleo em protozoário pode variar conforme a espécie. A maioria dos Cliados têm dois núcleos, os micronúcleos, ligados ao controle das atividades metabólicas e processo de regeneração e os micronúcleos, relacionados ao processo de reprodução. Quase todos os protozoários têm pelo menos um núcleo. Sobre a ecologia dos protozoários tem a fase vegetativa, denominada de trofozoíto, e a fase de resistência, cisto. A fase de trofozoíto é a forma ativa do protozoário, coberto de proteínas ricas em cisteínas que favorece a proteção contra os efeitos letais do oxigênio. A fase de cito, o protozoário, secreta um envelope espesso ao redor de si mesmo e fica inativo. O cisto é resistente ao dessecamento, a baixa temperatura, permitindo que a célula atravesse por condições desfavoráveis e também favorece a dispersão da espécie pela água, vento e animais. A relação do protozoário com seu hospedeiro pode ser parasitária, predatória, mutualística e de comensalismo. Para você perceber as principais diferenças entre os tipos de relações que o protozoário pode apresentar, observe a tabela 1, apresentada a seguir: 79PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 TABELA 2: DIFERENÇA ENTRE OS TIPOS DE RELAÇÃO DOS PROTOZOÁRIOS COM OS OUTROS SERES. Tipo de relação Característica Exemplo Parasitária Um organismo retira o alimento do outro Trypanossoma cruzi Predação Um organismo se alimenta do outro Amoeba Mutualismo As espécies trocam benefícios Trichonynpha – degrada celulose no intestino do cupim e obtem energia por meio da digestão da celulose. Condensalismo Não causa prejuízo e nem benefício Entomoeba coli – no trato digestivo Vida Livre Protozoários solitários encontrados em água, solo úmido. Coleps, Stentor, Vorticela. Fonte: Adaptado de Pelczar Jr, M.J. et al. (1996). Observamos, assim, caro(a) aluno(a), na tabela 1, que os protozoários além de causarem doenças também podem trazer benefícios ao meio em que se encontram. Agora vamos discutir sobre a nutrição, como se dá a absorção dos alimentos. Primeiro vamos lembrar do citoesqueleto que junto com a membrana celular formam uma “película”, então é esse conjunto que formam os pseudópodes que é uma estrutura especializada em obter alimento. Os protozoários são seres heterotróficos, então eles ingerem as partículas alimentares, mas para isso eles tem um processo diferente denominado de fagocitose e pinocitose, a diferença pode ser observada no esquema ilustrado na figura 1. 80PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 FIGURA 3: ESQUEMATIZAÇÃO PARA DIFERENCIAR OS PROCESSOS DE ALIMENTAÇÃO, FAGOCITOSE E PINOCITOSE Fonte: A autora. Assim, estimado(a) aluno(a) percebemos que, por meio da diferenciação apresentada na figura 1, que a fagocitose é quando a célula se deforma para englobar outra célula para se alimentar. O alimento é transportado por vesículas e a fagocitose é simples e classificada em endocitose (é o englobamento das partículas) e exocitose (eliminação das partículas dentro da célula). Vamos exemplificar, a Ameba está ingerindo um Paramecium. A Ameba se transloca por pseudópodes envolvendo o Paramecium e internaliza-o e uma vesícula chamada de fagossomo e os lisossomos liberam enzimas digestivas que passa a ser chamado de vacúolo digestivo, pois ocorre a digestão o que não foi digerido é liberado por clasmocitose que é o processo de exocitose. As vesículas que formam os fagossomas apresentam uma camada de fosfolipídios que se fundem com a bicamada de fosfolipídios da parede celular e passam a fazer parte da membrana plasmática. Assim, na endocitose a camada de fosfolipídios recebe o alimento por evaginação na qual as partículas ficam presas e forma-se uma vesícula que vai se desprender para que ocorra a digestão. No processo de excreção, dos dejetos provenientes da digestão da célula, ocorre a clasmocitose que nada mais é a eliminação dos dejetos. Enquanto que a 81PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 pinocitose internaliza alimentos diluídos em água e não emite os pseudópodes, ocorrendo a invaginação da partícula, sendo a membrana que faz todo o englobamento do alimento. Nos ciliados o alimento é capturado pela ondulação dos cílios e entram na célula pelo citóstomo, que é uma estrutura semelhante a uma boca. Assim a digestão é intracelular, o protozoário lança alimentos para dentro da célula. Em todos os protozoários a digestão ocorre em vacúolos e os dejetos são eliminados pelo poro anal que se encontra na membrana plasmática. Os protozoários que vivem no trato digestivo dos animais são anaeróbios obrigatórios.e que sem a invenção do microscópio seria impossível observar estes seres tão pequenos. No tópico seguinte serão abordados assuntos que tratam do surgimento da microbiologia como ciência. A descoberta do mundo microbiano inclui histórias dos primeiros cientistas que optaram por estudar a microbiologia, sendo eles motivados por suas descobertas, o que levou a algumas verdades serem reconhecidas. Em seguida, em um terceiro tópico, será abordado a diferença entre as células eucariontes e procariontes. Neste tópico convido você a conhecer as características dos grupos de microrganismos procariotos e as características dos grupos dos microrganismos eucariotos, uma vez que, com o avanço da microscopia, foi possível distinguir a célula microbiana nestas duas categorias. Para finalizar esta unidade, trataremos sobre a contribuição dos microrganismos no nosso cotidiano: fertilidade do solo, reciclagem de substâncias e participação de ciclos bioquímicos. Os microrganismos, também podem contribuir com a fabricação de produtos como iogurtes, vinhos, queijos, vinagres e pães. Além disso, tratarei de algumas informações sobre os microrganismos que causam doenças em humanos, animais e plantas. Espero que seja uma leitura agradável e que contribua para o seu desenvolvimento. INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 9 Para iniciarmos, vamos fazer a seguinte pergunta: 1.1 O que é microbiologia? Se fragmentarem a palavra, microbiologia, vamos ver que temos um conjunto de termos que denotam micróbio. Esta palavra, micróbio, tem origem grega onde mikros significa pequeno e bio significa vida. Assim, microbiologia é a ciência que estuda os organismos pequenos, e suas atividades biológicas. Organismos microscópicos são organismos que não são observados a olho nu, precisamos de uma ferramenta para observar estes organismos pequenos. Para termos noção do tamanho destes seres, vamos imaginar uma escala, e que a menor parte da escala é um angstrom que é igual a 10-10 metros, isso é muito pequeno, nossos olhos não conseguem identificar estruturas menores que um milímetro. Para isso, precisamos de técnicas que auxiliam na visualização destes microrganismos. Entre as técnicas mais usadas na microbiologia tem a microscopia de Luz e a Eletrônica. Estes equipamentos permitem visualizarmos estruturas que são impossíveis de enxergar a olho nu. Quando comparamos uma célula vegetal com a célula animal conseguimos fazer esta diferenciação com o microscópio de Luz, se quisermos maiores detalhes, por exemplo, de uma partícula viral vamos precisar de um microscópio eletrônico, pois é uma partícula muito pequena, menor, bem menor que a célula vegetal e animal. Portanto, antes de surgir a microscopia, não existia a microbiologia, pois era impossível de visualizar os microrganismos. A partir do surgimento do microscópio foi obtendo-se maiores informações para caracterizar os microrganismos. As características que permitem classificá-los são: Características culturais (exigência nutricional e ambiental); O QUE É MICROBIOLOGIA E SUA APLICAÇÃO1 TÓPICO INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 10 Características morfológicas (forma da célula e colônia); Características metabólicas (reações bioquímicas para sobrevivência); Características antigênicas (componente celular que são semelhantes entre espécies); Características genéticas (caracterização do genoma); Potencial de causar doenças (homens, animais e plantas); Características ecológicas (relação entre os microrganismos e sua ocorrência natural) e a classificação taxonômica (grupos de microrganismos). Todas estas características abrangem a microbiologia básica. E por meio do conhecimento obtido na microbiologia básica podemos utilizar estes princípios básicos e aplicar os microrganismos às suas finalidades específicas, ou seja, a microbiologia básica fornece os princípios fundamentais para a microbiologia aplicada. Enquanto que a microbiologia básica estuda a natureza fundamental, as propriedades de microrganismo, a microbiologia aplicada usa os microrganismos nas mais diversas áreas da medicina, agricultura, indústrias e ambiente. Os microrganismos são capazes de sintetizar várias substâncias químicas como ácido cítrico e antibióticos (Penicilina). Também tem microrganismos que são cultivados em grande escala para suplementação alimentar de humanos e animais. Certos microrganismos têm a capacidade de fermentar material orgânico, produzindo o gás metano. Além da indústria, os microrganismos podem ser utilizados para alterar ambientes específicos, como exemplo, bactérias que extraem cobre e ferro de minérios de baixa qualidade. Os microbiologistas de solo, que buscam microrganismos para degradar poluentes específicos como inseticidas e herbicidas. Ainda tem a área do controle biológico, na qual os microrganismos controlam pragas e doenças em plantas. Você percebe, caro aluno(a) a importância das duas áreas, microbiologia básica e aplicada? Uma vez que os microrganismos estão sempre conosco, seja na produção de substâncias químicas de interesse na indústria ou por causarem doenças. INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 11 Querido(a) acadêmico(a), falamos no início do primeiro tópico que a microbiologia surgiu após a invenção do microscópio, por isso neste segundo tópico vamos abordar a trajetória da microbiologia como ciência, mencionando os cientistas que mais contribuíram para o reconhecimento da microbiologia como ciências. A história da microbiologia começa quando Robert Hooke em 1665 decide fazer algo interessante. Com um conjunto de lentes de aumento, ele visualiza uma fatia de cortiça e vê grandes emaranhados e que os emaranhados são unidos por unidades que se repetem. Assim, ele compara-se com as células de animais e plantas, que são também formados por estruturas repetitivas. E Antony Van Leeuwenhoek (1632-1723), utilizou lentes de aumento acoplado a uma chapa que no lado anterior tinha um lugar para colocar água e contra a luz observou vários filamentos de tamanho variável, que se movimentavam, ele deu o nome de animacros para estas estruturas. Com a criação do microscópio possibilitou um avanço na biologia. Embora este microscópio fosse muito simples, adotado apenas de uma lente de vidro que permitia um aumento de 300 vezes. Assim, tudo o que era invisível a olho nu tornou-se visível o suficiente para ser pesquisado. Este microscópio primitivo permitia observar bactérias de 1 a 2 micras (um milésimo de milímetros). As observações de Hooke e Leeuwenhoek levaram à descoberta da célula, mas somente em 1839 que a célula foi reconhecida como unidade fundamental de vida. Para darmos continuidade a nossa discussão sobre o histórico da microbiologia, convido você, caro(a) aluno(a), a abordar os conceitos sobre a teoria da geração espontânea de microrganismos. HISTÓRICO DA MICROBIOLOGIA2 TÓPICO INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 12 Na época, muitos pesquisadores defendiam a teoria da ABIOGÊNESE, defende que a criação de um ser vivo é a partir de matéria inanimada (sem vida). Enquanto que poucos pesquisadores defendem a teoria da BIOGÊNESE, na qual acreditava que o ser vivo surgiu a partir de outro pré-existente. Vamos a nossa discussão sobre a história da microbiologia. Francesco Redi (1626-1697), provou em um experimento, no qual ele utilizava frascos com carne. Alguns fracos ficaram descobertos e outros ficaram fechados, impedindo a entrada de qualquer ser vivo. Com o passar do tempo ele observou que surgiram larvas na carne que estava com o descoberto, a carne já estava em decomposição. E de onde surgiram as larvas? Então ele observou que havia moscas que passavam pela carne deixando seus ovos, os quais davam origem às larvas. Hoje é comum ver isso no nosso dia a dia. Nas carnes que ficaram fechadas não houve interação com as moscas, as carnes ficaram intactas, ou seja, não teve o surgimento de larvas. Então,Outros três pontos importantes nos protozoários caro(a) aluno(a) são: a troca gasosa, o controle osmótico e a reprodução. A troca gasosa se dá por difusão simples, ou seja, os protozoários precisam de oxigênio para realizar a respiração celular. Há muito mais oxigênio no ambiente do que no protozoário, então o oxigênio vai da onde tem mais para onde tem menos, entrando por difusão. E na respiração celular produz o gás carbônico que está concentrado no protozoário e sai para o meio ambiente que está em menor concentração. Esta saída do gás carbônico também se dá por difusão. O fluxo de água através da membrana plasmática também se dá da maior concentração para a menor concentração, para isso o protozoário consegue fazer o controle osmótico. Ele remove o excesso de água com o auxílio do vacúolo pulsátil que tem a função de manter o equilíbrio osmótico na célula. Grande parte da água entra no vacúolo pulsátil, este vai encher e quando estiver cheio de água o vacúolo contrai e expulsa a água eliminando-a para o meio. A reprodução dos protozoários frequentemente é assexuada, apenas um indivíduo é envolvido, apresentando a mesma característica do organismo parental e não há troca de material genético. A reprodução sexuada por ser de três tipos: fissão (divisão binária), brotamento e esquizogania (divisão múltipla). A grande maioria das células livres faz reprodução do tipo de fissão na qual a célula aumenta e passa a se dividir, dando origem a dois clones. Na esquizogania, o núcleo dos protozoários passa a se dividir muitas vezes. E esses núcleos vão se envolvidos por uma porção do citoplasma e a célula se separa em células filhas, as quais repetem o processo. Na reprodução por brotamento, uma pequena protuberância cresce ao lado da célula e eventualmente torna-se uma nova célula com todos os constituintes celulares e se separa da célula parental. A reprodução sexuada, não bem definida, onde dois protozoários se unem, trocam o material genético e se separam. Os micronúcleos sofrem meiose e ocorre a formação de 82PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 uma ponte citoplasmática entre os dois protozoários, ocorrendo a troca de material genético. Os micronúcleos se fundem formando núcleos diploides e o protozoário passa-se a dividir por mitose, gerando novos indivíduos. Para finalizar a nossa unidade, caro(a) aluno(a), torna-se importante enfatizar que a bactéria é um organismo procarioto, que tem o núcleo disperso no citoplasma na região denominada de nucleoide, enquanto que o protozoário é um microrganismo eucarioto, tem o núcleo envolvido por uma membrana e apresenta organelas mais complexas quando comparado com as bactérias. Vimos muitas estruturas que diferenciam as bactérias (procariotas) dos protozoários (eucariotos). Como você percebe a distinção dos seres eucariotos dos seres procariotos? Fonte: Disponível em: https://openstax.org/books/biology/pages/4-2-prokaryotic-cells REFLITA Você sabe como o flagelo gira se não podemos observá-lo? A melhor explicação é o sistema celular-presa. Vamos comparar um flagelo bacteriano com um eixo de motor e a célula bacteriana como o corpo do motor. Se colocarmos o motor sobre a mesa, o eixo gira enquanto o corpo do motor permanece parado. Entretanto, se segurarmos o motor pelo eixo. O motor girará enquanto o eixo for mantido parado. Assim, se pudéssemos segurar o flagelo para que ele não girasse, a célula bacteriana iria girar. Por outro lado, tem a teoria de reflexão, na qual a célula não gira e sim flexiona. E isso torna o flagelo a única estrutura celular capaz de girar em uma direção. Fonte: PELCZAR, Jr. E; MICHAEL, Joseph. Microbiologia; conceitos e aplicações. Paerson Books: 1997. SAIBA MAIS https://openstax.org/books/biology/pages/4-2-prokaryotic-cells 83 Estimado(a) aluno(a), estamos finalizando mais uma unidade do nosso Livro didático de Microbiologia Geral e biossegurança. Vamos, agora, relembrar os principais pontos tratados. Os conteúdos abordados nesta unidade tiveram o intuito de esclarecer sobre as características de uma bactéria e um protozoário. Por esse motivo, iniciamos com a organização celular das bactérias, esse tópico focou nas estruturas da célula bacteriana externa e internamente, mencionando também a diferença entre Bactérias Gram-positivas e Gram negativas. Em um segundo momento, ao tratarmos das características das bactérias, abordamos sua reprodução, que se dá por fissão binária. O crescimento que em um sistema fechado tem três fases: a fase lag, a fase log e a fase estacionária e fase declínio e também vimos que a variabilidade genética se dá por mutação por meio de três processo: transformação, transdução e conjugação. Por fim, finalizando a Unidade III de nosso livro didático, tratamos das principais características dos protozoários. Abordei neste tópico, as principais características, o modo de associação com hospedeiros, estruturas celulares, grupos e os processos de osmose, regulação e fagocitose dos protozoários. CONSIDERAÇÕES FINAIS PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 84 Para aprofundar o conhecimento sobre o conteúdo que acabamos de estudar, que tal fazer uma leitura dos artigos citados abaixo! São três artigos que relatam temas diferentes, no entanto, destacam a importância das bactérias no âmbito de produto alimentício e dos protozoários como indicadores de contaminação ambiental. Tenha uma ótima leitura! • POMBO, J. C. P., RIBEIRO, E. R., de LIMA Pinto, R., & da Silva, B. J. M. (2018). Efeito antimicrobiano e sinergístico de óleos essenciais sobre bactérias contaminantes de alimentos. Segurança Alimentar e Nutricional, 25(2), 108-117. • BEVILAQUA, G. C., MENEZES, M. U. F. O., da CRUZ XIMENES, G. N., da SILVA NASCIMENTO, Í. R., da SILVA PEREIRA, E. F., & dos SANTOS CORTEZ, N. M. (2020). Queijo fresco artesanal de leite caprino com lactobacillus acidophilus: avaliação do crescimento de bactérias láticas. Brazilian Journal of Development, 6(4), 21214-21231. • SOLDATELLI, B. S. (2020). Ocorrência de geo-helmintos em areias das praias do Brasil: revisão integrativa. Medicina Veterinária-Tubarão. LEITURA COMPLEMENTAR PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 85 MATERIAL COMPLEMENTAR FILME/VÍDEO • Título: O Enigma de Andrômeda (1971) • Ano: 1970; • Sinopse: Um satélite espacial cai em uma pequena cidade na Terra. Por causa da colisão, uma bactéria fatal que veio do espaço começa a dizimar a população. Enquanto isso, uma equipe de cientistas trabalha em um laboratório no subsolo tentando encontrar a cura. Eles descobrem que entre os infectados, apenas sobreviveram um bêbado e uma criança. A solução precisa ser encontrada antes que toda a humanidade seja exterminada. LIVRO • Título: Microbiología • Autor: Flavio Alterthum; • Editora: Atheneu; 6° edição; • Sinopse: A presente edição estuda mais de duzentas variedades de bactérias, fungos e vírus. Aborda aspectos básicos do conhecimento dos micro-organismos: forma, estrutura, fisiologia, crescimento, genética, sistemática, controle tanto do ponto de vista físico (esterilização) como químico (desinfecção). Os antimicrobianos (antibióticos e quimioterápicos) de ação antibacteriana, antifúngica e antiviral são amplamente apresentados e discutidos. A interação patógeno/hospedeiro é abordada em profundidade, quer em capítulos gerais, quer em capítulos específicos dos agentes infecciosos. PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 3 Professor(a) Dra. Aline José Maia PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOS4UNIDADEUNIDADE PLANO DE ESTUDO 87 Plano de Estudos • Características morfológicas de fungos; • Características fisiológica e reprodução de fungos; • Classificação de fungos; • Principais características do vírus. Objetivos da Aprendizagem • Conceituar entender a importâncias de fungos e vírus. • Conhecer as principais características morfológicas e fisiológicas de fungos e vírus. • Estudar a classificaçãodos microrganismos, fungos e vírus. PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 88 Caro(a) aluno(a), nesta quarta unidade você compreenderá as estruturas de uma célula fúngica e de uma partícula viral. A célula fúngica é eucariótica não fotossintética que apresenta uma variedade de formas e processos celulares. Contudo, os vírus são os organismos mais simples já conhecidos, são parasitas intracelulares, que podem adentrar em qualquer tipo de célula existente. No primeiro tópico vamos melhor conceituar os fungos, explorando sua importância para o meio e demonstrando as estruturas morfológicas que os compõem, tanto a fase vegetativa como a fase reprodutiva. Em seguida, caro(a) aluno(a) será apresentado as características fisiológicas, discutindo os aspectos fisiológicos e reprodutivo dos fungos. No terceiro tópico será apresentada a classificação dos fungos que se baseia na característica dos esporos, natureza de seu ciclo de vida e as características morfológicas de seu micélio vegetativo ou suas células. Ademais, abordarei, nesta unidade, as principais características dos vírus. Vamos entender que são organismos que só podemos observar no microscópio eletrônico, não apresentam metabolismo próprio e que por isso precisam parasitar uma célula para realizarem suas funções. INTRODUÇÃO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 89 Caro(a) aluno(a), vamos iniciar este tópico com as características gerais dos fungos. Os fungos constituem–se em um grupo numeroso de organismos bastante diversificado morfologicamente e filogeneticamente. Apesar de heterogêneo, este grupo apresenta características básicas que permitem distingui-los dos outros seres vivos. Essas características são: • Eucariontes = os fungos apresentam membrana nuclear que envolve o núcleo, material genético da célula. Isso, caro(a) aluno(a), é o que faz os fungos serem diferentes das bactérias. • Heterotróficos = todos os fungos requerem carbono para sua alimentação. E é o que difere os fungos das plantas que possuem clorofila e sintetizam seu próprio alimento. • Absorção de nutrientes = a água e os nutrientes são absorvidas pelos fungos a partir de um substrato onde crescem. A absorção é feita através da parede celular das hifas. • Formação de esporos = maioria dos fungos caracterizam-se por produzirem esporos. Os esporos são unidades reprodutivas com tamanho e forma bem definidos. Agora, caro(a) estudante, que conhecemos algumas características, vamos iniciar a discussão sobre a morfologia dos fungos. O corpo do fungo é constituído por dois tipos básicos de estruturas, as estruturas assimilativas e as estruturas reprodutivas. Como os próprios nomes sugerem, as estruturas assimilativas são responsáveis pela assimilação dos nutrientes do hospedeiro e, portanto, são responsáveis pela colonização. As estruturas reprodutivas, por sua vez, são responsáveis CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE FUNGOS1 TÓPICO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 90PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 por produzir propágulos durante a fase de reprodução. Os quais desempenham papéis importantes durante a fase de disseminação e infecção. Os fungos têm origem dos esporos. Os esporos germinam, quando encontram condições ideais de temperatura e umidade. Os esporos podem ser comparados às sementes, embora não sejam semelhantes fisiologicamente. Os esporos necessitam de calor e umidade para germinar em, condições está igual das sementes. O resultado da germinação é a saída de um filamento delgado denominado de tubo germinativo, que cresce em comprimento, prolonga-se de maneira notável, se desenvolve pouco em diâmetro, se ramifica nos sentidos formando uma massa filamentosa chamada de Micélio. No entanto, as leveduras são unicelulares e não filamentosas. Então, o micélio constitui o corpo vegetativo dos fungos, composto de filamentos tubulares denominados de hifas. Esse conjunto de hifas pode ser visualizado a olho nu como um emaranhado de fios delgados coloridos ou não, dependendo da espécie. A palavra hifa vem do grego e significa teia. A hifa tem funções importantes no desenvolvimento do fungo. É por meio da hifa que o fungo coloniza seu substrato, absorvendo água e nutrientes, embora muitas vezes a absorção é facilitada pelas enzimas digestivas. No microscópio ótico é possível distinguir hifas com duas morfologias: com parede transversal (septo) e sem parede transversal (asseptado ou cenocítica) (Figura 1). A septação em fungos filamentosos leva a formação de compartimentos individuais, mas não totalmente fechado. A estrutura septal ao microscópio eletrônico pode apresentar um poro central simples, que conecta os compartimentos através do citoplasma e permite a passagem de organelas incluindo o núcleo. FIGURA 1: HIFA COM SEPTO E HIFA SEM SEPTO. Fonte: Sutterstock 91PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 A hifa apresenta três estruturas: parede celular, membrana plasmática e o citoplasma. A parede celular é constituída de um material capsular, hidrofobinas e polissacarídeos. O material capsular é uma matriz extracelular formada por substâncias mucilaginosas que tem função de adesão em diferentes grupos de fungos. As hidrofobinas são proteínas hidrofílica e hidrofóbica quando em contato com a água e o ar formando um filme anfipático que tem diversas funções no desenvolvimento do fungo. Como, por exemplo, intermediar a fixação da hifa em superfície hidrofóbica, facilitando o processo de penetração e infecção no hospedeiro. A parede de polissacarídeos são proteínas, lipídios e carboidratos que são responsáveis pela forma e integridade estrutural. Dentre as substâncias glucanas a quitina é o maior componente estrutural da parede celular. A quitina forma uma matriz anamórfica que produz uma amarração que dá a morfologia da parede. Outro aspecto da parede celular é a coloração, que nos fungos é determinada por diferentes pigmentos. Os pigmentos que podem ser encontrados na parede celular livre em grânulos são os compostos fenólicos ou melanina. Os compostos fenólicos podem funcionar como reforço de redes de proteínas e polissacarídeos por meio de ligações cruzadas da parede celular. Os pigmentos melanizados protegem do estresse ambiental (temperatura, umidade, exposição aos metais pesados) proteção contra radicais livres de oxigênio produzido pelo hospedeiro em resposta a infecção do fungo. 1.1 E qual é a importância da Parede celular? Primeiro a parede celular determina a forma da hifa, protege contra a lise osmótica, é sítio para as ligações enzimáticas e tem capacidade antigênica (capacidade de formar anticorpos). Outra estrutura de importância é a membrana plasmática, que é constituída por uma camada dupla de fosfolipídios e um arranjo de proteínas de superfície ligadas a pequena quantidade de carboidratos. Essa estrutura lipoproteica é uma barreira efetiva para muitas moléculas que atravessam por difusão ou transporte ativo. O componente de maior importância é o ergosterol, enquanto que nos animais é o colesterol. O ergosterol é responsável pela estrutura, permeabilidade e modulação da fluidez da membrana. Sua falta causa alteração na permeabilidade da membrana plasmática e inibição do crescimento. E o citoplasma, substância homogênea, coloidal, e de viscosidade superior à da água. É nesta substância transparente que se encontram as organelas tais como: vesículas, 92PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 mitocôndrias, ribossomos, sistema de Golgi, núcleo, vacúolo, hidrogenossomas, micro corpos e grânulos de glicogênio. Agora, caro(a) aluno(a), vamos detalhar um pouco mais cada uma destas organelas. • Vesículas: importante para o crescimento da hifa, pois transportam percursores para a síntese da nova membrana, parede e também enzimas que enfraquecem a parede. • Mitocôndrias: maior organela presente na hifa, é considerada a casa de força da célula, pois é responsável pela síntesede ATP (adenosina trifosfato). A mitocôndria se transloca no citoplasma para o local que depende de maior energia. O DNA mitocondrial apresenta um nucleoide no centro que pode mudar em número e forma dependendo da espécie. • Ribossomo: formado por uma parte maior 80S e a parte menor 40 S. • Sistema de Golgi — é formado por cisternas empilhadas localizadas próximo ao sítio do Retículo endoplasmático, localizados próximo ao núcleo. As vesículas localizadas no Sistema de Golgi estão relacionadas à extensão da hifa. • Retículo endoplasmático — tem o retículo endoplasmático liso, responsável pela síntese de glicogênio, esteroide e lipídios, e o retículo endoplasmático rugoso é responsável pela síntese de proteínas. • Núcleo: são caracterizados por serem pequenos, com genoma de 200 a 1200 kbp. A membrana nuclear é formada por duas unidades, uma interna e outra externa, como espaço perinuclear que permite a passagem do citoplasma e nucleoplasmas. Essa membrana tem associação ao retículo endoplasmático e ao sistema de Golgi e diversas vesículas que estão relacionadas com o funcionamento do núcleo, bem como o restante da hifa. • Vacúolos — são cavidades fluidas no citoplasma, com função de armazenar substâncias e de empacotar secreções enzimáticas hidrolíticas. • Hidrogenossomas — são responsáveis pela incorporação do cálcio e estão relacionadas com o processo de divisão de membranas internas e sequência de proteínas. E são encontrados em espécie de fungos anaeróbicos. • Microcorpos — também denominados de Peroxissomas, são estruturas esféricas envolta por uma membrana e são responsáveis pelo metabolismo de alcanos (metanos, etanos, propanos e álcoois) e pela degradação do oxigênio. • Grânulos de glicogênio — são substâncias encontradas no citoplasma e constituem-se em reserva glicosídica dos organismos desprovidos de clorofila. Estas são as organelas que estão presentes em uma célula fúngica. 93PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 Na sequência, caro(a) aluno(a), vamos discutir sobre a diferenciação das hifas. Que é quando as células assumem formas e funções diferentes. A diferenciação da hifa pode se dar em várias formas: Anastomose, Haustório, Apressório, Clamidosporo, Rizomorfa, Escleródio e Estroma. Vamos definir cada uma destas formas. • Anastomose: também conhecida como união. É a mais simples das diferenciações que a hifa pode sofrer. As hifas vizinhas se aproximam e entram em contato uma com a outra ou emitem uma ramificação que alcance a outra. Em ambos os casos a parede celular desaparece no ponto de contato. Outras vezes as hifas se unem por grampo de conexão em volta de um septo que as separam. Uma pequena ramificação é emitida de uma hifa próximo do septo, esta ramificação transpõe o septo e entra em contato com a outra hifa seguinte. • Haustório: prolongamentos emitidos pela hifa para o interior da célula do hospedeiro, com a finalidade de absorver alimentos. • Apressório: engrossamento da parte terminal da hifa e tem como função a fixação na superfície. E tem grande produção de fatores de patogenicidade. • Clamidósporo: hifa se diferenciar em forma arredondada, suas paredes se espessam e em alguns casos ficam coloridas. • Rizomorfas: é quando as hifas filamentosas se unem paralelamente intercalando-se umas nas outras, formando um feixe similar às raízes. • Escleródio: é o resultado do entrelaçamento de hifas, formando uma massa de consistência bem dura, arredondada ou irregular. • Estroma: também é resultado da fusão da parede celular das hifas, no entanto, se desenvolve sobre a superfície do substrato no qual o fungo se desenvolve. Geralmente abriga órgãos reprodutivos. Vamos, agora, ao sistema reprodutivo, iniciando com o esporo, que é a unidade reprodutiva do fungo que apresenta forma e tamanho definidos. Para o esporo assegurar sua disseminação é necessário que tenha acesso livre ao ar. Para isso, as hifas vegetativas são levantadas verticalmente sobre o plano micelial, isso é denominado de esporóforos e sobre eles é originado os esporos. Para melhor compreensão vamos estudar separadamente. 1.2 O que é um esporo? O esporo é um termo genérico usado para determinar uma célula ou grupo, cuja germinação origina o talo. É bastante variável em tamanho. O esporo possui membrana, citoplasma e núcleo. 94PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 A membrana pode ser interna (fina) denominada de endósporo e a membrana externa (espessa) denominada de episporo. A membrana pode ser hialina, escura, alaranjada ou rósea. Com superfície lisa, rugosa, crestada, reticulada, caldadas e ciliadas. Quanto à forma pode ser globosa, elíptica, redonda, ovoide, piriforme, filiforme e lobulada. Os esporos germinam por um ou mais poros de onde sai o tubo germinativo, ou promicélio. Os esporos apresentam características morfológicas importantes para a taxonomia que se baseia no número de células, cor, forma dos esporos, septação, ornamentação da parede, etc. Os esporos podem ser assexuados e sexuados. Os sexuados são obtidos pela transformação vegetativa, enquanto que os esporos sexuados são obtidos pela fusão de corpos especializados. Os esporos podem ser ainda endógenos ou exógenos. Os esporos endógenos são produzidos no interior de hifas diferenciadas e os esporos exógenos no exterior de hifas diferenciadas. Os principais tipos de esporos endógenos são: • Ascósporos: esporos formados no interior de ascas. • Esporangiósporos: esporos formados no interior de hifas globosas, denominadas de esporângios. • Zoósporos: esporos ciliados desprovidos de membrana, formados no interior de esporângios especiais denominados de zoosporângio. Os principais esporos exógenos são: • Conídios: esporos que se originam na extremidade de hifas simples ou complexas, eretas ou decumbentes, ramificadas ou não, com ou sem septo. • Basidiósporo: esporos que se originam de hifas férteis, denominadas de basídios. • Esporídios: esporos oriundos dos segmentos terminais ou laterais do promicélio. • Teleutósporos: esporos unicelulares ou multinucleados de parede bastante espessa. • Eciósporos: esporos de parede celular espessa que germinam dando origem a micélios de forma uredósporicos ou teleutósporos. • Picnidiósporos: esporos pequenos que são formados no interior do corpo de frutificação denominados de pícnios. • Clamidósporos — esporos redondos de parede celular espessa de coloração escura e constituem a forma de resistência de alguns fungos. Os esporóforos, 95PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 hifas diferenciadas do sistema vegetativo, tem o crescimento limitado e uma estrutura especial, pois diferenciam quanto a posição, apresentando-se simples ou compostos. Os esporóforos simples são constituídos por uma única hifa ereta ou decumbente. Enquanto que os esporóforos compostos são constituídos por feixes ou massas complexas de hifas. Os principais esporóforos são: • Conidióforos: é o tipo mais simples de esporóforo. É uma hifa fértil, erets ou decumbente, simples ou ramificada, com ou sem septo, podendo ser flexuosa ou não, e mantém os conídios. • Sinêmios: são esporóforos formados pela reunião de hifas eretas e paralelas, formando um feixe. • Esporodóquios: são esporóforos externos, formado pelo entrelaçamento de hifas em forma de um pequeno tubérculo sobre os quais originam os esporos. • Esporangióforos: são esporóforos simples, que na sua extremidade ou lateral apresenta esporângios. E dentro de cada esporângio tem os esporangiósporos que são esporos móveis. • Soros ou Acérvulos: originam-se abaixo da superfície do substrato e quando se desenvolve provoca a ruptura destes expondo os esporos formados. • Basidióforos: esporóforos dos Basidiomycetos. Os esporos se formam nas hifas férteis que se encontram nas lâminas radiais do píleo (chapéu). Também tem os esporos produzidos que não recebem uma denominação especial, como os esporos produzidos dentro de peritécio, cleistotécio,Apotécio e picnídios. Estes tipos de esporóforos tem os esporos encerrados em receptáculos em forma de taça ou frascos. Eles também são denominados de corpos de frutificação e quando possuem esporos exógenos são denominados de picnídios e quando possuem esporos endógenos são denominados de peritécio, apotécio ou cleistotécio. Nos corpos de frutificação, peritécio, apotécio e cleistotécio, os esporos encontram- se dentro de ascas (ascósporos) e se distinguem pelo modo de comunicação com o meio. O peritécio é um receptáculo esférico e tem uma pequena abertura denominada de ostíolo que serve para saída das ascas e ascósporos. Os cleistotécios ou ástomos desprovidos de abertura, para a liberação de ascas e ascósporos é necessário a degradação da parede. E o apotécio são corpos de frutificação abertos por completo na forma de taça ou disco. 96 Caro(a) aluno(a), depois de estudar a morfologia da célula fúngica, iniciaremos nossa discussão sobre a fisiologia e reprodução dos fungos. Na fisiologia, vamos iniciar discutindo o principal carboidrato de reserva dos fungos verdadeiro que é o glicogênio, e também é a reserva em células animais. E o ergosterol é o principal componente da membrana plasmática. Os fungos são seres heterotróficos, precisam de fonte de carbono como hemicelulose, celulose, lignina e açúcares. A fonte de nitrogênio, nitrato e amônio. Os macronutrientes essenciais são: além do carbono, hidrogênio e nitrogênio, tem também o potássio, necessário para o metabolismo dos carboidratos e atividade enzimática. O fósforo está presente no núcleo e metabolismo energético. O magnésio que atua ativando enzimas. O cálcio que está presente na parede celular e o enxofre que é componente dos aminoácidos e enzimas. Quanto aos micronutrientes que são elementos requeridos em menor quantidade podemos citar o ferro que está presente no citocromo, enzimas e pigmentos, o cobre presente em enzimas e pigmentos e manganês, zinco e molibdênio também presentes em pigmento. 2.1 E quanto ao metabolismo secundário? Quem produz as plantas ou os fungos? É raro em animais, comum em fungos, bactérias e plantas. O metabolismo secundário produz substâncias naturais produzidas durante seu ciclo de vida que não são necessárias para o crescimento do fungo. Um grupo especial de fungos produz essas substâncias, tais como Penicillium que pode produzir substâncias antibióticas e antifúngicas. CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS E REPRODUÇÃO DOS FUNGOS2 TÓPICO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOUNIDADE 4 97PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 Outros pontos importantes são o requerimento de água, a digestão e a respiração. O requerimento de água é indispensável para o crescimento, embora tenha os fungos que se desenvolvem em baixa quantidade de água como os fungos causadores de bolores. Os fungos fazem digestão extracorpórea, ou seja, fora da célula. Acadêmico(a), vamos imaginar uma laranja madura armazenada em um lugar com umidade e temperatura elevada, depois de alguns dias provavelmente esta laranja estará com podridão. O que aconteceu? É que o fungo liberou as hifas e micélio vegetativo e esses começaram a liberar enzimas que fazem a digestão dos nutrientes, e quando elas digeriram aquele nutriente fora da célula, agora, sim, o fungo absorve os nutrientes e manda para todo o fungo mantendo sua sobrevivência. E o transporte de nutrientes se dá por difusão, potencial osmótico, e por transporte ativo, canais formados por proteínas premeases. Os fungos têm um amplo espectro de enzimas capazes de degradar substratos orgânicos como a lignina, celuloses e Keratina. Quanto à respiração, os fungos necessitam de oxigênio para sobreviverem. Entretanto, tem fungos que se desenvolvem em meio líquido como quantidade de oxigênio pequena, proporcionando a fermentação de álcool e dióxido de carbono, como as Saccharomyces e fermentação do ácido lático, como os Zigomycota e Oomycetos. Os fungos também demonstram grande diversidade de comportamento em relação à variação de temperatura, pois esta pode influenciar no crescimento vegetativo, tamanho e número de esporos. Vejamos caro(a) aluno(a) um exemplo: • Temperatura ótima para: • Germinação de esporos = 22 ˚C • Desenvolvimento do micélio = 28 ˚C • Formação de novos esporos = 24 ˚C Essas condições são ideais para fungos do gênero Helminthosporium. De modo geral, a temperatura ótima para o desenvolvimento fúngico é de 20 a 30 ˚C. Temperaturas muito baixas, os fungos têm capacidade de suportar com o metabolismo baixo, como se estivessem dormentes. E temperaturas elevadas podem ocasionar a morte do fungo que é de 45 a 50 ˚C. Outro fator que pode influenciar no desenvolvimento dos fungos é a luminosidade. Os fungos quando armazenados no escuro podem ter maior facilidade de germinarem quando comparado com a claridade. Outros apresentam crescimento micelial diferenciado em resposta à luz, produzindo anéis concêntricos quando cultivados em meio de cultura em placas de Petri. Enquanto que as luzes negras e ultravioletas podem estimular a esporulação. 98PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 A luminosidade também pode influenciar a orientação no crescimento da hifa, que é denominado de tropismo. Além da luminosidade, tem a força da gravidade (geotropismo), unidade atmosférica (hidrotropismo) e substâncias químicas (quimiotropismo). Agora caro(a) aluno(a) vamos discutir sobre o modo de vida dos fungos. Os fungos são encontrados na natureza, na água, no solo, no ar, na matéria orgânica em decomposição, em produtos alimentícios, na indústria, parasitando vegetais e animais. Vimos que os fungos são seres heterotrófica, que precisam ser alimentados, eles não têm capacidade de sintetizar seu próprio alimento. E a forma como eles se alimentam obrigam eles a viver em estado saprofítica, parasítica e simbiose. Tanto a forma saprofítica como parasítica requerem carbono para sua alimentação. O fungo saprófita é quando obtém seu alimento na matéria orgânica, ou material em decomposição. Os fungos saprófitas facultativos parasitam substrato vivo ou morto. Neste caso iniciam a infecção em tecidos vivos e multiplicam-se em tecidos mortos. E os fungos parasitas obtêm seu alimento às custas de um organismo vivo, podendo ser parasita obrigatório (precisa do hospedeiro vivo para obter seu alimento), parasita facultativo (fungos que são saprófitas mais em condições favoráveis colonizam substrato vivo) e hemibiotróficos (atacam células inicialmente como parasitas obrigatórios e terminam como saprófitas). E os fungos que fazem simbiose, que é a associação de dois organismos que se beneficiam mutuamente, como, por exemplo, as micorrizas, que são fungos associados às raízes de plantas. Outro item do nosso capítulo a ser estudado, caro(a) aluno(a) é a reprodução dos fungos que pode ser sexuada e assexuada. Na reprodução sexuada, também denominada fase teleomórfica, a formação de um indivíduo se dá pela união de duas células sexuais diferentes conhecidas como gametas. Estes gametas quando se unem trocam material genético formando o zigoto que é produzido por meiose. Processo este que produz indivíduos com diferença genética entre si. Os indivíduos obtidos pela reprodução sexuada apresentam alta variabilidade genética e resistência às condições adversas. Enquanto que a reprodução assexuada, denominada de anamórfica, não envolve a união de gametas, permitindo obter células idênticas à célula mãe, ou seja, os esporos aqui produzidos são obtidos por mitose originando esporos com baixa variabilidade genética, verdadeiros clones. 99 CLASSIFICAÇÃO DE FUNGOS3 TÓPICO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 Ao abordarmos a classificação dos fungos, saliento a você, caro(a) aluno(a) que existem algumas diferenças nesta classificação, pois, pode ser encontrado autores que apresentam uma classificação mais detalhada. Por esse motivo,serão apresentados os principais grupos de fungos, baseando-se na classificação da 10ª edição do Dictionary of the fungi, de 2008 (Kirk et al. 2008), apesar de antiga, esta obra contempla uma classificação válida. A classificação de fungos está em constante alteração e parte destas alterações podem ser consultadas online em bancos de dados, tais como Mycobank (www.mycobank.org) (ROBERT, et al. 2005) e Index fungorum (www.indexfungorum.org). 3.1 Os principais grupos de fungos são: 01. Reino Protozoa • Classe Myxogastria ◦ São organismos multicelulares com plasmódio sem parede celular, que se transforma em esporângio onde internamente os esporos são formados. ◦ Espécies representativas: Physarum polycephalum 02. Classe Phytomyxia ◦ São parasitas obrigatórios, tipicamente patogênicos de plantas. O estágio vegetativo é em forma de plasmódio. Os plasmódios dão origem a zoosporângios os quais contêm quatro a oito zoósporos. Os zoósporos são biflagelados do tipo chicote, o que facilita sua movimentação no filme de água no solo. ◦ Espécies representativas: Plasmodiophora brassicae http://www.mycobank.org/ http://www.indexfungorum.org 100PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 03. Reino Chromista • Classe Oomycetes ◦ Os Oomicetos são organismos que produzem, por meio da reprodução assexuada, células móveis denominadas de zoósporos que apresentam dois flagelos, um flagelo do tipo chicote e outro do tipo tinsel. Os zoósporos são formados dentro dos esporângios. Durante a reprodução sexual produzem os oósporos, esporo de repouso com parede celular bem espessa. ◦ Espécies representativas: Saprolegina ferax e Phytophthora infestans. 04. Reino Fungi (Fungos verdadeiros) • Filo Blastocladiomycota e Chytridiomycota ◦ Os representantes destes Filos são os únicos fungos verdadeiros que se reproduzem por zoósporos. Os zoósporos são móveis e apresentam um flagelo tipo chicote, localizado na extremidade posterior. ◦ Espécies representativas: Physoderma alfafae, Olpidium brassicae e Allomyces macrogynus • Filo Zigomycota ◦ Os Zigomicetos se reproduzem sexuadamente por fusão gametangial caracterizado pela formação de zigosporangio contendo no seu interior um zigósporo com parede celular bem espessa. E a reprodução vegetativa se dá pela formação de Esporangiósporos no interior de esporângios. ◦ Espécies representativas: Rhizopus stolonifer e Mucor rouxil. • Filo Ascomycota ◦ Os Ascomicetos constituem o grupo mais numeroso de fungos. Os Ascomicetos distinguem-se dos outros fungos por produzir esporos (ascósporos) sexuados endogenamente em um asco. Os ascos podem ser produzidos livremente ou no interior de ascomas. E a sua reprodução assexuada dará origem aos conídios. ◦ Espécies representativas: Saccharomyces cerevisiae, Claviceps purpúrea, Trichoderma sp. e micorrizas (fungos que se associam com as raízes de plantas) • Filo Basidiomycota ◦ Os Basidiomicetos compreendem um grande grupo de fungos que causam doenças de importância em plantas. Eles são caracterizados por produzir esporos sexuados exogenamente em células em forma de clava denominada basídio. Os basídios são formados em basidiocarpos bem definidos. ◦ Espécies representativas: Agaricos bisporus, Puccinia graminis (ferrugem do trigo), Ustilago maydis (carvão do milho). 101PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 • Fungos anamórfico ◦ Os fungos anamórficos, também conhecidos como fungos imperfeitos, ou fungos mitospóricos, ou ainda deuteromicetos. Constituem um grupo de fungos em que a reprodução sexuada é ausente ou ocorre raramente. Estes fungos são caracterizados por produzirem conídios em conidiomas ou fragmentação do talo micelial. Espécies representativas: Penicillium notatum e Candida albicans 3.2 Diferença entre Oomicetos e fungos verdadeiros Caro(a) aluno(a), depois de estudar as principais características dos diferentes grupos de fungos fica uma questão a ser respondida. • Os omitetos são fungos verdadeiros? ◦ A resposta é não! Os Oomicetos apresentam características diferentes dos fungos verdadeiros, as quais são apresentadas na tabela 1. TABELA 1: PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE OS OOMICETOS E FUNGOS VERDADEIROS. Estruturas Oomicetos Fungos Verdadeiros Parede celular Celulose e glucanos Quitina Mitocôndrias Cristais tubulares Achatadas ou laminares Esporos com flagelos Com Sem Septos no talo micelial Ausente Presente Síntese de esteróis Não Sim Plodia 2N N Fonte: USP (2019). Observando a tabela 1, caro(a) aluno(a), vemos que os Oomicetos são muito semelhantes às plantas e algas, apesar dos pesquisadores defenderem a ideia de estes apresentarem um ancestral comum, consideram que os Oomicetos perderam a capacidade autotrófica e consequentemente passaram a necessitar de uma fonte de carbono, tornando- se saprófita ou parasita. 102 PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DOS VÍRUS4 TÓPICO PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 Neste tópico, caro(a) aluno(a) vamos discutir as principais características dos vírus, que comparado com os eucariotos e procariotos são muito menores. Os vírus podem medir de 20 a 30 nm de diâmetro e 2000 nm de comprimento. Para termos uma ideia de como são pequenos em uma célula bacteriana cabe mais de um milhão de partículas virais, assim são menores que qualquer célula existente. Eles não são observados em microscópio ótico, somente no microscópio eletrônico. 4.1 O que é vírus? É um microrganismo obrigatório, intracelular, constituído de uma ou mais moléculas de ácido nucleico (DNA ou RNA), geralmente envolto por uma capa proteica camada capsídeo (MIZUBUTI; MAFIA, 2006). Com essa definição, caro(a) aluno(a) você já pode dizer que o vírus é um parasita obrigatório, ou seja, para que ele possa se multiplicar é necessário que ele entre na célula do hospedeiro. Os vírus têm grande importância, pois é capaz de causar doenças em plantas e animais, são modelos de estudos na biologia molecular, são utilizados como vetores na síntese de proteínas e outras moléculas de interesse industrial, entre outros. Agora que você, caro(a) aluno(a), já sabe o que é um vírus, vamos conversar sobre os componentes estruturais e químico dos vírus. O vírus nada mais é que uma proteína, e dentro desta proteína tem o material genético, ou seja, o ácido nucleico. Então vamos ver isso detalhadamente. 103PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 4.2 Estrutura do vírus: O genoma é o conjunto de informações genética que é codificado por um ácido nucleico. O capsídeo que é a capa proteica que envolve genoma viral. É formada por subunidade de proteínas. E tem a função de proteger o genoma viral dos fatores adversos e de possibilitar a aderência da partícula viral da célula hospedeira e conferir simetria estrutural. O capsômero é a proteína que forma o capsídeo, são unidades de capsídeos. O nucleocapsídeo é o conjunto formado de genoma mais o capsídeo. E o envelope é a membrana que envolve o nucleocapsídeo. Esse envelope é um resquício de quando o vírus abandona a célula hospedeira, provavelmente tem caráter lipídico e glicoproteínas chamadas de espículas, como se fosse anteninhas, que são responsáveis pelas variações dos vírus. Nem todos os vírus têm o envelope, alguns podem ter somente o capsídeo e o material genético. Quanto aos componentes químicos dos vírus, eles apresentam: O ácido nucleico que pode ser DNA ou RNA, fita simples (ss), fita dupla (ds) ou ainda linear, ou circular. Os vírus com RNA ss atuam como RNA mensageiro (mRNA), são vírus de cadeia positiva (+) e são traduzidos pelos ribossomos da célula hospedeira. Enquanto que os vírus que replicam seu mRNA primeiro para depois formar a fita complementar são desligados da fita negativa (-) para a replicação da fita positiva (+) que é catalisada por uma RNA polimerase As proteínas são os principais componentes químicos do vírus. As polimerases são responsáveis pela cópia do genoma viral tanto DNA como RNA. As helicases ajudam a modificar aconformação da molécula para ação das polimerases. As Proteínas de movimento auxiliam no movimento do vírus nas células hospedeiras. Também tem as proteínas capsideais que protegem o vírus do sistema de defesa do hospedeiro, ajudando na transmissão. E as proteases, que quebram moléculas de protiproteinas. As proteínas supressoras de genes que conseguem inibir as proteínas de defesa do hospedeiro facilitando a disseminação do vírus em seu hospedeiro. Lipídeos e carboidratos também estão presentes na partícula viral. Os lipídios são encontrados na forma de fosfolipídios no envelope viral e glicoproteínas. Os carboidratos são ribose e desoxirribose que estão presentes no ácido nucleico. Quanto a morfologia básica das partículas virais, pode–se dizer que a maioria dos vírus se apresentam com aspecto poliédrico ou esférico de um capsídeo cuja estrutura básica é de um icosaedro, com face constituída de 20 faces triangulares e 12 vértices. A face triangular é um triângulo equilátero as quais juntam-se para formar 12 vértices. Os vírus com simetria helicoidal têm um capsídeo cujos capsômeros estão arranjados em torno do ácido nucleico em forma de uma hélice, apresentando-se em forma de bastão. Um dos vírus helicoidais muito estudado é o vírus do mosaico do tabaco e vírus animais, incluindo os agentes causais do sarampo, caxumba, influenza e raiva. Existem vírus animais com simetria complexa ou indefinida, como, por exemplo, os arenavírus e os poxvírus que apresentam capsídeo com simetria irreconhecível. 104PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 Outro ponto importante é a replicação Viral, que tem por base a pré-existência de um molde. Os vírus mudam o processo metabólico das células hospedeiras para produzir novos vírus. Este processo tem fases específicas para animais e plantas. A primeira fase que discutiremos ocorre somente para vírus que atacam os animais. É a fase de fixação ou também denominada de adsorção. A célula que vai receber o vírus apresenta em sua superfície receptores específicos ocorrendo a fixação. A penetração é a segunda etapa no processo de infecção do vírus na célula hospedeira. O genoma pode ser diretamente liberado no citoplasma passando pela cutícula ou por meio de fagocitose quando for célula animal. Em plantas são necessários ferimentos causados por insetos e poros presentes ao longo da parede celular. A biossíntese dos componentes virais dentro da célula hospedeira, seja animal ou vegetal, se dá pela síntese do mRNA viral e proteínas que montam o nucleocapsídeo. As etapas seguintes são a maturação e a montagem. Quando se tem um grande número de partículas virais, os mesmos são unidos em partículas maduras no núcleo e/ou citoplasma da célula infectada. O tempo que leva para o vírus perder a capa proteica até a montagem de um novo vírus é denominado de eclipse, pois se a célula for rompida neste período nenhum vírus infeccioso será encontrado. A liberação do vírus maduro na célula hospedeira é a etapa final da replicação viral. A liberação pode ser feita todos juntos quando ocorre a desintegração ou lise da célula. Outra alternativa é a expulsão das partículas virais por exocitose. E alguns vírus deixam as células por canais especiais (túbulos) com o auxílio das proteínas de movimentos. E para finalizarmos este tópico, caro(a) aluno(a), vamos relatar a classificação dos vírus que podem ser classificados de acordo com as características físicas, químicas e biológicas, um sistema estabelecido pelo Comitê Internacional de Taxonomia do Vírus (CITV). Quanto a nomenclatura, desde do início da virologia busca-se a melhor maneira de classificar os vírus, quanto a nomenclatura há várias décadas tem se usado o nome do hospedeiro e ou tipo de sintoma que ele induz, por exemplo, vírus da cólera suína, vírus da influenza suína, vírus do mosaico do pepino, vírus do mosaico do tabaco. Essa nomenclatura também é baseada na afinidade do vírus pelos tecidos afetados, como, por exemplo: vírus neurotrópicos, aqueles específicos das células nervosas. No entanto, como se tem muito conhecimento sobre características física, química e biológica do vírus, esquemas de classificação foram formulados. E esse tipo de classificação vem sendo utilizada pelo Comitê internacional de taxonomia dos vírus (CTIV) para classificar os vírus. O nome da família termina em –viridae, nomes de subfamílias em –virinae e o gênero e as espécies em — vírus. Por exemplo, Picornaviridae que significa vírus RNA pequeno (pico); Hepadnavírus, vírus DNA que causa doença no fígado (hepa). Os virologistas de vegetais classificam os vírus de maneira semelhante. Os vírus são classificados em grupos de vírus (em lugar de família e gênero). Os nomes são derivados de nomes protótipos mais representativos do grupo, por exemplo, o vírus do mosaico do tabaco é o grupo tabamo ou tobamovírus. 105 Você sabe que os vírus podem ser comedores de bactérias patogênicas a homens e animais? Muitas pesquisas estão sendo realizadas para avaliar a eficiência dos vírus como agentes terapêuticos em diversas áreas. Isso se deve ao crescente surgimento de resistência bacteriana aos antibióticos e a terapia com fagos acaba sendo uma alternativa viável, pois é uma forma de controle biológico, que se baseia em um vírus específico que infecta e destrói células bacterianas, os bacteriófagos. O uso de bacteriófagos como agentes antimicrobianos é utilizado com sucesso para detecção de patógenos em produtos alimentícios que compreendem desde a segurança da água e alimentos ao emprego da agricultura e saúde animal. Fonte: ROSSI, Lívia Píccolo Ramos; ALMEIDA, Rogeria Comastri de Castro. Bacteriófagos para controle de bactérias patogênicas em alimentos. Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso), v. 69, n. 2, p. 151–156, 2010. SAIBA MAIS “Os fungos são essenciais para a nossa sobrevivência. Estamos a fazer o suficiente para os proteger?” Este é o título do artigo publicado por SARAH GIBBENS, na revista National Geografic. Neste artigo, a autora relata que os cogumelos solitários estão em extinção e muitos outros podem estar em perigo. Os cogumelos além de serem saborosos, ricos em vitaminas, eles podem curar várias doenças e isso induz uma colheita excessiva, o que pode levá-los à extinção. No entanto, os fungos têm grande importância no ecossistema, ajudando a fragmentar o carbono armazenado em material vegetal, aprisionando-o no solo. Assim os pesquisadores questionam: Será que podemos perder algum fungo? Fonte: GIBBENS, Sarah. Os fungos são essenciais para a nossa sobrevivência. Estamos a fazer o suficiente para os proteger? 2021 Disponível em https://www.nationalgeographic.pt/ REFLITA PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 https://www.nationalgeographic.pt/ 106 Nesta unidade, caro(a) aluno(a), você aprendeu sobre o fascinante mundo dos fungos e vírus. Identificamos as principais características morfológicas dos fungos, sendo elas divididas em estrutura vegetativa e reprodutiva. A estrutura vegetativa é referente ao micélio que é formado por um conjunto de hifas. As hifas podem sofrer diversas modificações como haustório, apressório, escleródio, rizomorfas, clamidósporos e estroma. A estrutura reprodutiva se refere aos esporos que apresentam variações quanto à forma, coloração, septação e tamanho. E o esporo é a marca registrada do fungo. Em seguida, passamos a discutir sobre as características fisiológicas e a reprodução dos fungos. Vimos que os fungos precisam de uma fonte de carbono para se desenvolverem, que a digestão é extracelular e os fungos podem ser saprófita ou parasita. O fungo parasita, dependendo como ele se alimenta, pode ser parasita obrigatório, parasita facultativo ou parasita saprófita. Quanto à reprodução estudamos a reprodução sexuada, que vai gerar os conídios que são esporos com o mesmo material da célula mãe. E a reprodução sexuada tem troca de material genético, tem grande variabilidade e gera esporosde resistência. Abordamos também os principais grupos de fungos que são classificados de acordo com as características dos esporos, corpo de frutificação e seu ciclo de vida. Exposto em uma tabela listamos informações sobre as principais diferenças entre Oomicetos e fungos verdadeiros. Diferenciação necessária uma vez que Oomicetos tem ancestrais comum com plantas e algas. Por fim, tratamos da partícula viral, que envolve a definição, as características estruturais, químicas, replicação, movimentação na célula e classificação. Vimos que os vírus são parasitas obrigatórios, ou seja, precisa de um organismo vivo para desempenhar suas funções, caso não tenha um hospedeiro ele é considerado uma partícula inerte. CONSIDERAÇÕES FINAIS PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 107 Caro(a) aluno(a), você sabia que a biotecnologia utiliza microrganismos e sistemas biológicos na produção de produtos que podem ser aplicados na indústria de alimentos? Espero que estas referências complementares ajudem a entender que se tem muitos processos e técnicas ativas em pesquisas microbiológicas. • DE ABREU, Jéssica Aline Soares; ROVIDA, Amanda Flávia da Silva; PAMPHILE, João Alencar. Fungos de interesse: aplicações biotecnológicas. Revista UNINGÁ Review, v. 21, n. 1, 2015. • ORLANDELLI, Ravely Casarotti et al. Enzimas de interesse industrial: produção por fungos e aplicações. SaBios-Revista de Saúde e Biologia, v. 7, n. 3, 2012. • MALAJOVICH, Maria Antonia. Biotecnologia. Axcel Books do Brasil Editora, 2004. LEITURA COMPLEMENTAR PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 108 MATERIAL COMPLEMENTAR FILME/VÍDEO • Título: Nada se espelha com o medo — Contágio • Ano: 2011; • Sinopse: Contágio segue o rápido progresso de um vírus letal, transmissível pelo ar, que mata em poucos dias. Como a epidemia se espalha rapidamente, a comunidade médica mundial inicia uma corrida para encontrar a cura e controlar o pânico que se espalha mais rápido do que o próprio vírus. Ao mesmo tempo, pessoas comuns lutam para sobreviver em uma sociedade que está desmoronando. LIVRO • Título: Dictionary on the fungi. • Autores: Paul M Kirk, Paul F Cannon, J A Stalpers, David W Minter; • Editora: Cabi; 9th ed. Edição; • Sinopse: Este livro fornece a lista mais completa disponível de nomes genéricos de fungos, suas famílias e ordens, seus atributos e termos descritivos. Para cada gênero, a autoridade, a data de publicação, status, posição sistemática, número de espécies aceitas, distribuição e referências-chave são fornecidas. Diagnósticos de famílias e detalhes de ordens e categorias superiores são incluídos para todos os grupos de fungos. Além disso, há notas biográficas, informações sobre metabólitos e micotoxinas bem conhecidos e relatos concisos de quase todos os aspectos puros e aplicados do assunto (incluindo citações de literatura importante). PRINCIPAIS GRUPOS DE MICRORGANISMOSUNIDADE 4 109 CONCLUSÃO GERAL Prezado(a) aluno(a), concluímos nossa caminhada ao longo do curso, ao estudarmos diversos assuntos importantes relacionados à microbiologia. Na unidade I, conhecemos o mundo dos microrganismos. Compreendendo as principais características da microbiologia como ciências. Bem como aprendemos as perspectivas históricas da microbiologia. Também conhecemos e estudamos a diferença das células eucariontes e procariontes, caracterizando os principais grupos de microrganismo. E exemplificamos a função dos microrganismos no ambiente, o que é bastante comum e importante no nosso cotidiano. Na unidade II, tivemos acesso a obter o microrganismo em cultivo puro. Conhecemos a importância do microscópio e o preparo do material a ser observado quando se deseja obter um microrganismo puro em placas de Petri. Entendemos como é realizado o controle dos microrganismos indesejáveis para obter os microrganismos de interesse. Analisamos ainda sua aplicação e quais os instrumentos podem ser utilizados. As morfologia e classificação de bactérias e protozoários foram estudadas na Unidade III. Quanto às características da célula bacteriana aprendemos que são células procariontes, esféricas, cilíndricas e helicoidais, apresentam-se isoladas ou em arranjo, muitas bactérias têm flagelos para sua locomoção e pelos para auxiliar sua aderência a superfície. Além de que as bactérias são divididas em dois grandes grupos, Gram positivas e Gram negativas, que se diferem quanto à estrutura e composição química da parede celular. Detalhamos as organelas presentes na célula bacteriana, como também a sua reprodução, crescimento e variabilidade genética. Também estudamos os diferentes grupos de bactérias, as Eubactérias e as Arqueobactérias. E ainda nesta unidade, estudamos as principais características dos protozoários que se diferenciam das bactérias por serem organismos eucariotos, no entanto, apresentam flagelos e cílios mais complexos do que em bactérias. Na unidade IV conhecemos os fungos e as principais características da partícula viral. Compreendemos as mais diversas formas vegetativa e reprodutiva que os fungos apresentam. Assim, estudamos sobre o comportamento dos fungos quanto a obtenção do seu alimento, o que os tornam biotróficos e Necrotróficos. Além, de entendermos as condições necessárias para o seu crescimento e reprodução que é sexuada ou assexuada. Detalhamos a estrutura e os componentes químicos de um vírus. Contudo, os vírus se replicam somente na presença do 110 hospedeiro, ou seja, são parasitas obrigatórios. E que estes enganam o mecanismo de defesa da célula hospedeira para a produção de novas partículas virais. Por fim, concebemos este material com o intuito de auxiliar ao longo do seu curso. Certamente os assuntos abordados aqui terão grande importância para sua formação profissional. Espero que você, acadêmico(a) possa tirar o máximo de proveito dos conceitos apresentados neste material didático. E com isso possa abrir caminho para que você possa “tomar gosto pelas coisas” em desenvolver trabalhos na microbiologia. Até uma próxima oportunidade. Muito Obrigada! 111 REFERÊNCIAS ALFENAS, A. C.; MAFIA, R. G. Métodos em fitopatologia. Lavras: UFV, 2007. p. 53-90. ALMEIDA, L. M. et al. Microscopia: contexto histórico, técnicas e procedimentos para observação de amostras biológicas - 1. ed. -- São Paulo: Érica, 2014. ISBN 978853652112-1. ARMISEN, R., & GAIATAS, F. Agar. In Handbook of hydrocolloids. (pp. 82-107). BEVILAQUA, G. C., MENEZES, M. U. F. O., DA CRUZ XIMENES, G. N., DA SILVA NASCIMENTO, Í. R., DA SILVA PEREIRA, E. F., & DOS SANTOS. CORTEZ, N. M. Queijo fresco artesanal de leite caprino com lactobacillus acidophilus: avaliação do crescimento de bactérias láticas. Brazilian Journal of Development, 6(4), 21214-21231. (2020). CANHOS, V. P., & MANFIO, G. P. Recursos microbiológicos para biotecnologia. 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ISBN978853880677-6. https://unifatecie.edu.br/edufatecie/index.php/edufatecie/catalog/view/56/64/417-2?fbclid=IwAR2yYGBmg7aXwBBv8uTiU3ZbzJsMjPHKn43gaOVaiJOTR1GSzc-ir_Zcnr4 https://unifatecie.edu.br/edufatecie/index.php/edufatecie/catalog/view/56/64/417-2?fbclid=IwAR2yYGBmg7aXwBBv8uTiU3ZbzJsMjPHKn43gaOVaiJOTR1GSzc-ir_Zcnr4 https://unifatecie.edu.br/edufatecie/index.php/edufatecie/catalog/view/56/64/417-2?fbclid=IwAR2yYGBmg7aXwBBv8uTiU3ZbzJsMjPHKn43gaOVaiJOTR1GSzc-ir_Zcnr4 114 USP – Universidade de São Paulo. Disponível em: https://edisciplinas.usp.br/pluginfile. php/5251566/mod_resource/content/2/Fungos%20e%20Oomicetos%202020.pdf. Acessado em 2019 V. ROBERT, G. STEGEHUIS AND J. STALPERS. 2005. The MycoBank engine and related databases. Disponível em:https://www.mycobank.org/ VERMELHO, A. B. et al. Práticas de microbiologia - 2. ed. - Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2019. 256p. ISBN 978-85-277-3556-8 1. ZERBINI, F. M.; CARVALHO, MG de; ZAMBOLIM, E. M. Introdução à virologia vegetal. Cadernos Didáticos, v. 87, 2002. Pelczar et al. Microbiologia – Conceitos e Aplicações. 1996. Vol. 1. ENDEREÇO MEGAPOLO SEDE Praça Brasil , 250 - Centro CEP 87702 - 320 Paranavaí - PR - Brasil TELEFONE (44) 3045 - 9898 Unidade 1 - 2024 Unidade 2 - 2024 Unidade 3 - 2024 Unidade 4 - 2024 Site UniFatecie 3: Botão 19: Botão 18: Botão 17: Botão 16:caro(a) aluno(a) consegue perceber que a geração espontânea está incorreta? Se ela estivesse correta, as larvas surgirão tanto nas carnes que estavam nos frascos abertos como nos frascos fechados, nos dois frascos. Aqui ficou provado que a vida surge por meio de outro ser vivo. Mesmo com a comprovação de Redi, que os microrganismos não surgiram de material inanimado, muitos pesquisadores da época não aceitaram, outros falaram que este experimento era somente para organismos multicelulares. Então continuou a pesquisa para comprovar que os microrganismos não se desenvolviam por abiogêneses. Outro pesquisador que teve papel primordial na microbiologia foi o químico francês, Louis Pasteur (1859). Ele comprovou que o ser vivo não pode surgir de matéria inanimada. Para isso, o que ele fez? Ele realizou um experimento utilizando um balão de vidro, onde ele colocou um caldo nutritivo, em seguida ele ferveu o material para matar todos os microrganismos que estavam ali dentro, posteriormente ele pegou este balão e entortou o gargalo, ao entortar esse gargalo o que era impedido? A entrada do microrganismo. Assim os microrganismos não atingiam o caldo nutritivo, o ar entrava mais os microrganismos não, estes ficavam retidos na curva do gargalo. Depois o que Pasteur fez? Quebrou o gargalo deixando o ar em contato direto com o caldo nutritivo. E ele percebeu o desenvolvimento dos microrganismos. Com este experimento Pasteur provou que o material foi contaminado por microrganismos presentes no ar e não que o ser vivo surgiu do caldo nutritivo. Então Pasteur provou que a vida surge por meio de outro ser vivo. Essa ideia foi importante para derrubar a teoria da abiogênese que até então era dominante. Outra contribuição importante foi a técnica da pasteurização, técnica criada por Pasteur. Essa técnica é utilizada até hoje para evitar a proliferação de microrganismos. A técnica consiste no aquecimento e um rápido resfriamento. INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 13 Um exemplo, é o leite pasteurizado, no qual o leite é aquecido a 72 graus e rapidamente resfriado a 35 graus e embalado logo em seguida de forma a não entrar em contato com outros microrganismos. Continuando, em 1796, Jenner criou uma vacina para varíola. Ele põe em prova o ditado popular que as pessoas que trabalham com animais adquiriram uma versão mais leve da doença. Ao observar mulheres que eram responsáveis pela ordenha quando expostas ao vírus bovino tinham mesmo uma versão mais leve da doença. Ele colocou o pus das mãos de uma das mulheres que trabalhavam na ordenha em um menino e em poucos dias observou que o menino se recuperou em poucos dias. Ele repetiu esse procedimento em vários humanos com varíola, descobrindo assim a propriedade de imunização. Técnicas antissépticas foram introduzidas por um cirurgião e pesquisador inglês, Lister (1865). Ele demonstrou que o ácido carbólico (fenol) era um agente antisséptico eficiente, pois após seu uso em cirurgias fez com que reduzisse o número de mortes por infecção pós-operatória. Hoje utilizamos o álcool etílico, hipoclorito de sódio, compostos clorados e ácido acético. Em 1876, o médico alemão, que teve grande importância para descobertas e fundamentos da microbiologia, foi Robert Koch. Ele foi responsável pelo descobrimento da bactéria Bacillus anthracis, causador da doença carbúnculo, que dizimou populações inteiras de ovelhas. Em estudos desenvolvidos por Robert Koch revela que os esporos da bactéria poderiam sobreviver anos no solo, no qual Koch idealizada que os animais portadores da doença tivessem seus corpos cremados para evitar com que a doença fosse espalhada ainda mais. O médico ainda provou que cada tipo de microrganismo infeccioso provocava uma doença específica. Com estes estudos ele publicou quatro postulados que são utilizados até hoje na microbiologia. 01) Associação do microrganismo constante com a doença. 02) O Microrganismo deve ser cultivado em meio à cultura nutritiva. 03) Inocular em ser sadio suscetível 04) Recuperação do microrganismo - observar as mesmas características obtidas no postulado dois. Cumpridos os quatro postulados pode se dizer que o microrganismo é o agente que causa a doença. Estas etapas dos postulados foram responsáveis pela compreensão de como as doenças são transmitidas. Koch continuou a aperfeiçoar os métodos de laboratório, inventou diferentes meios de cultura nutritivo, entre eles o meio batata e ágar e este meio era mantido em um recipiente próprio, placas de Petri, que foram inventadas por seu amigo Richard Petri. Esta invenção é utilizada até hoje. E a pesquisa continuava, em 1892 Dimitri Ivanovski observou que o organismo que causava a doença do Mosaic taboco vírus era muito pequeno INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 14 e capaz de passar por qualquer filtro que na época era utilizado para deter as bactérias. No entanto, somente em 1936 Wendell Stanly demonstrou a verdadeira natureza química do vírus causador do mosaico do tabaco. Alexander Fleming, médico oficial inglês, por volta de 1929, estudando a bactéria Staphylococcus aureus, responsável pelas abscisão em feridas abertas provocadas pelas armas de fogo, acidentalmente descobriu que o mofo oriundo do fungo Penecillium secreta uma substância que destrói a bactéria. Ainda que seja ao acaso, ele criou o primeiro antibiótico da história da humanidade, a penicilina, o que fez da medicina uma verdadeira ciência. E por fim em 1995 é anunciado a primeira sequência completa de um genoma bacteriano Haemophilis influenzae, bactéria responsável em causar pneumonia. INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 15 Essa classificação envolve a sequência de nucleotídeos do gene que codifica para RNA ribossomo, para os ribossomos. Só para você lembrar, os ribossomos são macromoléculas responsáveis pela síntese de proteínas. Agora você deve ter perguntado por que usa a classificação ribossomo? Pois bem, todo o ser vivo tem seu código genético na forma de uma molécula de DNA e têm genes que codificam para os ribossomos. Todo ser vivo possui ribossomo em sua célula, pois estes são responsáveis pela síntese de proteína que é uma função básica. A vida só é possível, dentro de outros aspectos, porque fazemos síntese proteica. Esse processo é bem controlado, não pode ocorrer muitos erros, pois na síntese proteica as proteínas sintetizadas devem corresponder o mais próximo do código genético que é herdado das células parentais. Contudo, a evolução na modificação da sequência de nucleotídeos para o ribossomo é lenta, ou seja, ocorrem poucas modificações para a evolução dos seres vivos. Assim, ao analisarmos a classificação dos seres vivos, que começa com a informação se é um organismo eucarioto e/ou organismo procarioto, é com base na comparação da sequência do DNA e RNA codificados para o ribossomo. E com isso se tem três domínios, que é o táxon máximo que engloba a classificação dos seres vivos, é assim denominada, domínio, sendo o domínio Eucarioto, domínio Archaea e o domínio Bactéria. Agora, vamos dar ênfase a: quanto tempo há vida na terra. Se fizéssemos uma relação da origem da vida com um relógio, veríamos que os seres humanos surgiram nos últimos segundos. Considerando que a terra surgiu há aproximadamente 4,6 bilhões de anos atrás, veja que as primeiras formas de vida surgiram a quase 4 bilhões de anos atrás e foram os microrganismos, as bactérias, procariotos, CLASSIFICAÇÃO DOS SERES E CARACTERÍSTICA GERAL DOS MICRORGANISMOS3 TÓPICO INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 16 que continuam até hoje. Em seguida surgiu as bactérias fototróficas (bactérias que não precisam de oxigênio), e as bactérias cianobactérias (bactérias que liberam oxigênio) dando início a oxigenação na atmosfera e a 2 bilhões de anos atrás surgiu os eucariontes, seres mais complexos, inicialmente microrganismos unicelulares. Os eucariontes são a maioriadependente do oxigênio para seu metabolismo. Em seguida surgem as algas que começam a aumentar em termos de diversidade. Os invertebrados, as plantas e os mamíferos e por fim os humanos surgiram um pouco menos de meio milhões de anos atrás. Somente a menos de um bilhão de anos atrás que surgiram vidas mais complexas e que predominam até hoje. Assim, a raiz da árvore de ancestrais é a bactéria que foi se diversificando com a evolução durante 4 bilhões de anos e surgiu vários grupos de seres vivos. Dentro do domínio bactéria tem as bactérias Gram positivas, bactérias proteolíticas, Cianobactérias e hipertermófilos. No domínio Archaea, microrganismos que vivem em ambientes extremos, como halófilos (ambientes salinos), Metanogênicos (ambiente rico em metano) e hipertermófilos (ambiente com temperaturas elevadas). E no domínio Eucarioto, tem os grupos dos animais, o qual pertencemos, o grupo dos fungos e os vegetais. Evolutivamente somos próximos dos fungos, apesar de ter uma complexidade muito diferente. E muito longe de organismos capazes de causar doenças como protozoários e giárdia. Para completar nossa discussão, os ribossomos são moléculas presentes em todos os seres vivos e que são pouco alterados ao longo dos anos, então, ele é utilizado para a classificação dos seres vivos em domínio até diferentes taxas (Unidade taxonômica). Quando temos dois indivíduos e queremos descobrir a qual domínio eles pertencem, fazemos a comparação da sequência de nucleotídeos de genes que codificam para os ribossomos. E quanto mais próxima for a sequência de nucleotídeos entre dois indivíduos que dizer que a história evolutiva foi incomum. E quanto mais convergente, mais distante são os dois indivíduos. Os ribossomos das bactérias são de 70 S (S = sedimentação), com duas subunidades, uma de 50 S (maior) e outra de 20 S (menor). A unidade de 50 S é dividida em mais duas subunidades, uma de 23 S e outra de 5 S, com 31 proteínas. O gene de DNA que codifica 23 S tem aproximadamente 2904 pares de bases e a 5 S tem 120 pares de bases. Para a unidade menor, 30S é formada por 1542 pares de bases, com 21 proteínas. Quando classificamos um indivíduo como bactéria (procarionte) se usa esta sequência de nucleotídeos. Os ribossomos nos eucariotos têm o coeficiente de sedimentação maior, 80 S, a subunidade 60 S (maior) e 40 S (menor). A subunidade 60 S é formada por três unidades, 28 S (4.718 pares de bases), 5,8 S (160 pares de bases) e 5 S (120 pares de bases), sendo INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 17 que apresentam 49 proteínas. E a unidade 40 S tem a unidade 18 S com aproximadamente 1874 pares de bases que codificam 39 proteínas. Então quando temos o gene 18 S estamos nos referindo a subunidade menor com aproximadamente 1874 pares de bases, sequência de nucleotídeos ribossômico, que se refere aos eucariotos e não procariotos. A comparação da sequência de nucleotídeos RNA ribossômico permite identificar qualquer indivíduo que vai de domínio até espécie, veja, foram mais de 4 bilhões de anos de evolução, durante o qual os seres se diferenciam em tamanho, forma, genética e habitat, ainda se usa a morfologia para caracterizar os eucariotos, no entanto, para identificar procariotos usa a genética (RNA ribossomo), metabólicos e bioquímicos. Mas você deve estar se perguntando, qual é a diferença entre a célula procarionte e eucarionte. Então, a seguir vamos discutir as principais diferenças entre células procariotas e eucariotas. A célula eucariótica tem um núcleo verdadeiro, delimitado por membrana, enquanto que as células procarióticas o núcleo fica disperso no citoplasma em uma região denominada nucleoide. Quanto ao tamanho da célula, geralmente a célula procariótica apresenta 0,2 a 2 micrômetro e a célula eucariótica apresenta aproximadamente 10 a 100 micrômetros. Presença de organelas revestida por membranas, os procariotos apresentam poucas organelas enquanto que os eucariotos têm muitas (núcleo, lisossomo, complexo de golgi, retículo endoplasmático, mitocôndrias, cloroplastos). O flagelo presente em procariotos é composto por três partes, gancho, corpo basal e filamento, nas células eucarióticas é mais complexo, pois apresenta citoplasma no seu interior, múltiplos microtúbulos para garantir o movimento. O glicocálice em procariotos é presente em forma de cápsula e camada limosa, em eucariotos é presente em algumas células sem parede celular. A parede celular geralmente presente nos procariotos e bem complexa, pois contém peptidoglicano que divide as bactérias em gram-positiva (maior quantidade de peptideoglicano) e gram-negativa (menor quantidade de peptideoglicano), em eucariotos quando presente é mais simples contém celulose em vegetais e algas e quitina em fungos. A membrana plasmática em procariotos é composta por carboidratos, enquanto que nos eucariotos a principal substância são esteroides. Em procariotos o é ausente o fluxo citoplasmático e nos eucariotos ocorre o fluxo citoplasmático. E os ribossomos dos procariotos são menores (70S) quando comparado com os eucariotos que apresenta duas subunidades, a maior (80S) e a menor (70S). O material genético em procariotos apresenta um único cromossomo circular sem histonas (proteínas de enovelamento do DNA). E nos eucariotos o cromossomo é linear e com a presença de histonas. A divisão celular dos procariotos é por meio da fissão binária e não envolve INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 18 recombinação sexual, somente a transferência do DNA. Enquanto que os eucariotos a divisão celular envolve a mitose e a recombinação sexual a meiose. Essas são as principais diferenças entre uma célula procariótica e eucariótica. Caro aluno (a) no decorrer do curso você vai ver que os microrganismos podem ser divididos em grupos. Aqueles que utilizam oxigênio, aqueles que não usam o oxigênio, microrganismos que utilizam o carbono orgânico e aqueles que utilizam o carbono inorgânico. Então vamos deixar clara algumas definições. Os microrganismos podem usar como fonte de energia a luz, sendo denominados de fototróficos, ou utilizar compostos químicos, sendo denominados de quimiotróficos. Outra divisão é o tipo de molécula como fonte de carbono, elemento que todos os seres vivos contêm. Como fonte de carbono tem: compostos orgânicos, organismos denominados de heterotróficos; e o dióxido de carbono, organismos denominados de autotróficos. Logo temos: Quimioheterotróficos (organismos que utilizan como fonte de energia compostos químicos e fonte de carbono compostos orgânicos), Quimioautotróficos (organismos utilizam como fonte de energia compostos químicos e fonte de carbono dióxido de carbono), Fotoheterotrófico (organismo que utiliza como fonte de energia a luz e fonte de carbono compostos orgânicos) e fotoautotrófico (organismos que utilizam como fonte de energia a luz e fonte de carbono dióxido de carbono). Organismos quimioheterotróficos, o aceptor final de elétrons é o oxigênio, são quase todos os animais, fungos, protozoários, e boa parte das bactérias. E o aceptor final de elétrons sem oxigênio são as Streptomyces e Clostridium. Os quimioautotróficos são bactérias que oxidam oxigênio, enxofre, ferro e nitrogênio. As bactérias não sulfurosas são fotoautotróficas, enquanto que organismos como plantas e algas, utilizam água para reduzir o dióxido de carbono e as bactérias sulfurosas que não usam água para reduzir para dióxido de carbono são exemplos de organismos fotoheterotróficos. INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 19 Caro aluno(a), você sabia que os microrganismos estão presentes em todos os lugares e contribuem para a vida dos seres vivos? Os microrganismos estão presentes em várias coisas que acontecem à nossa volta. Os microrganismos estão envolvidos na fermentação, reciclagem de nutrientes, fabricação de alimentos e bebidas, na indústria farmacêutica, medicina e na agricultura. A fermentaçãoé um processo de liberação de energia que ocorre sem a participação de oxigênio, ou seja, é a transformação da matéria orgânica em outra, liberando energia. Quem é o responsável pela transformação da matéria orgânica em outros produtos? As bactérias e fungos. Para que se tenha a fermentação alcoólica é necessário que ocorra um processo denominado de glicólise. Processo químico no qual fosfatos são incorporados na molécula de glicose, que forma duas moléculas de ácido pirúvico, que sofre ação da levedura (Saccharomyces cerevisae) e da bactéria (Zymomonas mobilis), resultando em etanol e dióxido de carbono. Esse tipo de fermentação alcoólica é muito comum na produção de pães, vinhos, cerveja e etanol. A fermentação lática, que é realizada exclusivamente por bactérias, Lactobacillus e Streptococcus, ocorre com derivados da lactose, ou seja, o ácido pirúvico é transformado em ácido lático. Essa fermentação é comum na fabricação de iogurtes e queijos. A fermentação acética ocorre a partir da fermentação alcoólica. O etanol obtido da fermentação alcoólica entra em contato com as bactérias Acetobacter ou Gluconobacter, as quais transformam o etanol em moléculas do ácido acético, principal componente do vinagre. Os cogumelos podem ser alimentos muito nutritivos, com grande quantidade de proteínas que equivalem à carne bovina. São alimentos ricos em carboidratos e vitaminas com baixo teor de gordura. E são aliados benéficos nos tratamentos de doenças como o câncer, MICRORGANISMOS NO COTIDIANO4 TÓPICO INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 20 lúpus e HIV que afetam a humanidade. Dentre os cogumelos comestíveis, podemos citar o Lentinula edodes comumente conhecido como shitake, Agaricus bisporus, popularmente conhecido como champignon ou cogumelo de botão, Auricularia sp. Conhecida como orelha-de-pau. E as chamadas trufas, termo popular para indicar um tipo de fungo (Tuber meloporum) comestível do grupo ascomicetos. Geralmente as trufas aparecem associadas às raízes de plantas como carvalho, salgueiro, álamo e bétulas, ficando alguns centímetros da superfície das plantas. As trufas são consideradas um dos pratos mais caros da Europa, devido à dificuldade de serem encontradas. As trufas liberam substâncias químicas que somente os cães são capazes de sentir. Os queijos refinados como Roquefort de origem francesa são produzidos do leite de ovelha com veias originadas do fungo Penicillium roqueforti. O queijo de origem italiana, gorgonzola, produzido com leite de vaca, as veias de coloração cinza e azul deriva de maturação com o fungo Penicillium glaucum. Os queijos Camembert e Brie, também produzido com leite de vaca, sua casca apresenta uma camada branca ou cinza bem aveludada é devido à presença de fungos causadores de mofos, Penicillium candidum e Penicillium camemberti. Na indústria farmacêutica, o fungo Penicillium notatum que produz um antibiótico, composto com a capacidade de inibir o crescimento ou causar a morte de bactérias. Esse antibiótico, a penicilina, é utilizado no tratamento e profilaxia de doenças bacterianas. A penicilina inibe uma enzima chamada transpeptidase, que atua na formação do peptideoglicano (importante componente da parede celular das bactérias). Essa inibição faz com que a penicilina provoque a rápida destruição da célula, consequentemente morte da bactéria. A produção de bacitracina por Bacillus sp. Também é um importante antibiótico, pois inibe a biossíntese parede celular das bactérias. O antibiótico, a estreptomicina, é eficaz no tratamento de tuberculose. É produzido pela bactéria Streptomyces, pertencente ao grupo Actinomicetos. Esse antibiótico inibe também a síntese proteica, havendo, portanto, a inibição do crescimento e eliminação da célula bacteriana. As descobertas que ocorrem na microbiologia ajudam os profissionais da saúde a compreender, diagnosticar e tratar doenças que não são bem compreendidas. Os conhecimentos adquiridos foram primordiais para melhorar o tratamento de doenças como a AIDS, doença de Lyme e a doença de legionários, que são causadas por microrganismos. Os microbiologistas que trabalham o solo buscam microrganismos que degradam os poluentes como herbicidas e inseticidas. E na agricultura, na área de controle biológico, os microrganismos são usados para controlar insetos, como, por exemplo, Bacillus thuringiensis no controle de larvas de lepidópteros que atacam a cultura da soja e do milho. Os microrganismos também são utilizados para o controle de doenças em plantas, como, por exemplo, Trichoderma sp. no controle de Sclerotinia sclerotiorum agente causal do mofo branco em soja, cultura de maior interesse agronômico. Os microrganismos também fixam nitrogênio. As bactérias do gênero Bradyrhizobium capturam nitrogênio da INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 21 atmosfera e transforma em fertilizante para a planta. Alguns fungos e bactérias promovem a decomposição da matéria orgânica e liberação de nutrientes para o meio ambiente. Ainda tem os microrganismos que causam alteração nos produtos alimentícios. Fungos como Rhizopus stolonifer e Penicillium sp. Que causam podridão mole e conseguimos visualizar um crescimento micelial sobre o alimento atacado. E o fungo Aspergillus sp. que é um agente produtor de micotoxinas, substâncias tóxicas para seres humanos, por esse motivo os grãos são desvalorizados. Durante cem anos, os pesquisadores previram que as bactérias poderiam usar o manganês como fonte de energia para seu crescimento, mas nada foi encontrado. Até que dois microbiologistas ambientais da Caltech, Jared Leadbetter e Hang Yu, descobriram a primeira bactéria conhecida por usar o metal manganês para crescer. O principal autor, Professor Jared Leadbetter, pesquisador da Divisão de Ciências Geológicas e Planetárias e da Divisão de Engenharia e Ciências Aplicadas da Caltech, disse: “São as primeiras bactérias a usar o manganês como fonte de energia. Um aspecto maravilhoso dos micróbios na natureza é que eles podem metabolizar materiais aparentemente improváveis, como metais, gerando energia útil para a célula”. Os dois pesquisadores, examinaram a possibilidade de que microrganismos do ambiente anteriormente não avaliados possam oxidar manganês para obter energia. Para essa descoberta, eles revestiram um frasco de vidro com uma pasta de carbonato de manganês (MnCO3) e após a pasta secar, adicionou água da torneira municipal de Pasadena, Califórnia, e deixaram incubado em temperatura ambiente. Depois de vários meses, o revestimento de carbonato de cor creme oxidou em um óxido de manganês escuro. A bactéria recém-descoberta, recebe o nome de Candidatus Manganitrophus noduliformans, pertence ao filo Nitrospirae e está distantemente relacionada a espécies conhecidas dos gêneros Nitrospira e Leptospirillum. De acordo com os pesquisadores, esse achado expande a diversidade conhecida de metabolismos inorgânicos que suportam a vida e completam um ciclo de energia biogeoquímica para o manganês que pode fazer interface com outros grandes ciclos elementares globais. Fonte: H. Yu e J.R. Leadbetter. 2020. Quimiolitoautotrofia bacteriana via oxidação de manganês. Nature 583, 453-458; doi: 10.1038 / s41586-020-2468-5 SAIBA MAIS “A microbiologia contribui para uma melhor compreensão do complexo mundo da vida que cobre a terra, sendo os microrganismos valorizados por seus produtos industriais, são temidos por causarem doenças, ou são ignorados por que não podem serem vistos, os microrganismos sempre estão conosco. E como se referenciava Louis Pasteur “O microrganismo terá a última palavra”. Fonte: Pelczar Jr, M.J. et al. Microbiologia – Conceitos e Aplicações. Vol. I. São Paulo: Makron Books Editora. 1996. REFLITA INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 22 Estamos finalizando a primeira unidade do livro didático de microbiologia geral e biossegurança. Assim torna-se importante salientar algumas discussões que foram propostas. Nossas discussões se iniciaramcom o tópico ‘O que é a microbiologia e suas aplicações’ e ao abordar esse tópico teve como objetivo apresentar conceitos e aplicações da microbiologia de que você aluno(a) necessita compreender no decorrer do curso. E ao se tratar desta abordagem inicia-se a discussão do próximo tópico da Unidade I, intitulado Histórico da microbiologia. Neste tópico procurei mostrar o surgimento da microbiologia como ciências, sendo necessário conhecer como ela chegou até onde estamos atualmente. Ainda dentro dos conceitos da microbiologia, foi trabalhado a Classificação dos seres vivos e a diferença das células procariótica e eucariótica que é essencial para prosseguirmos no curso. Para finalizar esta unidade foram apresentados alguns exemplos de como microrganismos estão presentes no nosso dia a dia, participando de transformações de substância e produtos que contribuem para o meio ambiente e para o homem. Essa unidade tem o intuito de prepará-lo(a), caro aluno(a) para o assunto que será tratado nas próximas unidades. Passemos, então, à unidade II. CONSIDERAÇÕES FINAIS INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 23 Caro(a) aluno(a) para entender um pouco mais sobre os microrganismos no nosso cotidiano, leia as literaturas citadas abaixo intitulados: • H. Yu e J.R. Leadbetter. 2020. Quimiolitoautotrofia bacteriana via oxidação de manganês. Nature 583, 453-458; doi: 10.1038 / s41586-020-2468-5. • Canhos, V. P., & Manfio, G. P. (2001). Recursos microbiológicos para biotecnologia. • COLOMBO, G. D. S., MENDES, I., SOUTO, B. D. M., Parachin, N., de ALMEIDA, J. R. M., & Quirino, B. F. (2017). Descoberta de novos genes de xilose isomerase em rúmen de cabras brasileiras. In Embrapa Agroenergia-Artigo em anais de congresso (ALICE). In: ENCONTRO DE PESQUISA E INOVAÇÃO DA EMBRAPA AGROENERGIA, 4., 2017, Brasília, DF. Anais… Brasília, DF: Embrapa, 2017. Estas três literaturas apresentam como os microrganismos podem auxiliar nas mais diversas áreas de conhecimento. LEITURA COMPLEMENTAR INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 24 MATERIAL COMPLEMENTAR LIVRO • Título: Microbiologia conceitos e aplicações. • Autor: Pelczar Jr. E Michael Joseph. • Editora: Pearson Books. • Sinopse: Nesta obra os autores captaram o essencial da microbiologia, destacando-a como uma combinação das ciências básica e aplicada. Por essa razão é interessante não só para estudantes de graduação em curso introdutório de microbiologia, mas também para alunos de outras áreas, como nutrição, enfermagem, agricultura, administração florestal e ciência animal. FILME/VÍDEO • Título: Documentário: Introdução à Microbiologia • Sinopse: Nesse antigo, porém didático documentário (Os micróbios e o Homem), um passeio pelas descobertas que levaram ao surgimento da microbiologia. • Link do Vídeo: https://encurtador.com.br/7SJki INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIAUNIDADE 1 https://encurtador.com.br/7SJki Professor (a) Dra. Aline José Maia CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOS2UNIDADEUNIDADE PLANO DE ESTUDO 26 Plano de Estudos • Obtenção de cultura pura e meios utilizados para o cultivo; • Microscopia e preparo dos microrganismos; • Fundamentos de controle dos microrganismos; • Controle físico e químico dos microrganismos. Objetivos da Aprendizagem • Conhecer os diferentes meios de cultivo para obter uma cultura pura. • Entender como funciona as principais partes do microscópio. • Compreender a importância de realizar o controle dos microrganismos. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 27 Prezado(a) aluno(a), nesta segunda unidade do livro didático, será tratado a caracterização e controle dos microrganismos, que é um instrumento importante na compreensão dos seres dentro da microbiologia. No primeiro tópico, será abordado a obtenção de cultura pura e os meios utilizados para o cultivo in vitro (cultivo em condições estéreis). Vamos conhecer as receitas e a elaboração dos diferentes meios de cultivo. No segundo tópico falaremos dos microscópios que auxiliam na visualização dos microrganismos e detalharemos as principais partes do microscópio de luz, sendo o mais utilizado nos laboratórios de ensino e pesquisa. E também será apresentado os diferentes modos de preparação para exame em microscopia luminosa. E nos tópicos seguintes trataremos sobre o Controle dos microrganismos, que depende do objetivo se é remover, inibir ou destruir os microrganismos em seu meio. E veremos que vários são os agentes físicos e químicos que podem ser utilizados para matar ou reduzir os microrganismos em níveis aceitáveis. Sabemos da diversidade que existe de microrganismos à nossa volta, mas procurarei direcioná-lo a ser capaz de realizar o isolamento, a visualização e o controle dos microrganismos comumente manuseados em laboratório, como, por exemplo, fungos e bactérias. É muito importante que você faça uma leitura bem apurada desta unidade, pois, ao aprender como se obtém microrganismos em cultura pura e como é feito, seu controle poderá contribuir para pesquisa científica moderna. Vamos lá! INTRODUÇÃO CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 28 Ao finalizar a Unidade I de nosso livro didático, abordamos o que os microrganismos estão presentes no nosso dia a dia. E a pergunta que fica é: será que é possível obter o microrganismo em laboratório? Caro aluno(a), antes de iniciarmos a discussão de como obter cultura pura dos microrganismos, precisamos abordar itens que correspondem sobre as normas, regras que se seguidas ajudam a minimizar os riscos em um laboratório. Uma vez que para as técnicas para obter a cultura pura é totalmente laboratorial. Vamos lá! Primeiro vamos definir o que é biossegurança, são ações que previnem e controlam os riscos que estão presentes na atividade de pesquisa, que podem comprometer o homem, os animais e o meio ambiente. Os tipos de riscos encontrados no ambiente de trabalho podem ser: risco acidental, ergonômico, físico, químico e biológico. Os riscos acidentais são aqueles que afetam sua integridade moral física, por exemplo, piso escorregadio, equipamentos sem proteção, probabilidade de explosão e incêndio. Os riscos ergonômicos são aqueles que trazem o desconforto prejudicando sua saúde, como, por exemplo, trabalhos monótonos, ritmo acelerado de trabalho; os riscos físicos, é quando o pesquisador fica exposto a vibrações, ruídos, radiação e materiais pontiagudos. Os riscos químicos são quando o pesquisador está sujeito a absorver pela pele ou ingestão de poeira, gases e vapores; os riscos biológicos, é quando o pesquisador está exposto a bactérias, fungos, vírus e protozoários que têm persistência no meio de trabalho. E levando em consideração a persistência e a proliferação dos microrganismos no ambiente de trabalho, foi elaborado OBTENÇÃO DE CULTURA PURA E MEIOS UTILIZADOS PARA O CULTIVO1 TÓPICO CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 29 as classes de risco biológico, a classe I, a classe II, a classe II e a classe IV. Na classe I, encontram-se os microrganismos com pouca probabilidade de causar doenças em humanos e animais, como, por exemplo, os Lactobacillus. Na classe II estão presentes microrganismos que causam doenças, mas o controle é eficaz. Na classe III os microrganismos causam doenças e nem sempre o controle é eficaz, mas o microrganismo é pouco disseminado. Na classe IV os microrganismos causam doenças, o controle não é eficaz e tem elevada disseminação, por exemplo, vírus Ebola (causador da febre-amarela). E cada nível de risco deve seguir o grau de proteção que tem quatro níveis: Biossegurança 1, Biossegurança 2, biossegurança 3 e biossegurança 4. A biossegurança nível 1 é o mais básico no qual deve- se ter os equipamentos de proteção e uma estrutura do ambiente de trabalho adequada. No nível de biossegurança 2 os trabalhos somente serão realizados na presença de um técnico. Os níveis de biossegurança 3 e4 têm acesso restrito e é um sistema de segurança totalmente rigoroso. Então a finalidade da biossegurança é proteção do pesquisador e isso inclui equipamentos de segurança (equipamentos de proteção individual — luva, óculos e jalecos; proteção coletiva, barreiras de contenção; e boas práticas de laboratório), técnicas laboratoriais (treinamento), estrutura física (conhecer o que é feito em cada compartimento) e gestão administrativa (conhecer a organização das atividades, rotina e quais são os agentes biológicos que o laboratório trabalha, desenvolve a pesquisa). Agora que você, caro aluno (a), já conhece sobre os principais pontos de biossegurança, lembre-se que cada laboratório tem sua rotina, normas, regras a serem seguidas. No entanto, em qualquer laboratório você sempre deve entrar de jaleco, calças compridas e calçado fechado. Agora que você aluno (a), já sabe as normas básicas de um laboratório, vamos discutir a respeito de como obter uma cultura pura. Primeiro vamos ver a definição de uma cultura pura. A cultura pura é quando se obtêm um microrganismo por meio de uma única célula que cresce e se multiplica no meio de cultura. A cultura pura possibilita o estudo das características morfológicas e fisiológicas dos microrganismos. Quando estamos cultivando os microrganismos empregamos meio de cultura que contém nutrientes e vitaminas necessários para o seu crescimento e reprodução. O fornecimento de nutrientes tem que atender às exigências das espécies a serem cultivadas, promovendo o crescimento e ou esporulação satisfatória do microrganismo. A maior parte dos microrganismos cultiváveis crescem em meio à cultura que contém uma fonte de carbono e nitrogênio e em menor quantidade outros nutrientes como potássio, fósforo, enxofre, ferro e manganês. O carbono é um elemento de grande importância para o desenvolvimento de microrganismos, seja no seu habitat ou em meio de cultivo. Ele é um elemento estrutural que é considerado a principal CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 30 fonte de energia. O carbono é fornecido por meio de monossacarídeos como glicose, frutose e galactose. O nitrogênio é a parte essencial para a formação dos aminoácidos que compõem as proteínas e é fornecido de forma orgânica (asparagina, caseína e peptona) e de forma inorgânica (nitrato de sódio e nitrato de cálcio). Enquanto que o enxofre é utilizado na forma de sulfato para a biossíntese de aminoácidos como cisteínas e metionina. O enxofre na forma de sulfeto pode ser tóxico aos microrganismos. O fosfato é um componente da membrana e está presente na síntese dos ácidos nucleicos e ATP e é fornecido como fosfato de potássio. Os demais nutrientes são necessários em pequena quantidade e funcionam como cofatores. Entretanto, a composição do meio de cultivo depende do microrganismo que se deseja cultivar e do objeto de estudo. De modo geral, quando trabalhamos com o cultivo de microrganismos, caro aluno (a) saiba que o ambiente é asséptico, ou seja, ambiente livre de contaminação. E os meios de cultivo depois de preparados devem ser esterilizados, para garantir que estamos trabalhando somente com o microrganismo que pretendemos estudar. Agora, sim, vamos falar da classificação dos meios de cultivo. Os meios de cultivo são classificados quanto: sua consistência; composição e seletividade. Quanto à consistência, o meio pode ser líquido ou sólido. O meio líquido contém todos os nutrientes necessários para o crescimento do microrganismo são dissolvidos em água. Uma vez preparado e esterilizado pode inserir o microrganismo que se pretende trabalhar em meio de cultivo. Este meio é utilizado quando se tem por objetivo obter maior massa em menor tempo, geralmente é utilizado para o crescimento de bactérias. Os meios sólidos são preparados a partir da adição de um agente solidificador, o AGAR na concentração de 1,5 a 2% p/v, antes de esterilização. Este tipo de meio é o mais utilizado para a obtenção de culturas puras, para estudar as características morfológicas e para a estocagem de culturas puras. O meio de cultivo em relação a sua composição pode ser: Sintético, semi-sintético e natural. O meio sintético é quando sua composição química e concentrações são conhecidas. Um exemplo é o meio CZAPK (nitrato de sódio 2g L-1, sulfato de magnésio 0,5 2g L-1, cloreto de potássio 0,52g L-1, sulfato ferroso 0.01 2g L-1, difosfato de potássio 1,0 2g L-1, sacarose 30 2g L-1, e o pH final 7,2). O meio de cultivo semi sintético é a composição química é parcialmente conhecida de alguns componentes, por exemplo, o meio de cultivo batata-ágar-dextrose. Sua composição é 500 mL do caldo de batata (componentes desconhecidos), 20g dextrose e 20 g de ágar e completa para 1000 mL de água. Quando a composição do meio é desconhecida por completo, é denominado de meio de cultivo natural, como, por exemplo, o meio cenoura-ágar, que é composto de 400 mL do extrato de cenoura, 20 g de ágar e completa para 1000 mL de água. O meio CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 31 natural, por apresentar baixo custo, acaba sendo o mais utilizado nos laboratórios de pesquisa. Os meios de cultivo podem apresentar se: seletivos, não seletivos e diferenciais. Os meios de cultivos seletivos são aqueles que você vai adicionar uma substância que favorece o desenvolvimento de um determinado organismo. Por exemplo, adiciona cristal de violeta ao meio de cultivo, favorecendo o desenvolvimento de bactérias Gram negativa. Os meios de cultivo que desenvolvem uma grande gama de microrganismos são denominados meios não seletivos. E os meios diferenciais, são meios que permitem, mediante a adição de reagentes, verificar o comportamento de dois ou mais microrganismos. Por exemplo, quando adiciona ao meio de cultivo eosina e azul de metileno consegue ver a diferença de Escherichia coli de Enterobacter aerogenes. Caro aluno(a), quando for fazer o cultivo puro de bactérias e fungos, você precisa saber que as bactérias têm preferência a meios de cultivo próximo da neutralidade pH = 7 e ricos em proteínas, enquanto que, os fungos se desenvolvem melhor em meios de cultivo ligeiramente ácidos (pH = 5) e ricos em carboidratos. E para finalizar nosso tópico, vamos discutir a composição do meio de cultivo Batata-agar-dextrose (BDA), que é considerado o meio universal, pois suporta o crescimento de muitos organismos (fungos e bactérias) por isso é usado mundialmente como meio de rotina nos laboratórios para o isolamento (obtenção da cultura pura) e manutenção temporária das culturas. A batata serve como importante fonte de Carboidrato, o amido é absorvido pelo microrganismo como glicose após a hidrólise enzimática. A dextrose na quantidade certa permite o crescimento do microrganismo, pois é um monossacarídeo mais importante utilizado como fonte de energia na respiração de procariotos e eucariotos. Como é preparado este meio, qual a receita do meio? O modo de preparo é simples. Primeiro passo é ferver 200g de batata em 500 mL de água por 30 minutos. Em seguida filtrar o caldo em gases. Fazer a fusão do ágar (20g) junto com a quantidade de dextrose (20g) em 500 mL de água. Em seguida adicione o caldo e complete o volume para 1000 mL de água. E o meio está pronto para ser esterilizado. Após ser esterilizado pode ser vertido em placas de Petri, para ser feito o isolamento do microrganismo. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 32 Na unidade I, você aprendeu sobre a invenção do microscópio óptico que amplia a imagem de um pequeno objeto. Neste, segundo tópico da Unidade II, vamos apresentar a razão pela qual utilizamos a microscopia na microbiologia e também nas demais áreas de conhecimento. Em seguida vamos comentar sobre os princípios do funcionamento dos dois grandes grupos que será dividido em tipos de microscopia e por fim vamos detalhar a microscopia ópticaque é o mais comumente utilizado nos laboratórios de ensino. Vamos começar a discussão se referindo quando queremos observar um microrganismo que tem a estrutura muito pequena e os nossos olhos têm dificuldade de reconhecer o microrganismo ou objetos menores que 1 milímetro (mm). Objetos que apresentam 100 micrometros nossos olhos não conseguem distinguir, por isso, que precisamos da microscopia. Então, a microscopia é uma técnica que permite a visualização de estruturas minúsculas que são invisíveis ao “olho nu”. Com o desenvolvimento da microscopia obviamente que teve um grande avanço em diversas áreas de conhecimento como na saúde, agricultura, entre outros. Caro aluno(a), agora você entende que existem organismos do qual nossos olhos não conseguem ver, observar. E que a microscopia é uma técnica muito importante como um todo. Para que você entenda como os microscópios funcionam tem que entender os princípios de funcionamento de um microscópio. MICROSCOPIA E PREPARO DOS MICRORGANISMOS2 TÓPICO CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 33 O microscópio tem a capacidade de aumentar a resolução das estruturas extremamente pequenas por meio de lentes especializadas que podem ser de vidro (microscopia óptica /luminosa) ou eletromagnética (microscopia eletrônica). 2.1 Qual a diferença entre microscopia ótica e microscopia eletrônica? Então, aluno(a), elas diferem no princípio pelo qual a ampliação é produzida. Para ampliar um objeto, os microscópios ópticos modernos usam um sistema de lentes para direcionar o caminho que um feixe de luz percorre até o objeto a ser estudado. O microscópio eletrônico utiliza um feixe de elétrons controlado por um campo magnético. Esses são os dois grupos no qual a microscopia se fundamenta para observar os diferentes grupos de microrganismos. E quando estudamos estes dois tipos de microscopia o princípio de funcionamento seria: • Microscopia óptica: a luz é um tipo de onda que têm um comprimento. Esse comprimento de onda é visível aos nossos olhos. Então conseguimos manipular essa luz, condensando ela a um ponto específico no qual ampliamos as dimensões. Então, temos um ponto muito pequeno e conseguimos condensar a luz neste ponto e emitir ela novamente, fazendo com que ela seja capturada através de um objetivo para daí passar por um conjunto de lentes que vem até nossos olhos. Entretanto, a microscopia óptica tem um limite de resolução. E o que significa resolução? A resolução, caro aluno(a), é a capacidade de distinguir dois pontos distintos. Então quanto maior a capacidade de distinguir os dois pontos, maior é a resolução. E existe uma resolução máxima para a microscopia ótica. Quando queremos estudar as estruturas com maior detalhamento, que não são capazes de serem visualizadas no microscópio óptico, utilizamos o microscópio eletrônico, que utiliza feixes de elétrons para visualizar a amostra. Seu modelo de funcionamento é a passagem de feixes de elétrons por um percurso no qual as lentes eletromagnéticas permitem que o feixe de elétrons seja direcionado à amostra. Aqui na microscopia eletrônica temos lentes e condensadores eletromagnéticos. Na microscopia de luz temos lentes de vidro que desviam o caminho da luz. No caso do microscópio eletrônico o feixe de elétrons incide na amostra, obtendo-se um perfil de imagem do produto que vamos visualizar. Nossos olhos não enxergam elétrons, tem um detector de elétrons para observar a imagem. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 34 Caro aluno(a) este é basicamente o perfil de funcionamento dos microscópios óticos e eletrônicos. Agora vamos comentar os tipos de microscopia. Vários são os tipos de microscopia que permite avaliar diferentes estruturas dos produtos que queremos observar. Cada uma tem a sua vantagem e desvantagens. Na microscopia ótica temos alguns tipos que é bastante utilizada: Microscopia óptica composta (é a mais utilizada), microscopia de campo escuro; microscópio contraste de fase, microscopia de fluorescência e microscopia confocal. A microscopia óptica composta é possível observar os microrganismos com o emprego de corantes, ou seja, os microrganismos são tingidos para serem observados em microscópio. A maior parte dos corantes pode paralisar ou até mesmo matar o microrganismo. Outro tipo de microscopia utilizada para visualizar microrganismos transparentes que aparecem brilhantes ou iluminados sobre um campo escuro é a Microscopia de campo escuro, que é aplicada para microrganismos que exibem características morfológicas específicas quando vivos. Na microscopia de fluorescência o microrganismo é corado com uma substância fluorescente. E a microscopia confocal permite maior contraste entre materiais de espessura ou densidade diferentes. Aqui a luz incide em várias direções em diferentes partes do material analisado. E essa é a vantagem, pois aumenta a capacidade de mostrar a estrutura celular sem utilizar corantes. E também tem a microscopia eletrônica, que existem vários tipos: transmissão, varredura, tunelamento e força atômica. A microscopia eletrônica de transmissão e varredura, oferecem imagens que dão aspecto físico dos microrganismos, como, por exemplo, a aderência de uma célula bacteriana a um objeto. A microscopia eletrônica de tunelamento como se a superfície a ser analisada fosse rastreada com uma agulha sobre um disco e entre o espaço da agulho com o disco ficam os elétrons localizando um átomo individual sobre a superfície. Enquanto, que a microscopia de força atômica aplica uma força entre a agulha e a superfície. Então, agora que definimos os vários tipos de microscopia, vamos detalhar um pouco mais a microscopia óptica simples. Para isso, caro aluno(a), vamos falar o que é o microscópio ótico composto, os principais componentes, também vamos ver como é o cálculo da resolução e pôr fim a mensuração da potência das lentes. O microscópio óptico composto é utilizado para visualizar estruturas celulares por intermédio da ampliação da luz refletida pela amostra em análise. Esse microscópio é utilizado em laboratórios de microbiologia, para analisar as amostras. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 35 E como a maioria das amostras tem em torno de 1 a 100 micrômetros dá para utilizar o microscópio ótico para visualizar muito bem as estruturas da amostra, não com tantos detalhes igual o microscópio eletrônico, mas conseguimos obter vários detalhes importantes para diagnosticar fungos, bactérias, protozoários e outros tipos de células. E quando falamos de composição estrutural do microscópio ótico vemos que os principais componentes deste microscópio são: Iluminador, fonte de luz que vai iluminar a amostra; Condensador, que condensa a luz em um ponto específico na amostra para que possamos avaliar; Lentes objetivas, que vão ampliar a imagem; e também as lentes oculares (Figura 1), que vão fornecer uma potência maior para visualizarmos a imagem, ou seja, imagem refletida para os nossos olhos, é observada pelas lentes oculares. FIGURA 1: PRINCIPAIS PARTES DO MICROSCÓPIO ÓTICO Fonte: A autora. Estas são as principais partes do microscópio, claro que existem outras partes que vamos citá-las logo mais. Caro aluno(a), quando você for observar uma amostra, qual o primeiro passo a ser feito? Então, primeiro de tudo, quando você for observar uma amostra, ela deve ser colocada na interface do condensador e da lente objetiva. Cada parte do microscópio tem uma razão, na porção biocular, temos as lentes oculares, onde a luz será projetada para nossos olhos. As lentes objetivas, na verdade, é um conjunto de lentes que confere diferentes graus de resolução para a amostra a ser analisada. O condensador, tem um conjunto de lentes que vão focalizar a luz na amostra e o iluminador é que imite a luz e esta luz pode ser CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE2 36 controlada pelo botão denominado de ajustador de luz, ou seja, você consegue aumentar e diminuir a intensidade de luz que vai até a amostra. Essa quantidade de luz depende da amostra a ser analisada. Outros componentes importantes são os parafusos macrométrico e micrométrico. O parafuso micrométrico faz ajuste fino da amostra, o macrométrico faz o ajuste grosseiro da amostra. Primeiro faz o ajuste com o macrométrico e depois somente o micrométrico. E obviamente a luz vai fazer todo um trajeto, ela passa pelo corpo do microscópio para chegar nas lentes oculares, na qual observa a amostra a ser analisada. Quando falamos da luz que incide a amostra, as lentes objetivas têm que capturar essa luz para emitir ela até as lentes oculares para chegar nos nossos olhos. Então veja, caro aluno(a) que a luz tem um trajeto especial no microscópio ótico. O trajeto se dá da seguinte maneira: primeiro a luz sai do iluminador, que gera luz, esta luz vai percorrer por duas lentes condensadoras, aí ela vai focalizar exatamente a amostra, focalizando a amostras, as lentes objetivas vão capturar a luz e transmitir a luz até um prisma. Este prisma reflete a luz e faz com que essa luz refletida seja desviada até as lentes oculares, onde vamos enxergar a amostra. Caro aluno(a), veja que temos lentes que vão ampliar a imagem, ampliar a visualização, ampliar a resolução da nossa amostra. Assim temos a capacidade de enxergar estruturas com mais detalhes se compararmos com o que podemos ver a amostra a olho nu. E podemos ter algumas imagens que podemos observar no microscópio ótico, imagens de bactérias, fungos (Figura 2) e protozoários. FIGURA 2: ESTRUTURAS DE FUNGOS, FILAMENTOS E ESPOROS Fonte: A autora. Estruturas estas que não conseguimos enxergar a olho nu, mas quando utilizamos o microscópio óptico, podemos observá-las. Os fungos conseguem visualizar filamentos e esporos. As bactérias conseguem enxergar que são cocos. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 37 Veja, caro aluno(a), temos um momento de detalhamento, e a resolução da imagem utilizando o microscópio óptico. E nestas duas imagens podemos observar o uso de corantes. Sabe por quê? É comum utilizar corantes para visualizar no microscópio óptico devido ao baixo contraste das amostras não coradas. As amostras que são submetidas a visualização do microscópio óptico são muito delgadas (finas), por isso o contraste que elas oferecem é muito baixo. Alguns microscópios permitem a visualização sem corante, mas quando as amostras realmente são delgadas é importante corar as amostras para aumentar o seu contraste, para poder visualizar suas estruturas e identificar as amostras em análise. Agora falando especificamente da resolução e detalhamento da imagem. Vamos começar como a seguinte pergunta: 2.2 O que significa resolução? A resolução é a capacidade de diferenciar dois pontos que apresentam uma distância específica. Para melhor entender, vamos dar um exemplo de dois pontos. Esses dois pontos têm uma distância de 2 micrômetros entre eles. Daí nós queremos avaliar os dois pontos no microscópio óptico com diferente capacidade de resolução. Se formos avaliar esses dois pontos em um microscópio óptico com resolução de 1 micrômetro, a gente consegue distinguir perfeitamente entre si os dois pontos com uma distância de 1 micrômetro. Se olharmos conseguimos distinguir os dois pontos e eles estão separados, porque a resolução do microscópio é menor que a distância entre os dois pontos. E mesmo se os pontos estivessem a 1 micrômetro de distância entre eles, também enxergávamos os pontos separados. Agora se utilizarmos um microscópio que tem uma resolução máxima de 4 micrômetros e observarmos estes dois pontos, neste microscópio não iremos enxergar os dois pontos e sim um único ponto, pois a distância entre os dois pontos é de dois micrometros e esse microscópio não distingue os dois pontos que possuem distância menor que 4 micrômetros. Isso é muito importante quando utilizamos microscópio ótico. Caro aluno(a), observe que quanto maior for a resolução, melhor é a capacidade de distinguir os detalhes da imagem. E existe uma maneira de calcular essa resolução. O cálculo para resolução segue a seguinte fórmula: R = (0,61 x λ)/ (Ƞ x sen α) CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 38 Cada ponto deste significa: • R = resolução • 0,61 = constante • Λ = Letra grega, comprimento de onda da luz, usa-se 0,5 micrometros (varia entre 0,4 a 0,7 micrômetros) • Ƞ = índice de refração (ar = 1 e o óleo de imersão 1,4). Esse índice de refração é que a luz vai sofrer quando passa pela amostra. Se usarmos óleo de imersão para visualizar a amostra, o valor de refração é de 1,4. • sen α = é o seno do ângulo do cone de luz (90˚= 1), que é formado no momento que incide a amostra. Normalmente utiliza-se uma lente objetiva em relação à amostra de um ângulo de 90 ˚, se fizermos o cálculo do seno de 90˚ veremos que é igual a 1. Agora podemos substituir os valores e chegaremos no valor da resolução máxima do microscópio ótico que é 0,22 micrômetros. Isso significa que partículas menores não se distinguem uma das outras. E também não quer dizer que não podemos utilizar resoluções maiores. Em alguns casos não é necessário usar uma resolução maior, pois para isso temos a potência das lentes. A potência das lentes que são utilizadas no microscópio ótico pode ser mensurada pela seguinte fórmula: Pt = PLo x Piob • Pt = potência total • Plo = potência da lente ocular (10x) Geralmente essa potência já vem fixada. Ela consegue ampliar 10 x o tamanho da amostra. • Piob = potência da lente objetiva, que pode ser diferente (4x; 10x; 40x; 100x), representado na figura 3. CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 39 FIGURA 3: LENTES OBJETIVAS DO MICROSCÓPIO ÓTICO Fonte: Schwan-Estrada et al. 2020. Então, caro aluno(a), se queremos observar uma amostra com maior detalhe, nos variamos as lentes objetivas na qual estamos fazendo a leitura da amostra. Se quiser mais detalhes utilizamos a lente de maior potência. Na maioria das vezes utiliza-se as lentes de potência de 10 e 40x. A lente de 4x tem uma análise superficial da amostra, que confere informações importantes. No caso de lente de 100x é necessário utilizar o óleo de imersão para visualizar a amostra, pois quando a luz incide na lente de 100x muitas vezes a luz transmitida é dispersa para o ambiente devido o índice de refração do ar. E para esse índice de refração da luz utiliza-se o óleo de imersão que acaba sendo a única maneira de observar a amostra ampliada na lente de 100x. Agora que já conhecemos as principais partes e princípios do microscópio óptica, vamos deixar aqui alguns procedimentos que você aluno deve fazer ao observar corretamente uma amostra. 2.3 Procedimento correto para focalização Primeiro você deve acender a luz do microscópio. Depois verifique a posição da alavanca quando está travada e destravada. Em seguida, gire o revólver, encaixando a objetiva de menor aumento (4X). Coloque a lâmina na platina, segurando-a com a mão direita e abrindo a presilha com a mão esquerda. Não toque no corpo da lâmina; segure-a como se segura um negativo fotográfico. Solte a presilha e verifique se a lâmina está bem encaixada. Verifique sempre se a lâmina está voltada para cima. Centralize o material no orifício da platina, utilizando os parafusos da Charriot. Na sequência, levante a mesa (ou platina), movimentando o parafuso Fixa Imersão Laminas Óleo de Imersão Retrátil Retrátil CARACTERIZAÇÃO E CONTROLE DOS MICRORGANISMOSUNIDADE 2 40 macrométrico, até o ponto máximo. Quando chegar ao final, não force o parafuso, pois danifica as roscas do mesmo. Verifique se o diafragma está aberto, olhando lateralmente (se não tiver, abra-o movimentando a alavanca correspondente); o condensador deve ser mantido