AULA 1 MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA

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CITOLOGIA E HISTOLOGIA GERAL
AULA 1 – MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA
1. INTRODUÇÃO
Histologia é o estudo das células e dos tecidos do corpo e de como essas estruturas se organizam para constituir os órgãos. Em razão das pequenas dimensões das células, seu estudo é realizado com auxílio de microscópios. Neste capítulo, esses instrumentos serão apresentados, e também serão abordadas algumas maneiras usadas para preparar as células, os tecidos e os órgãos para análise microscópica. Além disso, serão descritas algumas das metodologias mais utilizadas para investigar a função e o metabolismo dessas estruturas.
2. PREPARAÇÃO DE ESPÉCIMES PARA EXAME MICROSCÓPICO
A pequena dimensão das células e dos componentes da matriz extracelular (MEC) contida entre as células faz com que a histologia dependa do uso de microscópios. Pesquisas em química, fisiologia, imunologia e patologia são fundamentais para um conhecimento adequado da biologia das células, dos tecidos e dos órgãos e de como seus vários componentes interagem na saúde e na doença. Conhecer as ferramentas e os métodos de investigação também é essencial para a compreensão adequada da estrutura e do funcionamento das células, dos tecidos e dos órgãos.
O procedimento mais usado no estudo de tecidos ao microscópio de luz consiste na preparação de cortes histológicos. No microscópio de luz (também chamado de microscópio óptico ou fotônico), a imagem se forma a partir dos raios luminosos de um feixe de luz que atravessou uma estrutura. Células vivas, camadas muito delgadas de células ou de tecidos, membranas transparentes de animais vivos (p. ex., o mesentério, a cauda de um girino, a parede de uma bolsa existente na bochecha de hamsters) podem ser observadas diretamente ao microscópio. Dessa maneira, é possível estudar essas estruturas por longos períodos sob diferentes condições fisiológicas ou experimentais. Em contrapartida, na maioria dos casos os tecidos e órgãos são espessos e não possibilitam a passagem adequada da luz para a formação de uma imagem. Por essa razão, antes de serem examinados ao microscópio, eles devem ser fatiados em secções ou cortes histológicos muito delgados que são colocados sobre lâminas de vidro. Os cortes são obtidos por meio de instrumentos de grande precisão chamados micrótomos, mas antes os tecidos e órgãos necessitam passar por uma série de tratamentos que serão descritos a seguir.
FIXAÇÃO
Logo após sua remoção do corpo, células ou fragmentos de tecidos e órgãos devem ser submetidos a um processo chamado fixação, que tem várias finalidades: evitar a digestão dos tecidos por enzimas existentes nas próprias células (autólise) ou em bactérias; endurecer os fragmentos; preservar em grande parte a estrutura e a composição molecular dos tecidos. A fixação pode ser feita por métodos químicos ou, menos frequentemente, por métodos físicos (ver mais adiante). Na fixação química, os tecidos são imersos em soluções de agentes desnaturantes ou de agentes que estabilizem as moléculas ao formar pontes com moléculas adjacentes. Essas soluções são chamadas de fixadores. Como demora algum tempo para que o fixador se difunda de maneira rápida e completa pelo interior dos fragmentos, um grande fragmento deve ser cortado em outros menores antes de ser imerso no fixador. Dessa maneira, torna-se mais fácil a penetração do fixador no fragmento e garante-se melhor preservação da sua estrutura. De modo alternativo, pode ser utilizada a perfusão intravascular do fixador, o qual, então, alcança o interior dos tecidos rapidamente pelos vasos sanguíneos, resultando em uma fixação melhor.
Um dos fixadores mais usados para microscopia de luz é uma solução de formaldeído a 4%; outro fixador bastante utilizado é o glutaraldeído. Em virtude da alta resolução oferecida pelo microscópio eletrônico, é necessário um cuidado muito maior na fixação para melhor preservar detalhes da ultraestrutura das células e da matriz. Para essa finalidade, uma fixação dupla, usando uma solução de glutaraldeído tamponado, seguida por uma segunda fixação em tetróxido de ósmio, que preserva e fornece contraste aos lipídios e proteínas, tornou-se o procedimento padrão para estudos ultraestruturais.
INCLUSÃO
Para obter secções delgadas com o micrótomo, os fragmentos de tecidos e órgãos devem, após a fixação, ser infiltrados com substâncias que lhes proporcionem uma consistência rígida. As substâncias mais utilizadas para esse fim são a parafina e algumas resinas de plástico. A parafina é habitualmente utilizada para microscopia de luz, e as resinas, para microscopia de luz e eletrônica.
O processo de impregnar os tecidos com parafina é chamado inclusão ou embebição em parafina e geralmente é precedido por duas etapas: desidratação e clareamento. A água contida nos tecidos é inicialmente extraída pela passagem dos fragmentos por diversos banhos de soluções de concentrações crescentes de etanol (normalmente desde etanol 70% em água até etanol 100%). Após a desidratação, o etanol dos fragmentos deve ser substituído por uma substância intermediária (geralmente um solvente orgânico), que é miscível tanto em etanol como no meio que foi escolhido para inclusão (parafina ou resina). Para a inclusão em parafina, as substâncias intermediárias mais comumente usadas são o xilol e o toluol. Quando os fragmentos de tecidos são embebidos no solvente orgânico, eles ficam transparentes ou translúcidos. Em seguida, são colocados em parafina derretida (56 a 60°C). O calor causa a evaporação do solvente orgânico, e os espaços existentes dentro dos tecidos tornam-se preenchidos com parafina. Depois de os fragmentos serem retirados da estufa, a parafina solidifica e eles se tornam rígidos. Os blocos de parafina que contêm os tecidos são então levados a um micrótomo (Figura 1.1), onde são seccionados por uma lâmina de aço ou de vidro, de modo a fornecer cortes de 1 a 10 micrômetros de espessura. Lembre-se de que: um micrômetro (1 μm) = 0,001 mm = 10–6 m; um nanômetro (1 nm) = 0,001 mm = 10–6 mm = 10–9 m. Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar sobre uma superfície de água aquecida e, depois, sobre lâminas de vidro, onde aderem e serão, em seguida, corados.
	FIXAÇÃO FÍSICA POR CONGELAÇÃO
	Um modo completamente diferente de preparar secções de tecidos ocorre após submeter os tecidos a um congelamento rápido; dessa maneira, os tecidos são fixados por congelação, um método físico de fixação, tornando-se rígidos e, assim, prontos para serem seccionados. Um micrótomo para tecidos congelados – o criostato ou criomicrótomo – foi desenvolvido para a produção de cortes de tecidos congelados. Uma vez que esse método possibilita a preparação rápida de cortes sem passar pelo longo procedimento de desidratação e inclusão descrito anteriormente, ele é habitualmente utilizado em hospitais para que seja possível analisar, em poucos minutos, espécimes obtidos durante procedimentos cirúrgicos. São os assim chamados “cortes por congelação”. Congelar tecidos é também muito útil para o estudo histoquímico de enzimas e de outras proteínas em cortes histológicos; isso porque o congelamento, ao contrário da fixação química, não inativa a maioria das enzimas e mantém muitas proteínas em suas conformações naturais e em seus locais originais. Quando se deseja estudar lipídios contidos nos tecidos, aconselha-se o uso de secções congeladas, já que a imersão de tecidos em solventes como xilol dissolve essas substâncias.
	COLORAÇÃO
	Para ser estudada ao microscópio, a maioria dos cortes histológicos deve ser corada, porque, com poucas exceções, os tecidos são incolores. Com essa finalidade, foram desenvolvidos métodos de coloração que tornam evidentes os vários componentes dos tecidos, das células e da MEC. A seletividade com que os corantes coram os componentes dos tecidos pode ser maior ou menor. Muitos corantes se comportam como substâncias de caráter ácido ou básico e tendem a formar ligações eletrostáticas (salinas) com componentes ionizados dos tecidos. Os componentes dos tecidos que se coram bem com corantesbásicos são chamados de basófilos, e os que têm grande afinidade com corantes ácidos, de acidófilos.
O azul de toluidina e o azul de metileno são exemplos de corantes básicos. Outros corantes, como a hematoxilina, comportam-se como corantes básicos e se ligam às estruturas basófilas das células e dos tecidos. Os principais componentes dos tecidos que reagem com corantes básicos o fazem por conter ácidos na sua composição – ácidos nucleicos, glicosaminoglicanos e glicoproteínas ácidas. Por outro lado, corantes ácidos (tais como orange G, eosina, fucsina ácida) coram principalmente os componentes acidófilos dos tecidos, como, por exemplo, mitocôndrias, grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno.
Dentre todos os corantes, a combinação de hematoxilina e eosina (HE) é a mais comumente utilizada. A hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo das células e outras estruturas ácidas (tais como porções do citoplasma ricas em ácido ribonucleico [RNA] e a matriz extracelular da cartilagem hialina). A eosina, por outro lado, cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa. Muitos outros corantes são usados além da HE, como os tricrômicos (p. ex., os corantes de Mallory e de Masson). Os tricrômicos, além de mostrarem muito bem o núcleo e o citoplasma, ajudam a diferenciar colágeno de músculo liso. Uma técnica especialmente boa para observar e diferenciar colágeno é o uso do corante picrosirius associado a luz polarizada. Embora a maioria dos corantes seja útil para visualizar os vários componentes dos tecidos, eles normalmente oferecem pouquíssima informação sobre a natureza química dos componentes dos tecidos.
Em muitos procedimentos, os resultados de uma reação são evidenciados por um precipitado ou por um corante fluorescente, mas as células e os seus limites não são visíveis. Nesse caso é usado um contracorante – trata-se de um corante aplicado a um corte apenas para tornar possível a visualização das células ou dos núcleos. Outra maneira de evidenciar componentes de células e tecidos é a sua impregnação por metais, como prata e ouro, método muito usado para estudar tecido nervoso.
O procedimento inteiro, desde a fixação até a observação de um tecido em um microscópio de luz, pode demorar de 12 horas a 2 dias, dependendo do tamanho do tecido, do fixador e do meio de inclusão utilizados.
3. Microscopia de luz
Ao microscópio de luz (também chamado microscópio óptico), as preparações coradas são examinadas por iluminação que atravessa o espécime (transiluminação). O microscópio de luz é composto de partes mecânicas e ópticas (Figura 1.2). O componente óptico consiste em três sistemas de lentes: condensador, objetivas e oculares. O condensador concentra a luz de uma lâmpada e projeta um feixe luminoso sobre o espécime. A objetiva recebe a luz que atravessou o espécime e projeta uma imagem aumentada do espécime em direção à ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta na retina, em uma tela, em uma câmera fotográfica ou em um detector eletrônico. No caso das imagens projetadas na retina, a ampliação total é calculada multiplicando-se o aumento da objetiva pelo aumento da ocular.
	RESOLUÇÃO
	O que se deseja em um microscópio é uma imagem aumentada e com muitos detalhes. O fator mais crítico para a obtenção de uma imagem aumentada e com muitos detalhes é o parâmetro chamado poder de resolução. Este pode ser definido como a menor distância entre duas partículas ou entre duas linhas, distância essa que possibilita que elas sejam vistas como dois objetos separados. O poder de resolução máximo do microscópio de luz (também chamado de resolução ou limite de resolução) é de aproximadamente 0,2 μm; essa resolução torna possível a obtenção de boas imagens aumentadas até 1.000 a 1.500 vezes. Objetos menores ou mais delgados que 0,2 μm (como, por exemplo, a membrana da célula ou um filamento de actina) não podem ser distinguidos com esse instrumento. Da mesma maneira, dois objetos, como, por exemplo, duas mitocôndrias ou dois lisossomos, serão vistos como um só objeto se eles estiverem separados por menos de 0,2 μm. Portanto, o que determina a riqueza de detalhes da imagem é o limite de resolução de um sistema óptico, e não seu poder de aumento. O aumento só tem valor prático se for acompanhado de resolução. A resolução depende essencialmente da objetiva, pois a lente ocular apenas aumenta a imagem nela projetada pela objetiva.
A área de atuação da microscopia tem sido ampliada pelo uso de videocâmeras de alta sensibilidade e resolução, que tornam possível a digitalização de imagens que podem ser usadas em computadores para análise quantitativa por meio de aplicativos de análise de imagem. Objetos que não são visíveis diretamente pela ocular podem ser visualizados por uma videocâmera. Esses sistemas também são úteis para estudar células vivas por períodos longos, porque usam luz de baixa intensidade e evitam o dano celular que pode resultar de uma iluminação intensa.
4. Microscopia de contraste de fase e de contraste diferencial de interferência
Alguns sistemas ópticos possibilitam a observação de células e cortes não corados. Espécimes biológicos não corados são geralmente transparentes e difíceis de serem observados com detalhes, pois todas as partes do espécime têm quase a mesma densidade óptica. Em contrapartida, o microscópio de contraste de fase usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de objetos quase transparentes (Figura 1.3 A e B). Outra metodologia utilizada para observar células ou secções de tecidos não corados é a microscopia de contraste diferencial (microscopia de Nomarski), que produz uma imagem aparentemente tridimensional (Figura 1.3 C). Essas imagens são sempre vistas em preto, branco e tons de cinza.
 
FIGURA 1.3 Células da crista neural foram cultivadas e examinadas por meio de três sistemas ópticos diferentes. O preparado não está corado e as mesmas células aparecem em todas as fotografias – use as duas células pigmentadas para orientar-se em cada imagem. A. Microscopia de luz convencional. B. Microscopia de contraste de fase. C. Microscopia de diferença interferencial de contraste segundo Nomarski. (A, B e C. Grande aumento. Cortesia de S. Rogers.)
5. Microscopia confocal
Infelizmente a imagem fornecida pelos microscópios não costuma ser composta de um único plano muito delgado do corte. Geralmente, há superposição de vários planos, os quais aparecem em foco simultaneamente, causando certo grau de deterioração da imagem. Para resolver esse problema, foi desenvolvido o microscópio confocal, que torna possível focalizar um plano muito delgado do espécime.
	Os fundamentos desse microscópio são:
· O espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito
· A imagem coletada do espécime deve passar por um orifício muito pequeno.
A consequência desse arranjo é que só a imagem originada do plano focalizado alcança o detector, enquanto as imagens de planos anteriores e posteriores são bloqueadas (Figura 1.4). A luz proveniente de fora do plano de foco é, em grande parte, eliminada, a definição do objeto focalizado torna-se melhor e a localização de componentes do espécime pode ser feita com muito mais precisão que ao microscópio de luz.
Por motivos práticos, o seguinte arranjo é utilizado em muitos microscópios confocais (Figura 1.5): (1) a iluminação é provida por uma fonte de laser; (2) como esta fornece um ponto de iluminação muito pequeno, o feixe deve ser varrido sobre o espécime para possibilitar a observação de uma área maior; (3) o componente do espécime que é de interesse deve ser marcado com uma molécula fluorescente (isso significa que uma secção rotineira não pode ser estudada); (4) a luz usada para formar uma imagem é aquela porção que é refletida pelo espécime; (5) a luz refletida é capturada por um detector, em que o sinal é amplificado eletronicamente para ser visto em um monitor.
 FIGURA 1.4 Princípio da microscopia confocal. Luz originada de um plano do corte cruza o pequeno orifício existente em um obstáculo e alcança um detector; no entanto, raios originadosde outros planos são bloqueados pelo obstáculo. Dessa maneira, só um plano muito delgado do espécime é analisado de cada vez.
 FIGURA 1.5 Esquema do funcionamento de um microscópio confocal. A iluminação de uma fonte de laser alcança o espécime e é refletida. Um espelho dirige a luz refletida a um obstáculo que tem um pequeno orifício. A luz proveniente de planos do espécime que estão à frente ou atrás do plano focalizado é bloqueada pelo obstáculo. O laser varre o espécime para que uma área maior do corte seja observada.
Como somente um plano focal muito delgado é focalizado de cada vez (também chamado de secção óptica), é possível depois reunir os vários planos de um espécime e reconstruí-los em um objeto tridimensional. Para realizar todas essas funções, os microscópios confocais dependem de grande capacidade de computação.
6. Microscopia de fluorescência
Quando algumas substâncias são irradiadas por luz de um determinado comprimento de onda, elas emitem luz com um comprimento de onda mais longo. Esse fenômeno é chamado fluorescência. Na microscopia de fluorescência, as secções são iluminadas por uma fonte de luz de mercúrio sob alta pressão. Filtros especiais permitem selecionar o comprimento de onda dos raios luminosos que alcançam o espécime e também dos raios que são emitidos pelo espécime. Desta maneira, as substâncias fluorescentes são observadas como objetos brilhantes e coloridos.
Substâncias fluorescentes que tenham afinidade por moléculas encontradas nas células ou na matriz extracelular podem ser usadas como corantes fluorescentes, como o alaranjado de acridina, que pode combinar-se com o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o RNA. Quando observado em um microscópio de fluorescência, o complexo DNA-alaranjado de acridina emite fluorescência de cor verde-amarelada, e o complexo RNA-alaranjado de acridina emite fluorescência vermelho-alaranjada. Assim, é possível identificar e localizar os dois tipos de ácidos nucleicos nas células por meio da microscopia de fluorescência (Figura 1.6).
 FIGURA 1.6 Fotomicrografia de células de rim de hamster em cultura, coradas com alaranjado de acridina. Em um microscópio de fluorescência, o DNA (no interior dos núcleos) emite luz amarela, enquanto o citoplasma rico em RNA aparece com cor avermelhada ou laranja. (Grande aumento. Cortesia de A. Geraldes e J.M.V. Costa.)
Outra aplicação importante resulta da combinação química de substâncias fluorescentes (como o isotiocianato de fluoresceína – FITC) com moléculas que se ligam especificamente a componentes das células e dos tecidos, tornando possível assim a identificação desses componentes por meio da fluorescência que eles irão emitir (ver, mais adiante, “Detecção de moléculas em cortes histológicos por meio de interações moleculares de alta afinidade”).
7. Microscopia eletrônica
As microscopias eletrônicas de transmissão e de varredura se baseiam na interação entre elétrons e componentes dos tecidos.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
O microscópio eletrônico de transmissão (Figura 1.7) é um sistema de produção de imagens que teoricamente possibilita altíssima resolução (0,1 nm). Na prática, porém, a resolução obtida pela maioria dos bons instrumentos se situa em torno de 3 nm, resolução que torna possível que espécimes ampliados até cerca de 400 mil vezes sejam vistos com detalhes. Infelizmente, esse grande nível de ampliação só pode ser usado para analisar partículas ou moléculas isoladas, pois cortes delgados de células e tecidos podem ser observados com detalhes em aumentos de até cerca de 120 mil vezes.
 FIGURA 1.7 Microscópio eletrônico de transmissão 906E. (Cortesia de Carl Zeiss.)
A configuração do microscópio eletrônico é muito semelhante à do microscópio de luz, embora geralmente o trajeto dos elétrons ocorra de cima para baixo (ver Figura 1.8). A primeira lente é uma condensadora que focaliza o feixe de elétrons no espécime. Ao atravessar o corte, alguns elétrons interagem com átomos do espécime e continuam seus trajetos em direção às outras lentes, enquanto outros elétrons simplesmente cruzam o corte sem interagir com ele. Dos elétrons que alcançam a lente objetiva, forma-se uma imagem aumentada do objeto, a qual é projetada nas outras lentes que, por sua vez, aumentam a imagem ainda mais. Como nossa retina não é sensível a elétrons, é necessário que os elétrons sejam captados por um detector para se observar uma imagem. Esse detector pode ser uma placa fluorescente, um negativo fotográfico ou uma câmera CCD. Como a imagem no microscópio eletrônico de transmissão é produzida pelo balanço da quantidade de elétrons que alcançaram o detector e elétrons que foram retidos no tubo do microscópio, a imagem resultante é sempre em preto e branco. As áreas escuras de uma micrografia eletrônica costumam ser denominadas de elétron-densas, enquanto as áreas claras são chamadas de elétron-lucentes ou elétron-transparentes.
 FIGURA 1.8 Desenho esquemático de um microscópio eletrônico de transmissão com seus principais componentes.
Para haver boa interação entre o espécime e os elétrons e para a formação de uma boa imagem, o microscópio eletrônico utiliza cortes muito mais delgados que os de microscopia de luz (40 a 90 nm de espessura). Para conseguir esses cortes, os tecidos são incluídos em resinas plásticas, como as do tipo epóxi. Os blocos de tecidos são seccionados com navalhas de vidro ou de diamante, e os cortes são coletados sobre pequenas grades de metal (de cerca de 3 mm de diâmetro).
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
A microscopia eletrônica de varredura fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies de células, tecidos e órgãos. Nesse microscópio, um feixe de elétrons de diâmetro muito pequeno é focalizado sobre o espécime, percorrendo sequencialmente (i. e., varrendo) sua superfície. Ao contrário do microscópio eletrônico de transmissão, no microscópio de varredura os elétrons não atravessam o espécime (Figura 1.9). Os elétrons varrem uma delgada camada de metal previamente aplicada ao espécime e são refletidos pelos átomos do metal. Esses elétrons são capturados por um detector e transmitidos a amplificadores e outros componentes eletrônicos que geram um sinal, o qual resulta em uma imagem em preto e branco que pode ser observada em um monitor, gravada ou fotografada. As imagens são de fácil interpretação, pois os objetos parecem ser iluminados e apresentam locais sombreados, fornecendo uma ideia de três dimensões.
 FIGURA 1.9 Desenho esquemático de um microscópio eletrônico de varredura com seus principais componentes.
8. Radioautografia em secções de tecidos
A radioautografia in situ possibilita o estudo funcional de processos biológicos em cortes de tecidos pelo uso de radioatividade, aproveitando a capacidade de alguns tipos de emissões radioativas sensibilizarem emulsões fotográficas. Cristais de brometo de prata que foram colocados previamente na emulsão fotográfica funcionam como detectores de radioatividade da mesma maneira como eles respondem à luz em um negativo fotográfico. A primeira etapa do método consiste em fornecer átomos ou moléculas radioativas às células. A escolha dessas substâncias depende da finalidade do estudo: aminoácidos radioativos, nucleotídios radioativos, açúcares radioativos etc. Essas moléculas são chamadas de precursores, porque podem ser usadas pelas células para sintetizar moléculas maiores, como proteínas, ácidos nucleicos, polissacarídios e glicoproteínas.
Muitas informações podem ser obtidas pela localização de radioatividade em componentes de tecidos. Se o precursor fornecido tiver sido um aminoácido radioativo, é possível conhecer quais células de um tecido produzem mais e quais produzem menos proteínas, porque o número de grânulos de prata existentes sobre as células é proporcional à intensidade de síntese de proteína. Se for usado um precursor radioativo de DNA (como timidina radioativa), é possível determinar quais e que proporção de células de um tecido estão se preparando para dividir (Figura 1.11).
Procedimento da Radioautografia: Emum ambiente escuro, cortes dos tecidos a serem analisados são cobertos com uma emulsão fotográfica. Depois de um tempo adequado de exposição, as lâminas passam por uma revelação fotográfica e são depois examinadas ao microscópio. Os cristais da emulsão que foram atingidos por radiação originam pequenos grânulos pretos de prata metálica, que indicam a existência de radioatividade no tecido. As estruturas do corte que contêm moléculas radioativas ficam, portanto, cobertas por esses grânulos. Esse procedimento pode ser realizado tanto em microscopia de luz como eletrônica (Figura 1.10).
 FIGURA 1.10 Radioautogramas de glândulas salivares submandibulares de um camundongo que foi injetado com 3H-fucose 8 horas antes do sacrifício. A. Ao microscópio de luz, observam-se grãos negros de prata (setas), que indicam as regiões celulares que estão radioativas. A maior parte da radioatividade está localizada nos grânulos citoplasmáticos das células dos ductos glandulares. (Médio aumento.) B. Tecido preparado para observação em microscópio eletrônico de transmissão. Observe os grãos de prata que aparecem como estruturas enoveladas (setas), localizadas principalmente sobre os grânulos citoplasmáticos (G) e no lúmen (L) dos túbulos. (Grande aumento.) (A e B. Cortesia de T.G. Lima e A. Haddad.)
 FIGURA 1.11 Radioautogramas de cortes de órgãos de um rato que foi injetado com 3H-timidina. Os radioautogramas foram expostos durante um tempo muito longo, e, por essa razão, os núcleos radioativos se tornaram fortemente marcados e aparecem cobertos por uma grande quantidade de grânulos escuros. A. Muitas células epiteliais estavam se dividindo na base das glândulas intestinais (setas), mas nenhuma no restante das vilosidades. B. Um corte de linfonodo mostra que a divisão de suas células ocorre principalmente nos centros germinativos desta estrutura (seta). (A e B. Cortesia de Telma M.T. Zorn, Mauricio Soto-Suazo, Cleusa M.R. Pellegrini e W.E. Stumpf.)
9. Cultura de células e tecidos
Células podem ser mantidas vivas e estudadas fora do corpo, o que é muito útil para se pesquisar o efeito isolado de moléculas naturais ou fármacos sobre um tipo de célula ou tecido. A cultura de células possibilita também a análise direta do comportamento de células vivas por meio de um microscópio, e, além disso, várias experiências que não podem ser realizadas em um animal vivo podem ser feitas in vitro.
Enquanto em um organismo complexo as células são banhadas pelo plasma sanguíneo que contém centenas de substâncias diferentes, quando cultivadas in vitro elas são cultivadas em soluções de composição conhecida (sais, aminoácidos, vitaminas) às quais são frequentemente adicionados componentes do soro. Para preparar culturas de um tecido ou órgão, as células devem ser inicialmente separadas mecanicamente ou por meio de tratamento enzimático. Uma vez isoladas, as células podem ser cultivadas em suspensão ou colocadas sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamínula de vidro, superfícies sobre as quais as células aderem e crescem sob forma de uma única camada de células (Figura 1.12). Todos os procedimentos com células e tecidos vivos devem obviamente ser executados em área estéril, usando-se soluções e equipamento estéreis.
 FIGURA 1.12 Fotomicrografia de células deciduais de camundongo cultivadas in vitro e observadas por microscopia de contraste de fase. Observam-se várias células de diferentes formas, algumas arredondadas, outras alongadas. Seus núcleos são bem visíveis, e muitos contêm um ou dois nucléolos no seu interior. O citoplasma ao redor dos núcleos contém muitas organelas. (Médio aumento. Cortesia de Fabiano G. Costa.)
Linhagens de células: Culturas feitas com células obtidas diretamente de animais são chamadas culturas primárias. A maioria das células obtidas de tecidos normais tem uma duração de vida finita, programada geneticamente. Muitos tipos de células originalmente isolados a partir de tecidos normais ou patológicos e mantidos in vitro constituem agora linhagens permanentes de células, as quais podem ser mantidas indefinidamente em cultura. Para tornar possível essa “imortalidade” de células normais, é necessário submetê-las a um processo chamado de transformação.
10. Fracionamento celular
Organelas e outros componentes das células e tecidos podem ser purificados e isolados por meio de uma técnica chamada fracionamento celular. Trata-se de um processo físico pelo qual é usada força centrífuga para separar organelas e componentes celulares em função de seus coeficientes de sedimentação. O coeficiente de sedimentação de uma partícula depende de seu tamanho e de sua forma, bem como da densidade e viscosidade do meio em que está suspensa (Figura 1.13). A composição química e as funções das organelas e moléculas podem então ser estudadas in vitro. As frações obtidas por essas técnicas podem ser analisadas ao microscópio eletrônico para verificar sua pureza (Figura 1.14).
 
FIGURA 1.14 Micrografias eletrônicas de três frações celulares isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. A. Fração de mitocôndrias contaminada com retículo endoplasmático. B. Fração de microssomos. C. Fração de lisossomos. (Grande aumento. Cortesia de P. Baudhuin.)
 
FIGURA 1.13 O fracionamento celular possibilita o isolamento de componentes da célula por meio de centrifugação diferencial. A coluna de desenhos à direita da figura mostra as organelas celulares obtidas ao fundo de cada tubo após cada centrifugação. A força centrífuga é expressa em unidades g, equivalentes à força da gravidade. A. Um fragmento de tecido é picado com uma navalha de barbear ou com tesoura e depois dissociado com um homogeneizador ou por ultrassom. B. O tecido dissociado permanece em repouso durante cerca de 20 min para que grumos não dissociados e fibras da matriz extracelular precipitem. C. O sobrenadante é centrifugado a 1.000 g por 20 min. Os núcleos são precipitados no fundo do tubo. D. O sobrenadante é centrifugado a 10.000 g por 20 min. Mitocôndrias e lisossomos precipitam. E. O sobrenadante é centrifugado a 105.000 g por 120 min. Os microssomos precipitam. F. Se o sobrenadante é tratado com desoxicolato de sódio antes da centrifugação, os microssomos se dissociam e precipitam separadamente como ribossomos e membranas do retículo endoplasmático granuloso. (Adaptada e reproduzida, com autorização, de Bloom e Fawcett, 1968
11. Histoquímica e citoquímica
Os termos histoquímica e citoquímica são usados para indicar métodos que identificam e localizam substâncias em células e matriz extracelular, seja em cortes histológicos ou em células cultivadas. Há vários procedimentos para obter essas informações, a maioria baseada em reações químicas específicas ou em interações de alta afinidade entre moléculas. Esses métodos normalmente originam substâncias insolúveis coloridas (para microscopia de luz) ou elétron-densas (para microscopia eletrônica).
►Íons: Vários íons (p. ex., cálcio, ferro, fosfato) podem ser localizados em tecidos, usando reações químicas que produzem produtos insolúveis escuros ou coloridos (Figura 1.15).
 FIGURA 1.15 Fotomicrografia de um corte de osso tratado por uma técnica histoquímica para demonstrar íons cálcio. Os precipitados escuros na parte inferior da figura indicam a existência de fosfato de cálcio no osso e na cartilagem calcificada. Tecido cartilaginoso não calcificado (corado em alaranjado) está na metade superior da figura. (Médio aumento.)
Ácidos nucleicos: O DNA pode ser identificado e quantificado nos núcleos das células por meio da reação de Feulgen, que produz cor vermelha no DNA. O DNA e o RNA também podem ser evidenciados pela coloração de células ou cortes de tecidos com corante básicos.
►Proteínas: Embora haja métodos gerais para detectar proteínas em células e cortes de tecidos, os métodos histoquímicos normalmente não possibilitam localização de proteínas específicas, o que pode ser feito pela imunocitoquímica. Há, porém, vários métodos histoquímicos que revelam com maior ou menor especificidade um grupo grande de proteínas,as enzimas.
Alguns exemplos de enzimas que podem ser detectadas são: 
■ Fosfatases: são enzimas amplamente encontradas no organismo. Elas clivam a ligação entre um grupo fosfato e um resíduo de álcool de moléculas fosforiladas. O produto final da reação é insolúvel e colorido, geralmente fosfato ou sulfeto de chumbo. Por essas técnicas podem-se detectar fosfatases alcalinas que têm sua atividade máxima em um pH alcalino (Figura 1.16). Frequentemente se usa uma reação de detecção de fosfatases ácidas para demonstrar por microscopia de luz ou eletrônica lisossomos, organelas citoplasmáticas que contêm grande quantidade dessas enzimas (Figura 1.17).
 FIGURA 1.16 Fotomicrografia de corte de rim tratado pelo método de Gomori para demonstrar a enzima fosfatase alcalina. As regiões em que essa enzima é encontrada aparecem escuras em razão do precipitado de sais de chumbo (setas). (Médio aumento.)
 FIGURA 1.17 Detecção de fosfatase ácida. Micrografia eletrônica de uma célula de rim de rato que mostra três lisossomos (L) junto de um núcleo (N). O depósito escuro no interior dos lisossomos é fosfato de chumbo que precipitou nos locais em que havia fosfatase ácida. (Grande aumento. Cortesia de E. Katchburian.)
■ Desidrogenases: removem hidrogênio de um substrato e o transferem a outro. Há muitas desidrogenases nas células, onde elas têm um papel importante em vários processos metabólicos. A demonstração histoquímica de desidrogenases consiste em incubar cortes de tecidos não fixados em uma solução que contém uma molécula que, ao receber hidrogênio, precipita sob forma de uma substância colorida insolúvel. Por esse método, a succinodesidrogenase – enzima fundamental do ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs) – pode ser localizada nas mitocôndrias 
■ Peroxidase: a peroxidase, existente em vários tipos celulares, é uma enzima que promove a oxidação de certos substratos e a transferência de íons de hidrogênio para peróxido de hidrogênio, produzindo ao mesmo tempo moléculas de água. A atividade de peroxidase em células de sangue, que é importante no diagnóstico de leucemias, pode ser evidenciada por esse método. Uma vez que a peroxidase é uma enzima extremamente ativa e produz rapidamente uma quantidade apreciável de precipitado insolúvel, ela tem uma importante aplicação prática: ser usada para marcar outras moléculas. Moléculas de peroxidase podem ser extraídas de vegetais, isoladas e acopladas com outras moléculas. Mais adiante neste capítulo serão estudadas várias aplicações da marcação de moléculas com peroxidase.
Polissacarídios e oligossacarídios
Os polissacarídios do nosso organismo existem livres ou combinados com proteínas e lipídios. Quando combinados, eles constituem um grupo de moléculas heterogêneo e extremamente complexo. Eles podem ser demonstrados pela reação de ácido periódico-Schiff (PAS), que se baseia na transformação de radicais 1,2-glicol encontrados nos açúcares em resíduos de aldeído. Esses resíduos são, em seguida, revelados pelo reagente de Schiff, que produz uma coloração púrpura ou magenta nos locais do corte em que há muitos polissacarídios.
Um polissacarídio livre muito encontrado no organismo é o glicogênio, que pode ser demonstrado pela reação de PAS em fígado, músculo estriado e outros tecidos em que se acumula.
Glicoproteínas são moléculas de proteínas associadas a cadeias pequenas e ramificadas de açúcares (oligossacarídios). A cadeia proteica predomina em peso e volume sobre a cadeia de oligossacarídio. Enquanto algumas glicoproteínas não contêm nenhum grupo ácido (glicoproteínas neutras) e são PAS-positivas, outras têm radicais carboxila ou sulfato. A Figura 1.18 mostra estruturas coradas pela reação de PAS.
 FIGURA 1.18 Fotomicrografia de vilosidades intestinais coradas pela técnica de ácido periódico-Schiff (PAS). No epitélio de revestimento simples cilíndrico que reveste essas vilosidades, há células secretoras de muco denominadas células caliciformes. A secreção dessas células aparece intensamente corada pelo PAS devido ao alto conteúdo de polissacarídios do muco. Essas células têm a forma de uma taça de vinho, em que o pé da taça contém o núcleo, e a porção alargada, a secreção. A intensa coloração de uma faixa na superfície das células do revestimento epitelial é chamada bordadura estriada, que é constituída por uma grande quantidade de microvilosidades em cuja superfície existem muitos polissacarídios. Corte contracorado com hematoxilina para demonstrar os núcleos. (Médio aumento.)
Glicosaminoglicanos são polissacarídios não ramificados, fortemente aniônicos, que contêm monossacarídios aminados (aminoaçúcares). Quando um grande número de cadeias de glicosaminoglicanos se prende ao longo de um eixo proteico, elas constituem os proteoglicanos. Alguns dos componentes mais importantes da matriz extracelular do tecido conjuntivo são proteoglicanos. Diferentemente das glicoproteínas, nos proteoglicanos as cadeias de carboidrato constituem o componente principal da molécula. Glicosaminoglicanos e glicoproteínas ácidas são fortemente aniônicas por causa do seu alto conteúdo de grupos carboxila e de sulfato. Por essa razão, eles reagem intensamente com o corante alcian blue.
Lipídios
O melhor meio utilizado para revelar lipídios são os corantes que são solúveis em lipídios. Cortes obtidos por congelação são imersos em soluções alcoólicas saturadas com esses corantes (os corantes sudan IV e sudan black são os mais usados). O corante se dissolve nas gotículas de lipídios, as quais adquirem a cor do corante. Métodos adicionais usados para a localização de colesterol e seus ésteres, de fosfolipídios e de glicolipídios são úteis para diagnosticar doenças metabólicas em que há acúmulo intracelular de diferentes tipos de lipídios.
12. Detecção de moléculas em cortes histológicos por meio de interações moleculares de alta afinidade
Uma molécula em uma célula ou em um corte de tecido pode ser detectada por meio de compostos que interagem especificamente e se ligam com a molécula que queremos detectar. Esses compostos geralmente não têm cor e, para que possam ser vistos, devem ser previamente acoplados a um marcador. Marcador é um composto visível por microscopia de luz ou eletrônica e, quando está acoplado a uma substância com afinidade específica por uma molécula, ela denuncia a presença dessa molécula (Figura 1.19). Os marcadores mais usados são: substâncias fluorescentes (para serem visualizadas com um microscópio de fluorescência ou de laser), átomos radioativos (para serem detectados por radioautografia), moléculas de enzimas como a peroxidase (que pode ser detectada pela demonstração da enzima com peróxido de hidrogênio e DAB), metais (geralmente partículas de ouro) que podem ser observados por microscopia de luz e eletrônica. Esses métodos se destinam principalmente a detectar açúcares, proteínas e ácidos nucleicos.
FIGURA 1.19 Substâncias que têm grande afinidade por uma molécula podem ser marcadas e usadas para identificar esta molécula. A. A molécula a tem uma afinidade intensa e específica por uma porção da molécula b. B. Se a e b são colocadas em contato, a se liga com a porção de b que ela reconhece. C. Um marcador, visível em microscopia de luz ou eletrônica, pode ser ligado à molécula a. O marcador pode ser um composto fluorescente, uma enzima como a peroxidase, uma partícula de ouro ou um átomo radioativo. D. A molécula b pode ser detectada se existir em uma célula ou na matriz extracelular após incubação em uma solução que contém a molécula a.
Faloidina, proteína A, lectinas e anticorpos são exemplos de compostos que interagem especificamente com outras moléculas.
A faloidina, que é extraída de um cogumelo (Amanita phalloides), interage fortemente com actina e é geralmente marcada com substâncias fluorescentes para demonstrar filamentos de actina.
A proteína A é uma proteína extraída de Staphylococcus aureus e que se liga à região Fc de moléculas de imunoglobulinas (anticorpos). Quando a proteína A é ligada a um marcador, podemos detectar imunoglobulinas em corteshistológicos.
As lectinas são proteínas ou glicoproteínas derivadas principalmente de sementes de vegetais que se ligam com alta afinidade e especificidade a determinados carboidratos. Diferentes lectinas interagem com diferentes açúcares ou sequências de açúcares. Elas, portanto, ligam-se a glicoproteínas, proteoglicanos e glicolipídios e são muito usadas para caracterizar moléculas de membranas celulares que contêm sequências específicas de açúcares.
Imunocitoquímica
Um tipo de interação altamente específica entre moléculas é aquela que ocorre entre uma molécula e um anticorpo que a reconhece. Por essa razão, métodos que usam anticorpos são de grande utilidade para identificar e localizar proteínas e glicoproteínas. A imunocitoquímica é a metodologia que possibilita identificar, por meio de anticorpos, moléculas em cortes ou em células cultivadas.
Em uma reação imunocitoquímica, células em cultura ou um corte de tecido que supostamente contenham uma determinada proteína são incubados em uma solução que contém um anticorpo que reconhece essa proteína. Como o anticorpo não é visível por microscopia, suas moléculas devem ser inicialmente acopladas a um marcador. O anticorpo se liga especificamente à proteína e sua localização pode então ser evidenciada por microscopia de luz ou eletrônica, dependendo do marcador que foi acoplado ao anticorpo.
Uma das exigências mais importantes da imunocitoquímica é a disponibilidade de um anticorpo contra a proteína que se pretende detectar. Isso significa que a proteína deve ter sido previamente purificada e isolada de modo que anticorpos possam ser produzidos contra ela.
Anticorpos monoclonais e policlonais: Suponhamos que se queira produzir anticorpos contra a proteína X de uma determinada espécie animal (um rato, um humano). Se X já está isolada, ela é injetada em outra espécie (um coelho, uma cabra). Se a proteína for suficientemente diferente para este animal reconhecê-la como estranha, o animal produzirá anticorpos contra a proteína (anticorpo de coelho contra proteína X de rato ou anticorpo de cabra contra proteína X humana). Esses anticorpos são coletados do plasma do animal e usados para imunocitoquímica.
Quando se oferece um antígeno X a um animal, vários grupos (clones) de linfócitos deste animal podem reconhecer porções diferentes de X, e os vários grupos de linfócitos produzem anticorpos diferentes contra as várias porções, resultando em uma mistura de anticorpos. Essa mistura constitui o que se chama de anticorpo policlonal.
É possível, por outro lado, fornecer a proteína X para linfócitos mantidos em cultura (na verdade são linfócitos que foram fundidos com células de um tumor). Os diferentes grupos (clones) de linfócitos produzirão anticorpos diferentes contra as várias porções da proteína X. Cada clone pode ser isolado e cultivado isoladamente, de modo que os diferentes anticorpos contra X podem ser coletados separadamente. Cada um desses anticorpos constitui um anticorpo monoclonal. Há várias vantagens em usar um anticorpo monoclonal em comparação a um anticorpo policlonal; por exemplo, eles costumam ser mais específicos (e, portanto, mais precisos no reconhecimento da proteína X). Por esse motivo, haverá menos ligações inespecíficas com outras proteínas, as quais podem causar resultados falso-positivos.
 FIGURA 1.22 Fotomicrografia de uma célula decidual de camundongo cultivada in vitro. A proteína desmina, que forma filamentos intermediários que fazem parte do citoesqueleto, foi detectada com uma técnica de imunofluorescência (imunocitoquímica) indireta. Uma malha de filamentos intermediários fluorescentes é visível na maior parte do citoplasma. O núcleo (N) está corado em azul. (Grande aumento. Cortesia de Fabiano G. Costa.)]
 FIGURA 1.23 O antígeno carcinoembriônico é uma proteína encontrada em vários tumores malignos, principalmente da mama e dos intestinos. Esta fotomicrografia é uma demonstração imunocitoquímica de antígeno carcinoembriônico em uma secção de um adenocarcinoma de intestino grosso. O anticorpo estava marcado com peroxidase, evidenciada pela cor marrom. Portanto, os locais corados em marrom indicam células que contêm o antígeno carcinoembriônico. (Contracoloração: hematoxilina. Médio aumento.)
FIGURA 1.24 Fotomicrografia de um corte de intestino delgado no qual um anticorpo foi aplicado contra a enzima lisozima para demonstrar lisossomos em macrófagos e em células de Paneth. A cor marrom é o resultado da reação feita para demonstrar a enzima peroxidase, que foi o marcador acoplado ao anticorpo secundário. Núcleos contracorados com hematoxilina. (Médio aumento.)
 FIGURA 1.25 Esta eletromicrografia mostra secção de uma célula acinosa do pâncreas que foi incubada com anticorpo antiamilase e, em seguida, com proteína A marcada com partículas de ouro. A proteína A tem alta afinidade por moléculas de anticorpo. As partículas de ouro são vistas como delicados pontos pretos sobre os grânulos de secreção. (Grande aumento. Cortesia de M. Bendayan.)
Técnicas de hibridização
O desafio central da moderna biologia celular é entender o funcionamento das células em seus detalhes moleculares. Esse objetivo requer técnicas que viabilizem a análise das moléculas envolvidas no processo de fluxo de informação do DNA para proteína e no controle desse fluxo. Muitas técnicas são baseadas em hibridização (ou hibridação). Hibridização é a ligação entre duas moléculas de cadeia única de ácidos nucleicos (DNA com DNA, RNA com RNA ou RNA com DNA) que se reconhecem um ao outro se suas sequências forem complementares, formando moléculas de cadeia dupla. A hibridização possibilita a identificação de sequências específicas de DNA ou RNA.
 FIGURA 1.26 Corte de um tumor epitelial benigno (condiloma) submetido a hibridização in situ. As áreas marrons são regiões em que o DNA de vírus de papiloma humano tipo 2 (HPVII) é encontrado. (Contracoloração: hematoxilina. Médio aumento. Cortesia de J.E. Levi.)
Hibridização in situ
Quando aplicada diretamente a células e cortes de tecidos, esfregaços ou cromossomos de células mitóticas, a técnica é chamada de hibridização in situ. Essa técnica é excelente para averiguar se uma célula tem uma sequência específica de DNA (p. ex., um gene ou parte de um gene), ou para definir a localização de um gene em um cromossomo ou identificar as células nas quais um gene específico está sendo transcrito. Um trecho de DNA deve ser inicialmente desnaturado por calor ou agentes desnaturantes, fazendo com que as suas duas cadeias se separem. As cadeias (chamadas de sondas) tornam-se, então, prontas para serem ligadas a um segmento de cadeia simples de DNA ou a um segmento de RNA que sejam complementares à sequência que desejamos analisar. A sonda pode ser obtida por clonagem, por amplificação da sequência por meio de PCR (reação em cadeia da polimerase, do inglês polymerase chain reaction) ou por síntese se a sequência desejada for curta. A sonda deve ser ligada a um marcador, normalmente um isótopo radioativo (que pode ser localizado por radioautografia) ou um nucleotídio modificado (digoxigenina), que pode ser identificado por imunocitoquímica.
Na hibridização in situ, as lâminas que contêm os cortes de tecido, células ou cromossomos são inicialmente aquecidas para separar as cadeias duplas de seu DNA. Em seguida, uma solução contendo a sonda é colocada sobre o espécime por um período necessário para hibridização. Depois de lavar a lâmina, a localização da sonda ligada a sua sequência complementar é revelada pelo marcador utilizado (ver Figura 1.26).
Hibridização pode também ser executada com DNA ou RNA purificados, colocados em apoios sólidos. Trechos de moléculas de DNA ou de RNA são separados por tamanho por meio de eletroforese em gel de agarose ou em gel de poliacrilamida. Em seguida, são transferidos a uma folha de náilon ou de nitrocelulose por meio de um solvente em que os ácidos nucleicos podem ser analisados por hibridização. A técnica de identificação de DNA é chamada de Southern blotting; quando a eletroforeseé feita com moléculas de RNA, a técnica é chamada Northern blotting.
As técnicas de hibridização são altamente específicas e habitualmente utilizadas em pesquisa, diagnóstico clínico e medicina forense.
13. Problemas na interpretação de cortes
►Distorções e artefatos provocados pelo processamento dos tecidos
	Ao estudar e interpretar cortes de tecidos, é importante lembrar-se de que o que está sendo observado é o resultado final de uma série de processos que começam com a fixação e terminam com a coloração do corte. As várias etapas desse procedimento podem distorcer os tecidos, fornecendo uma imagem que pode diferir da que os tecidos apresentavam quando vivos. Uma causa de distorção é a retração produzida pelo fixador, pelo etanol e pelo calor da parafina usada para inclusão. A retração é atenuada quando os tecidos são incluídos em resina.
	Uma consequência da retração é o aparecimento de espaços artificiais nas células e entre as células e outros componentes de tecido. Outra fonte de espaços artificiais é a perda de moléculas que não foram mantidas corretamente nos tecidos pelo fixador ou que foram retiradas pelas soluções de desidratação e clareamento. Exemplos de moléculas não preservadas são o glicogênio e lipídios.
	Todos esses espaços artificiais e outras distorções causadas pelo procedimento de preparação dos cortes são chamados artefatos de técnica. Outros artefatos podem incluir pregas do corte (que podem ser confundidas com capilares sanguíneos), precipitados de corantes ou de sujeira (que podem ser confundidos com grânulos citoplasmáticos) e muitos mais. Os estudantes devem estar atentos para a existência de artefatos e precisam tentar reconhecê-los para não serem enganados por eles.
►Totalidade do tecido
Uma grande dificuldade apresentada por cortes de microscopia de luz é a impossibilidade de se corar diferencialmente todos os componentes das células e tecidos em um só preparado. Seria muito desejável, mas quase impossível, observar células por um microscópio de luz e enxergar os seus núcleos, as mitocôndrias, os lisossomos, os peroxissomos, todos envolvidos por uma membrana celular e, externamente, por uma membrana basal e por matriz extracelular contendo fibras colágenas, elásticas e reticulares. Para se conseguir essa imagem, é necessário examinar várias preparações diferentes, cada qual corada por outro método, e assim obter uma visão completa da composição e estrutura de um tecido. Por outro lado, o microscópio eletrônico de transmissão torna possível a observação de células com todas as suas organelas e inclusões, envolvidas pela membrana e pelos componentes da matriz extracelular.
►Duas dimensões e três dimensões
Quando uma estrutura tridimensional é cortada em secções muito delgadas, as secções parecem ter somente duas dimensões: comprimento e largura. Isso frequentemente conduz o observador a erros se ele não se conscientizar de que uma esfera seccionada é vista como um círculo e que um tubo seccionado é visto como um anel (Figura 1.27). Quando um corte é observado ao microscópio, o estudante sempre deve imaginar que algo pode estar faltando à frente ou atrás daquele corte, uma vez que muitas estruturas são mais espessas que o corte. Além disso, deve lembrar-se também de que os componentes de um tecido ou órgão são geralmente seccionados ao acaso.
Para entender a arquitetura de um órgão, é necessário estudar secções feitas em planos diferentes. Às vezes, somente a análise de secções consecutivas e a sua reconstrução em um volume tridimensional tornam possível compreender a organização de um órgão complexo.
FIGURA 1.27 Como diferentes estruturas tridimensionais são observadas após serem cortadas em secções delgadas. A. Diferentes secções de uma esfera oca e de um tubo oco. B. Um corte ao longo de um único tubo enovelado pode ser visto como cortes de vários tubos. C. Cortes através de uma esfera sólida e através de um cilindro sólido podem ser semelhantes.