Apostila Prática Bioquímica

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DISCIPLINA DE BIOQUIMICA 
AULAS PRÁTICAS
PROFESSOR: MÁRCIO FRITZEN
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INTRODUÇÃO
A- Objetivos gerais das aulas práticas de Bioquímica
As aulas práticas de bioquímica tem como objetivo criar condições para que os estudantes sejam capazes, ao final do curso, de:
1. Manipular os equipamentos frequentemente utilizados em laboratório de bioquímica.
2. Conhecer por meio de reações efetuadas no laboratório, as propriedades químicas das substâncias que compõem os organismos vivos.
3. Interpretar resultados experimentais.
B - Normas do laboratório de Bioquímica
1. Balanças, espectrofotômetros, centrífugas, microscópios ou quaisquer outros aparelhos, somente deverão ser manuseados pelos alunos após instruções, a fim de se evitar danos irreparáveis.
2. Em dias e horas destinados aos trabalhos práticos, os estudantes terão à sua disposição professores encarregados de orientá-los na execução e interpretação dos referidos trabalhos.
3. Após o uso de um bico de gás, ou de água, não deixá-los abertos inutilmente, tomando o cuidado de fechar as torneiras completamente.
4. Não lançar nas pias quaisquer materiais, com exceção de água, para evitar a corrosão dos encanamentos.
5. Não lançar fósforos acesos nos locais destinados à coleta do lixo.
C - Material do estudante
Todo estudante deverá trazer, para o trabalho prático, o material abaixo relacionado:
Avental – necessário para proteger a sua roupa e lhe facultar desembaraço na execução das operações. Não será permitido a presença do aluno sem esse requisito.
Apostilas de aulas práticas – sem o qual é impossível realizar qualquer trabalho no laboratório.
Caneta para retroprojetor – para marcar adequadamente a vidraria durante a execução dos trabalhos práticos.
Material para anotações .
D - Apostila de aulas práticas
Constituída de roteiros para a execução do trabalho prático, com exposição completa das marchas das operações. O roteiro de cada trabalho prático deverá ser estudado previamente a fim de possibilitar a sua execução no laboratório. As dúvidas serão resolvidas antes do início dos trabalhos.
O roteiro consta dos seguintes itens:
1. Objetivos específicos que deverão ser alcançados após o término de cada aula.
2. Material necessário – relação do material à execução do trabalho.
3. Procedimento – etapas do trabalho a serem seguidas.
4. Interpretação – explicação sobre as reações, detalhes de técnicas ou cálculos empregados durante o trabalho prático.
E – Material recebido e sua limpeza
Cada grupo de estudante receberá o material necessário à execução do trabalho prático.
O aluno não deverá utilizar o material de seus colegas, a não ser com autorização prévia.
Será exigido dos estudantes o máximo cuidado com o seu lugar na bancada e com o respectivo material.
No caso de inutilização de algum material recebido, o estudante deverá dar conhecimento aos professores responsáveis pela aula, a fim de se providenciar a sua substituição.
O aluno não deverá jogar fora o material inutilizado ou quebrado, pois às vezes o mesmo poderá ser recuperado.
Terminado o trabalho, o estudante deverá proceder à limpeza de seu lugar, deixando-o em condições de ser utilizado novamente.
F – Reagentes
Para cada trabalho prático haverá à disposição dos estudantes, uma provisão dos reagentes relacionados nos roteiros.
Imediatamente após o uso, cada reagente deverá ser colocado em seu lugar próprio.
Deve-se tomar alguns cuidados com os vidros de reagentes e as soluções nele contidas, a fim de se evitar contaminações:
Não trocar as rolhas;
Não introduzir pipetas nas soluções padrões. Deve-se transferir um pouco de solução (volume aproximado ao que vai ser gasto) para tubo de ensaio ou Becker limpo e seco e somente então pipetar as quantidades indicadas;
Não restituir ao frasco original as soluções retiradas em excesso;
Caso seja autorizado pipetar diretamente do vidro de reagentes, usar sempre uma pipeta limpa;
G – Execução dos trabalhos práticos
Exige-se para todos os trabalhos práticos a mesma atenção, rigor técnico e disciplina.
A inobservância de qualquer dos requisitos técnicos pode induzir erros que invalidam, parcial ou totalmente, o trabalho realizado, não se levando em conta o desperdício de material, reagentes e tempo.
Para que o aluno alcance a eficiência desejada é necessário que o mesmo seja pontual, assíduo, ordeiro asseado e tenha conhecimento prévio do trabalho prático a ser executado.
H – Prevenção de acidentes
 
Trabalhar sempre protegido por avental.
Não fumar dentro do laboratório.
Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira de gás, antes que tenha a mão o palito de fósforo acesso.
Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter) nas proximidades de uma chama. 
Os reagentes tóxicos ou corrosivos, álcali ou ácidos fortes (quando concentrados), não deverão ser pipetados com a boca.
1 - Socorro de emergências
Vertigem
Não administrar nada por via oral enquanto o paciente estiver inconsciente, pois o mesmo não consegue deglutir, ocorrendo, portanto, perigo de sufocamento.
Evitar aglomeração e colocar o paciente em lugar arejado. É necessário que respire com o máximo de liberdade possível e ar bastante puro.
Caso necessário, afrouxar a roupa em volta do pescoço facilitando assim sua respiração.
Fazer inalação com hidróxido de amônia, não próximo ao nariz. Os vapores emitidos desta substância irritam a mucosa nasal e desperta o paciente mais rapidamente. Na falta de hidróxido de amônia, podemos usar com inalante: álcool, éter, clorofórmio, etc.
Lavar o rosto do paciente com água fria.
Sentar o paciente e conservá-lo com a cabeça baixa, até os joelhos, fazendo com que o mesmo tente levantá-la enquanto pressiona-se sua nuca. O recurso exposto ativa a circulação cerebral, oxigenando mais rapidamente as células do cérebro tornando assim mais rápida a recuperação.
Administrar, após verificar se o paciente consegue deglutir com facilidade, um estimulante (café quente, chá, etc...).
Encaminhar o paciente ao atendimento médico-hospitalar, quando necessário.
Hemorragia
Hemorragia = perda de sangue.
Hemostasia = É o conjunto de mecanismo através dos quais se consegue deter o processo hemorrágico. Significa, portanto, a detenção da perda de sangue. Dos mecanismos de hemostasia a coagulação é o principal deles.
Como atender uma pessoa com hemorragia?
Hemorragia nasal (rompimento de capilares)
a) Colocar o paciente com a cabeça inclinada para trás, para evitar o aumento do fluxo sanguíneo e facilitando a coagulação. 
b) Aplicar algodão ou gaze (estéreis) em bebidos em água gelada ao nível da mucosa nasal, sobre o nariz e na testa; a diminuição da temperatura contrai os capilares ajudando a formação do coágulo.
c) Apertar o nariz durante alguns segundos soltando em seguida; este artifício favorece à formação do coágulo.
d) Caso a hemorragia continue por mais 5 minutos, encaminhar ao atendimento médico hospitalar.
Hemorragia proveniente de veias
Aplicar gaze limpa e seca e apertar firmemente diminuindo assim o fluxo sanguíneo.
Comprimir com torniquete, quando o sangue fluir em grandes quantidades.
Obs: Nunca apertar muito o torniquete, e soltá-lo em pequenos intervalos voltando a comprimi-lo. Usar como torniquete tirar de pano ou borracha largar, nunca utilizar material fino como torniquete. Quando se aperta em demasia evitamos a oxigenação, por estar-se impedindo a circulação sanguínea, abaixo do torniquete, causando morte celular.
Quando a coagulação não for conseguida em pequeno espaço de tempo ou se a hemorragia for intensa encaminhar o paciente, ao atendimento médico-hospitalar.
Hemorragia proveniente de artéria
Quando o sangue fluir em golfadas indica, possivelmente, o rompimento de uma artéria.Deve-se comprimir firmemente o local seccionado, evitando ao máximo a perda de sangue.
Quando possível fazer torniquete (observar as normas anteriores).
Encaminhar com urgências o paciente ao hospital mais próximo.
3- Envenenamento
		Deve-se suspeitar de envenenamento quando:
A respiração apresentar-se com odor diferente do normal.
Lábios e bocas descorados.
Dor ou sensação de ardência na garganta.
Sempre que frascos com drogas e produtos tóxicos estiverem abertos, desnecessariamente.
Inconsciência, perturbação mental ou doença súbita, quando houve acesso a venenos.
O que fazer como primeiros-socorros?
		Rapidez é essencial. Devemos impedir que o organismo absorva o veneno.
Eliminar imediatamente o veneno da boca:
- Venenos ácidos: usar solução de bicarbonato de sódio a 5% ou leite de magnésio.
- Venenos alcalinos: usar solução de ácido acético a 5%
- Venenos salino: usar leite.
Quando o envenenamento ocorrer através de venenos desconhecidos, usar o “antídoto Universal”, o qual é utilizado para neutralizar a ação de venenos não identificados. É composto de:
Carvão ativo		2 partes
Óxido de magnésio	1 parte
Tanino		 1 parte
Misturar e administrar 15g em meio copo de água tépida
c) Não utilizar eméticos (substâncias que provocam vômitos), quando o envenenamento ocorrer com ácidos minerais, álcali cáustico e derivados do petróleo. Nestes casos usar:
- Purgantes minerais para venenos orgânicos e vice-versa.
- Diuréticos: chá, café fraco, citrato de potássio.
- Analgésicos: cloridrato de policarpina.
d) Não utilizar eméticos quando:
	
- A vítima estiver inconsciente.
- Estiver com convulsão.
- Estiver com a garganta queimada ou sejá estiver vomitando.
Levar imediatamente ao pronto socorro.
 
Envenenamento por gases
- Transferir a vítima para local arejado imediatamente, sem deixá-la andar.
- Aplique respiração artificial, boca a boca, caso a respiração estiver parada ou for irregular.
- Se a vítima estiver com convulsões, mantenha-a deitada na penumbra evitando barulho.
TRABALHO PRÁTICO Nº 01
A.Objetivos específicos
No final deste trabalho prático o estudante deverá saber:
1. Definir análise qualitativa e análise quantitativa.
2. Identificar pipeta, bureta, becker, balões volumétricos, e outras vidrarias usualmente	utilizadas em Laboratório de Bioquímica.
3. Usar pipetas e buretas.
4. Ler as graduações de pipetas e buretas.
5. Aquecer substâncias, em tubos de ensaio, sem risco de acidentes.
B. Análise qualitativa e quantitativa
Nas análises qualitativas o pesquisador procura determinar a qualidade do material a ser analisado, ou seja, a detecção de substâncias específicas. Exemplo: Análise qualitativa de glicose na urina verifica-se a existência ou não de glicose na urina, não importando a quantidade em que ela possa aparecer. Em testes qualitativos pode-se utilizar vidraria de menor precisão, como por exemplo, pipetas graduadas, béqueres, erlenmeyers, provetas, que dão medidas aproximadas.
Por outro lado, as análises quantitativas destinam-se à determinação, com o maior grau possível, a quantidade do material analisado. Nestes casos, interessa ao pesquisador obter a quantidade exata de uma determinada substância (glicose sanguínea), procurando evitar ao máximo, erros e interferências de outros compostos. Os materiais utilizados em análises quantitativas incluem aqueles de grande precisão, como pipetas volumétricas, balões volumétricos, buretas, que apresentam medidas mais exatas e permitem chegar o mais próximo possível dos valores reais.
C. Reconhecimento dos materiais de laboratório
O estudante deve conhecer o material que será utilizado no laboratório, saber manipulá-lo e ter conhecimento dos cuidados relativos à sua conservação.
1. Balão volumétrico – Podem ser de vidro comum ou pirex, com diversas capacidades. Medem um volume exato, a uma determinada temperatura, geralmente 20º C, podendo ser utilizados sem erro apreciável a 20º C ±8º C. Utilizados para o preparo de soluções. Por se tratar de equipamentos volumétricos aferido, não submetê-lo a altas temperaturas.
2. Bureta – São aparelhos para medidas precisas de volume frequentemente utilizados em titulações. Antes de ser usada, a bureta lavada com água corrente, em seguida, vária vezes com água destilada e depois três vezes com o líquido a ser medido. Não usar escova para lavar a bureta nem colocá-la na estufa para secar.
Modo de usar: encher a bureta de tal forma que não fiquem bolhas de ar no seu interior. Manter a bureta em posição vertical.
3. Pipetas – São aparelhos para medidas precisas de volume. Distinguem-se dois tipos fundamentais conhecidas como volumétricas e graduadas, ambas com diversas capacidades. Antes de serem usadas, devem ser lavadas com os mesmos cuidados indicados anteriormente para as buretas. Devem ser lavadas e enxaguadas com água destilada logo após o uso, principalmente quando se medir líquidos viscosos.
4. Proveta ou Cilindro graduado – Podem ser de vidro comum ou pirex com diversas capacidades. Utilizados para medir volumes com precisão de até 0,5%.
5. Becker – Geralmente de vidro pirex; diversas capacidades. São destinados a conter, e não medir volumes.
6. Frasco erlenmeyer – Geralmente de vidro pirex; diversas capacidades. São também destinados a conter volumes.
7. Tubo de ensaio – De vidro pirex ou comum, com ou sem orla, de diversos tamanhos. Utilizados para reações. Observação: Não aquecer os tubos de ensaio com a boca virada para si ou para outra pessoa, pois o líquido pode ser projetado para fora. Deve-se agitar continuamente, a fim de evitar que isto aconteça.
8. Funil de vidro – De colo curto ou longo, liso ou com ranhuras; diversos diâmetros. Usados para filtração simples ou na transferência de líquidos para recipiente de boca estreita.
9. Cápsula de porcelana – Diversas capacidades. Utilizadas para preparos de misturas, para evaporação e em alguns casos para titulações.
10. Bico de Bunsen – Possuem uma entrada para gás ajustável que permite regular a composição de mistura de gás com ar. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a entrada de gás antes de ter a mão à chama para acendê-lo. Nesta chama distinguem-se três zonas: uma neutra (sem combustão de gás o que é, portanto, relativamente fria); uma redutora (onde a combustão do gás é ainda incompleta ) e uma oxidante (onde se dá a combustão completa do gás).
D. Manipulação do material recebido
1. Medir soluções incolores e coradas com precisão em bureta e pipeta.
2. Medir volumes em balões e provetas.
3. Aquecer a água em erlenmeyers, beckeres e tubos de ensaio.
Trabalho prático nº02
 
Determinação de pH
Objetivos específicos
No final desse trabalho prático, o estudante deverá saber: 
1. Determinar o pH de soluções.
2. Reconhecer a capacidade tamponante das soluções.
3.Relacionar os conhecimentos adquiridos ao funcionamento dos tampões de importância biológica.
Fundamento:
Segundo as definições de Bronsted-Lowry, ácidos são substâncias que doam prótons, e bases aceitam prótons.
HCl + H2O � H3O+ + Cl-
Ácido Base Ácido conjugado da base H2O Base conjugada do ácido HCl
NH3 + H2O � NH4+ + OH- 
Base Ácido Ácido conjugado da Base NH3 Base conjugada do ácido H2O
Os ácidos podem ser classificados como ácidos fortes e fracos de acordo com a facilidade com que doam seus prótons em solução aquosa.
A água pode agirtanto como um ácido como uma base.
Tampões são sistemas aquosos que tendem a resistir às alterações no pH quando pequenas quantidades de ácido (H+) ou base (OH-) são adicionadas.
Definição de pH
É o potencial de hidrogênio iônico, que expressa a concentração de prótons em uma solução. Como os valores de concentração de prótons e íons hidróxido em soluções diluídas são muito pequenos, introduziu-se o termo pH como forma mais prática de expressar a concentração de prótons.
Então: pH
 pOH = 
 
Substituindo esses termos na equação do produto iônico da água.
 pH + pOH = 14
Determinação do pH de uma solução:
Para determinar o pH de uma solução, podemos usar certos compostos que tem capacidade de mudar de cor em função da [H+]. Esses compostos são conhecidos como indicadores ácido-base, que são ácidos fracos que mudam de cor se estão protonados ou desprotonados. 
Os papéis indicadores são papéis impregnados de um indicador ou de mais indicadores e são usados para determinação aproximada do pH.
O método potenciométrico é o mais preciso, para isso, é utilizado um aparelho chamado pHmetro, que consiste de um eletrodo de vidro e um sistema para medida de voltagem.
Procedimento experimental
	Tubo
	Amostra
	Volume
	HCl 
0,1 mol/L
	NaOH 
0,1 mol/L
	pH
	Classificação
	1
	Água destilada
	5,0
	-
	-
	
	
	2
	Água destilada
	5,0
	1 gota
	-
	
	
	3
	Água destilada
	5,0
	-
	1 gota 
	
	
	4
	Solução pH 7,0
	5,0
	-
	-
	
	
	5
	Solução pH 7,0
	5,0
	1 gota
	-
	
	
	6
	Solução pH 7,0
	5,0
	1 mL
	-
	
	
	7
	Refrigerante
	5,0
	-
	-
	
	
	8
	Solução de Alvejante doméstico
	5,0
	-
	-
	
	
Determinar o pH de cada tubo utilizando papel indicador e classificar as soluções de acordo com os resultados observados.
Trabalho prático nº03
Identificação de Aminoácidos
Objetivos específicos
No final desse trabalho prático, o estudante deverá saber: 
Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento de aminoácidos.
Reação com ninhidrina
A ninhidrina (hidrato de triceto-hidrindeno) é um composto heterocíclico que forma um derivado corado, após reagir com aminas, com os aminogrupos dos aminoácidos livres ou de terminações de proteínas e peptídeos. A ninhidrina oxida o aminoácido, produzindo CO2, NH3, e um derivado aldeídico com um átomo de carbono a menos e, consequentemente, reduzido. Posteriormente, a ninhidrina oxidada e reduzida reage com a amônia liberada formando um complexo violeta ou púrpura. Exceto o derivado da prolina, que é amarelo. As reações podem ser equacionadas da seguinte maneira:
Como a intensidade da coloração do complexo formado é proporcional à concentração de aminoácidos ou peptídeos, esta reação é frequentemente utilizada para determinação quantitativa de aminoácidos em solução.
Procedimento experimental
	Tubo
	Amostra/Concentração
	Volume ml
	Ninhidrina 0,1%
(gotas)
	1
	Água
	1,0
	5
	2
	Glicina 1,5mM
	1,0
	5
	3
	Prolina 1,5mM
	1,0
	5
	4
	Aspartame 0,19%*
	1,0
	5
	5
	Solução protéica
	1,0
	5
* Aspartame ( L-aspartil-fenilalanina metil éster), adoçante 200 vezes mais potente que o açúcar. Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 ml de água destilada.
Após a adição da ninhidrina, cobrir com papel alumínio e aquecê-los em banho-maria a 100º C por 3 minutos. Compare os resultados com o branco (tubo 1). Anote os resultados e explique-os.
Trabalho prático nº04
Caracterização de Proteínas
I – Introdução:
As proteínas, que são macromoléculas de peso molecular definido, são eletrólitos cujo comportamento se ajusta aos mesmos princípios físicos de eletrólitos de massa molecular menor. A natureza química dos radicais R (cadeias laterais) dos aminoácidos que compõe a estrutura primária das proteínas determinam a sua estrutura secundária e/ou terciária.
II – Objetivos específicos
No final deste trabalho prático o aluno estará familiarizado com as propriedades físico-químicas das proteínas, bem como com as técnicas e reações de identificação das mesmas.
III – Reação do Biureto
3.1 Fundamento
A reação do biureto ocorre com substâncias que contenham grupos –C=O e grupos nitrogenados. Sendo assim, essa reação é positiva para todas as proteínas e peptídeos graças às suas ligações peptídicas. Estas moléculas, quando tratadas com uma solução diluída de sulfato de cobre, em meio alcalino, dão coloração púrpura característica, devido à formação do complexo de coordenação entre o átomo de cobre e 4 átomos de nitrogênio.
3.2 - Procedimento
Montar uma bateria com:
	Tubos
	Amostra
	CuSO4 a 0,5%
ml
	NaOH a 10%
ml
	1
	Água, 2ml
	0,5
	0,5
	2
	Clara de ovo(a), 2ml
	0,5
	0,5
	3
	Leite(c),2ml
	0,5
	0,5
Observar que alguns tubos haverá formação de uma coloração violeta, característica da reação positiva, enquanto que no tubo contendo apenas água e os reagentes verificar-se-á uma cor azul escura característica do cobre em meio alcalino (formação de Cu(OH)2 e de óxidos de Cu(I).
IV) Reações de precipitação de proteínas com desnaturação
4.1) Termocoagulação – coagulação pelo calor
As proteínas são termolábeis, quando submetidas à ação do calor desnaturam irreversivelmente.
Procedimento 
Colocar em tubos de ensaio soluções contendo proteínas (ovo, soro, etc.).
Aquecer, e observar a coagulação.
4.2) – Precipitação com solventes orgânicos
Procedimento
Colocar em tubo de ensaio:
2ml de solução protéica
1ml de etanol
Notar a formação de um anel branco na separação das camadas.
V – Reações de precipitação de proteínas sem desnaturação
a) Salting In e Salting out.
5.1- Fundamento
Os sais neutros têm efeito pronunciado na solubilidade das proteínas globulares. Em baixa concentração os sais aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno chamado salting-in ou salting-out . A força iônica dos sais neutros depende tanto da sua concentração, como do número de cargas elétricas dos cátions e ânions que formam o sal. Por outro lado, em forças iônicas elevadas, uma proteína pode ser completamente precipitada de sua solução, efeito denominado dessalificação ou salting-out.
Salificação e dessalificação são processos importantes para separação de misturas de proteínas, uma vez que proteínas diferentes variam quanto a sua resposta à concentração de sais neutros. Os precipitados protéicos resultantes da dessalificação mantém sua conformação nativa e podem ser dissolvidos novamente, em geral sem haver desnaturação. Em soluções de solventes orgânicos elas sofrem desnaturação.
As proteínas apresentam os grupos carregados – COO- e NH3+ , que podem interagir eletrostaticamente uns com os outros; com íons pequenos de cargas opostas ou com a água são (hidrófilos). A força de atração eletrostática (F) entre as partículas de cargas opostas é dada pela equação:
F = e+ . e- / D.r2, onde:
						e+ e e- = são cargas 
						r = distância entre elas
						D = constante dielétrica do meio
A água tem constante dielétrica relativamente alta (78,54 a 25º C); enquanto que a do metanol é 32,4; do etanol e acetona é 19,6.
5.2- Procedimento
a) Salting-In
Pipetar 3ml de clara de ovo em um Becker;
Diluir com água destilada, mexendo com bastão de vidro até notar o aparecimento de um precipitado protéico.
Juntar em seguida uma solução de NaCl 1N até a redissolução do precipitado de proteínas não-desnaturadas.
b) Salting-Out
A 5ml de solução de proteínas adicionar lentamente sulfato de amônio ((NH4)2SO4) sólido, até saturação.
Forma-se um precipitado.
Filtrar ou centrifugar.
Separar sobrenadante e precipitado. Retirar uma pequena quantidade do precipitado do papel defiltro e adicionar 5ml de água. Observar o resultado.
Tomar 3 tubos de ensaio e adicionar ao primeiro 2ml de filtrado, ao segundo 2ml do precipitado que foi dissolvido em água e ao terceiro, 2ml de água destilada. Fazer o teste do Biureto nestes tubos.
Trabalho Prático nº 05
Enzimas 
Objetivos específicos:
Ao final deste trabalho prático o estudante deverá saber:
- Manipular experimentalmente soluções de enzimas;
- Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidade;
- Manipular reações catalisadas por enzimas com a finalidade de determinar semi-quantitativamente a influência da concentração de enzima, temperatura e do pH na atividade enzimática.
Procedimento experimental
Atividade da Catalase
 
Enzima presente em quase todas as células animais.
a) Em um tubo de ensaio colocar:
5 gotas de sangue.
5ml de água destilada-homogeneizar.
1ml de H2O2 3% (10 volumes) - agitar.
b) Note a formação de espuma abundante. Procure uma explicação para o fato. Esquematize a reação ocorrida.
2. Atividade da Peroxidase
A peroxidase é uma enzima encontrada em todas as plantas superiores, sendo rara em tecidos animais. As exceções são leucócitos, hemácias, fígado e rins.
a) Colocar em dois tubos de ensaio:
	Tubos
	Reativo Kastle-Meyer
ml
	Água
ml
	Sangue diluído
ml
	H2O2 3%
gotas
	1
	1,0
	-
	5,0
	3
	2
	1,0
	5,0
	-
	3
b) Note o aparecimento imediato de cor rosa, que se intensifica, lentamente, no tubo que contém sangue.
Obs.: O reativo de Kastle-Meyer é uma solução alcalina de fenolftaleína reduzida (AH2), que oxida diidroxifenóis na presença de H2O2, formando a quinona correspondente. Não sendo oxidada pelo peróxido de hidrogênio (H2O2), nem pelo oxigênio molecular (O2). O sangue contém peroxidase, que transfere dois átomos de hidrogênio do substrato (AH2) para H2O2, que é convertido em H2O, oxidando assim a fenolftaleína, que adquire coloração rósea, em meio alcalino.
 
 AH2		 +	 H2O2	 →		2H2O	 +	 A+
Fenolftaleína reduzida							 fenolftaleína oxidada
Trabalho prático nº 06
Identificação de Carboidratos
Introdução
Os carboidratos podem ser identificados por meio de várias reações. Algumas dessas reações envolvem a formação de complexos corados, e a especificidade da identificação depende da estrutura dos carboidratos. Assim, há reações gerais e outras para estruturas mais específicas, como aquelas para aldoses, cetonas, mono e dissacarídeos redutores, etc.
Objetivos específicos
No final deste trabalho prático, o estudante deverá saber:
- Executar testes qualitativos para reconhecimento de carboidratos.
- O significado dos seguintes testes: Seliwanof e Benedict.
1. Reação de Seliwanoff
Na presença de HCL, as cetoses, mais rapidamente do que as aldoses, formam derivados de furfural que se condensam com o reagente de Seliwanoff, que contém resorcinol (1,3-benzenodiol), produzindo compostos avermelhados. A reação exige aquecimento em banho fervente, e é positiva para sacarose que, nas condições do teste, é hidrolisada em glicose e frutose. Mesmo a glicose pode dar reação positiva, se o aquecimento for prolongado, porque na presença de HCL, ocorre a sua transformação em frutose. A concentração do HCL na reação não deve ultrapassar 12% (aproximadamente 4 N).
A reação que ocorre é a seguinte:
Procedimento experimental
Preparar 5 tubos de ensaio:
	Tubos
	Amostra
	Volume
ml
	Selliwanoff (Resorcinol 0,05% em HCL 2N)
ml
	1
	Água
	0,5
	3,0
	2
	Frutose 0,1M
	0,5
	3,0
	3
	Glicose 0,1M
	0,5
	3,0
	4
	Sacarose 0,1M
	0,5
	3,0
	5
	Pentose 0,1M
	0,5
	3,0
Após misturar o conteúdo dos tubos, colocar em banho de água fervente, e acompanhar o desenvolvimento da cor a cada 2 ou 3 minutos, até no máximo 15 minutos.
Quando notar o aparecimento de cor vermelha, acompanhada ou não de precipitado de cor marrom avermelhado, retirar o tubo do banho. Para dissolver o precipitado eventualmente formado, acrescente algumas gotas de etanol absoluto, agitando o tubo. Anotar os resultados obtidos, lembrando-se sempre de usar o tubo 1 (controle ) como referência.
2. Reação de Benedict
Utilizada para identificação de carboidratos redutores. Íons de metais como, cobre, prata, ferro, mercúrio, etc. são reduzidos por grupos aldeídicos ou cetônicos livres de vários carboidratos. Colocando-se hidróxido de cobre II, Cu (OH)2, de cor azul, em meio alcalino, forma-se uma suspensão que, sob aquecimento, se precipita como óxido de cobre II, CuO de cor preta. Mas se compostos redutores forem acrescentados à suspensão, o Cu (OH)2 é reduzido a Cu2 O, que se precipita e cuja cor se situa entre o amarelo e o vermelho. As reações abaixo mostram o que ocorre o Cu (OH)2 na presença e na ausência de agentes redutores, em meio alcalino e a quente.
Ausência de composto redutor:
			 Meio alcalino
Cu(OH)2 → CuO + H2O
(azul)	 aquecimento	 (preto)
Presença de composto redutor:
 
			 Meio alcalino
Cu(OH)2 → Cu2O + H2O
(azul)	 aquecimento	 (amarelo/vermelho)
Como não é prático utilizar uma suspensão de Cu2+, e também para se evitar que o CuO(preto) mascare o resultado da reação, acrescenta-se ao meio da reação um composto orgânico solubilizador que, em meio alcalino, adequado, reage com os íons metálicos, formando um complexo iônico solúvel. Este complexo se dissocia em grau suficiente para que haja, no meio da reação, íons metálicos disponíveis para se reduzirem. No caso do reagente de Fehling, emprega-se CuSO4 2% solubilizado por tartarato de Na+ e de K+ 10%.
Dissolvido em NaOH 2 M; no caso de reagente de Benedict (qualitativo), emprega-se CuSO4 2% solubilizado por citrato de Na+ 20%, dissolvido em Na2CO3 2M.
Os testes de carboidratos redutores são positivos para compostos com grupamento OH glicosídico livre, mas negativos para polímeros de cadeias longas. Assim, amido não dá reação positiva, a não ser após a sua hidrólise, e a reação é tanto mais positiva quanto maior a extensão da hidrólise.
Até alguns anos atrás, os testes de substâncias redutoras, sobretudo na urina, era empregado no diagnóstico de pacientes diabéticos, ou suspeito de sê-lo, de modo rotineiro. Atualmente, há testes mais sensíves para dosagem rápida de glicose, baseadas em ensaio enzimático (glicofita/glicose-oxidase) e que são muito mais práticos, por não exigirem a disponibilidade dos reagentes mencionados.
Procedimento experimental
Identificação de substâncias redutoras com reagentes de Benedict (qualitativo).
Preparar 5 tubos de ensaio:
	Tubo
	Amostra
	Volume
ml
	Reagente de Benedict
ml
	Resultado
	1
	Água
	1,0
	1,0
	
	2
	Glicose 0,1M
	1,0
	1,0
	
	3
	Frutose 0,1M
	1,0
	1,0
	
	4
	Sacarose 0,1M
	1,0
	1,0
	
	5
	Amido 0,1%
	1,0
	1,0
	
Aquecer todos os tubos em banho de água fervente, durante 5 minutos. Anotar os resultados obtidos (se positivo, numa escala de 1 a 4 cruzes, + a ++++), comparando com o tubo 1 ( controle). Explique os resultados obtidos.
Trabalho prático n° 07
Caracterização de Lipídeos
Procedimento experimental
1. Solubilidade
Em uma bateria de 9 tubos de ensaio numerados, colocar 3 gotas de óleo vegetal em cada um e adicionar 3ml de:
1. Água
2. HCL a 4%
3. Na2CO3 a 2%
4. NaOH a 10%
5. Gasolina (mistura de hidrocarbonetos)
7. Álcool
Agitar vigorosamente e verificar:
a) insolubilidade no 1º e 2º tubos.
b) emulsão estável no 3º, 4º e 6º tubos.
c) solubilidade total no tubo5.
Juntar mais 20 gotas de óleo nos tubos contendo:
5. Gasolina
Observar a grande solubilidade do óleo nesses solventes.
Trabalho prático n° 08
Aula prática - Fermentação alcóolica:
Processo de fermentação
Objetivo: 
Observar as células de leveduras Sacharomyces cerevisae incubadas em diferentes condições. 
Material:
- células de Sacharomyces cerevisae (Fermento biológico seco).  Pesar 5g/ erlenmeyer
- agitador de bandeja
- solução de sacarose 10% ou glicose 10%
- erlenmeyer de 250ml e balões de borracha
 
Procedimento (4 erlenmeyers):
Erlenmeyer 1: Adicionar 5g de S. cerevisae (fermento biológico) e 50 mL de solução de glicose 10%. Vedar a saída de ar com um balão. Aquecer em banho maria 75 graus por 15 minutos. Agitar com frequência.
Erlenmeyer 2: Adicionar 5g de S. cerevisae (fermento biológico) e 50 mL de solução de glicose 10%. Vedar a saída de ar com um balão. Deixar sobre a bancada por 15 minutos. Agitar com frequência.
Erlenmeyer 3: Adicionar 5g de S. cerevisae (fermento biológico) e 50 mL de água destilada. Vedar a saída de ar com um balão. Deixar sobre a bancada por 15 minutos. Agitar com frequência.
Erlenmeyer 4: Adicionar apenas 50 mL de solução de glicose 10%. Vedar a saída de ar com um balão. Deixar sobre a bancada por 15 minutos. Agitar com frequência.
Observar os resultados, solicitar relatório e/ou distribuir questionário.
 	
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