Aula - Fundamentos da Microscopia_final

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Fundamentos da 
Microscopia 
Brunno Verçoza 
brunno.vercoza@gmail.com 
 Capacidade visual 
 Capacidade visual 
 Capacidade visual 
 Aproximar um objeto do olho conseguimos ampliação da imagem. 
 Desde que dentro da distância mínima de visão distinta que é 25 cm. 
Óptica e aumento dos 
objetos 
 Principio físico 
o Formação de imagens em Lentes Convergentes 
 
 
 
 
 
O – Centro óptico; 
F – Distancia focal; 
A – Ponto antiprincipal; 
 Principio físico 
o Lentes Convergentes 
 
 
 
 
 
 Principio físico 
 Escalas de medidas 
 Escalas de medidas 
 Escalas de medidas 
A capacidade de 
observação humana 
 Capacidade de observação do olho 
 Capacidade de observação do olho 
 Capacidade de observação do olho 
O que fazer para observar o 
que não podemos ver? 
Mas afinal o que é um 
microscópio? 
 Instrumento utilizado para observação de 
detalhes de objetos ou objetos de dimensões 
extremamente pequenas, que os olhos humanos não 
tem poder de resolver. 
 
 
 
Que informações obtemos 
com os microscópios 
35x 2 mm 
100x 
Capacidade de observação 
dos microscópios 
 Capacidade de observação dos microscópios 
100 µm 
Histórico 
 Capacidade de observação dos microscópios 
 Capacidade de observação dos microscópios 
100 nm 
 Capacidade de observação dos microscópios 
 Capacidade de observação dos microscópios 
 Capacidade de observação dos microscópios 
 Capacidade de observação dos microscópios 
0.1 nm 
 Capacidade de observação dos microscópios 
Uma breve história da 
microscopia 
1590 – Invenção do microscópio por um fabricante de óculos holandês chamado 
Zaccharias Janssen. 
 
1609 – Galileo Galilei desenvolve primeiro microscópio composto por lentes côncavas e 
convexas. 
 
1655 – O inglês Robert Hooke cria o primeiro microscópio composto por dois sistemas 
de lentes, a lente ocular e a lente objetiva. 
 
Histórico 
Histórico 
1655 – Robert Hooke publica Micrographia, o primeiro livro descrevendo as 
observações de diversos organismos feitas pelo microscópio que construiu. Nesse livro, 
Hooke denominou os inúmeros compartimentos separados por paredes de “células”. 
 
1673 – Antoni Van Leeuvenhoek, da Holanda, construiu seu próprio microscópio 
simples, que possibilitou sua descoberta das células vermelhas do sangue, bem como a 
descoberta da bactéria e do esperma humano. 
 
1700 – Esforços para aperfeiçoar o microscópio ópticos foram realizados basicamente 
na Inglaterra. 
Histórico 
1873 – Hermann Helmholtz e Ernst Abbe demostram que a resolução óptica depende 
da fonte de iluminação e de seu comprimento de onda. 
 
1897 – J.J. Thompson descobre o elétron. 
 
1908 – August Köhler e Henry Siedentopf apresentaram primeiro microscópio de 
fluorescência. 
 
 
 
 
Histórico 
 
1924 – Louis de Broglie introduz em sua tese de doutorado a teoria sobre o 
comprimento de onda dos elétrons, afirmando que qualquer partícula ou objeto em 
movimento está associado a um comprimento de onda. 
 
1926 – Hans Busch demostrou que lentes magnéticas eram capazes de direcionar 
elétrons da mesmas maneira que as lentes ópticas, finalizando o quebra cabeça para 
montagem dos microscópios eletrônicos. 
 
1932 – Ruska e Knoll criam o primeiro microscópio eletrônico. 
 
 
 
 
Núcleo Multidisciplinar de Pesquisa UFRJ –Xerém em Biologia 
1934 – L. Marton visualizou pela primeira vez uma amostra biológica ao microscópio 
eletrônico. 
 
1935 – Max Knoll introduz o conceito do microscópio eletrônico de varredura. 
 
1945 – Albert Claude publica a primeira imagem de uma célula observada ao 
microscópio eletrônico de transmissão. 
 
1964 – É fabricado o primeiro microscópio de varredura pela Cambridge Instruments. 
Histórico 
Histórico 
Conceitos importantes 
em microscopia 
Aumento 
 
 
 
 
 
 
 
É a capacidade de ampliação do tamanho 
da imagem comparada com o objeto real. 
 Conceitos importantes em microscopia 
35x 6x 
Aumento 
 
 
 
 
 
 
 Conceitos importantes em microscopia 
Resolução 
 
 
 
É a capacidade de distinguir dois pontos 
muito próximos como pontos separados. 
 Conceitos importantes em microscopia 
Limite de Resolução 
d= 
0,61×λ
𝑛×𝑠𝑒𝑛θ
 
 
Meio Índice de Refração 
Ar 1,00 
Vidro 1,50 
Água 1,33 
Glicerina 1,90 
Óleo de Imersão 1,56 
Limite de Resolução 
d= 
0,61×λ
𝑛×𝑠𝑒𝑛θ
 
 
 Conceitos importantes em microscopia 
Resolução 
 Conceitos importantes em microscopia 
35x 
Resolução 
 Conceitos importantes em microscopia 
Principio de funcionamento dos 
Microscópios 
 Principio de funcionamento dos Microscópios 
 Principio de funcionamento dos Microscópios 
 Principio de funcionamento dos Microscópios 
 Principio de funcionamento dos Microscópios 
 Principio de funcionamento dos Microscópios 
 Principio de funcionamento dos Microscópios 
 Principio de funcionamento dos Microscópios 
X 
 Modalidades microscópicas 
 Modalidades microscópicas 
Microscopia Óptica 
O principio físico 
 O principio físico 
Conhecendo o microscópio 
 Conhecendo o microscópio 
Lentes 
Oculares Canhão 
Revólver 
Objetivas Braço 
Platina 
Charriot 
Condensador 
Macrométrico 
Micrométrico 
Lâmpada 
Base Diafragma de 
campo 
 Conhecendo o microscópio 
Detalhes importantes 
 Conhecendo o microscópio 
Lentes 
Oculares Canhão 
Revólver 
Objetivas Braço 
Platina 
Charriot 
Condensador 
Macrométrico 
Micrométrico 
Lâmpada 
Base Diafragma de 
campo 
 Conhecendo o microscópio 
 Objetivas 
 Objetivas 
 Objetivas 
Limite de 
Resolução 
d= 
0,61×λ
𝑛×𝑠𝑒𝑛θ
 
Abertura 
numérica 
NA = 𝑛 × 𝑠𝑒𝑛θ 
Limite de 
Resolução 
d= 
0,61×λ
𝑁𝐴
 
Uma pequena duvida 
 Conhecendo o microscópio 
 Conhecendo o microscópio 
 Lâmpadas 
Limite de Resolução 
d= 
0,61×λ
𝑁𝐴
 
Câmeras 
 Conhecendo o microscópio 
 Conhecendo o microscópio 
 Conhecendo o microscópio 
Observação de células e 
tecidos 
 Observação de células e tecidos 
o Células em geral são transparentes, pequenas e finas; 
o Células são hidratadas e frágeis; 
o Órgãos e tecidos espeço; 
 Observação de células e tecidos 
Técnicas de microscopia 
óptica 
Campo Claro 
 Técnicas de microscopia 
 A imagem é formada pela passagem ou reflexão da a luz através um espécime; 
 
 
 A iluminação não é alterada por um dispositivo que altera as propriedades da luz; 
 
 
 Desde que a iluminação seja ajustada fechando-se um pouco mais a passagem de luz pela 
condensadora, é possível observar células a fresco; 
 
 
 Em geral requer que a amostra seja fixada e corada antes da observação; 
 
 
 O espécime aparece com brilho, mas mais escuro que o brilho de fundo; 
 
 
 Todos os microscópios de luz são capazes de imagem de campo claro; 
 
 
 Técnicas de microscopia – Campo Claro 
 Técnicas de microscopia – Campo Claro 
 Técnicas de microscopia – Campo Claro 
 Técnicas de microscopia – Campo Claro 
 Técnicas de microscopia – Campo Claro 
 Técnicas de microscopia – Campo Claro 
Contraste de Fase 
 Técnicas de microscopia 
 A imagem é formada pela passagem ou reflexão da a luz através um espécime; 
 
 
 A iluminação é alterada por um dispositivo que altera as propriedadesda luz; 
 
 
 Utilização de sistema de anéis de fases que interfere, na trajetória da luz ao passar pelo 
material; 
 
 
 Dispensa o uso de corantes, permitindo a observação de células vivas; 
 
 
 O espécime aparece com um alo brilhante ao seu redor; 
 
 
 Pode ser adicionada a quase qualquer microscópio de campo claro; 
 Técnicas de microscopia – Contraste de Fase 
 Técnicas de microscopia – Contraste de Fase 
 Técnicas de microscopia – Contraste de Fase 
 Técnicas de microscopia – Contraste de Fase 
 Técnicas de microscopia – Contraste de Fase 
 Técnicas de microscopia – Contraste de Fase 
Contraste Interferência e 
Diferencial (DIC) 
 Técnicas de microscopia 
 A imagem é formada pela passagem ou reflexão da a luz através um espécime; 
 
 
 A iluminação é alterada por um dispositivo que altera as propriedades da luz; 
 
 
 Utilização de sistema de prismas que explora a alteração do incide de refração do material 
ao ser atravessado pelas luz; 
 
 
 Fornece informações morfológicas sem a necessidade da utilização de corantes, 
permitindo a observação de células vivas; 
 
 
 O espécime aparece com características de relevos tridimensionais; 
 
 
 A capacidade DIC pode ser instalada em quase todos os microscópios de campo 
claro transmitido, refletido, vertical ou invertido; 
 Técnicas de microscopia – DIC 
 Técnicas de microscopia – DIC 
 Técnicas de microscopia – DIC 
 Técnicas de microscopia – DIC 
 Técnicas de microscopia – DIC 
 Técnicas de microscopia – DIC 
 Técnicas de microscopia – DIC 
Fluorescência 
 Técnicas de microscopia 
 A imagem é formada pela passagem emissão de luz proveniente de moléculas 
auto fluorescentes do espécime ou de marcadores fluorescentes ligados ao 
espécime; 
 
 
 A iluminação é alterada por um dispositivo que filtram os comprimentos da luz 
capazes de excitar as moléculas fluorescentes e filtra os comprimentos de onda 
emitidos por tais moléculas ; 
 
 
 Utilização de um sistema de lâmpada especial e filtros com capacidade de 
selecionar comprimentos de ondas específicos; 
 
 
 O processamento de imagem por fluorescência permite que as moléculas além 
do limite de resolução do microscópio de luz, sejam visualizadas. 
 Técnicas de microscopia – Fluorescência 
 Técnicas de microscopia – Fluorescência 
 Técnicas de microscopia – Fluorescência 
 Técnicas de microscopia – Fluorescência 
 Técnicas de microscopia – Fluorescência 
 Técnicas de microscopia – Fluorescência 
 Técnicas de microscopia – Fluorescência 
Confocal de varredura a 
laser 
 Técnicas de microscopia 
 A imagem é formada pela passagem emissão de luz proveniente de moléculas 
auto fluorescentes do espécime ou de marcadores fluorescentes ligados ao 
espécime; 
 
 
 A iluminação é realizada através de um laser de comprimento de onda especifico 
para cada molécula que se deseja excitar; 
 
 
 Utilização de discos e detectores especiais com capacidade de varrer a amostra 
ponto a ponto formando uma imagem muito mais nítida; 
 
 
 O processamento de imagem por fluorescência permite que as moléculas além 
do limite de resolução do microscópio de luz, sejam visualizadas. 
 Técnicas de microscopia – Confocal 
 Técnicas de microscopia – Confocal 
 Técnicas de microscopia – Confocal 
 Técnicas de microscopia – Confocal 
 Técnicas de microscopia – Confocal 
 Técnicas de microscopia – Confocal 
 Técnicas de microscopia – Confocal 
 Técnicas de microscopia – Confocal 
Super resolução 
 Técnicas de microscopia 
Técnica ganhadora do premio Nobel de física em 2014; 
 
 
Ampliação do limite de resolução do microscópio óptico próximo ao 
dos microscópios eletrônicos; 
 
Limite de resolução de 10 nm; 
 
 
O processamento do material é muito menos agressivo do que os 
utilizados para microscopia eletrônica, observação da célula 
próxima ao seu estado real; 
 Técnicas de microscopia – Super Resolução 
 Técnicas de microscopia – Super Resolução 
 Técnicas de microscopia – Super Resolução 
 Técnicas de microscopia – Super Resolução 
Microscopia Eletrônica 
O principio físico da 
microscopia eletrônica 
 O principio físico 
 O principio físico 
Qualquer partícula ou objeto em movimento está associado a um 
comprimento de onda. 
 O principio físico 
 O principio físico 
 O principio físico 
Mas vale apena usar elétrons 
como fonte luminosa? 
 Comprimento de onda do feixe de 
elétrons: λ = 0,1 
150
𝑉
 
 
 Abertura Numérica: NA = n.sen(α) 
 
 Limite de Resolução: d = 0,61λ / NAobj 
 
 Para 30KV: 
 λ = 0,1 
150
30000
= 0,007071 
 d = λ /2xNAobj = 
0,007071 
2 𝑥 1
 = 
0,003535 nm ≈ 3,5 A 
 Para 5KV: 
 λ = 0,1 
150
5000
= 0,01732 
 d = λ /2xNAobj = 
0,01732 
2 𝑥 1
 = 
0,008660 nm ≈ 8,6 A 
 Poder de resolução 
Interações átomos-elétrons 
 Interações átomos-elétrons 
 Interações átomos-elétrons 
SE 
 Interações átomos-elétrons 
BSE 
 Interações átomos-elétrons 
IS e ES 
 Interações átomos-elétrons 
 Interações átomos-elétrons 
Conhecendo o microscópio 
Vamos por partes 
 Canhão de elétrons 
 Canhão de elétrons 
 Lentes eletromagnéticas 
 Lentes eletromagnéticas 
 Porta espécime 
 Porta espécime 
 Sistema de vácuo 
 Sistema de vácuo 
 Lentes de escaneamento 
 Lentes de escaneamento - MEV 
 Microscópio eletrônico de transmissão 
 Microscópio eletrônico de varredura 
Observação de células e 
tecidos 
 Observação de células e tecidos 
o Células em geral são transparentes, pequenas e finas; 
o Células são hidratadas e frágeis; 
o Órgãos e tecidos espeço; 
 Observação de células e tecidos - MET 
 Observação de células e tecidos - MEV 
Técnicas de microscopia 
eletrônica 
Microscopia eletrônica de 
transmissão 
 Técnicas de microscopia – MET 
 Técnicas de microscopia – MET 
 Técnicas de microscopia – MET 
 Técnicas de microscopia – MET 
Microscopia eletrônica de 
varredura 
 Técnicas de microscopia – MEV 
 Técnicas de microscopia – MEV 
 Técnicas de microscopia – MEV 
 Técnicas de microscopia – MEV 
 Técnicas de microscopia – MEV 
 Técnicas de microscopia – MEV 
Muito obrigado pela 
atenção