Genética de bactérias 1

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5920117 - Genética I I 2014 
Genética de Bactérias: 
Processos parassexuais e Transformação 
 
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 
tiagocampospereira@ffclrp.usp.br 3602 3818 – sala 13, bloco 14 
 
Principle of Genetics 5th Edition - Cap 8 . Snustad & Simons, Editora Wiley 
 
Assuntos abordados nesta aula: 
 
• Recombinação em bactérias: processos parassexuais 
• Mutantes em bactérias (metabólicos, auxotróficos e resistentes) 
• Transferência unidirecional 
• Distinção entre os processos parassexuais 
• Competência 
• Transformação 
 
 
O material genético de bactérias é armazenado na forma de um único “cromossomo” 
circular de DNA carregando poucos milhares de genes além de um número 
variável de “minicromossomos” denomimandos plasmídeos e epissomos. 
 
Plasmídeos são moléculas circulares de DNA, de replicação autônoma (independente 
do cromossomo) contendo entre 3 a centenas de genes. Algumas bactérias 
contém até 11 tipos de plasmídeos além do cromossomo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Epissomos são semelhantes aos plasmídeos, podendo se replicar de maneira 
independente do cromossomo ou como parte dele, em um estado integrado 
semelhante ao do profago . 
 
As bactérias se reproduzem assexuadamente (por fissão simples) cada célula-filha 
recebendo uma cópia do cromossomo. Elas são monoploides (haploides) porém 
geralmente possuem 2 ou mais cópias idênticas do cromossomo. 
 
 
 
 
 
 
 
O cromossomo bacteriano não passa por ciclos mitóticos e meióticos de condensação 
que ocorrem em eucariotos. 
Portanto, os eventos de recombinação - segregação independente e crossing over 
meiótico - não ocorrem em bactérias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mesmo assim, a recombinação genética tem sido tão importante na evolução de 
bactérias como tem sido na evolução de eucariotos. 
Esta recombinação ocorre em bactérias através de mecanismos distintos dos 
eucariotos, denominados processos parassexuais (para-: semelhante, próximo). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Paramédicos: 
profissionais 
semelhantes aos 
médicos, que 
trabalham junto 
com os médicos. 
Forças paramilitares: 
grupos semelhantes a 
militares, agem como 
um exército, mas 
trabalham para outras 
organizações 
(rebeldes, tráfico, 
separatistas). 
Procesos parassexuais: 
processos semelhantes 
ao sexo e que permitem 
a recombinação em 
bactérias. 
As bactérias podem crescer em meios de cultura líquidos ou semisólidos (com ágar). 
No último caso, as bactérias crescem formando colônias que podem se diferir em 
forma e cor, de acordo com a linhagem e espécie bacteriana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
E. coli tipo selvagem pode utilizar quase qualquer açúcar como fonte de energia. 
Contudo, alguns mutantes são incapazes de crescer em meios que contêm lactose 
como única fonte de energia. Outros não crescem em meio de galactose ou 
arabinose. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
v 
A nomenclatura padrão para descrever estes e outros mutantes em bactérias é o uso 
de abreviaturas de três letras: 
 
Fenótipo Genótipo Descrição 
Lac+ lac + Crescem em meio contendo lactose como 
 única fonte de energia. 
 
Lac- lac- Não crescem em meio contendo lactose como 
 única fonte de energia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
E. coli tipo selvagem pode crescer em meios mínimos, contendo uma fonte de 
energia e alguns sais inorgânicos. Estas células conseguem sintetizar todos os 
metabólitos que elas precisam (aminoácidos, vitaminas, purinas, pirimidinas, etc) 
a partir destes elementos mínimos. São chamados prototróficos. 
 
 Contudo, algumas linhagens possuem mutações em um gene codificador de uma 
enzima necessária para síntese de um metabólito essencial. Estas bactérias 
apenas irão crescer em meios nos quais este metabólito foi adicionado. Tais 
mutantes são chamados auxotróficos (necessitam de nutrientes auxiliares). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fenótipo Genótipo Descrição 
Trp+ trp + Crescem em meio sem triptofano. 
 
Trp- trp- Não crescem em meio sem triptofano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
E. coli tipo selvagem são mortas por antibióticos como ampicilina e tetraciclina. 
Fenotipicamente elas são AmpS e TetS. 
 
Halos de inibição 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
As bactérias mutantes resistentes a estes antibióticos são genotipicamente amp
r 
(resistentes à ampicilina) e tet
r
(resistentes a tetraciclina). Estes genes de resistência 
geralmente estão localizados em plasmídeos. 
 
Portanto, antibióticos podem ser utilizados para selecionar bactérias portadoras de 
genes de resistência. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Na reprodução sexuada em eucariotos superiores, dois genitores (doadores) 
contribuem com metade de seus materiais genéticos para um terceiro indivíduo 
(receptor), i.e., uma prole que é o resultado de uma fusão. 
 
Os eventos de recombinação que ocorrem em bactérias envolvem transferências 
gênicas unidirecionais, de uma bactéria (doadora) para outra (receptora ou célula 
recipiente). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Geralmente, os eventos de recombinação bacteriana ocorrem entre um fragmento 
de um cromossomo (da célula doadora) e um cromossomo completo (na célula 
recipiente), ao invés de 2 cromossomos completos, como nos eucariotos. 
 
Portanto, o receptor se torna um diploide parcial, contendo um pedaço de 
cromossomo linear do doador e um cromossomo circular completo do receptor. 
 
Um número par de crossing overs deve ocorrer para que a transferência gênica seja 
bem sucedida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se um número ímpar de crossing overs ocorrer, a integridade do cromossomo recipiente 
será destruída (DNA linear sem telômeros), produzindo um célula inviável. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Três processos parassexuais distintos ocorrem em bactérias. A diferença mais óbvia 
entre eles é o mecanismo pelo qual o DNA é transferido de uma célula para 
outra. 
1. A transformação envolve a absorção de “moléculas livres de DNA” no ambiente 
liberadas, por exemplo, durante a morte de outra bactéria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Três processos parassexuais disntintos ocorrem em bactérias. A diferência mais óbvia 
entre eles é o mecanismo pelo qual o DNA é transferido de uma célula para 
outra. 
1. A transformação envolve a absorção de “moléculas livres de DNA” no ambiente 
liberadas, por exemplo, durante a morte de outra bactéria. 
2. A conjugação envolve a transferência direta do DNA da célula doadora para a 
recipiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Três processos parassexuais disntintos ocorrem em bactérias. A diferência mais óbvia 
entre eles é o mecanismo pelo qual o DNA é transferido de uma célula para 
outra. 
1. A transformação envolve a absorção de “moléculas livres de DNA” no ambiente 
liberadas, por exemplo, durante a morte de outra bactéria. 
2. A conjugação envolve a transferência direta do DNA da célula doadora para a 
recipiente. 
3. A transdução ocorre quando genes bacterianos são carregados da doadora para a 
receptora por bacteriófagos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se a recombinação ocorrer mesmo na presença de 
DNase o processo deve envolver transdução.Como elaborar um experimento 
que demonstre o envolvimento 
de contato? 
Nem todos os três processos parassexuais ocorrem em todas as bactérias, 
provavelmente apenas a transdução. 
 
A ocorrência de transformação e/ou conjugação em determinada espécie se deve à 
presença de determinados genes e maquinaria metabólica, tais como proteínas 
necessárias para a absorção de DNA livre. 
 
E. coli tipo selvagem sofre apenas conjugação e transdução em habitats naturais. 
Contudo, cientistas conseguiram criar estratégias artificiais para promover a 
transformação de E. coli em laboratório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O processo de transformação foi 
descoberto por Frederick 
Griffith em Streptococcus 
pneumoniae em 1928. 
Fenótipos em S. pneumoniae: 
- presença/ausência de cápsula 
- tipo de cápsula 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rough: irregular, áspero. 
Não se trata de “IIIS” sobreviventes, pois o calor mata todas elas (segundo exemplo). 
Não se trata de reversão (mutação) de “R” para “S” pois o genótipo é “IIIS” e não “IIS”. 
A explicação mais simples é transformação, pois a dupla mutação R  S e II  III é menos 
provável. 
 
O processo de transformação não ocorre apenas in vivo (i.e., não demanda um hospedeiro), 
ele também pode ocorrer in vitro. 
 
O processo de transformação apresenta diferenças entre espécies: 
 
- S. pneumoniae e B. subtilis incorporam DNA de qualquer fonte (!) 
- H. influenzae e N. gonorrhoeae incorporam DNA apenas da mesma espécie ou espécies 
próximas (contendo uma sequência de 10 nt que ocorre 600 vezes no genoma). 
 
As células devem estar expressando certos genes necessários para a absorção do “DNA 
livre” para que a transformação ocorra. Estas proteínas são chamadas proteínas de 
competência (Com). Células capazes de realizar a transformação (absorver o DNA livre) são 
chamadas de células competentes. 
 
Células adquirem competência 
na fase tardia de seu crescimento 
exponencial. 
B. subtilis secreta feromônios de competência que se acumulam durante altas densidades 
celulares. Estes pequenos peptídeos induzem a expressão das proteínas de competência. 
 
Genes de competência estão localizados em clusters designados por letras: A, B, C, D... 
Genes de cada cluster também são designados por letras: A, B, C, D.... 
 
Portanto, a proteína codificada pelo quinto cluster, primeiro gene é designada ComEA. 
 
Células adquirem competência 
na fase tardia de seu crescimento 
exponencial. 
ComEA e as proteínas ComG se ligam ao dsDNA na superfície das células. 
Uma DNase degrada uma das fitas. 
ComFA (uma DNA translocase) puxa o ssDNA para dentro da célula através do canal criado 
pelas proteínas ComEC. 
Este ssDNA fica protegido pelas proteínas de ligação a DNA fita simples e RecA. 
O ssDNA invade o cromossomo e RecA realiza a recombinação (troca). 
 
Se a célula receptora possuir um alelo diferente, a dupla hélice resultante possuirá um 
alelo em cada fita, condição designada “heteroduplex” (um dupla hélice heterozigota). 
5920117 - Genética I I 2014 
Genética de Bactérias: 
Conjugação 
 
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 
tiagocampospereira@ffclrp.usp.br 3602 3818 – sala 13, bloco 14 
 
Principle of Genetics 5th Edition - Cap 8 . Snustad & Simons, Editora Wiley 
 
Assuntos abordados nesta aula: 
 
• Conjugação 
• Fator F 
• Células Hfr 
• Conjugação interrompida e mapas genéticos 
 
 
Apesar de E. coli não sofrer transformação naturalmente, outros processos de 
recombinação podem ocorrer, tal como a conjugação (descoberta em 1946 por 
Joshua Lederberg e Edward Tatum). 
 
Durante a conjugação, ambas células (doadora e recipiente) estão em íntimo contato e 
o DNA é transferido através de um canal intercelular especializado de conjugação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
J. Lederberg 
EUA, 1925-2008 
E. Tatum 
EUA, 1909-1975 
As células doadoras possuem uma pequena molécula de DNA circular de 105 pb 
denominado “Fator F” (de fertilidade), responsável pela síntese dos “pilos F”, que 
promovem o contato e aproximação entre ambas células. O canal de conjugação 
é formado logo em seguida. 
 
Portanto, as células que contêm o fator F (F+ ; doadoras) são capazes de transferir 
seu DNA para bactérias que não contêm este fator (F- ; recipientes). 
 
 
 
 
 
 
 
O fator F é um epissomo, portanto ele pode existir em dois estados: 
(i) autônomo, replicando-se independentemente do cromossomo bacteriano ou 
(ii) integrado, estando covalentemente ligado ao cromossomo bacteriano e 
replicando-se como parte dele. 
 
Durante a conjugação entre células F+ e F- apenas o fator F é transferido. 
 
 
 
 
 
 
 
O fator F pode se integrar ao cromossomo 
bacteriano por meio de eventos de 
recombinação sítio-específicos. 
A integração é mediada por pequenas 
sequências de DNA que estão presentes em 
múltiplas cópias tanto no fator F quanto no 
genoma bacteriano. 
 
Portanto, este epissomo pode se integrar em 
diferentes posições. A célula contendo um 
fator F integrado é chamada célula Hfr 
(para high-frequency of recombination). 
 
Na forma integrada, o fator F medeia a 
transferência do cromossomo da Hfr para a 
célula recipiente. 
 
 
 
 
 
A transferência inicia-se em um sítio denominado oriT (origem de transferência). 
 
O fator F tem ainda outras duas origens de replicação: 
oriV: principal origem de replicação durante a divisão celular. 
oriS: origem de replicação secundária, usada apenas quando oriV é ausente ou não-
funcional. 
 
 
 
 
 
 
Durante a conjugação, uma fita do fator F é cortada e transferida para a célula 
recipiente através do canal de conjugação. 
 
O fator F se replica por meio do mecanismo de círculo rolante. 
 
 
 
 
 
 
Aparentemente, o mecanismo de transferência entre Hfr e F- é o mesmo que entre F+ e F- . 
 
 
 
 
 
 
A transferência é iniciada dentro da sequência integrada F, seguida pelos genes cromossomais 
e por fim o restante do fator F. 
 
 
 
 
 
Portanto, raramente uma célula recipiente 
recebe completamente o fator F, 
convertendo-se em um célula Hfr. 
Uma série de detalhes da conjugação foram 
esclarecidos utilizando uma linhagem 
particular de Hfr denominada “H”. 
 
Nesta linhagem o fator F está integrado próximo 
aos loci thr (treonina) e leu (leucina). 
 
Em 1957, Elie Wollman e François Jacob 
forneceram novos insights no processo de 
conjugação ao cruzar: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Células Hfr 
 
 
Células F- 
 
 
 
thr: síntese do aminoácido treonina 
leu: síntese do aminoácido leucina 
azir; tonr ; strr: resistência a azida sódica, bacteriófago T1 e estreptomicina 
azis; tons ; strs: sensibilidade a azida sódica, bacteriófago T1 e estreptomicina 
lac-: incapacidade de crescer em meio contendo lactose como única fonte de energia 
gal-: incapacidade de crescer em meio contendo galactose como única fonte de energia 
 
 
 
 
 
Células Hfr e F- foram misturadas para conjugar. 
 
Em intervalos variáveis de tempo amostras eram coletadas, misturadas em 
liquidificador para quebrar os canais de conjugação e interromper o processo de 
recombinação. 
 
Estas células foram plaqueadas em meios com estreptomicina e mas sem treonina e 
leucina. Apenas as células F- (resistentes a estreptomicina) carregando os alelos 
thr+ e leu+ oriundos de Hfr (recombinantes) podiam crescer no meio seletivo. 
 
 
Células Hfr 
 
 
Células F- 
 
 
 
 
 
Colônias produzindo thr+leu+ strr recombinantes foram transferidas para uma série 
de placas contendo diferentes meios seletivos para determinar seus genótipos: 
 
- com ou sem azida sódica 
- com ou sem bacteriófago T1 
- com lactose como a única fonte de energia 
- com galactose como a única fonte de energia 
 
 
 
 
 
 
 
 A coordenada zero deste 
mapa circular é definida 
em thr porque ele foi o 
primeiro gene a ser 
transferido. 
 
 
 
 
Estudos subsequentes com diferentes linhagens Hfr revelaram que a transferência 
gênica pode ser iniciada em diferentes sítios do cromossomo, devido aos 
diversos sítios de integração do fator F. 
 
Adicionalmente, a orientação da integração do fator F determinará se a transferência 
dos genes cromossomais é no sentido horário ou anti-horário. 
 
A transferência completa de um cromossomo Hfr leva aproximadamente 100 min e 
parece ocorrer em um taxa bem constante.