4-Experimentos Importantes da Genética

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas
Departamento de Biodiversidade, Evolução e Meio Ambiente
Disciplina Genética
Professor: Armando Maia Wood
4-Experimentos Importantes da Genética
A pergunta fundamental aqui: Quais foram os experimentos que definiram para o homem, que o responsável pela hereditariedade seria o DNA?
Experimento Número 1
Frederick Griffith, Inglês, publicou seu trabalho em 1928
Trabalhou com a bactéria, Gran+, Diploccocus pneumoniae, causadora de pneumonia em humanos.
	Griffith estava atrás de uma vacina contra os pneumococos, desde Edward Jenner 1749-1823 (inglês também) os homens já conheciam as vacinas, Jenner observou que as mulheres que tiravam leite, e que tinham contato com pequenas feridas da varíola da vaca não contraíam a varíola de humanos, uma pequena ferida na mão da mulher e em contato com as pústulas da doença em vacas, fazia com que as mulheres ficassem imunizadas. Jenner coletou as casquinhas das feridas nos úberes das vacas e usou este material para vacinar humanos, com grande sucesso.
Os Diploccocus pneumoniae quando eram colocados para crescer em meio semi-sólido, apresentavam colônias, que quando a luz batia sobre elas, davam a impressão de serem colônias com aspecto em sua superfície de lisas (em inglês smooth), logo chamou estes Diploccocus de “S”. Observando ao microscópio óptico, detectou-se a presença de uma cápsula ao redor da célula deste Diploccocus. 
Estas placas com meio semi-sólido e os Diploccocus crescendo em sua superfície (crescem com o raio, para todos os lados), se forem deixadas ocupar a superfície do Agar (substância na forma de pó, purificada de algas, que serve para fazer meios semisólidos), em um certo momento, naturalmente pode acontecer uma mutação natural, e sua freqüência é de uma célula mutante em um milhão de células selvagens. Se o crescimento neste setor continuar, será formado um setor diferenciado, forma diferente, na placa. Observando este setor, e retirando algumas células deste local e colocando para crescer em meio líquido separado e depois plaqueando novamente, observa-se o aparecimento de colônias que apresentam um aspecto, quando a luz incide sobre elas, de apresentar aspecto rugoso em sua superfície (em inglês rough). Logo Griffith deu o nome a estas células de “R”. Posteriormente observando estes mutantes ao microscópio ótico, observou que estas não possuíam cápsulas.
Os experimento foram feitos tendo como cobaias alguns camundongos, os Diploccocus eram inoculados sob a pele do animal, e o animal quando morria, deveria através da autópsia, ser detectado o organismo causador da doença e a doença deveria ser necessariamente a pneumonia.
Os experimentos consistiram em quatro diferentes situações:
1)- S + Camundongo ® morte, autópsia (S).
2)- R + Camundongo ® não morre.
Estes resultados nos leva a desconfiar da cápsula, pois esta é a única diferença entre as duas células de Diploccocus.
Uma das técnicas para se fazer vacinas é tentar diminuir a virulência do agente causador da doença. Griffith vai usar o calor para lisar as células de Diploccocus. Coloca-se o tubo de ensaio com o meio e as células, retira-se uma gota desta solução e observa-se ao microscópio ótico (MO), observa-se as células andando de um lado para outro normalmente, depois coloca-se sobre um bico de Bunsen, aquecendo por um minuto e retira-se mais uma gota e observa-se ao MO, vendo que algumas células foram lisadas, repete-se a operação com mais um minuto até que todas as células estejam lisadas, mas observe bem, as estruturas moleculares contidas no tubo não foram destruídas, pois não ficou cozinhando o extrato para quebrar todas as ligações existentes, mas foram lisadas todas as células. Chamaremos este material de extrato da célula “S” morta pelo calor que representaremos como SD (esse delta).
3)- SD + Camundongo ® não morre.
4)- SD + R + Camundongo ® morte, autópsia (S).
Este quarto experimento é intrigante, o quê aconteceu? 
Griffith propôs a presença de um princípio transformante, algo do extrato (SD) morto pelo calor, foi capaz de adentrar a célula R e transformá-la em S, novamente. Griffith não foi capaz de determinar especificamente, qual a substância, responsável pela transformação, por isto colocou um nome sutil para o fator (princípio transformante).
O objetivo do experimento não foi alcançado, Griffith não conseguiu a vacina contra o Diploccocus, mas achou interessante o quarto experimento, sentindo algo importante neste resultado, publicou seu trabalho em 1928.
Bibliografia:
Griffith, F., 1928. The significance of pneumococcal types. Jour. Hygiene, 27,113-159.
Experimento número 2
Avery,O.T. e Goebels, 1941
	Avery e Goebels, fizeram uma leitura do trabalho de Griffith, para descobrir qual era o fator transformante, mas se restringiram ao estudo da cápsula, que era o fator mais claro, seu envolvimento com o princípio. Depois de uma centrifugação diferencial, purificaram as cápsulas de Diploccocus pneumoniae e foram capazes de determinar a composição química da cápsula, como constituída de polissacarídeos. Descobriram também que cepas diferentes da bactéria só eram capazes de fabricar um tipo específicode polissacarídeo, do tipo I, II, III, e IV. Tentaram colocar a cápsula pura junto com R e injetaram em um camundongo mas não transformava. E consequentemente os camundongos não morriam.
Experimento número 3
Avery,O.T.,C.M.Mac Leod, and M.Mc Carty, 1944
Pergunta: Como Avery et al, vão desenvolver o trabalho definitivo, onde será determinado que o responsável pelo princípio transformante de Griffith é o DNA?
	Neste momento os bioquímicos já tinham purificado há pouco tempo, as seguintes enzimas: DNase, Rnase e uma Protease (tripsina e a quimiotripsina, já conhecidas há mais tempo). Este foi um trabalho longo, demorou dez anos para sua publicação.
	Neste ponto devemos colocar que se desconfiava do DNA, do RNA e das proteínas, o que se conhecia na época de complexo eram as proteínas e um responsável por transportar uma mensagem para algo complexo deveria ser complexo também. Ainda não se conhecia as estruturas do DNA nem do RNA. No extrato estava presente o DNA, o RNA e as proteínas, pois as células foram lisadas e tudo que estava dentro das células foi para fora e estava presente no extrato. A lógica do experimento é que os três estavam presentes ao mesmo tempo no extrato, logo se fossem usadas enzimas duas a duas, destruiríamos duas substâncias e ficaríamos com somente uma íntegra em cada tubo e seria testado cada um quanto ao seu poder de transformação.
Experimento:
Extrato + Dnase + Rnase = (P) + R + camundongo ® não morre
Extrato + Dnase + Protease = (R) + R + camundongo ® não morre
Extrato + Rnase + Protease + (D) + R + camundongo ® morte, autópsia (S).
Como podemos observar só quando o DNA fica íntegro no tubo, neste foi capaz de se observar células transformadas de células R em S e sendo capaz de matar o camundongo de pneumonia portanto. 
Com este experimento se determinou o agente transformante e consequentemente da hereditariedade em bactérias era o DNA. O princípio transformante de Griffith era o DNA. O primeiro experimento definitivo, demonstrando que o DNA era o responsável pela hereditariedade de um ser vivo.
Hoje sabemos que o DNA entra nesta célula, Gram positiva, permissiva, e adentrando o citoplasma, o DNA exógeno, pareia com o DNA residente e fazem uma espécie de “crossing over” não meiótico, trocando o gene com erro pelo gene correto para síntese da cápsula e este material incorporado, ao DNA bacteriano, permite agora a bactéria produzir a síntese do polissacarídeo expresso na cápsula. A maioria das bactérias não permite esta invasão por DNAs exógenos (células Gram negativas não permitem).
O resultado desta ação permite a bactéria o poder da invasibilidade, podendo infectar o camundongo matando-o de peneumonia.
Bibliografia:
Avery,O.T.,C.M.Mac Leod, and M.Mc Carty, 1944. Studies on the Nature of the Substance InducingTransformation of Pneumococcal Types. Jour. Exp. Med., 79: 137-158. Reprinted in J.A. Peters, ed. 1959. Classic Papers in Genetics, Englewood Cliffs, N.J.,Prentice-Hall.
Experimento número 4
Pergunta: Como ampliar a importância do DNA.
Hershey,A.D., M. Chase, 1952, trabalharam com o vírus T2, que tem como hospedeiro a Escherichia coli, (Gram negativa, enterobactéria) sendo portanto um bacteriófago (vírus cujo hospedeiro é uma bactéria). Logo podemos induzir que esta bactéria possui em sua membrana, um tipo de receptor para este tipo de vírus.
	Para entender este experimento, são necessários quatro conhecimentos: o primeiro, o que é um isótopo? 
Este conceito surge quando por exemplo comparamos dois átomos e se eles tiverem o número atômico igual (Z=) e o número de massa diferentes (A ¹) e compreendemos que eles são diferentes por causa dos seus número de nêutrons (N), se isto ocorre consideramos estes dois átomos como isótopos.
Os químicos já determinaram a existência de uma certa porcentagem de isótopos entre os átomos de um elemento químico na natureza observa-se que cada um dos elementos químico tem uma certa porcentagem de cada um de seus isótopos. A maioria dos elementos apresentam dois ou mais isótopos, mas em alguns casos (berílio, flúor, sódio, alumínio) apresentam só um isótopo naturalmente, podendo ainda apresentar outros produzidos artificialmente e mas são mais instáveis. O estanho é o elemento que apresenta o maior número de isótopos estáveis (10). As propriedades químicas de todos os isótopos de um elemento são iguais, podendo formar os mesmos compostos químicos, que o elemento químico seja capaz de fazer. 
O próton apresenta uma massa de 1,0078 unidades de massa atômica, o nêutron apresenta uma massa de 1,0090 unidades atômicas. O hidrogênio, por exemplo, apresenta os seguintes isótopos: hidrogênio comum (H1), chamado de leve (1,0078 unidades de massa atômica), mas em cada 5.000 átomos de hidrogênio encontraram um chamado de deutério (2,0168 de massa atômica), mais pesado, estes dois são os isótopos estáveis do hidrogênio, artificialmente pode-se ainda conseguir o trítio (H3)(3,0258 unidades de massa atômicas), este é radioativo, podendo se decompor espontaneamente. O oxigênio comum é o O-16, e encontramos uma pequena porcentagem de O-17 e O-18.
	O segundo ponto que devemos saber é que o vírus em sua composição é constituído de uma cápsula protéica e do material genético, neste caso do T2 é o DNA. Observando a constituição química dos dois teremos:
	 DNA = C,O,H, N, P
	Proteína = C,O,H, N, S
	A questão é, qual elemento que está em cima que não está em baixo e qual está em baixo e não está em cima, conclusão o fósforo acima e o enxofre abaixo. Temos de lembrar que se forem usados os dois isótopos P32 e o S35, devemos saber que o fósforo marcará todos os monômeros (desoxirribonucleotídios), mas o enxofre marcará somente os aminoácidos que possuírem enxofre (que no caso são cisteína e metionina), na composição das proteínas. Quase sempre as proteínas têm todos os aminoácidos em sua composição, mas existem proteínas que não possuem certos aminoácidos, também pode acontecer.
	O terceiro ponto consiste em entender a lógica da técnica de separação, chamada centrifugação, que será mais bem explicada em um experimento posterior. Aqui neste ponto é importante saber a lógica. A força da centrifugação serve para separar substâncias, compostos e estruturas. Quando se centrifuga, a força empurra a matéria, que possui uma certa superfície, para esta força atuar, quanto mais superfície, menor a força para empurrar a matéria para o fundo do tubo, formando um precipitado ou “pellet”, e o que não foi empurrado para o fundo fica no sobrenadante em solução. Se uma matéria é muito pequena e não tem superfície para a força atuar, neste caso é preciso uma força enorme para empurrar esta matéria para o “pellet”. Uma célula, como uma bactéria, quando se usa a centrifugação de baixa velocidade é empurrada para o “pellet” e devemos posteriormente, com cuidado, despejar o sobrenadante em um outro tubo e ficar com o “pellet" (constituído portanto, pelas células da bactéria separadas pelo processo da centrifugação, aglomeradas no fundo do tubo)
	O quarto ponto é como marcar o DNA e as proteínas do vírus. Aqui devemos saber que o hospedeiro é o responsável pela síntese dos desoxirribonucleotídios e dos aminoácidos que serão utilizados na reprodução do vírus. A bactéria é capaz de sintetizar todos os desoxirribonucleotídios e todos os aminoácidos necessários para a reprodução viral. Portanto devemos servir as bactérias com um meio, que possua compostos químicos, que entre eles os isótopos (P32 e o S35) na forma de sais, que se deseja usar e ao hospedeiro caberá fabricar os monômeros necessários para a reprodução viral, fabricando os monômeros, a partir do que se oferece no meio e conseqüentemente marcando as proteínas e o DNA viral. Se deixarmos as bactérias com os vírus crescendo durante a noite “over night” podemos dizer que o DNA e as proteínas ficarão marcadas adequadamente, podendo ser usados no experimento posterior, podemos detectar as moléculas através dos marcadores isotópicos.
	Experimento: 
	As bactérias E.coli, com os vírus T2, foram deixadas crescer em meio com os isótopos P32 e S35, durante a noite, após este tratamento, purificou-se através de centrifugação os vírus que serão usados no experimento.
	Os vírus estando marcados com os isótopos (vírus estrela) foram colocados junto com novas E. coli, que pudessem ser infectadas, e após a infecção, usou-se um aparelho chamado de mesclador ou homogenizador, que faz com que as cápsulas virais ligadas aos receptores nas membranas da célula se soltem e as cápsulas vazias ficariam no sobrenadante, após uma centrifugação de baixa velocidade separou-se o pellet (onde estavam às células, infectadas pelo DNA do vírus e marcado com o fósforo), e o sobrenadante, onde estavam as cápsulas vazias e marcadas com o enxofre. Analisando este sobrenadante encontrou-se 70% do material marcado com o enxofre.
	As células infectadas (com o DNA) foram colocadas em um meio novo, foi analisado o meio e não se percebia a presença de vírus no meio e se encontrarmos depois da incubação uma nova prole de vírus este fato se deveria a presença do DNA dentro da célula de E. coli e então as células foram incubadas, após um tempo adequado, centrifugou-se o meio, separando as células, e encontrando no sobrenadante vírus maduros e nestes alguns estavam marcados com o P32, representando 30% do material marcado total. Não sendo encontrado o S35.
	Logo se chegou a conclusão de que, em vírus o responsável pela hereditariedade era o DNA. Devemos lembrar que existem vírus, cujo material genético não é o DNA. O vírus da AIDS por exemplo é um retrovírus.
Bibliografia:
Hershey,A.D., M. Chase, 1952. Independent fuctions of rival protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. Jour.Gen. Physiol.,36, 39-56. Reimpreso en la colección de Stenty en la de Taylor;1965, Selected Papers on Molecular Genetics. Academic Press, New York.
Experimento número 5
Beadle, G.W. and E.L.Tatum, 1941.
Pergunta: como as mensagens nos genes estão “escritas”na macromolécula DNA?
	Trabalharam com um fungo chamado Neurospora crassa, estes possuem um número haplóide de cromossomos, usando um agente mutagênico físico, descoberto por Miller, que era o Raio X, que permitia criar mutantes artificialmente.
	Os mutantes foram separados dos selvagens através do uso de dois tipos de meios: meio mínimo e meio completo ou complexo. Temos de saber que os fungos selvagens (selvagem são aqueles fungos encontrados na natureza) são capazes de crescer em meios mínimo e no completo, já os mutantes só crescem no meio completo.
	Os fungos foram deixados crescer em meio líquido e depois em meio semissólido, onde cresceu em quase toda a superfície do agar, neste momento foi colocado uma fita adesiva ao redor da placa de petri, criando no interior uma condição e anaerobiose, isto estressa o fungo que é levado para suaforma de resistência, no caso ele forma corpos frutíferos, chamados de ascosporos, conídios, nestes conídios encontramos os esporos (sua forma de resistência). Quando irradiamos na presença destes esporos o DNA encontra-se mais empacotado o que facilita a incidência dos raios X e, portanto propiciando a criação de mutantes. Estes mutantes são chamados de auxotróficos. Não crescem no meio mínimo e precisam de uma suplementação alimentar (meio completo).
	Já colocamos como os mutantes foram separados, através do crescimento ou não crescimento nos meios mínimo e completo, os mutantes escolhidos, todos não cresciam no meio mínimo e cresciam em meio complexo.
	Neste momento os mutantes deverão ser classificados, e para classificá-los, foram colocados dois tubos, um contendo meio mínimo, e o fungo não podia crescer neste tubo (controle negativo), pois essa era a garantia de que ele era mutante. Chamamos este tubo de controle e neste caso era um controle negativo, pois não era capaz de crescer. O segundo tubo continha meio mínimo e todos os tipos de aminoácidos (20 tipos diferentes), se o mutante crescesse neste tubo, saberíamos que ele perdera a capacidade de sintetizar um tipo de aminoácido e agora não conseguia crescer sem que lhe fosse oferecido pronto o aminoácido já sintetizado (meio completo). Os mutantes que apresentavam estas características passavam para uma outra bateria de tubos, em número de vinte e um, onde um deles era o controle negativo que é o meio mínimo sozinho e os outros são meio mínimo mais um tipo de aminoácido diferente. E devemos fazer isto com cada um dos mutantes.
	Desta bateria foram selecionados três tipos de mutantes:
1) mutante que cresceu em um tubo onde foi acrescentado arginina
2) mutante que cresceu em dois tubos onde se acrescentou arginina e citrulina 
3) mutante que cresceu em três tubos onde foi acrescentado arginina, citrulina e ornitina.
	Neste momento, não pode ser esquecido que para o geneticista só interessa o mutante com um só tipo de mutação, porque conseqüentemente não seria possível saber se em um experimento qual das mutações estaria influenciando o resultado encontrado. Tornando o experimento dúbio e não aceitável, devendo ser desprezados.
	Outros pesquisadores abandonariam os números dois e três, mas Beadle e Tatum, tiveram a sensibilidade de perceber que dentre os três mutantes, todos cresciam quando era oferecido arginina, e dois deles cresciam quando era oferecido citrulina. Pensaram se não seria possível se estes aminoácidos estivessem em uma mesma via metabólica no fungo.
	Eles encontraram com os mutantes acima três tipos diferentes de loci das mutações e em cromossomos diferentes.
	Os aminoácidos estavam realmente em uma mesma via metabólica, formando uma seqüência mais ou menos assim:
 Enz 1 Enz 2 Enz 3
 Precurssor ( ornitina ( citrulina ( arginina
	Como pode ser visto, podemos dizer que o mutante número um tem um problema na enzima número 3, o mutante dois tem sua mutação na enzima 2 e o terceiro tem sua mutação na enzima número 1. Srb e Horowitz (1944), refizeram estas mutações usando dois agentes mutagênicos físicos o Rx e o UV, conseguindo 15 mutantes diferentes e encontraram os sete passos diferentes desta via. O que reforçou os três encontrados anteriormente. 
Como a sequência:
 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7
 1(2(3(4(Orn(5(Citru(Arginina
1º mutante problema na enzima 7
2º mutante problema na enzima 6
3º mutante problema na enzima 4
	Cada vez que ocorria uma mutação, o fungo perdia uma enzima. Isto levou a dupla de pesquisadores a generalizar da seguinte maneira “um gene uma enzima”.
	Por um certo tempo esta generalização permaneceu como correta, mas depois foram descobertas outras funções para as proteínas e a generalização não procedia mais e teve de ser modificada para “um gene um polipeptídio”. Desta maneira se descobriu que o DNA trazia mensagens para sintetizar proteínas, que podiam exercer diferentes funções, como as enzimas sem dúvida, mas também as proteínas estruturais, os hormônios protéicos (nem todo hormônio é protéico), as imunoglobulinas e muitas outras funções com proteínas de transporte etc. Mas todas eram feitas com polipeptídios.
	O trabalho dos dois levou dez anos oferecendo muitos frutos, e Beadle e Tatum fizeram vários outros experimentos, com complementos alimentares, que muitas vezes aparecem na literatura, quando se fala sobre seus trabalhos, vitaminas e etc. Por isto procure entre elas esta que colocamos aqui.
Bibliografia:
Beadle, G.W. and E.L.Tatum, 1941, Genetic Control of Biochemical Reactions in Neurospora . Proc. Nat. Acad. Sci. (US), 27: 499-506. Reprinted in J.ª Peters, ed.,1959. Classic Paper in Genetics. Englewood Clifft, N.J. : Prentice – Hall.
Experimento número 6 
Matthew Meselson e Franklin Sthal, 1958 
Pergunta: Qual o processo pelo qual o DNA é duplicado?
	Trabalharam com a bactéria, Escherichia coli , que foram deixadas crescer em um meio contendo um isótopo pesado do nitrogênio (N15), ao invés do isótopo leve (N14). Este marcador isotópico foi insertado nas bases nitrogenadas, que por sua vez foram incorporadas na forma de desoxirribonucleotídios nas fitas novas do DNA. É importante saber que a bactéria fabrica os 4 tipos de desoxirribonucleotídios a partir da matéria prima oferecido no meio. Após várias divisões das células no meio com o N15, pode-se dizer que o DNA das células estará marcado com este isótopo pesado. Devemos lembrar que o nitrogênio esta presente em cada monômero do DNA nas bases nitrogenadas, cada base nitrogenada possui uma certa quantidade de nitrogênios como: as bases nitrogenadas dos desoxirribonucleotídios de adenina e guanina possuem 5 nitrogênios, citosina tem 3 N e timina tem 2 N. As células foram removidas do meio através de centrifugação de baixa velocidade, estas células com o N15 e foram colocadas em um novo meio contendo o isótopo leve N14, para crescer; após dar tempos de uma geração (no caso de E.coli 20 minutos) e de dois tempos de geração (40 minutos), amostras foram retiradas de meio com as células contidas. O DNA das células foram extraídos das células em cada uma das amostras, de tempo zero, do tempo um ( tempo de 20 minutos) e as do tempo dois (40 minutos). Os DNAs purificados foram colocados em uma solução de cloreto de césio (CsCl) e depois ultracentrifugadas, apresentando padrões de bandas a serem observadas.
	Se o cloreto de césio é colocado para girar na ultracentrífuga, este colocado sob uma tremenda força oferecida por velocidades acima de 50.000 rpm, por várias horas, os íons do cloreto de césio apresentam uma tendência de serem puxados pela força centrífuga para o fundo do tubo. Finalmente, um gradiente de íons de Cl+ e Cl-, estabilizam-se no tubo, com as maiores concentrações de íons no fundo do tubo. As moléculas de DNA em solução também são puxadas através do tubo até o fundo, pela força centrífuga. Mas a medida que elas trafegam dentro do tubo, elas encontram um aumento crescente na concentração do sal em direção ao fundo do tubo, em contrapartida as moléculas de DNA tendem a serem puxadas para traz, fazendo-as boiar (ou sua tendência de flotar, força de flotação).
	Deste modo o DNA finalmente encontra um certo local no tubo, onde as forças da centrifugação e a força de flotação entram em um balanço em relação a molécula que migra, em um certo ponto determinado formando uma banda, no gradiente de densidade de cloreto de césio. A força de flotação do DNA depende da densidade (o que reflete nas proporções entre os pares: G e C e A e T). A presença do isótopo pesado do nitrogênio muda a densidade de flotação do DNA. Dando uma diferença de 1%, o que permite o bandeamento diferencial, aparecendo bandas diferentes.
	Os padrões usados por Meselson e Sthal, foram os DNAs marcados com o isótopo N14, e com o isótopo do N15. Se for ultracentrifugado por tempo adequado em um gradiente de densidade em CsCl, teremos asseguintes bandas nos tubos após a centrifugação, sabendo que quem é mais pesado fica mais no fundo do tubo, quem é mais leve fica mais perto da boca do tubo:
1) DNA marcado com N14 - dá uma banda chamada de leve, mais perto da boca do tubo.
2) DNA marcado com N15 - dá uma banda chamada de pesada, pois está mais ao fundo do tubo.
	Quanto mais pesado o material, mais para o fundo ele irá formar sua banda que chamamos de pesada, e se for mais leve, no gradiente formará uma banda para o lado da boca do tubo e mais no alto, que chamamos de leve. Se forem misturados um pouco do material dos DNAs, marcados com os isótopos N14 e N15 teremos juntos no mesmo tubo:
3) Um pouco dos dois DNA marcados um com o N14 e o outro com o N15- teremos em um mesmo tubo um padrão de banda de duas bandas uma leve e uma pesada. Estes são os nossos três padrões de migração de bandas no gradiente de densidade.
	Agora vamos analisar as hipóteses consideradas no trabalho:
Primeira Hipótese chamada de Conservativa
	Nesta hipótese considera-se que as duas fitas do DNA servem de molde ao mesmo tempo para a formação de uma fita dupla toda nova que surge. Se purificarmos os DNAs de cada tempo (T=0; T=20’; T=40’) que tipo de padrão teríamos, se forem colocados ao lado de cada um.
Hipótese Conservativa Duplicação Padrões
Logo: 
Tempo zero:
TG-0 N15 / N15 = Uma banda pesada.
1ª geração=20’.
TG-1 N15 / N15 + N14 / N14 = padrão duas bandas, uma leve e uma pesada.
2ª geração=40’.
TG-2 N15 / N15 N14 / N14 + N14 /N14 N14 / N14 = padrão duas bandas, uma leve e uma pesada.
TG = a tempo de geração. Tempo necessário para que uma bactéria seja capaz de exercer suas funções, crescer e se desenvolver até se dividir em duas células, em E. coli este tempo é de 20 minutos.
	Temos aqui o que estaria acontecendo com a duplicação do DNA e o que se espera como padrão de banda em forma de bandas resultantes da ultracentrifugação em um gradiente de densidade de CsCl.
Segunda Hipótese chamada de Semiconservativa
	Nesta hipótese considera-se que cada uma das fitas do DNA serve de molde para uma nova fita simples complementar a fita antiga. Se purificarmos os DNAs de cada tempo que tipo de padrão teríamos, será colocado ao lado de cada uma.
Logo: 
Tempo zero:
TG-0 N15 / N15 = Uma banda pesada.
1ª geração=20’.
TG-1 N15 / N14 + N14 / N15 = padrão duas bandas, única intermediária.
2ª geração=40’.
TG-2 N15 / N14 N14 / N14 + N14 /N14 N14 / N15 = padrão duas bandas, uma leve e uma intermediária.
	Temos aqui o que estaria acontecendo com a duplicação do DNA e o que se espera como padrão de banda em forma de bandas resultantes da ultracentrifugação em um gradiente de densidade de CsCl.
	Estas são as duas hipóteses consideradas no trabalho. 
	No experimento agora temos: as células foram deixadas crescer em meio adequado, com o isótopo N15, durante a noite, depois foi feita uma centrifugação de baixa velocidade, separando as células do sobrenadante. Após a separação das células, estas foram ressuspendidas em um meio novo onde se apresentava somente o isótopo N14.
	As bactérias foram incubadas e deixadas crescer nos três tempos distintos, o primeiro chamado de tempo zero, o segundo 20’ e o terceiro 40’, retirou-se um terço do volume constituindo o primeiro tempo zero, após passar 20’, retirou-se outro terço que era o segundo tempo (20’) e foi colocado em um tubo junto com gelo (O(C), depois de mais vinte minutos constituímos o 40’ o último terço foi colocado em um tubo no gelo. As células foram lizadas com lisozima e tiveram purificados seus DNA (tirar as proteínas), e posteriormente foram colocados em um gradiente de densidade em CsCl, para ultracentrifugar, por 48hs a 100.000 rpm. 
	Após a corrida foram observados os padrões de bandas em cada tubo e foram conseguidas em TG=0 uma banda pesada, em TG-1 uma banda intermediária e em TG-2 duas bandas uma leve e uma intermediária.
	Comparando estes resultados com as hipóteses veremos que confere com a hipótese de número dois, semiconservativa. Logo o processo pelo qual o DNA é duplicado em bactérias é o semiconservativo.
	Como pode ser observado foram utilizados isótopos do nitrogênio neste experimento. A utilização destes isótopos se deveu a diferença em seus números de massa, a diferença na massa das moléculas de DNA e conseqüentemente nas moléculas de DNA dentro do gradiente de densidade, marcadas com o isótopo N14 e as marcadas com o N15, permitiu o aparecimento de bandas diferenciadas onde podíamos distinguir entre as moléculas de DNA velho(N15) ou do recém sintetizado (N14). Mas lembre-se que este experimento o resultado é dado com um padrão de bandas conseguidos depois da ultracentrifugação em um gradiente de densidade de CsCl
Bibliografia:
Meselson, M.S., and F.W. Sthal, 1958. The Replication of DNA in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. (US), 44: 671-682.
Experimento número 7
Rosalind Franklin e Maurice Wilkins 1952, Wilkins, inglês, Francklin, inglesa.
A pergunta aqui colocada é depois que ficou determinado que o DNA era o responsável pela hereditariedade muitos cientistas procuraram determinar qual seria a exata estrutura molecular do DNA.
	Franklin e Wilkins trabalharam com E.coli , após crescer em meio líquido, peletaram as células através de centrifugação, lisando estas células com lisozima posteriormente, purificando o DNA (tirar as proteínas), e finalmente foi retirada a água contida no DNA e este se transformou em fibras cristalizadas. A técnica usada foi a cristalografia, que consiste em colocar os cristais de interesse sob uma emissão de Raio X, que logo em seguida passa por um colimador, o colimador faz com que todos os raios que passam por ele fiquem paralelos entre si. Passando pelas fibras cristalizadas os raios, todos paralelos, estes são espalhados pela estrutura das moléculas de sais ali presentes e a radiação é espalhada e recolhida por um filme sensível ao Raio X, que é queimado pelos raios incidentes espalhados pelas moléculas queimando o filme. Após a revelação do filme, as manchas resultantes são interpretadas pelos cristalógrafos, como as características provocadas pelas distâncias e ângulos destes cristais, que provocaram tal espalhamento, assim como informações sobre a posição de certos átomos ou de certos grupos de átomos na molécula. E o trabalho desta dupla portanto consistiu na determinação de distâncias e ângulos da molécula de DNA. A avaliação feita sugeria que o DNA era uma molécula longa e extremamente fina, e possuíam duas fitas similares, paralelas uma a outra. Os dados apresentados pelo Raio X mostrou que a molécula era helicoidal.
Bibliografia:
Wilkins,M.H.F., A.R. Stokes y H.R. Wilson, 1953. Molecular structure of desoxypentose nucleic acids. Nature, 171, 738-740.
Wilkins, M.H.F., 1963. The molecular configuration of nucleic acids. Science, 140,941-950.
Franklin, R.E. and R.Gosling, Nature, 171, 740, 1953.
Experimento número 8
J.D.Watson e F.H.C Crick 1953 (PN de 1962) Watson americano, Crick, inglês Cavendish Lab,Cambridge Univ. Temos frisar que estes não fizeram experimentos, desenvolveram experimentos teóricos, Biologia teórica.
	O trabalho de Franklin e Wilkins foi muito importante para Watson e Crick, outro indício analisado por Watson e Crick, foi o trabalho de Erwin Chargaff, que determinou a proporção existente entre as bases A-T e C-G em DNA de vários tipos de seres, Chargaff determinou empiricamente algumas regularidades:
1) A quantidade total de nucleotídeos de pirimidinas (T e C) era igual à quantidade total de nucleotídeos de purinas (A e G);
2) A quantidade de T era igual à quantidade de A, e a quantidade de C era igual à de G. Mas a quantidade de A e T não era necessariamente igual à quantidade de C e G.
	Watson e Crick conceberam de todos estes indícios um modelo de uma dupla hélice, feita por uma corrente de desoxirribonucleotídeos, ligados entre si por pontes de ligação fosfodiéster, onde um grupamento fosfato forma a ponte entre o grupo- OH entre dois resíduos de açúcares adjacentes. As duas fitas são ligadas por pontes de hidrogênio, duplas ou triplas, dependendo das bases nitrogenadas presentes. A e T são duplas e entre C e G são triplas. Para formar estas pontes de hidrogênio são necessários dois elementos eletronegativos, um de um lado e o outro do outro, que compartilham um próton (hidrogênio) entre si. Uma ponte de hidrogênio é uma ligação fraca, pois significa 3% da força de uma ligação covalente. Mas esta ligação fraca tem uma importância grande na função do DNA na hereditariedade. Um dos importantes fatos é que a ponte de hidrogênio fica mais forte se os átomos participantes são colocados um atras do outro, com uma orientação sequencial.
	Os degraus se distanciam uns dos outros de 3,4 Å (angstrons), e uma volta completa na fita dupla sobre o eixo central é dez vezes maior = 34 Å. O diâmetro da molécula tem 20 Å . Temos de saber também que um degrau está deslocado em relação ao próximo, com um ângulo de 36 graus, formando uma hélice. Observando o desenho, pode ser visto que as duas fitas giram juntas ao redor do eixo central, de fora então está a porção hidrofílica e ao mesmo tempo o esqueleto da molécula, porção açúcar - fosfato, e a parte de dentro é a porção hidrofóbica, formada pelas bases nitrogenadas.
	Uma das fitas simples é paralela à outra fita simples, mas uma está o inverso da outra. Se for observada a orientação dos carbonos da pentose em uma das fitas, uma delas tem orientação 3’ ( 5’ e a outra ao contrário 5’ ( 3’.
	A molécula apresenta-se como uma escada onde os corrimãos são uma seqüência de pentoses e ácidos fosfóricos e nos degraus temos as bases nitrogenadas pareadas entre as duas fitas, formando as pontes de hidrogênio e é onde encontraremos as mensagens do código genético.
	Como poderia funcionar esta mensagem? Necessitamos de informações para fazer proteínas com a qual se constrói os corpos dos seres vivos, para construir as proteínas precisamos de aminoácidos e estes existem formando seres vivos em número de 20 tipos diferentes. Nos degraus estão as bases nitrogenadas e estas estão em número de quatro: A (dATP),C(dCTP),G (dGTP),T(TTP), diferentes bases, encontradas nos desoxirribonucleotídios, cada um deles com uma base diferente. Se cada uma fosse uma mensagem teríamos quatro insuficientes mensagens; 4 elevado a um =4; se tivéssemos uma leitura com duas a duas, teríamos 4 elevado a dois = 16, já ficou melhor mas estariam faltando quatro aminoácidos, por fim se tivermos leitura com três a três; teríamos 4 elevado a três = 64. Que contempla perfeitamente e sobram mensagens. As mensagens portanto são constituídas por seqüências de tripletes e como temos mais de um triplete que podem significar um mesmo aminoácido, denominamos o código genético de degenerado, existem somente dois aminoácidos que possuem uma só mensagem como metionina (AUG) e o triptofano (UGG). 
Leucina aminoácido que possui seis opções (UUA,UUG,CCU,CUC,CUA, CUG), prolina, treonina, alanina, arginina, e glicina possuem quatro, isoleucina tem três, fenilalanina, histidina, ácido glutâmico, asparagina, lisina, ácido aspártico, glutamina, cistina, serina e arginina possuem duas mensagens e ainda temos três mensagens que não são mensagens para aminoácidos, são mensagens de parada, códigos de finalização dos genes (UAA,UAG e UGA). Logo teremos 61 mensagens para aminoácidos e três sinais de parada formando então 64 combinações dos quatro desoxirribonucleotídeos. Com os tripletes formamos mensagens que se relacionam com uma sequencia de aminoácidos, na constituição de uma proteína, que é capaz de exercer uma função na célula. Logo se eles não estiverem em posição e na fita certa, não conseguiremos sintetizar as proteínas necessárias.
 Tirar de fase um gene significa não respeitar estes códigos na fita correta. Se mudarmos uma única base, tudo que estiver para frente será modificado na sequência, se mudarmos dois da mesma forma atrapalha toda a sequência para frente, mas se mudarmos três bases mudamos somente um aminoácido na seqüência da proteína. Que pode ser considerado um dano menor, mas dependendo do local na proteína onde foi feita esta mudança, insignificante que possa parecer, pode mudar toda a proteína inviabilizando sua função. Temos de lembrar a máxima “Forma possui relação direta com a Função“, quando se fala em proteínas.
	
Bibliografia:
1-Watson, J.D. e F.H.C. Crick, 1953. Molecular Structure of Nucleic Acids. A Structure for Deoxyribonucleic Acid. Nature, 171: 737-738. Reprinted in J.H.Taylor, ed., 1965. Selected Papers on Molecular Genetics. New York: Academic Press.
2-Watson, J.D. e F.H.C. Crick, 1953. Genetical implications of the estructure of the deoxyribonucleic acid. Nature, 171, 964-967.
3-Chargaff,E., and J.N. Davidson. 1955. The Nucleic acids. Vol II. Academic Press, New York.