Tecnologia_da_Biologia_Celular_e_Molecular

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Tecnologia da Biologia Celular e Molecular
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Confecção de cortes para estudo nos microscópios óptico e eletrônico
Mesmo se podendo observar células vivas ao microscópio, há vantagens em se obter uma lâmina permanente onde as células ficam preservadas, isto é, fixadas e coradas, para melhor demonstração de seus componentes.
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Uma lâmina fixada deveria mostrar as células com a mesma estrutura microscópica e composição química que possuíam quando vivas. Entretanto, isto não é possível e todos os preparados apresentam artefatos, que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas. 
1a etapa  Fixação
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Finalidades:
evitar a autólise, que é a destruição da célula por suas próprias enzimas;
impedir a atividade e a proliferação de bactérias;
endurecer as células para que elas resistam melhor às etapas seguintes da técnica;
aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na microscopia óptica e aumentar o contraste na microscopia eletrônica.
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Química da fixação: complexa e pouco conhecida. Formol e aldeído glutárico (glutaraldeído) fixam as células (combinam com os grupamentos amínicos das proteínas). 
O tetróxido de ósmio e o glutaraldeído são os fixadores mais usados em microscopia eletrônica, porque coagulam proteínas, causando modifica-ções mínimas na estrutura celular.
Cada fixador simples apresenta certos inconve-nientes e algumas qualidades desejáveis. 
Por isso foram elaboradas as misturas fixa-doras: proporções variáveis dos fixadores simples para compensar-lhes as deficiências.
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2a etapa  Microtomia 
Técnica que usa um aparelho para efetuar cortes de tecidos em fatias finas para exame no microscópio, o micrótomo. 
O fragmento de tecido fixado é geralmente protegido por um material que o envolve e nele penetra, e que deve possuir propriedades físicas que facilitem o corte. 
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Cortes para MO  devem ser incluídos em parafina ou em resinas plásticas especiais.
Cortes para ME  devem ser incluídos em resinas mais duras, como as do tipo epóxi (Araldite, Epon).
Obs.: Os micrótomos que cortam tecidos incluídos em parafina utilizam navalhas de aço, e os que cortam tecidos incluídos em resinas usam navalham de vidro ou de diamante.
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3a etapa  Coloração 
Organelas e inclusões são quase sempre transparentes e incolores (dificulta seu estudo microscópico). 
Foram criados numerosos processos de coloração que tornam visíveis os diversos componentes celulares.
Há corantes básicos (+) que coram estruturas ácidas. Ex.: hematoxilina, azul-de-toluidina e azul-de-metileno 
Há corantes ácidos (-) que coram estruturas básicas ou alcalinas. Ex.: eosina, orange G e fucsina ácida.
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O Microscópio Óptico 
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A ampliação total dada por um microscópio é igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular.
Poder de resolução: é a capacidade de separar detalhes em um sistema óptico. É expresso pelo limite de resolução → menor distância entre dois pontos para que eles apareçam individualizados. 
O Microscópio Óptico 
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Microscópio de Polarização 
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Microscópio de Polarização
É semelhante ao MO comum, acrescido de dois prismas ou dois discos polaróides. 
Um desses elementos é colocado no condensador e funciona como polarizador; o outro é colocado na ocular e é chamado analisador. 
A função do polarizador é iluminar a célula com um feixe de luz polarizada. O analisador verifica o efeito das estruturas celulares sobre o feixe polarizado. 
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Microscópio de Contraste de Fase 
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Microscópio de Contraste de Fase
É dotado de um sistema óptico especial que transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade. Assim, as diferenças de fase, para as quais o olho não é sensível, tornam-se visíveis, pois são traduzidas em diferenças de intensidade luminosa, facilmente perceptível. 
O microscópio de contraste de fase pode ser usado de modo que as estruturas celulares apareçam, escuras (fase positiva) ou claras (fase negativa). 
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Microscópio de Contraste de Fase
As estruturas celulares têm quantidades diversas de matéria e causam atrasos diferentes na luz que as atravessa.
 O microscópio de contraste de fase é empregado em especial para o estudo de células vivas. É de grande utilidade para a observação de células cultivadas, cujo crescimento e divisão mitótica podem ser facilmente seguidos sem o emprego de corantes. 
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Microscópio Confocal 
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Microscópio Eletrônico 
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Microscópio Eletrônico
Visualização de estruturas celulares não visíveis no microscópio óptico → poder resolutivo é muito maior. 
Emprega feixes de elétrons que, acelerados, têm um comprimento de onda de 0,005 nm. 
Ainda não se consegue aproveitar inteiramente a capacidade resolutiva do ME por causa das dificuldades em preservar as células e, sobretudo, em obter cortes extremamente finos, imprescindíveis para o máximo de resolução. 
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Citoquímica 
Compreende técnicas diversas para a identificação e localização das moléculas que constituem as células. 
Ácido desoxirribonucléico (DNA)  o DNA é demonstrado citoquimicamente pela reação de Feulgen, técnica específica para o DNA e, como a intensidade de cor vermelha que se forma é proporcional à concentração de DNA, ela permite o estudo quantitativo deste ácido nucléico. Graças a esse processo, descobriu-se que a quantidade de DNA é fixa para cada espécie (se duplica na intérfase, e, ao entrar na prófase, a célula já contém uma quantidade dupla de DNA).
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Ácido ribonucléico (RNA) o estudo citoquímico do RNA é baseado em sua basofilia e nas propriedades da enzima ribonuclease, que ataca exclusivamente o RNA.
Catecolaminas o formaldeído reage com as catecolaminas produzindo compostos fluorescentes. Deste modo, é possível a localização citoquímica das catecolaminas adrenalina e noradrenalina.
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Proteínas  reações para demonstração das proteínas totais das células são baseadas em técnicas que identificam aminoácidos. Entre estas técnicas estão a de Millon, que tirosina; a do diaminoazobenzeno, para triptofano; e a de Sakaguchi para arginina. 
Polissacarídeos  um exemplo é a técnica para evidenciação do glicogênio, conhecida como técnica do PAS (Periodic Acid Schiff). A reação baseia-se na oxidação, pelo ácido periódico, de grupamentos OH vizinhos, formando grupamentos aldeídicos que dão cor vermelha com o reativo de Schiff (fucsina básica descorada pelo anidrido sulfuroso). 
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Enzimas  algumas vezes, para impedir que o fixador inative a enzima, é preciso usar cortes de tecidos não fixados, obtidos por congelação. As desidrogenases e as fosfatases são exemplos de enzimas demonstráveis citoquimicamente. As desidrogenases retiram o H de um substrato, transferindo-o para outro composto. As fosfatases ácidas são enzimas que hidrolisam ésteres do ácido fosfórico em pH ácido. 
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Microscopia de Fluorescência 
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É geralmente aplicada com técnicas citoquímicas. As substâncias fluorescentes gozam da propriedade de emitir luz quando excitadas por radiações de certos comprimentos de onda.
 
Alguns constituintes celulares são fluorescentes e podem ser identificados e localizados por meio da microscopia de fluorescência.
 
Utilizam-se também corantes fluorescentes que se combinam e identificam certas substâncias não-fluorescentes. 
Um dos corantes fluorescentes mais usados é o alaranjado-de-acridina, que se combina com os ácidos nucléicos, permitindo a sua localização. 
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Imunocitoquímica 
Tem técnicas que permitem o estudo da localização intracelular de proteínas específicas.
A imunocitoquímica se baseia na reação antígeno-anticorpo.
Pode ser direta ou indireta. 
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Imunocitoquímica direta 
Consiste em se injetar um antígeno no indivíduo para que ele forme uma gamaglobulina (anticorpo) com a propriedade de se combinarem
(reação antígeno-anticorpo). A seguir, utiliza-se marcadores que podem ser evidenciados por reações citoquímicas específicas e apropriadas. 
Os marcadores mais utilizados são a peroxidase (forma um composto corado e elétron-denso), ou um corante fluorescente (utiliza-se o microscópio de fluorescência), ou a ferritina (muito elétron-densa, vista ao ME). 
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Imunocitoquímica indireta 
Nesta técnica a marcação é colocada em um antianticorpo, isto é, uma antigamaglobulina.
A técnica indireta utiliza dois anticorpos: a gamaglobulina, obtida através da injeção do antígeno, e a antigamaglobulina, obtida pela injeção de gamaglobulina em um novo indivíduo. 
A antigamaglobulina pode ser evidenciada por conjugação com substâncias fluorescentes, ferritina ou peroxidase. 
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Cromatografia em Coluna 
Baseia-se no fato de que, quando se faz uma mistura de proteínas dissolvidas em água passar por uma coluna constituída por uma matriz sólida e porosa, contida num tubo de vidro.
A velocidade de migração das diferentes proteínas varia conforme a interação de cada uma delas com a matriz. 
Mantendo-se um fluxo contínuo de proteínas, que sai pela parte inferior da coluna, podem-se coletar separadamente as proteínas contidas na amostra inicial.
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 Natureza do grau e do tipo de interação das proteínas com a matriz da coluna
a) interação de troca iônica –a matriz é constituída por partículas com carga positiva ou negativa e na qual a separação das proteínas depende das cargas elétricas na superfície de suas moléculas;
b) interação hidrofóbica – as partículas da matriz apresentam superfície hidrofóbica, retardando a migração das proteínas hidrofóbicas, que têm afinidade pelas partículas da matriz;
c) filtração em gel – a matriz atua apenas como peneira, por onde as proteínas migram com velocidade variável, dependendo do tamanho e da forma de suas moléculas;
d) interação por afinidade – muitas moléculas biológicas interagem com alto grau de especificidade, Ex.: enzimas e seus substratos, certos segmentos de DNA e RNA e antígenos e anticorpos. 
A técnica é muito usada para purificação de anticorpos.
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Eletroforese em gel de poliacrilamida 
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É uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.
A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.
Eletroforese em gel de poliacrilamida 
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Radioautografia 
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Radioautografia
Técnica citoquímica para a detecção de isótopos radioativos. 
Baseia-se na sensibilidade das emulsões fotográficas às radiações ionizantes. 
Como não existem átomos radioativos nas células, pela radioautografia, podem-se seguir, a incorporação e a migração de compostos radioativos introduzidos nas células com finalidades experimentais. 
Pode ser usada tanto para a MO como para o ME. 
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Centrifugação 
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Centrifugação 
Permite o fracionamento celular e a obtenção de frações relativamente puras de organelas. As organelas são separadas de um homogeneizado pela centrifuga-ção de células em que as MP são rompidas e os constituintes celulares dispersos em um meio líquido, geralmente contendo sacarose, evita a tendência de as organelas se aglutinarem quando as células se rompem.
 
 
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 O isolamento de uma organela através da centrifugação depende do seu coeficiente de sedimentação, isto é, do seu tamanho, forma e densidade, bem como da densidade e viscosidade da solução em que está sendo centrifugada.
 Em geral utiliza-se a centrifugação fracionada, que consiste em uma série de centrifugações a velocidades crescentes. As organelas ou inclusões maiores e mais densas sedimentam primeiro, e o sobrenadante de cada centrifugação é centrifugado de novo, porém com velocidade maior. 
Centrifugação