Diagnóstico das Infecções Virais - Aula 4

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Diagnóstico das infecções virais: métodos clássicos, imunológicos e moleculares
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Imunofluorescência
Diagnóstico de infecções virais
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Imunofluorescência
Métodos diretos
Métodos diretos: utilizados na detecção do vírus, antígenos ou genoma viral:
Microscopia eletrônica
Isolamento viral
Detecção antígeno (IPX, IF, Imunocromatografia)
Hemaglutinação (HA)
ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
PCR, RT-PCR, qPCR
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Microscopia Eletrônica
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Isolamento Viral em Cultivo Celular
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Isolamento Viral em Cultivo Celular
Vírus são espécie-específicos, mas alguns conseguem se replicar em espécies homólogas.
Células MARC-145 (macrófago renal de macaco)
Células VERO (rim de macaco verde)
Células RK-13 (rim coelho)
Células MDCK(rim canino)
Células GBK(rim bovino)
Células MRC-5 (pulmão feto humano)
Células HeLa (célula de carcinoma cervical)
Células HEp-2 (célula tumoral de carcinoma laríngeo humano)
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Imunofluorescência
Métodos diretos: isolamento viral em cultivo celular
Cultura Primária
Derivadas diretamente dos tecidos
Custo elevado, dificuldade de obtenção
Cultura Contínua
Úteis em pesquisa
Vacina
Cultura Transformadas
Diminui característica do tecido
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Imunofluorescência
Métodos diretos: isolamento viral em cultivo celular
Efeito citopático
Sincício - sarampo
Coilócito - HPV
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Imunofluorescência
Métodos diretos: isolamento viral em cultivo celular
Obtenção do vírus viável permite a sua caracterização e estudos posteriores 
Detecção de antígenos ou ácidos nucleicos 
Neutralização com soro imune específico 
•Desvantagens: caro, demorado, risco de contaminações 
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Quantificação
Unidade Formadora de Placa
UFP
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Quantificação
Unidade Formadora de Placa
UFP
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Quantificação
Unidade Formadora de Placa
UFP
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Inoculação em animais
Inoculação em animais 
Ex.: em camundongos lactentes para o diagnóstico conclusivo da raiva 
•Inoculação em ovos embrionados 
Ex.:Vacina febre amarela
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Hemaglutinação
Observação da capacidade do vírus de aglutinar hemácias
 
Vantagens: rápida, boa sensibilidade e especificidade e de fácil execução 
Desvantagens: aplicável a um grupo restrito de vírus 
Necessidade de espécies doadoras de hemácias (coelhos ou galinha) 
Hemaglutinina (VAP)
AMOSTRA
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Hemaglutinação
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Pesquisa de Antígenos Virais
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Pesquisa de Antígenos Virais
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Imunofluorescência
Métodos diretos: 
IPX (imunoperoxidase)
NEGATIVO
POSITIVO
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Métodos diretos: Imunofluorescência
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Imunofluorescência Indireta
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Imunofluorescência Indireta
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Imunofluorescência Indireta
IFI a partir do isolamento viral
Fonte: Dr. Roberto da Justa/UFC/HSJ
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Imunofluorescência
Métodos diretos: 
ELISA
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Métodos diretos: 
ELISA
Espectofotômetro
Densidade ótica (D.O)
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Imunofluorescência
Métodos diretos: Imunocromatografia
1
2
 Ac ligado ao ouro coloidal específico para antígeno viral
 Anticorpo específico para antígeno viral é fixo na membrana
1
2
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Métodos diretos: Imunocromatografia
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Bem mais rápidos, menos de 15 minutos.
Baixo custo por não exigir equipamento específico.
Fácil execução e leitura.
Permite intervenção clínica imediata.
Dispensa coleta e envio de materiais biológicos para centros especializados.
100.000 partículas virais são necessárias para resultado positivo;
Qualitativo;
 Geralmente alta sensibilidade e menor especificidade: Falso positivo.
Landry, M. L. Clinics in Laboratory Medicine, 2009.
Métodos diretos: Imunocromatografia
Desvantagens
Vantagens
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Imunofluorescência
Métodos diretos: 
Pesquisa de ácidos nucleicos
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Imunofluorescência
Métodos diretos: 
Pesquisa de ácidos nucleicos
RT-PCR para pesquisa de dengue-1/Ceará
Fonte: LACEN/CE
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Imunofluorescência
Métodos diretos: 
Pesquisa de ácidos nucleicos
Semi nested RT-PCR para pesquisa de dengue
Fonte: Lancitotti, 1992
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Imunofluorescência
Métodos indiretos
Testes sorológicos
Soro-neutralização
Inibição da hemaglutinação
IFI
ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) indireto
Imunocromatografia
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Soro-neutralização
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Soro-neutralização
AMOSTRA
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Soro-neutralização
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Soro-neutralização
IPX
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Soro-neutralização
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Soro-neutralização
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Inibição da Hemalutinação
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Inibição da Hemalutinação
AMOSTRA
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Imunofluorescência
Métodos indiretos: 
Inibição da Hemalutinação
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Métodos indiretos: 
ELISA indireto
ELISA Indireto
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 No geral exige 100.000 partículas virais ou mais para resultado positivo;
Sujeito a erros de pipetagem;
Lavagem cuidadosa e minunciosa é fundamental: ocorrência de falsos positivos
Mais demorado que os testes rápidos e de Imunofluorecência
Métodos indiretos: 
ELISA indireto 
Desvantagens
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Métodos indiretos: outros métodos – 
Imunoquimioluminescência
Detecta anticorpo contra p24, pg120 (HIV-1), gp36 (HIV-2)
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Métodos indiretos: outros métodos – 
Western blot
Associa técnica de eletroforese em SDS-page com técnicas imunológicas
Permite a identificação do reconhecimento de antígenos de peso molecular conhecido
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Métodos indiretos: outros métodos – 
Western blot
Teste confirmatório HIV
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Métodos indiretos: outros métodos – 
Western blot
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Limitações da sorologia
IgM e IgG
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Cinética da replicação viral
IgM e IgG
Métodos diretos
Métodos indiretos
Resultado positivo: Soroconversão
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Evolução da resposta do hospedeiro
IgM e IgG
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Útil durante a gestação (rubéola e citomegalovírus)
Teste positivo indica infecção a mais de 4 meses 
Métodos indiretos: 
Teste de Avidez
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PARA PENSAR.....
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Controle negativo
Pct 1
Pct 2
Os pacientes estão doentes?
Qual a titulação dos pacientes?
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Quais testes foram aplicados?
São métodos diretos ou indiretos? 
O paciente está doente?
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Dúvidas?
morganabiologia@gmail.com
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Literatura Recomendada
Jawets et al. Microbiologia Médica. 25ed. Lange, 2012.
Murray et al. Microbiologia Médica. 5ed. Elsevier, 2006.
Abbas et al. Imunologia Celular e Molecular. 5ed. Elsevier. 2005
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