Genética de bactérias 2 e vírus

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5920117 - Genética I I 2014 
Genética de Bactérias: 
Transdução e Sexdução 
 
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 
tiagocampospereira@ffclrp.usp.br 3315 3818 – sala 13, bloco 14 
 
Principle of Genetics 5th Edition - Cap 8 . Snustad & Simons, Editora Wiley 
Assuntos abordados nesta aula: 
 
• Transdução: especializada e generalizada 
• Lisados Lft e Hft 
• Plasmídeos e epissomos 
• Fatores F’ e Sexdução 
 
 
 
Joshua Lederberg e Norton Zinder descobriram em 1952 um terceiro tipo de processo 
parassexual. Estudando linhagens auxotróficas de Salmonella typhimurium, eles 
observaram o surgimento de recombinantes em tubo de ensaio em “U” utilizando 
filtros e DNase (portanto excluindo conjugação e transformação). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
J. Lederberg 
EUA, 1925-2008 
N. Zinder 
EUA, 1928-2012 
S. typhimuirum 
Experimentos posteriores revelaram que uma das linhagens estava contaminada com o 
bacteriófago P22, que estava levando genes de uma célula (doadora) para outra 
(receptora). 
Portanto, as raras bactérias prototróficas detectadas surgiram devido a recombinação 
entre o DNA bacteriano carregado pelo vírus e o DNA da célula recipiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
P22 
Outros experimentos revelaram que há dois tipos diferentes de transdução: 
- Transdução generalizada: um fragmento aleatório (ou quase aleatório) do DNA 
bacteriano é empacotado na cabeça do fago, substituindo o DNA do vírus. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Outros experimentos revelaram que há dois tipos diferentes de transdução: 
- Transdução generalizada: um fragmento aleatório (ou quase aleatório) do DNA 
bacteriano é empacotado na cabeça do fago, substituindo o DNA do vírus. 
- Transdução especializada: eventos de recombinação entre o DNA bacteriano e o do 
vírus geram fagos com cromossomos contendo uma parte de DNA bacteriano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Partículas virais contendo DNA bacteriano são denominadas partículas de transdução. 
Portanto: 
- partículas de transdução generalizada contêm apenas DNA bacteriano; 
- partículas de transdução especializada contêm DNA bacteriano e viral. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fagos de transdução generalizada podem transportar qualquer gene bacteriano de 
uma célula a outra (por isto o termo “generalizado”). 
 
Os fagos de transdução generalizada mais conhecidos são P22 em S. typhimurium e P1 
em E. coli. 
 
Apenas 1-2% das partículas virais produzidas por uma célula infectada por P22 ou P1 
contém DNA bacteriano. 
Apenas 1-2% do DNA transferido pelo vírus é incomporado no cromossomo bacteriano 
por recombinação. 
 
Portanto, o processo é bem ineficiente: a frequência de transdução de um gene 
qualquer é de aproximadamente 1 a cada 106 partículas de fago. 
 
 
 
 
 
 
 
Transdução especializada é característica de vírus que transferem apenas certos genes 
entre bactérias. 
 
Lambda () é o fago de transdução especializada mais conhecido, ele carrega apenas os 
genes gal e bio de uma E. coli para outra. 
 
Esta especificidade se deve ao mecanismo de integração e excisão de  no genoma 
bacteriano. 
 
Uma vez que o sítio attB está localizado entre os genes gal e bio,  naturalmente se 
integra neste ponto. 
 
Geralmente, o processo de excisão é preciso (apenas o DNA do fago é removido). 
Contudo, ocasionalmente, uma recombinação errônea (não homóloga) pode 
ocorrer, gerando uma excissão anômala. 
 
 
 
 
 
Portanto, excisões anômalas de  geram partículas de transdução especializada 
carregando o gene gal OU o gene bio. 
 
Estas partículas de transdução são denominadas dgal (ou dbio): bacteriófago  
defectivo carregando gene gal (ou bio). 
 
Eles são chamados de defectivos porque perderam, durante o processo de 
recombinação anômala, um ou mais genes necessários para a reprodução lítica ou 
lisogênica. 
 
 
 
 
 
 
 
Devido ao pequeno tamanho da cabeça do fago, apenas genes bacterianos localizados 
próximos ao profago podem ser excisados e empacotados na cabeça do fago. 
 
Partículas de transdução ocorrem apenas quando profagos em fase lisogênica entram 
no ciclo lítico (ocorrendo a excisão). Partículas de transdução não são observadas 
em infecções líticas primárias. 
 
A frequência de partículas de transdução produzidas durante a indução de células 
lisogênicas é de aproximadamente 1 a cada 106 partículas. 
 
Estes lisados de células (= amostra de células lisadas) são denominados Lft (low-
frequency transduction): lisados com baixa frequência de transdução. 
 
 
 
 
 
 
 
O destino de moléculas de DNA de dgal (ou dbio) após sua introdução no hospedeiro 
dependerá de quais genes de  foram perdidos. 
 
Se genes do crescimento lítico forem perdidos mas o sítio att e o gene int (integrase) 
forem mantidos, os cromossomos defectivos serão capazes de se integrar no 
cromossomo hospedeiro. 
Contudo, estes mesmos profagos não serão capazes de se replicar de maneira lítica, a 
não ser que um fago  tipo-selvagem (+) esteja coinfectando a célula. Este + 
atuará como um vírus ajudante (helper virus), expressando os genes ausentes no 
profago defectivo. 
 
Por outro lado, se o gene int (integrase) tiver sido perdido, o cromossomo defectivo 
será capaz de se integrar apenas na presença de um vírus ajudante. 
 
 
 
 
 
 
 
Se um fago dgal+ infectar uma bactéria recipiente gal-, a integração de dgal+ irá 
produzir um diploide parcial instável gal+ / gal-. Esta condição é instável porque a 
excisão deste profago reverterá a condição. 
 
 
 
 
 
 
 
Raramente, eventos de recombinação entre o gene gal+ do DNA de transdução e o 
gene gal- da bactéria recipiente irão gerar um transdutante gal+ estável. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se a razão vírus/bactéria for muito alta, células recipientes irão receber tanto o  tipo-
selvagem quanto dgal+ e ambos podem se integrar no genoma. 
 
Quando o ciclo lítico for induzido (com UV, por exemplo), 50% das partículas virais do 
lisado serão dgal+ e 50% +, pois lambda tipo selvagem age como um vírus 
ajudante, permitindo a excisão da partícula de transdução dgal+. 
 
Considerando que partículas de transdução ocorrem raramente (por recombinação 
não homóloga – anômala, 1 a cada 106 partículas virais), estes lisados com 50% de 
partículas de transdução são chamados de Hft (high-frequency of transduction). 
 
Devido à elevada taxa de transdução, lisados Hft são os preferencialmente escolhidos 
para realizar experimentos de transdução. 
 
 
 
 
 
 
 
Lisados Hft produzem 50% de partículas de transdução . 
 
 
 
 
 
 
 
 
Partícula de transdução 
carregando gal+ 
Partícula viral selvagem 
(não de transdução) 
Luz UV 
O material genético bacteriano é carregado em um cromossomo principal MAIS uma 
(ou várias) moléculas de DNA circular de replicação independente do cromossomo 
denominados plasmídeos e epissomos. 
 
Plasmídeos e epissomos geralmente carregam genes não essenciais às bactérias. 
 
Plasmídeos não se integram ao cromossomo bacteriano, havendo dois principais tipos: 
- Plasmídeos R: carregam genes de resistência a antibióticos e outras drogas. 
- Plasmídeos Col: codificam proteínas bactericidas (colicinas) que são liberadas para 
o ambiente para reduzir a competição com outras linhagens bacterianas. 
 
Por outro lado, além de se replicar de maneira autônoma, os epissomos podem 
também se integrar ao cromossomo bacteriano. O epissomo mais conhecidoé o 
Fator F (de fertilidade, visto na conjugação). Ele era antigamente conhecido 
“Plasmídeo F”. 
 
 
 
 
 
Alguns plasmídeos codificam proteínas que tornam as células capazes de conjugar. 
Todos os “fatores F”, muitos “plasmídeos R” e alguns “plasmídeos Col” têm esta 
propriedade e portanto são denominados plasmídeos conjugativos. 
 
A natureza conjugativa de muitos plasmídeos R promove um papel importantíssimo na 
rápida propagação, dentro de populações de bactérias patogênicas, de genes de 
resistência a antibióticos. 
 
 
 
 
 
 
A habilidade de integração dos epissomos ao cromossomo bacteriano depende da 
presença de curtas sequências de DNA denominadas IS (sequências de inserção). 
Estas sequências de 800 a 1400 pb estão presentes tanto nos epissomos quanto nos 
cromossomos bacterianos e são transponíveis (i.e., podem mover de posição no 
genoma - transposons, vistos futuramente). 
 
 
 
 
 
 
 
Como visto anteriormente (conjugação), o Fator F pode manter-se na célula de maneira 
autônoma ou integrar-se ao genoma bacteriano, gerando um célula Hfr. 
 
 
 
 
 
 
 
Raramente o fator F pode 
excisar-se do genoma em 
culturas Hfr, gerando: 
- fatores F íntegros, 
promovidos por excisões 
precisas 
- fatores F carregando genes 
bacterianos devido a 
excisões anômalas 
(semelhantes à observado 
na transdução especializada 
em ). 
 
 
 
 
 
 
 
Estes fatores F modificados, denominados F’ (F linha) foram identificados por Edward 
Adelberg e Sarah Burns em 1959. 
 
Ao contrário do DNA de , cuja cabeça do fago limita o tamanho do DNA a ser 
transduzido, os fatores F’ não são empacotados, portanto podem carregar consigo 
qualquer tamanho de sequência bacteriana: de um único gene à metade do 
genoma. 
 
 
 
 
 
 
A transferência de um fator F’ para um célula F- é denominada sexdução (sexduction) e 
ocorre pelo mesmo mecanismo de transferência visto em F+ e F-. 
 
A grande diferença é que a frequência de transferência de genes bacterianos por 
sexdução é bem maior. 
 
 
 
 
 
 
 
5920117 - Genética I I 2014 
Genética de Vírus 
 
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 
tiagocampospereira@ffclrp.usp.br 3315 3818 – sala 13, bloco 14 
 
Principle of Genetics 5th Edition - Cap 8 . Snustad & Simons, Editora Wiley 
 
Assuntos abordados nesta aula: 
 
• Formas de replicação de vírus 
• Bacteriófagos: T4 e Lambda 
• Replicação viral: ciclos lítico e lisogênico 
• Recombinação em vírus 
• Mapeamento de genes em bacteriófagos 
• Bacteriófago: do grego “comedor de bactérias”, i.e. vírus que infecta bactérias. 
 
 
 
• Dois colifagos (bacteriófagos de E. coli) tiveram papeis especialmente 
importantes na elucidação da genética de vírus: 
• Bacteriófago T4 (= Fago T4 ou T4) 
Trata-se de um fago virulento, i.e., usa a maquinaria metabólica da bactéria 
para se reproduzir e mata o hospedeiro durante o processo. 
• Bacteriófago Lambda (= Lambda, ) 
Trata-se de um fago temperado, i.e., ele pode matar a célula OU entrar em uma 
associação especial com a mesma e replicar seu genoma junto com a 
genoma do hospedeiro durante a divisão celular. 
 
 
 
 
Lambda 
T4 
• T4 possui um genoma de dsDNA de 168.000 pb armazenado na cabeça, 150 genes 
além de mais 150 ORFs (Open Reading Frames – Fases Abertas de Leitura). 
• Composto basicamente de DNA (50%) e proteínas (50%). 
• A bainha (sheath) é oca e composta por proteínas contráteis que permitem a 
introdução da cauda através da parede celular bacteriana e inoculação do genoma 
viral. 
 
 
 
 
 
 
 
Elétron-micrografia de um T4 do qual o 
DNA foi liberado através de choque 
osmótico. 
• T4 é um fago lítico (virulento), i.e., ele mata o hospedeiro durante a replicação, 
liberando uma progênie de 300 fagos. 
 
 
 
 
 
• Ciclo bacteriano: 20 min 
• Ciclo viral: 17 min 
 
 
 
 
 
 
Nuclease viral não degrada o genoma 
viral porque ele é modificado* 
 
*5 hydromethylcytosine 
• Lambda é menor que T4, porém seu ciclo de vida é mais complexo. 
• Ele possui 50 genes dispostos em um genoma linear de dsDNA de 48.502 pb. 
 
 
 
 
 
Logo após entrar na célula 
o genomar circulariza-se. 
 
Em seguida ele pode entrar no 
ciclo lítico (como T4) ou no 
ciclo lisogênico (inserindo seu 
DNA no genoma da célula 
hospedeira, permanecendo 
inativo). 
 
Durante o ciclo lisogênico 
o DNA do fago é denominado 
profago. 
 
 
 
 
A integração do genoma circular de  ocorre através de um processo de recombinação 
sítio-específica, envolvendo uma integrase viral (gene  int) e os sítios attP e attB. 
 
 
 
 
 
As regiões centrais dos sítios attP e attB 
possuem as mesmas sequências nucleotídicas  
 
 
 
 
Como a recombinação ocorre exatamente no meio dos sítios attP e attB, o profago 
apresenta os sítios attB/P em ambas extremidades. 
Isso é importante pois permitirá a excisão controlada do fago por um evento 
semelhante de recombinação sítio-específica. 
 
 
 
 
 
A excisão espontânea de  ocorre a cada 105 divisões celulares. É por este motivo 
que o ciclo é chamado lisogênico (=capaz de causar lise, mesmo que em baixa 
frequência). Alternativamente, a excisão pode ser induzida por UV. 
Em ambos os casos o processo é preciso. Porém, partes do genoma bacteriano 
podem eventualmente ser carregadas junto com o fago. 
 
 
 
 
 
Como realizar o mapeamento de genes se os vírus não sofrem meiose? 
 
 
 
 
Placas de lise 
(regiões nas quais houve morte 
bacteriana devido a replicação do fago) 
 
 
 
Halos de inibição 
(regiões nas quais houve inibição do 
crescimento bacteriano devido a 
presença de antibióticos) 
 
 
Como cultivar vírus em laboratório? Há meios de cultura para vírus? 
 
 
 
 
Mutantes para morfologia da placa de lise (r e r+) 
T4 de lise rápida (r): mata rapidamente as bactérias e forma uma placa de lise grande 
com borda bem definada. 
T4 selvagem (r+ ): quando um fago T4 r+ se adere a uma célula já infectada com esta 
mesma linhagem (r+), ele desencadeia a síntese de mais material para a parede 
celular, atrasando a lise por pelo menos 2 horas. Este processo denominado inibição 
de lise é responsável pela margens nebulosas (mal definidas) das placas de lise do 
fago selvagem. 
 
 
 
 
 
Mutantes para diferentes linhagens hospedeiras (h e h+) 
T2 selvagem (h+): se replica bem em E. coli da linhagem B, mas não na linhagem B/2. 
T2 (h): se replica bem em ambas linhagens hospedeiras. 
 
 
 
 
 
h+ h 
E. coli B E. coli B/2 
h 
Placa de Petri contendo: E. coli B + E. coli B/2 
h: placas bem definidas 
h+: placas turvas (lodosa, barrenta) 
 
 
h+ 
Alfred Hershey e Max Delbrück, 1946 
Infectaram E. coli B simultaneamente com T2 h+ r e T2 h r+ 
 
 
 
 
 
 
 A. Hershey M. Delbrück 
Morfologia das placas de lise quando 
os vírus são cultivados em de E. coli B+B/2 
Total de recombinantes: 2% 
Distância entre os loci h e r: 2 centiMorgans