Publicação cientifica do Nobel quimica DNA 2015 com tradução

Prévia do material em texto

7 OCTOBER 2015 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2015 
 
 
MECHANISTI C STUDIE S OF DNA REPAIR 
 
compiled by the Class for Chemistry of the Royal Swedish Academy of Sciences 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
THE ROYAL SWEDISH ACADEMY OF SCIENCES, founded in 1739, is an independent organisation whose overall objective is to promote the sciences 
and strengthen their influence in society. The Academy takes special responsibility for the natural sciences and mathematics, but endeavours to promote 
the exchange of ideas between various disciplines. 
 
 
BOX 50005 (LILLA FRESCATIVÄGEN 4 A), SE-104 05 STOCKHOLM, SWEDEN 
TEL +46 8 673 95 00, INFO@KVA.SE HTTP://KVA.SE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award Tomas Lindahl, Paul Modrich 
and Aziz Sancar the Nobel Prize in Chemistry 2015 for their “Mechanistic studies of DNA repair” 
 
Damage to the genetic material poses a threat to all organisms. To counteract this threat, cells 
have evolved a series of intricate DNA repair pathways that correct DNA lesions affecting base 
pairing or structure of DNA. Today we understand the molecular mechanisms of these pathways 
in great detail, in large part due to the pioneering studies by Lindahl, Modrich and Sancar that 
opened up the field. 
 
 
 
Background 
The human genome encodes the information needed to create a complete human being. During 
every cell division, more than three billion DNA base pairs are replicated and copies of the 
genome are transferred to the daughter cells. Although very efficient, the DNA replication 
machinery responsible for this task still makes occasional mistakes. Given the size of the human 
genome and the large number of cells in a human body (about 3.7 1013) mistakes will 
inevitably accumulate during the lifetime of an individual. Most of these errors will remain 
silent, but they can also cause serious diseases. 
 
Despite its essential role in storing genetic information, the DNA molecule has limited chemical 
stability and is subject to spontaneous decay [1]. Processes such as hydrolysis and oxidation 
occur at significant levels in vivo, in part due to reactive metabolites continuously generated in 
various physiological processes. In addition, external factors like radiation and genotoxic 
chemicals will further stimulate of DNA damage formation. 
 
The inherent instability of DNA constitutes both an opportunity and a threat. DNA lesions can 
block important cellular processes such as DNA replication and transcription, cause genome 
instability and impair gene expression. Lesions can also be mutagenic and change the coding 
capacity of the genome, which can lead to devastating diseases and conditions associated with 
genome instability, including cancer, neurodegenerative disorders and biological ageing. At the 
same time, without mutations Darwinian evolution would not be possible. Furthermore, 
mutagenic chemicals and radiation can also have a healing effect; they can for instance be used 
to treat cancer, by introducing DNA lesions that halt cell proliferation and stimulate 
programmed cell death. 
 
1 (15) 
2 (15) 
 
 
 
The cell has developed ways to counteract DNA lesions and to keep DNA mutations at a 
tolerable level. A number of different DNA repair mechanisms correct lesions and safeguard the 
integrity of the genome. Four fundamental DNA repair pathways delineated by this year’s Nobel 
Prize laureates will be discussed here. 
 
Photoreactivation – the first DNA repair mechanism 
In the 1920s, the American geneticist Hermann Muller (Nobel Prize in Physiology or Medicine, 
1946) found that X-rays could mutate and kill cells [2]. Later on, other types of agents, including 
ultraviolet (UV) light, were also shown to affect cell viability and mutation levels. The cellular 
target for the lethal effects of X-rays and UV-light was unknown at this time, and there were no 
identified cellular mechanisms that could repair the lesions once they occurred. A breakthrough 
came in the late 1940s, when Albert Kelner studied bacteria and their recovery in response to 
damage caused by UV-light. Kelner found that visible light could dramatically stimulate growth 
recovery after a growth arrest caused by UV exposure [3], [4]. The phenomenon was termed 
photoreactivation and it pointed to the existence of a light-dependent cellular mechanism that 
could correct UV-induced cellular damage. 
 
Oswald Avery and co-workers had demonstrated in 1944 that DNA is the material of heredity [5] 
and in the 1950s it became clear that UV-induced damage most likely was targeted to DNA. At 
this point, Renato Dulbecco (Nobel Prize in Physiology or Medicine, 1975) suggested that 
photoreactivation was an enzymatic reaction dependent on visible light [6]. The correctness of 
this assumption was demonstrated by Stanley Rupert, who in a series of reports showed that 
DNA could be reactivated by visible light in the presence of a cell-free extract from Escherichia 
coli or Saccharomyces cerevisiae [7, 8]. The observation of this enzymatic activity, known as the 
photolyase, was of profound importance, since it demonstrated for the first time the existence of 
DNA repair enzymes that could rescue UV-irradiated DNA. At first, the photolyase was just an 
activity in an extract, but in 1978 Aziz Sancar could clone the E. coli photolyase gene and amplify 
the gene product in vivo [9]. Sancar was at the time a PhD student of Rupert’s, but instead of 
continuing to characterise the photolyase, he wrote his PhD dissertation and graduated. It 
would take another six years, before Sancar returned to photolyase research. 
 
Dark repair – the discovery of nucleotide excision repair 
In addition to photoreactivation, UV damage can also be repaired in a light-independent process 
(known as “dark repair”). That UV-irradiation of DNA introduced thymine dimers in vitro was 
reported in 1960, but the in vivo relevance of this finding was unclear [10]. A couple of years 
later, Jane Setlow and Richard Setlow demonstrated that thymine dimers inactivated 
transforming DNA in the bacterium Hemophilus influenzae and that this type of lesion was 
responsible for the biological effect of UV-radiation [11, 12]. This realization made it possible to 
study the precise molecular consequences of thymine dimers and investigate how cells deal with 
3 (15) 
 
 
 
them. In 1963, Richard Setlow reported that thymine dimers inhibit DNA synthesis and that 
these lesions are excised from DNA in wild-type UV-irradiated bacteria, but not in an UV- 
sensitive, mutant E. coli strain [13]. In 1964, he made the seminal discovery that thymine dimers 
disappeared from the irradiated, high molecular weight genomic DNA shortly after exposure to 
UV and instead appeared in low molecular weight fractions. Richard Setlow and his colleague 
William Carrier correctly interpreted this result as thymine dimers being excised (removed) 
from the DNA, hence the name excision repair [14]. Around this time, Richard Boyce and Paul 
Howard-Flanders also published observations with conclusions similar to those reached by 
Richard Setlow [15]. The emerging mechanisms of what later became known as nucleotide 
excision repair (NER) was further elucidated in crucial work by Philip Hanawalt and David 
Pettijohn, who found that UV-irradiation stimulated DNA repair synthesis even outside the S- 
phase, i.e. independent of genome replication [16]. The groundbreaking contributionsof these 
early pioneers clearly indicated the existence of repair mechanisms that could correct UV- 
induced lesions, but the precise molecular mechanisms underlying NER remained obscure. 
 
The molecular mechanisms of NER 
The identification of the enzymes responsible for NER was greatly assisted by genetics analyses. 
Earlier bacterial work had identified uvrA, uvrB, and uvrC genes in a search for mutations that 
impaired NER and hindered growth resumption after UV irradiation [17]. Work in vivo [18-20] 
and in E. coli extracts [21] by Erling Seeberg and others indicated that the uvr gene products 
functioned by endonucleolytic cleavage of irradiated DNA, but this could not be examined in 
detail due to the lack of purified proteins. 
 
In the 1970s, identification of proteins was a major challenge, since DNA sequencing techniques 
were limited and a given gene locus could encode more than one protein. Aziz Sancar, now 
working with W. Dean Rupp at Yale School of Medicine, developed the elegant Maxicell 
technique, which relies on a UV-repair deficient bacterial strain [22]. After transformation of a 
plasmid DNA of interest, the hypersensitive bacteria can be UV-irradiated, which causes 
breakdown of the larger chromosomal DNA, whereas the plasmid molecules that have not been 
hit by UV can continue to replicate and express proteins. In combination with radioactive amino 
acid incorporation, the technique allows for labelling and detection of plasmid-encoded proteins 
in the absence of a chromosomal background. The Maxicell technique was soon applied to a 
wide variety of protein identification projects and allowed Sancar to rapidly identify the proteins 
encoded by the uvrA, uvrB and uvrC genes [23-25]. 
 
In a groundbreaking work published in 1983 [26], Sancar used the purified UvrA, UvrB, and 
UvrC proteins to reconstitute essential steps in the NER pathway. The three proteins acted 
specifically on damaged DNA. With UV-irradiated DNA as a substrate, the proteins hydrolysed 
two phosphodiester-bonds on the damaged DNA strand. The incisions were performed at 
4 (15) 
 
 
 
precise locations relative the UV adduct, one at the 8th phosphodiester bond 5' to the lesion and 
a second at the 4th or 5th bond 3' to the same lesion, thus generating a 12-13 nt long fragment. 
Later, Sancar could show that the rate of the reaction is stimulated by UvrD (DNA helicase II) 
and DNA polymerase I (Pol I), which catalyses the removal of the incised strand and synthesis of 
the new DNA strand, respectively [27]. Finally, DNA ligase catalyses the formation of two new 
phosphodiester bonds and thus seals the sugar-phosphate backbone. In the 1983 paper, Sancar 
described the UvrA, B, and C proteins as working together in a single complex (an excinuclease), 
but later findings by him and also others have modified this view. We know today that Uvr 
proteins associate with DNA lesions in a step-wise fashion (Figure 1) [28]. First, a complex of 
two UvrA and one UvrB subunit (UvrA2B) tracks along the DNA. The UvrA subunits are 
responsible for the initial damage recognition on double-stranded DNA, which causes the 
UvrA2B complex to halt. At this point, the UvrB helicase activity is activated, leading to local 
unwinding of DNA around the lesion (about 5 bp), kinking of the template and further 
recognition of the damaged strand by UvrB. As a consequence, the UvrA proteins dissociate 
from UvrB and a single UvrC subunit binds to the remaining UvrB-DNA complex. UvrC 
activates UvrB, which makes the 3' incision, which is followed by UvrC catalysed incision at the 
5' side of the lesion. The UvrD helicase displaces the damaged DNA strand, after which only 
UvrB remains bound to the gapped DNA. At this point, Pol I associates with DNA, fills the gap 
and UvrB is released. Finally, the repaired patch is ligated. 
 
We know today that thymine dimers are just one of numerous types of lesions that interfere with 
normal base pairing and thus distort the helical structure of DNA. NER can recognise these 
problems and correct them by its cut-and-patch mechanism. The overall mechanisms of NER in 
mammalian cells are closely related to those characterised in bacteria. The mechanisms of 
damage recognition, incision on both sides of the lesion, removal of the damaged oligomer and 
resynthesis of the gap are very similar between the two systems. However, even if the overall 
strategy of repair is the same, the proteins responsible are distinct. Whereas damage recognition 
and dual incision is carried out by only three proteins in E. coli more than fifteen proteins are 
required to carry out the same function in human cells. 
5 (15) 
 
 
 
 
 
Figure 1. (Petit and Sancar, Biochimie 1999, 
81:15-25) A simplified model for nucleotide 
excision repair in E. coli. First, a 
heterotrimer of UvrA and UvrB is located to 
the DNA damage. Next, DNA is kinked and 
partially unwound by UvrB through an ATP- 
dependent reaction. UvrA leaves and UvrC 
binds to the UvrB-DNA complex, activating 
UvrB that makes the 3' incision, which is 
followed by an UvrC dependent 5' incision. 
The excised oligomer is released by the UvrD 
helicase. Pol I fills the gap and releases UvrB 
at the same time. Finally, the repaired patch 
is ligated. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mutations in the NER system is linked to a number of human genetic disorders, including 
Xeroderma pigmentosum (XP), which is characterised by hypersensitivity to UV-radiation and 
a very high risk for skin cancer. Many of the genes encoding mammalian NER factors were first 
identified by James Cleaver, who carefully identified XP causing mutants in affected humans 
[29]. Over the years, the mammalian NER system and its mechanisms have been characterised 
in detail by a number of different laboratories. Among the many notable contributions is the 
reconstitution of human NER with purified factors by Sancar [30] and Richard D. Wood [31]. 
 
The photolyase and its reaction mechanism 
In 1982, Sancar took up a faculty position at the University of North Carolina, Chapel Hill. At 
this point he also returned to his PhD project, the photolyase. Between 1984 and 1989, Sancar 
published a series of papers in which he described the mechanisms for photolyase function, 
including the identification of two chromophores present in the E. coli enzyme [32-34]. Sancar 
demonstrated that photolyase, can convert the energy of an absorbed photon into chemistry that 
6 (15) 
 
 
 
produces a localised free radical that initiates thymine dimer splitting. One of the two 
chromophores in the photolyase is the fully reduced flavin–adenine dinucleotide (FADH-). This 
chromofore functions as catalytic cofactor and upon excitation, it performs the actual repair, 
when the excited flavin cofactor transfers an electron to the pyrimidine dimer to generate a 
charge-separated radical pair (FADH· + Pyr<>Pyr·–). The anionic ring of the dimer is split by a 
cycloreversion, and the excess electron returns to the flavin radical to restore the catalytically 
competent FADH– form and close the catalytic photocycle (Figure 2). The reaction is light- 
activated, since the flavin cofactor may be excited by direct photon absorption or by resonance 
energy transfer from another chromophore, which is an antenna pigment 
(methenyltetrahydrofolate or deazaflavin) that harvests sunlight and enhances repair efficiency. 
 
Photoreactivation was the first form of DNA repair identified, but this process is not conserved 
in mammalian cells, which instead rely on NER for correction of UV damage. However, the 
photolyase has mammalian homologues, which are used to helpsetting the circadian clock, i.e. 
the regulation of biological processes in response to light [35]. 
 
 
 
 
 
 
 
DNA is an unstable molecule 
In the early 1970s Tomas Lindahl demonstrated that DNA has limited chemical stability even in 
the absence of external physical assaults. Under physiological conditions DNA is subject to a 
number of chemical reactions such as hydrolytic deamination, oxidation and non-enzymatic 
methylation. These reactions modify the bases of DNA and as a consequence increase the risk 
for mutations. Tomas Lindahl used the term DNA decay to describe these processes and 
elegantly demonstrated that under physiological conditions, spontaneous hydrolytic DNA 
Figure 2. (Kao et al., Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 16128-32) Repair of 
damaged DNA by photolyase. Photolyase acts through an electron-transfer radical 
mechanism. The key catalytic reactions, charge separation (k 1) and ring splitting 
(k 2), are given at the bottom. 
7 (15) 
 
 
 
depurination occur at significant levels [36] and stimulate cleavage of DNA chains [37]. Perhaps 
the most fascinating discovery was the demonstration of high levels of spontaneous cytosine 
deamination under physiological conditions, which leads to the formation of uracil. Since uracil 
forms base pairs with adenine, cytosine deaminiation is a highly mutagenic process, with 
important long-term consequences. High levels of cytosine deamination pose a risk of depleting the 
genetic material from cytosine-guanine base pairs and replacing them with thymine-adenine [38]. 
 
Discovery of base excision repair 
Based on his observation that uracil is frequently formed in DNA, Tomas Lindahl came to the 
conclusion that there must exist an enzymatic pathway that can handle this and other types of 
base lesions. In a now classic study, he single-handedly identified the E. coli uracil-DNA 
glycosylase (UNG) as the first repair protein [39] and two years later a second glycosylase, 
specific for 3-methyladenine DNA [40]. We know today that UNG is the founding member of a 
large family of proteins that orchestrate base excision repair (BER). The identification of UNG 
relied on careful analysis of enzymatic release of uracil as a free base from DNA in vitro. Lindahl 
demonstrated that the enzyme was specific to DNA and did not act on deoxymononucleotides or 
any form of RNA. He also showed that the DNA backbone remained intact in the process, which 
immediately suggested the involvement of another category of enzymes, the 
apurinc/apyrimidinic endonucleases. An E. coli activity specific for apurinic sites had been 
identified just two years earlier by Walter Verly [41, 42]. Lindahl could outline the basic 
concepts for BER already in the 1974 paper and in a series of papers published in the years to 
follow he and others could verify the proposed model. Through continued studies, Lindahl could 
reconstitute the entire BER with purified enzyme, both from E. coli [43] and human cells [44]. 
The process is initiated when a DNA glycosylase recognises and hydrolytically cleaves the base- 
deoxyribose glycosyl bond of a damaged nucleotide (Figure 3). Mammalian cells contain 
number of different DNA glycosylases, which act on various forms of base modifications [45]. 
Once a damaged nucleotide has been identified, the DNA glycosylase kinks the DNA and the 
abnormal nucleotide flips out [46]. The altered base interacts with a specific recognition pocket 
in the glycosylase and is released by cleavage of the glycosyl bond. The DNA glycosylase itself 
often remains bound to the abasic site until being replaced by the next enzyme in the reaction 
cycle, the apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease, which cleaves the DNA backbone at the 5 
side of the abasic position. The AP endonuclease also associates with DNA polymerase β (pol-β), 
to fill the gap [47]. In addition, pol-β harbors a lyase activity, which excises the 5-terminal base- 
free sugar phosphate residue in a nonhydrolytic elimination process [48]. However, the repair of 
oxidatively damaged nucleotides has no requirement for such a pol-β-associated lyase activity, 
because the DNA glycosylases concerned possess endogenous AP lyase activity themselves. In a 
final step, DNA ligase III/XRCC1 heterodimer interacts with pol-β, displaces the polymerase, 
and catalyses the formation of a new phosphodiester bond [44]. 
8 (15) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 3. (Lindahl, Nature 1993, 
362:709-715) The base excision repair 
pathway for removal of endogenous 
damage from cellular DNA. The 
scheme shows the removal of a 
deaminated cytosine residue (uracil). 
The details of the reaction are given in 
the text. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
We know today that BER corrects many different forms of lesions that affect the bases without 
causing gross structural perturbation in the DNA structure. Lesions like these present a special 
challenge to the replication machinery, since they may cause miscoding, i.e. the chemically 
altered base has the potential to base pair with an erroneous base, either during DNA replication 
or transcription. To date, more than 100 different types of oxidative lesions have been identified 
and the vast majority of these are corrected by BER. The lesions corrected by BER may also be 
formed by exogenous factors, including ionizing radiation. 
9 (15) 
 
 
 
 
 
Mismatch repair 
As noted above, the DNA replication machinery is not error-free. There is always the possibility 
that an incorrect nucleotide is introduced during synthesis of a new DNA strand. As a result, a 
non-Watson-Crick base pair is formed, which distorts the double-stranded DNA helix. These 
types of errors are known as mismatches and they have the capacity to change the sequence of 
DNA, i.e. to introduce mutations. As a first line of defence against mismatches, replicating DNA 
polymerases contain a 3 to 5 exonuclease activity that allows them to proofread the newly 
synthesized DNA strand [49]. The exonuclease activity can correct mistakes during DNA 
replication by reversing the direction of the polymerase and excising incorrectly introduced 
nucleotides. Even if proofreading efficiently corrects most mistakes made during DNA synthesis, 
some non-Watson-Crick base pairs still remain. To correct these errors, cells use mismatch 
repair. It is estimated that that replicative DNA polymerases with proofreading in vitro have 
error frequencies of about 5 10-5. Mismatch repair lowers this frequency significantly and the 
mutation rate in for example human germ cells is estimated to be close to 1 10-8 per base pair 
per generation [50]. 
 
The early studies of mismatch repair were mainly carried out by geneticists interested in 
recombination. Robin Holliday had hypothesised that heteroduplexes between different DNA 
strands would be formed during recombination [51]. The mismatches formed in this way had to 
be corrected by some sort of cellular system, leading to gene conversion. Indeed, transfection of 
heteroduplex molecules of lambda phage DNA into E. coli led to repair of the mismatches, but 
the enzymatic system required for this effect was unknown. An important step was taken in 
1976, when Robert Wagner and Matthew Meselson reported that repair of two or more close 
sites on the same heteroduplex DNA molecule occur more often on the same strand than on the 
opposite strand [52]. This observation led them to propose that mismatches are repaired by a 
strand-specific mechanism directed towards one strand, which allows for repair of long DNA 
tracts. They also speculated that strand-specific mismatchrepair could be used to correct non- 
canonical base pairs formed during DNA synthesis. The repair machinery could be guided to the 
newly replicated strand either via a special relation to the replication machinery or directed by 
under-methylation of the newly synthesised strand. In E. coli DNA is normally methylated on 
both strands at GATC-sites, but during DNA synthesis the nascent strand is unmethylated for a 
period of time [53], which could allow the mismatch repair machinery to distinguish newly 
replicated DNA from the template DNA strand. In support of this notion, loss of cellular DNA 
methylase, the enzyme that adds a methyl group to the adenine of the sequence GATC, was 
already in 1975 shown to cause higher mutation rate in E. coli [54]. The genetics of mismatch 
repair was further clarified when Barry W. Glickman and Miroslav Radman could demonstrate 
10 (15) 
 
 
 
that mutH, mutL, mutS and uvrD genes were all required for the methylation-instructed DNA 
mismatch correction [55]. 
 
Direct evidence for methyl-directed repair of mismatches came in 1983. First, Paul Modrich and 
Matthew Meselson used heteroduplex constructs with defined states of DNA methylation to 
demonstrate that DNA methylation indeed directed strand-specific elimination of mismatches 
in E. coli [56]. Furthermore, Modrich developed an assay that allowed analysis of DNA 
mismatch repair in cell-free E. coli extracts [57]. In his assay, he used the classical bacteriophage 
heteroduplexes, but introduced mismatches within overlapping sequences recognised by two 
different restriction endonucleases. About 1,000 bp from the mismatch was a GATC methylation 
site, which could be methylated in a controlled way and thus used to monitor strand-specific 
correction. Using the assay, Modrich could demonstrate that the repair activity was dependent 
on ATP, the methylation state of the heteroduplex, and that mutations affecting mutH, mutL, 
mutS, and uvrD all impaired mismatch repair in cell-free E. coli extracts. With the help of this 
elegant assay, Modrich could in a series of papers isolate the products of the different repair 
genes to near homogeneity, identify the proteins and investigate their properties in vitro in 
great detail [58-60]. 
 
Modrich’s work culminated in a groundbreaking paper published in 1989 [61], in which he could 
finally reconstitute DNA mismatch correction in a defined in vitro system. In the paper, 
Modrich demonstrated the requirement of DNA polymerase III, exonuclease I, and DNA ligase 
for mismatch repair. He then combined these factors with purified MutH, MutL, MutS, UvrD, 
and single-stranded DNA-binding protein. Together these factors could process mismatches in 
vivo in a strand-specific manner directed by the single, GATC sequence methylated on only one 
strand (hemimethylated) and located distant from the mismatch. In this and other studies, 
Modrich demonstrated that MutS, which recognises and binds to non-Watson-Crick base pairs, 
performs a core function in mismatch repair system. To confer strand-specificity, MutH binds at 
hemimethylated GATC sites on the nascent strand. MutL acts as a mediator, which interacts 
with both MutH and MutS. MutL transduces signals from MutS, which leads to activation of the 
latent MutH endonuclease activity causing a nick in the nascent DNA strand near the 
hemimethylated GATC-site. The machinery now interacts with a helicase (UvrD), which 
together with the MutS, MutL, and MutH proteins separates the two DNA strands towards the 
location of the mismatch. Displacement of the mutant strand continues past, and halts just 
downstream of, the mismatch. The nascent strand is then replaced by a gap-filling reaction, in 
which DNA polymerase III uses the parental strand as a template. 
 
Mismatch repair in mammalian cells. 
Later studies by Modrich and others have demonstrated the conservation of mismatch repair in 
eukaryotic cells and in 2004, Modrich managed to reconstitute human mismatch repair with 
only purified factors [62]. In contrast to the situation in E. coli, DNA methylation does not direct 
11 (15) 
 
 
 
strand specific DNA repair in eukaryotic cells. One possibility is that the strand specific nicks 
formed during DNA replication can direct strand-specific error correction. In support of this 
notion, mismatch repair is more efficient on the lagging strand at the replication fork [63], and a 
single nick is sufficient to direct strand specific repair in in vitro [62, 64]. Alternatively, the 
mismatch repair machinery may be directed by ribonucleotides transiently present in DNA after 
replication [65]. In other aspects, eukaryotic mismatch repair is closely related to the E. coli 
system with conserved homologues to key factors such as MutS and MutL. The importance of 
the mammalian mismatch repair system is underscored by the finding that defects in this 
pathway cause hereditary nonpolyposis colon cancer [66, 67]. 
 
Summary 
Tomas Lindahl, Paul Modrich, and Aziz Sancar have made fundamental and groundbreaking 
discoveries on the enzymatic mechanisms of DNA repair. Lindahl demonstrated that DNA is an 
inherently unstable molecule, subject to decay even under physiological conditions. Guided by 
thia observation, Lindahl identified a completely new group of DNA glycosylases and described 
their role in base excision repair. Modrich transformed the field of mismatch repair from genetic 
observations to a detailed biochemical understanding, first in bacteria, and later in eukaryotic 
cells. Sancar has transformed the field of nucleotide excision repair, from genetics and 
phenomena in cell extracts, to a detailed molecular description of the mechanisms involved, first 
in bacteria, and later also in eukaryotic cells. Sancar also explained the molecular mechanisms 
underlying photoreactivation, the first form of DNA repair described. 
 
 
 
 
 
 
 
Claes M. Gustafsson 
Professor of Medical Chemistry and Cell Biology, University of Gothenburg 
Member of the Nobel Committee for Chemistry 
12 (15) 
 
 
 
Referenser 
 
1. Lindahl, T., Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, 1993. 
362(6422): p. 709-15. 
2. Muller, H.J., Artificial Transmutation of the Gene. Science, 1927. 66(1699): p. 84-7. 
3. Kelner, A., Effect of Visible Light on the Recovery of Streptomyces Griseus Conidia 
from Ultra-violet Irradiation Injury. Proc Natl Acad Sci U S A, 1949. 35(2): p. 73-9. 
4. Kelner, A., Photoreactivation of Ultraviolet-Irradiated Escherichia Coli, with Special 
Reference to the Dose-Reduction Principle and to Ultraviolet-Induced Mutation. J 
Bacteriol, 1949. 58(4): p. 511-22. 
5. Avery, O.T., C.M. Macleod, and M. McCarty, Studies on the Chemical Nature of the 
Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types : Induction of 
Transformation by a Desoxyribonucleic Acid Fraction Isolated from Pneumococcus 
Type Iii. J Exp Med, 1944. 79(2): p. 137-58. 
6. Dulbecco, R., Experiments on photoreactivation of bacteriophages inactivated with 
ultraviolet radiation. J Bacteriol, 1950. 59(3): p. 329-47. 
7. Rupert, C.S., S.H. Goodgal, and R.M. Herriott, Photoreactivation in vitro of 
ultraviolet-inactivated Hemophilus influenzae transforming factor. J Gen Physiol, 
1958. 41(3): p. 451-71. 
8. Rupert, C.S., Photoreactivation of transforming DNA by an enzyme from bakers' 
yeast. J Gen Physiol, 1960. 43: p. 573-95. 
9. Sancar, A. and C.S. Rupert, Cloning of the phr gene and amplification of photolyase in 
Escherichia coli. Gene, 1978. 4(4): p. 295-308. 
10. Beukers, R. and W. Berends, Isolation and identification of the irradiation product of 
thymine. Biochim Biophys Acta, 1960. 41: p. 550-1. 
11. Setlow, R.B. andJ.K. Setlow, Evidence that ultraviolet-induced thymine dimers in 
DNA cause biological damage. Proc Natl Acad Sci U S A, 1962. 48: p. 1250-7. 
12. Setlow, J.K. and R.B. Setlow, Nature of Photoreactivable Ultra-Violet Lesion in 
Deoxyribonucleic Acid. Nature, 1963. 197(486): p. 560-&. 
13. Setlow, R.B., P.A. Swenson, and W.L. Carrier, Thymine Dimers and Inhibition of DNA 
Synthesis by Ultraviolet Irradiation of Cells. Science, 1963. 142(3598): p. 1464-6. 
14. Setlow, R.B. and W.L. Carrier, The Disappearance of Thymine Dimers from DNA: An 
Error-Correcting Mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A, 1964. 51: p. 226-31. 
15. Boyce, R.P. and P. Howard-Flanders, Release of Ultraviolet Light-Induced Thymine 
Dimers from DNA in E. Coli K-12. Proc Natl Acad Sci U S A, 1964. 51: p. 293-300. 
16. Pettijohn, D. and P. Hanawalt, Evidence for Repair-Replication of Ultraviolet 
Damaged DNA in Bacteria. J Mol Biol, 1964. 9: p. 395-410. 
17. Howard-Flanders, P., R.P. Boyce, and L. Theriot, Three loci in Escherichia coli K-12 
that control the excision of pyrimidine dimers and certain other mutagen products 
from DNA. Genetics, 1966. 53(6): p. 1119-36. 
18. Rupp, W.D. and P. Howard-Flanders, Discontinuities in the DNA synthesized in an 
excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. 1968. 
DNA Repair (Amst), 2005. 4(5): p. 620-33. 
19. Shimada, K., H. Ogawa, and J. Tomizawa, Studies on radiation-sensitive mutants of E. 
coli. II. Breakage and repair of ultraviolet irradiated intracellular DNA of phage 
lambda. Mol Gen Genet, 1968. 101(3): p. 245-56. 
20. Seeberg, E., W.D. Rupp, and P. Strike, Impaired incision of ultraviolet-irradiated 
deoxyribonucleic acid in uvrC mutants of Escherichia coli. J Bacteriol, 1980. 144(1): 
p. 97-104. 
13 (15) 
 
 
 
21. Seeberg, E., J. Nissen-Meyer, and P. Strike, Incision of ultraviolet-irradiated DNA by 
extracts of E. coli requires three different gene products. Nature, 1976. 263(5577): 
p. 524-6. 
22. Sancar, A., A.M. Hack, and W.D. Rupp, Simple method for identification of plasmid- 
coded proteins. J Bacteriol, 1979. 137(1): p. 692-3. 
23. Sancar, A., et al., Identification of the uvrB gene product. J Mol Biol, 1981. 148(1): p. 
63-76. 
24. Sancar, A., et al., Identification of the uvrA gene product. J Mol Biol, 1981. 148(1): p. 
45-62. 
25. Sancar, A., et al., Identification of the uvrC gene product. Proc Natl Acad Sci U S A, 
1981. 78(9): p. 5450-4. 
26. Sancar, A. and W.D. Rupp, A novel repair enzyme: UVRABC excision nuclease of 
Escherichia coli cuts a DNA strand on both sides of the damaged region. Cell, 1983. 
33(1): p. 249-60. 
27. Husain, I., et al., Effect of DNA polymerase I and DNA helicase II on the turnover rate 
of UvrABC excision nuclease. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(20): p. 6774-8. 
28. Petit, C. and A. Sancar, Nucleotide excision repair: from E. coli to man. Biochimie, 
1999. 81(1-2): p. 15-25. 
29. Cleaver, J.E., Defective repair replication of DNA in xeroderma pigmentosum. Nature, 
1968. 218(5142): p. 652-6. 
30. Mu, D., et al., Reconstitution of human DNA repair excision nuclease in a highly 
defined system. J Biol Chem, 1995. 270(6): p. 2415-8. 
31. Aboussekhra, A., et al., Mammalian DNA nucleotide excision repair reconstituted 
with purified protein components. Cell, 1995. 80(6): p. 859-68. 
32. Sancar, G.B., et al., Action mechanism of Escherichia coli DNA photolyase. I. 
Formation of the enzyme-substrate complex. J Biol Chem, 1987. 262(1): p. 478-85. 
33. Jorns, M.S., et al., Action mechanism of Escherichia coli DNA photolyase. II. Role of the 
chromophores in catalysis. J Biol Chem, 1987. 262(1): p. 486-91. 
34. Sancar, G.B., et al., Action mechanism of Escherichia coli DNA photolyase. III. 
Photolysis of the enzyme-substrate complex and the absolute action spectrum. J Biol 
Chem, 1987. 262(1): p. 492-8. 
35. Sancar, A., Regulation of the mammalian circadian clock by cryptochrome. J Biol 
Chem, 2004. 279(33): p. 34079-82. 
36. Lindahl, T. and B. Nyberg, Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. 
Biochemistry, 1972. 11(19): p. 3610-8. 
37. Lindahl, T. and A. Andersson, Rate of chain breakage at apurinic sites in double- 
stranded deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1972. 11(19): p. 3618-23. 
38. Lindahl, T. and B. Nyberg, Heat-induced deamination of cytosine residues in 
deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1974. 13(16): p. 3405-10. 
39. Lindahl, T., An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA 
containing deaminated cytosine residues. Proc Natl Acad Sci U S A, 1974. 71(9): p. 
3649-53. 
40. Lindahl, T., New class of enzymes acting on damaged DNA. Nature, 1976. 
259(5538): p. 64-6. 
41. Verly, W.G. and Y. Paquette, An endonuclease for depurinated DNA in Escherichia 
coli B. Can J Biochem, 1972. 50(2): p. 217-24. 
42. Verly, W.G., Y. Paquette, and L. Thibodeau, Nuclease for DNA apurinic sites may be 
involved in the maintenance of DNA in normal cells. Nat New Biol, 1973. 244(133): 
p. 67-9. 
43. Dianov, G. and T. Lindahl, Reconstitution of the DNA base excision-repair pathway. 
Curr Biol, 1994. 4(12): p. 1069-76. 
14 (15) 
 
 
 
44. Kubota, Y., et al., Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human 
proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein. EMBO J, 
1996. 15(23): p. 6662-70. 
45. Lindahl, T. and R.D. Wood, Quality control by DNA repair. Science, 1999. 
286(5446): p. 1897-905. 
46. Mol, C.D., et al., Crystal structure and mutational analysis of human uracil-DNA 
glycosylase: structural basis for specificity and catalysis. Cell, 1995. 80(6): p. 869- 
78. 
47. Sobol, R.W., et al., Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision 
repair. Nature, 1996. 379(6561): p. 183-6. 
48. Matsumoto, Y. and K. Kim, Excision of deoxyribose phosphate residues by DNA 
polymerase beta during DNA repair. Science, 1995. 269(5224): p. 699-702. 
49. Brutlag, D. and A. Kornberg, Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. 36. A 
proofreading function for the 3' leads to 5' exonuclease activity in deoxyribonucleic 
acid polymerases. J Biol Chem, 1972. 247(1): p. 241-8. 
50. Segurel, L., M.J. Wyman, and M. Przeworski, Determinants of mutation rate 
variation in the human germline. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2014. 15: p. 47- 
70. 
51. Holliday, R., Mechanism for Gene Conversion in Fungi. Genetical Research, 1964. 
5(2): p. 282-&. 
52. Wagner, R., Jr. and M. Meselson, Repair tracts in mismatched DNA heteroduplexes. 
Proc Natl Acad Sci U S A, 1976. 73(11): p. 4135-9. 
53. Marinus, M.G., Adenine methylation of Okazaki fragments in Escherichia coli. J 
Bacteriol, 1976. 128(3): p. 853-4. 
54. Marinus, M.G. and N.R. Morris, Pleiotropic effects of a DNA adenine methylation 
mutation (dam-3) in Escherichia coli K12. Mutat Res, 1975. 28(1): p. 15-26. 
55. Glickman, B.W. and M. Radman, Escherichia coli mutator mutants deficient in 
methylation-instructed DNA mismatch correction. Proc Natl Acad Sci U S A, 1980. 
77(2): p. 1063-7. 
56. Pukkila, P.J., et al., Effects of high levels of DNA adenine methylation on methyl- 
directed mismatch repair in Escherichia coli. Genetics, 1983. 104(4): p. 571-82. 
57. Lu, A.L., S. Clark, and P. Modrich, Methyl-directed repair of DNA base-pair 
mismatches in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 1983. 80(15): p. 4639-43. 
58. Su, S.S. and P. Modrich, Escherichia coli mutS-encoded protein binds to mismatched 
DNA base pairs. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(14): p. 5057-61. 
59. Grilley, M., et al., Isolation and characterization of the Escherichia coli mutL gene 
product. J Biol Chem, 1989. 264(2): p. 1000-4. 
60. Welsh, K.M., et al., Isolation and characterization of the Escherichia coli mutH gene 
product. J Biol Chem, 1987. 262(32): p.15624-9. 
61. Lahue, R.S., K.G. Au, and P. Modrich, DNA mismatch correction in a defined system. 
Science, 1989. 245(4914): p. 160-4. 
62. Dzantiev, L., et al., A defined human system that supports bidirectional mismatch- 
provoked excision. Mol Cell, 2004. 15(1): p. 31-41. 
63. Pavlov, Y.I., I.M. Mian, and T.A. Kunkel, Evidence for preferential mismatch repair of 
lagging strand DNA replication errors in yeast. Curr Biol, 2003. 13(9): p. 744-8. 
64. Holmes, J., Jr., S. Clark, and P. Modrich, Strand-specific mismatch correction in 
nuclear extracts of human and Drosophila melanogaster cell lines. Proc Natl Acad Sci 
U S A, 1990. 87(15): p. 5837-41. 
65. Lujan, S.A., et al., Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand 
replication errors. Mol Cell, 2013. 50(3): p. 437-43. 
15 (15) 
 
 
 
66. Fishel, R., et al., The human mutator gene homolog MSH2 and its association with 
hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell, 1993. 75(5): p. 1027-38. 
67. Parsons, R., et al., Hypermutability and mismatch repair deficiency in RER+ tumor 
cells. Cell, 1993. 75(6): p. 1227-36. 
 
16 (15) 
 
 
 
Estra tradução é literal deita pelo site https://translate.google.com.br/?hl=pt-BR 
 
 
 
 
 
Fundo científico sobre o Prêmio Nobel de Química 2015 
 
 
ESTUDOS mecanicista do DNA REPAIR 
 
compilado pela Classe de Química da Real Academia Sueca de Ciências 
 
 
A Real Academia Sueca de Ciências decidiu conceder Tomas Lindahl, Paul Modrich e Aziz Sancar o Prêmio Nobel de 
Química 2015 por seus "Estudo do mecanismo de reparo do DNA" 
 
Danos ao material genético representa uma ameaça para todos os organismos. Para neutralizar esta ameaça, as 
células desenvolveram uma série de vias de reparo de DNA intrincados que corrigem lesões de DNA que afetam o 
emparelhamento de base ou estrutura do DNA. Hoje entendemos os mecanismos moleculares destas vias em 
grande detalhe, em grande parte devido aos estudos pioneiros de Lindahl, Modrich e Sancar que abriu o campo. 
 
 
 
Antecedentes 
O genoma humano codifica as informações necessárias para criar um ser humano completo. Durante cada divisão 
celular, mais de três milhões de pares de bases de ADN são replicadas e cópias do genoma são transferidos para as 
células filhas. Embora muito eficiente, a máquina replicação do DNA responsável por esta tarefa ainda comete erros 
ocasionais. Tendo em conta o tamanho do genoma humano e o grande número de células num corpo humano 
 o tempo de vida de um indivíduo. A maioria 
destes erros irá permanecer silencioso, mas também podem causar doenças graves. 
 
Apesar do seu papel essencial no armazenamento de informação genética, a molécula de ADN tem uma estabilidade 
química limitada e está sujeito ao decaimento espontâneo [1]. Processos tais como hidrólise e oxidação ocorrem em 
níveis significativos in vivo, em parte devido a metabolitos reactivos continuamente gerados em vários processos 
fisiológicos. Além disso, fatores externos, como produtos químicos e radiação genotóxicos continuará a estimular a 
formação de danos no DNA. 
 
A instabilidade inerente do DNA constitui uma oportunidade e uma ameaça. Lesões do ADN pode bloquear 
processos celulares importantes, tais como a replicação e transcrição de ADN, genoma causa instabilidade e 
comprometer a expressão do gene. As lesões também podem ser mutagénico e alterar a capacidade de codificação 
do genoma, o que pode levar a doenças e condições associadas com devastadores instabilidade do genoma, 
incluindo o cancro, doenças neurodegenerativas e envelhecimento biológico. Ao mesmo tempo, sem mutações 
evolução Darwiniana não seria possível. Além disso, os produtos químicos mutagénicos e radiação também pode ter 
um efeito de cura; eles podem por exemplo ser utilizados para tratar cancro, através da introdução de lesões de 
ADN que param a proliferação de células e estimulam a morte celular programada. 
 
1 (15) 
 
 
A célula tem desenvolvido maneiras de neutralizar lesões de DNA e para manter mutações no DNA em um nível 
17 (15) 
 
 
tolerável. Uma série de diferentes mecanismos de reparo do DNA lesões corretas e salvaguardar a integridade do 
genoma. Quatro vias de reparo de DNA fundamentais delineadas por laureados com o Prêmio Nobel deste ano será 
discutido aqui. 
 
Fotorreativação - o primeiro mecanismo de reparo do DNA 
Na década de 1920, o geneticista norte-americano Hermann Muller (Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina, 1946) 
descobriu que os raios X pode sofrer mutação e matar células [2]. Mais tarde, outros tipos de agentes, incluindo a 
luz ultravioleta (UV), também foram exibidas para afectar a viabilidade celular e os níveis de mutação. O alvo celular 
para os efeitos letais de raios-X e UV-luz era desconhecido neste momento, e não foram identificados mecanismos 
celulares que poderiam reparar as lesões, uma vez que ocorreu. A descoberta veio no final de 1940, quando Albert 
Kelner estudou bactérias e sua recuperação em resposta a danos causados por luz UV. Kelner descobriu que a luz 
visível poderia estimular o crescimento de recuperação dramaticamente após uma paragem do crescimento 
causada pela exposição à radiação UV [3], [4]. O fenómeno foi denominado fotorreativação e que apontam para a 
existência de um mecanismo celular dependente da luz que pode corrigir os danos celulares induzidos por UV. 
 
Oswald Avery e colegas de trabalho tinha demonstrado em 1944 que o DNA é o material da hereditariedade [5] e 
em 1950 tornou-se claro que o dano induzido por UV provavelmente foi alvo de DNA. Neste ponto, Renato Dulbecco 
(Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina, 1975) sugeriu que fotorreativação foi uma reação enzimática dependente 
da luz visível [6]. O acerto desta suposição foi demonstrada por Stanley Rupert, que, em uma série de relatórios 
mostraram que o DNA poderia ser reativada pela luz visível na presença de um extrato livre de células de Escherichia 
coli ou Saccharomyces cerevisiae [7, 8]. A observação desta actividade enzimática, conhecida como a fotoliase, era 
de profunda importância, uma vez que demonstrou pela primeira vez a existência de enzimas de reparação de ADN 
que pode resgatar DNA de UV-irradiado. No início, a fotoliase era apenas uma atividade em um extrato, mas em 
1978 Aziz Sancar poderia clonar o gene E. coli fotoliase e amplificar o produto do gene in vivo [9]. Sancar era na 
época um estudante de PhD de Rupert, mas em vez de continuar a caracterizar a fotoliase, ele escreveu sua tese de 
doutorado e se formou. Levaria mais seis anos, antes de Sancar voltou a fotoliase pesquisa. 
 
Reparação Dark - a descoberta de nucleotídeo reparo por excisão 
Além fotorreativação, danos de UV também pode ser reparado num processo independente de luz (conhecido como 
"reparação escuro"). Essa radiação UV de dimeros de timina de ADN introduzida in vitro foi relatado em 1960, mas a 
relevância in vivo deste achado foi claro [10]. Um par de anos mais tarde, Jane Setlow e Richard Setlow 
demonstrado que dimeros de timina inactivado transformando o DNA em bactéria Haemophilus influenzae e que 
este tipo de lesão foi responsável pelo efeito biológico de radiação UV [11, 12]. Esta constatação permitiu estudar as 
consequências moleculares precisos de dimeros de timina e investigar como as células tratar 
 
 
eles. Em 1963, Richard Setlow relatado que dimeros de timina inibir a síntese de ADN e que estas lesões são 
excisados a partir de ADN em bactérias irradiadas com UV de tipo selvagem, mas não de uma sensível, estirpe 
mutante UV E. coli [13]. Em 1964, a descoberta feita seminal que dimeros de timina desapareceu do ADN irradiado, 
de elevado peso molecular genómico logo após a exposição à radiação UV e, em vez apareceu nas fracções de baixo 
peso molecular. Richard Setlow e seu colega William portador interpretados corretamente esse resultado como 
dímeros de timina sendocortado (afastado) do DNA, daí o nome de reparação excisão [14]. Nessa época, Richard 
Boyce e Paul Howard-Flanders também publicou observações com conclusões semelhantes aos alcançados por 
Richard Setlow [15]. Os mecanismos emergentes do que mais tarde se tornou conhecido como reparo excisão de 
nucleotídeos (NER) foi ainda elucidado na obra fundamental por Philip Hanawalt e David Pettijohn, que descobriu 
que radiação UV, estimularam a síntese de reparação do ADN, mesmo fora da fase S-, ou seja, independente da 
replicação do genoma [16]. As contribuições pioneiras destes pioneiros indicaram claramente a existência de 
mecanismos de reparação que poderiam corrigir lesões induzidas UV, mas os mecanismos moleculares precisos 
subjacentes NER permaneceu obscura. 
 
Os mecanismos moleculares de Ner 
A identificação das enzimas responsáveis pela NER foi grandemente assistida por análises de genética. Trabalho 
18 (15) 
 
 
bacteriana anteriormente havia identificado genes uvrA, uvrB, e uvrC em busca de mutações que NER deficientes e 
impediram a retomada do crescimento após a irradiação UV [17]. Trabalho in vivo [18-20] e em extractos de E. coli 
[21] por Erling Seeberg e outros indicaram que os produtos dos genes UVR funcionou por clivagem endonucleolítica 
de ADN irradiado, mas isto não pode ser examinada em pormenor, devido à falta de purificada proteínas. 
 
Na década de 1970, a identificação de proteínas foi um desafio importante, uma vez que técnicas de sequenciação 
de DNA foram limitados e um dado locus do gene pode codificar mais do que uma proteína. Aziz Sancar, agora 
trabalhando com W. Dean Rupp em Yale School of Medicine, desenvolveu a técnica Maxicell elegante, que se baseia 
em um UV-reparação estirpe bacteriana deficiente [22]. Após a transformação de um plasmídeo de ADN de 
interesse, as bactérias podem ser hipersensíveis UV-irradiada, o que causa a quebra do ADN cromossómico maiores, 
enquanto que as moléculas de plasmídeo que não tenham sido atingidos por UV pode continuar a replicar e 
expressar proteínas. Em combinação com radioactivos incorporação de aminoácidos, a técnica permite a marcação 
e detecção de proteínas codificadas pelo plasmídeo na ausência de um fundo cromossómico. A técnica Maxicell logo 
foi aplicada a uma grande variedade de projectos de identificação de proteínas e permitiu identificar rapidamente 
Sanear para as proteínas codificadas pelos genes uvrA, uvrB e uvrC [23-25]. 
 
Em um trabalho inovador publicado em 1983 [26], Sancar usado as proteínas uvrA, uvrB, e UvrC purificadas para 
reconstituir passos essenciais na via NER. As três proteínas agiu especificamente no ADN danificado. Com ADN de 
UV-irradiado como um substrato, as proteínas hidrolisadas duas ligações fosfodiéster na cadeia de ADN danificado. 
As incisões foram realizadas a 
 
 
locais precisos relativos o aducto de UV, um na ligação fosfodiéster 8 5 'para a lesão e um segundo no quarto ou 
quinto ligação 3' para a mesma lesão, gerando um fragmento de 12-13 nt de comprimento. Mais tarde, Sanear 
poderia mostrar que a velocidade da reacção é estimulada por UvrD (helicase do ADN II) e ADN polimerase I (pol I), 
que catalisa a remoção da cadeia de incisão e a síntese da nova cadeia de ADN, respectivamente [27]. Finalmente, a 
ligase de ADN catalisa a formação de duas novas ligações fosfodiéster e, assim, sela a estrutura açúcar-fosfato. No 
papel 1983, Sancar descreveu as proteínas uvrA, B e C como trabalhar juntos em um único complexo (um 
excinuclease), mas os resultados posteriores por ele e também outros têm modificado este ponto de vista. Sabemos 
hoje que as proteínas UVR associar com lesões no ADN de uma forma passo a passo (Figura 1) [28]. Em primeiro 
lugar, um complexo de dois uvrA e uma subunidade uvrB (UvrA2B) faixas ao longo do DNA. As subunidades uvrA são 
responsáveis pelo reconhecimento de um dano inicial no ADN de cadeia dupla, o que faz com que o complexo 
UvrA2B a parar. Neste ponto, a actividade de helicase uvrB é activado, conduzindo a desenrolamento local do ADN 
em torno da lesão (cerca de 5 pares de bases), a torção do molde e um maior reconhecimento da cadeia danificado 
por uvrB. Como consequência, as proteínas uvrA dissociar uvrB e uma única subunidade UvrC se liga ao complexo 
ADN-uvrB restante. UvrC uvrB activa, o que faz com que 'a incisão, a qual é seguida por UvrC catalisada incisão na 
extremidade 5' a 3 lado da lesão. A helicase UvrD desloca a cadeia de DNA danificado, depois que só uvrB 
permanece ligada ao DNA gapped. Neste ponto, associados com pol I de ADN, preenche a lacuna e uvrB é libertado. 
Finalmente, o remendo reparado é ligado. 
 
Sabemos hoje que dímeros de timina são apenas um dos inúmeros tipos de lesões que interferem com base 
emparelhamento normal e assim distorcer a estrutura helicoidal do DNA. NER pode reconhecer esses problemas e 
corrigi-los por seu mecanismo de corte-e-patch. Os mecanismos gerais de NER em células de mamífero estão 
estreitamente relacionadas com aquelas que se caracterizam em bactérias. Os mecanismos de reconhecimento de 
danos, incisão em ambos os lados da lesão, remoção do oligómero danificado e resíntese do fosso são muito 
semelhantes entre os dois sistemas. No entanto, mesmo se a estratégia global de reparação é o mesmo, as 
proteínas responsáveis são distintos. Considerando que o reconhecimento de danos e incisão dupla é levada a cabo 
por apenas três proteínas em E. coli mais do que quinze proteínas são necessárias para realizar a mesma função em 
células humanas. 
 
 
Figura 1. (Petit e Sanear, Biochimie 1999, 81: 15-25) um modelo simplificado para reparação de excisão de 
19 (15) 
 
 
nucleótidos em E. coli. Primeiro, um heterotrímero de uvrA e uvrB está localizado ao dano ao DNA. Em seguida, o 
DNA é dobrado e parcialmente desenrolado por uvrB através de uma reação ATP dependente. UvrA folhas e UvrC se 
liga ao complexo uvrB-ADN, activar uvrB que faz com que o 'incisão, a qual é seguida por uma UvrC dependentes 5' 
3 incisão. O oligómero excisada é liberado pela helicase UvrD. Pol I preenche a lacuna e uvrB liberta, ao mesmo 
tempo. Finalmente, o remendo reparado é ligado. 
 
 
 
Mutações no sistema NER está ligada a uma série de doenças genéticas humanas, incluindo xeroderma pigmentoso 
(XP), o qual é caracterizado por hipersensibilidade a radiação UV e um risco muito elevado de cancro da pele. 
Muitos dos genes que codificam fatores NER mamíferos foram inicialmente identificados por James Cleaver, que 
cuidadosamente identificados XP causando mutantes em humanos afetados [29]. Ao longo dos anos, o sistema de 
NER e os seus mecanismos de mamífero foram caracterizadas em detalhe por uma série de laboratórios diferentes. 
Entre as muitas contribuições notáveis é a reconstituição de NER humano com factores purificados por Sanear [30] e 
Richard D. Wood [31]. 
 
O fotoliase e seu mecanismo de reação 
Em 1982, Sancar assumiu uma posição do corpo docente da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill. Nesse 
ponto, ele também voltou ao seu projecto de doutoramento, a fotoliase. Entre 1984 e 1989, Sancar publicou uma 
série de papéis em que ele descreveu os mecanismos para a função fotoliase, incluindo a identificação de dois 
cromóforos presentes na enzima E. coli [32-34]. Sanear demonstrado que fotoliase, pode converter a energia de um 
fotão absorvida em que a química 
 
 
produz um radical livre localizada que inicia divisão timina dímero. Um dos dois cromóforos da fotoliase é o 
dinucleótido flavina totalmente reduzida-adenina (FADH-). Isto funciona como cofactor chromofore catalítica e após 
excitação, ele executa a reparação real, quando o co-factor flavina animado transfere um electrão para o dímero de 
pirimidina para gerar um par de radicais separados por carga (FADH · Pyr + <> · Pyr -). O anel aniónica do dímero é 
dividido por um cycloreversion, e o excesso de retorno de electrõespara o radical flavina para restaurar a forma 
FADH- cataliticamente competente e fechar a photocycle catalítica (Figura 2). A reacção é luz- activado, uma vez que 
o co-factor flavina pode ser excitado por absorção de fotões directa ou por transferência de energia de ressonância 
de outro cromóforo, que é um pigmento de antena (ou methenyltetrahydrofolate deazaflavin) que colhe a luz solar 
e aumenta a eficiência de reparação. 
 
Fotorreativação foi a primeira forma de reparação de ADN identificado, mas este processo não é conservada em 
células de mamífero, o qual em vez disso dependem de NER para correcção de danos UV. No entanto, a fotoliase 
tem homólogos de mamífero, que são usados para ajudar a ajustar o relógio circadiano, ou seja, a regulação de 
processos biológicos, em resposta à luz [35]. 
 
 
O DNA é uma molécula instável 
No início de 1970 Tomas Lindahl demonstraram que o DNA tem estabilidade química limitada, mesmo na ausência 
de agressões físicas externas. Sob condições fisiológicas, o ADN é sujeito a uma série de reacções químicas, tais 
como a desaminação hidrolítica, oxidação e metilação não enzimática. Estas reacções modificar as bases de ADN e, 
consequentemente, aumentar o risco de mutações. Tomas Lindahl usado o decaimento DNA termo para descrever 
estes processos e elegantemente demonstrado que, sob condições fisiológicas, DNA hydrolytic espontânea 
 
 
despurinação ocorrem em níveis significativos [36] e estimular a clivagem de cadeias de ADN [37]. Talvez o mais 
fascinante descoberta foi a demonstração de níveis elevados de desaminação espontânea citosina sob condições 
fisiológicas, o que leva à formação do uracilo. Desde pares de bases formas uracila com adenina, citosina 
deaminiation é um processo altamente mutagênico, com importantes consequências a longo prazo. Altos níveis de 
20 (15) 
 
 
citosina deamination representar um risco de esgotar o material genético de pares de bases de citosina-guanina e 
substitui-los com timina-adenina [38]. 
 
Descoberta de reparação por excisão de bases 
Com base em sua observação de que uracila é frequentemente formado em DNA, Tomas Lindahl chegou à 
conclusão de que deve existir uma via enzimática que pode lidar com este e outros tipos de lesões de base. Em um 
estudo clássico agora, ele sozinho identificou a glicosilase de E. coli de uracilo-DNA (UNG), como a primeira proteína 
de reparação [39] e dois anos mais tarde uma segunda glicosilase, específico para ADN 3-metiladenina [40]. 
Sabemos hoje que a UNG é o membro fundador de uma grande família de proteínas que orquestram reparo por 
excisão de base (BER). A identificação de UNG invocado análise cuidadosa de libertação enzimática de uracilo como 
uma base livre a partir de ADN in vitro. Lindahl demonstraram que a enzima foi específica ao ADN e não actuar 
sobre deoxymononucleotides ou qualquer forma de ARN. Ele também mostrou que a espinha dorsal do ADN 
permaneceu intacta durante o processo, o que sugere imediatamente o envolvimento de uma outra categoria de 
enzimas, o apurinc / endonucleases apirimidinicos. Uma atividade E. coli específica para sites apurínicos havia sido 
identificado apenas dois anos antes por Walter Verly [41, 42]. Lindahl poderia delinear os conceitos básicos para BER 
já no papel 1974 e em uma série de artigos publicados nos anos que se seguiram, ele e outros poderiam verificar o 
modelo proposto. Através de inúmeros estudos, a Lindahl podia reconstituir todo o BER com a enzima purificada, 
tanto de E. coli [43] e células humanos [44]. O processo é iniciado quando uma glicosilase DNA reconhece e cliva a 
ligação hidroliticamente glicosil- deoxyribose base- de um nucleotídeo danificado (Figura 3). As células de mamífero 
contêm número de diferentes glicosilase de ADN, que actuam em várias formas de modificações de bases [45]. Uma 
vez que um nucleótido danificada tenha sido identificado, a ADN glicosilase de ADN e a torções do nucleótido 
anormal vira para fora [46]. A base alterada interage com um bolso de reconhecimento específico no glicosilase e é 
libertado por clivagem da ligação glicosil. A glicosilase de ADN em si, muitas vezes permanece ligado ao sitio não 
básico, até ser substituído pelo próximo enzima no ciclo de reacção, o apirimidinico (AP) de endonuclease apurínico 
polimerase (pol-P), para preencher o hiato [47]. Além disso, Pol-β abriga uma actividade de liase, que extirpa o 
resíduo fosfato de açúcar livre base- -terminal de um processo de eliminação não hidrolítica [48]. No entanto, a 
reparação de nucleótidos oxidativamente danificados não tem necessidade de tal actividade de liase associada-POL-
β, porque os ADN glicosilases em questão possuem actividade de liase AP endógena si. Num passo final, a ADN-
ligase III / XRCC1 heterodímero interage com POL-β, desloca a polimerase, e catalisa a formação de uma nova 
ligação fosfodiéster [44]. 
 
 
Figura 3. (Lindahl, Nature 1993, 362: 709-715) A via de reparação de excisão de bases para a remoção de lesões de 
ADN celular endógeno. O esquema mostra a remoção de um resíduo de citosina desaminado (uracilo). Os detalhes 
da reacção são dados no texto. 
 
 
Sabemos hoje que a BER corrige muitas formas diferentes de lesões que afetam as bases sem causar perturbação 
estrutural bruto na estrutura do DNA. As lesões como estes apresentam um desafio especial para a maquinaria de 
replicação, uma vez que eles podem causar má codificação, ou seja, a base modificados quimicamente tem o 
potencial de pares de bases com uma base errada, quer durante a replicação de DNA ou transcrição. Até à data, 
mais de 100 tipos diferentes de lesões oxidativas foram identificados e a grande maioria destes é corrigida por BER. 
As lesões corrigidas por BER também pode ser formado por factores exógenos, incluindo a radiação ionizante. 
 
 
Reparo incompatível 
Como observado acima, a maquinaria de replicação de ADN não é livre de erros. Existe sempre a possibilidade de 
que um nucleótido incorrecta é introduzido durante a síntese de uma nova cadeia de ADN. Como resultado, um par 
de bases não de Watson-Crick é formada, que falseia a dupla hélice de ADN de cadeia. Estes tipos de erros são 
conhecidos como os desfasamentos e eles têm a capacidade para alterar a sequência de ADN, ou seja, a introdução 
de mutações. Como uma primeira linha de defesa contra desemparelhamentos, replicando as polimerases de ADN 
21 (15) 
 
 
actividade de exonuclease pode corrigir erros durante a replicação do ADN por inversão do sentido da polimerase 
de nucleótidos e excisão introduzidas incorrectamente. Mesmo se a rever de forma eficiente corrige a maioria dos 
erros cometidos durante a síntese de DNA, alguns pares de bases não de Watson-Crick ainda permanecem. Para 
corrigir esses erros, as células usam de reparo incompatível. Estima-se que que as DNA polimerases replicadoras 
-5. Reparo incompatível reduz significativamente 
essa freqüência ea taxa de mutação em, por exemplo, células germinais humanas é estimada em perto de 1 par por 
10-8 por base. 
 
Os primeiros estudos de reparo incompatível foram realizados principalmente pelos geneticistas interessadas em 
recombinação. Robin Holliday tinha a hipótese de que heteroduplexes entre as diversas vertentes de DNA seria 
formado durante a recombinação [51]. Os descasamentos formados desta maneira tinha que ser corrigido por 
algum tipo de sistema celular, levando à conversão do gene. Com efeito, a transfecção de moléculas de 
heteroduplex de fago lambda de ADN em E. coli levou a reparação dos desfasamentos, mas o sistema enzimática 
necessária para este efeito era desconhecida. Um passo importante foi dado em 1976, quando Robert Wagner e 
Matthew Meselson informou que o reparo de duas ou mais fechar sites na mesma molécula de DNA heteroduplex 
ocorrem mais frequentemente na mesma cadeia do que na cadeia oposta [52]. Esta observação levou-os a propor 
quedescasamentos são reparadas por um mecanismo específico de cadeia dirigida para uma cadeia, que permite a 
reparação de extensões longas de DNA. Eles também especulado que específico de cadeia reparação de 
emparelhamentos incorrectos pudesse ser utilizada para corrigir os pares de bases não- canónica formados durante 
a síntese de ADN. A maquinaria de reparação pode ser guiado com a cadeia recém-replicado, quer através de uma 
relação especial da maquinaria de replicação ou dirigido por sub-metilação da cadeia sintetizada de novo. Em E. coli, 
o DNA é normalmente metilada em ambas as cadeias na GATC-sites, mas durante a síntese da cadeia de ADN 
nascente é não metilado por um período de tempo de [53], o que pode permitir que a maquinaria reparação de 
emparelhamentos incorrectos do ADN de distinguir recém replicada do ADN molde vertente. Em apoio a esta noção, 
perda de metilase de ADN celular, a enzima que adiciona um grupo metilo para a adenina de sequência GATC, já em 
1975, foi demonstrado que provoca mais elevada taxa de mutação em E. coli [54]. A genética de reparo 
incompatível foi clarificado quando Barry W. Glickman e Miroslav Radman conseguiu demonstrar 
 
 
que Muth, mutL, mutS e genes uvrD foram todos necessários para a correcção de emparelhamentos incorrectos do 
ADN instruído-metilação [55]. 
 
A evidência direta para o reparo dirigido-metil de descasamentos veio em 1983. Primeiro, Paulo Modrich e Matthew 
Meselson usado heteroduplex constrói com estados definidos de metilação do DNA para demonstrar que a 
metilação do DNA, na verdade dirigido eliminação específica de cadeia de descasamentos de E. coli [56]. Além disso, 
Modrich desenvolvido um ensaio que permite análise de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN de E. 
coli em extractos livres de células de E. [57]. Em seu ensaio, usou os heteroduplexes bacteriófago clássicos, mas 
introduzido desemparelhamentos dentro de sequências reconhecidas por sobreposição de duas endonucleases de 
restrição diferentes. Sobre 1000 pb a partir do desfasamento era um local GATC metilação, o que pode ser metilado, 
de forma controlada e assim utilizado para monitorizar correcção específica de cadeia simples. Utilizando o ensaio, 
Modrich poderia demonstrar que a actividade de reparação era dependente de ATP, o estado de metilação do 
heteroduplex, e que mutações que afetam Muth, mutL, mutS, e uvrD tudo de reparo incompatível prejudicada em 
célula-livre extractos de E. coli. Com a ajuda deste ensaio elegante, Modrich poderia, em uma série de papéis de 
isolar os produtos de diferentes genes de reparação para próximo da homogeneidade, identificar as proteínas e 
investigar as suas propriedades in vitro em grande detalhe [58-60]. 
 
O trabalho de Modrich culminou em um papel inovador publicado em 1989 [61], no qual ele poderia finalmente 
reconstituir correção incompatibilidade DNA em um definido sistema in vitro. No papel, Modrich demonstrou a 
exigência de ADN-polimerase III, exonuclease I, e ligase de ADN para reparação de emparelhamentos incorrectos. 
Ele em seguida, combinado com estes factores purificados Muth, mutL, MutS, UvrD, e proteína de ligação ao ADN 
de cadeia simples. Juntos, esses fatores poderiam processar desfasamentos in vivo de uma forma específica de 
22 (15) 
 
 
cadeia dirigida pela sequência único, GATC metilado em apenas uma vertente (hemimethylated) e localizado 
distante da incompatibilidade. Neste e noutros estudos, Modrich demonstrado que MutS, que reconhece e se liga 
aos pares de bases não de Watson-Crick, executa uma função central no sistema de reparação de emparelhamentos 
incorrectos. Para conferir vertente especificidade, Muth se liga em locais GATC hemimethylated na vertente 
nascente. MutL actua como um mediador, o qual interage com ambos Muth e MutS. MutL transduz sinais do MutS, 
o que leva à activação da actividade de endonuclease Muth latente causando um entalhe na cadeia de ADN 
nascente próximo do local hemimethylated GATC. A máquina agora interage com uma helicase (UvrD), que, em 
conjunto com os MutS, proteínas Mutl, e Muth separa as duas cadeias de ADN para a localização do desfasamento. 
O deslocamento do cordão mutante continua passado, e interrompe imediatamente a jusante de, a 
incompatibilidade. A cadeia nascente é então substituída por uma reacção de preenchimento de lacunas, em que o 
ADN-polimerase III usa a fita parental como um modelo. 
 
Reparação de incompatibilidade em células de mamíferos. 
Estudos posteriores por Modrich e outros demonstraram a conservação de reparo incompatível em células 
eucarióticas e, em 2004, Modrich conseguiu reconstituir reparo incompatível humano com fatores só purificados 
[62]. Em contraste com a situação em E. coli, a metilação do DNA não dirige 
 
 
vertente de reparação do ADN específica em células eucarióticas. Uma possibilidade é que os nicks específicos 
vertente formados durante a replicação do DNA pode direcionar a correção de erro específico de cadeia. Em apoio a 
essa noção, de reparo incompatível é mais eficiente na costa de retardamento na bifurcação de replicação [63], e 
uma única nick é suficiente para a reparação específica vertente direta in vitro [62, 64]. Alternativamente, a 
máquina reparação de emparelhamentos incorrectos podem ser dirigidas por ribonucleótidos transitoriamente 
presentes no ADN após a replicação [65]. Em outros aspectos, reparo incompatível eucariótica está intimamente 
relacionado com o sistema de E. coli com homólogos conservados a fatores-chave como MutS e mutL. A importância 
do sistema de reparo incompatível mamíferos é sublinhada pela constatação de que defeitos neste caminho causar 
câncer de cólon hereditário sem polipose [66, 67]. 
 
Resumo 
Tomas Lindahl, Paul Modrich, e Aziz Sancar fizeram descobertas fundamentais e inovadoras sobre os mecanismos 
enzimáticos de reparo do DNA. Lindahl demonstrou que uma molécula de ADN é inerentemente instável, sujeito à 
decomposição, mesmo sob condições fisiológicas. Guiados pela tia observação, Lindahl identificou um grupo 
completamente novo de glicosilases DNA e descreveu seu papel no reparo por excisão de base. Modrich 
transformado no campo de reparação de emparelhamentos incorrectos de observações genéticos para uma 
compreensão detalhada bioquímica, primeiro em bactérias, e mais tarde, em células eucarióticas. Sanear 
transformou o campo da reparação de excisão de nucleótidos, da genética e fenómenos em extractos de células, 
para uma descrição detalhada molecular dos mecanismos envolvidos, primeiro em bactérias, e mais tarde também 
em células eucarióticas. Sanear também explicou os mecanismos moleculares subjacentes fotorreativação, a 
primeira forma de reparação do ADN descrito. 
 
 
Claes Gustafsson M. 
Professor de Química Médica e Biologia Celular da Universidade de Gotemburgo Membro do Comitê Nobel de 
Química