Microscopia: Tipos e Funcionamento

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MICROSCOPIA 
A Lupa estereoscópica é um tipo de microscópio utilizado para a observação de amostras 
com grandes relevos, como grãos, partículas ou superfícies de fratura. Ela é formada por 
dois sistemas óticos independentes, dois tubos, objetivas e oculares, o que permite ver 
imagens tridimensionais de objetos com relevo. As Lupas estereoscópicas podem ser de 
luz transmitida ou luz refletida. Em alguns casos elas permitem que sejam feitas pares de 
fotografias do mesmo objeto, usando os dois tubos, obtendo-se um “par 
estereoscópico” de imagens, que observado com um dispositivo que os separa permite 
que cada foto seja vista com um olho formando uma imagem tridimensional graças ao 
efeito da paralaxe entre as duas imagens. 
Microscópios são aparelhos nos quais lentes de vidro são associadas de tal forma que se 
consiga reproduzir para o olho humano, uma imagem aumentada e detalhada de 
objetos, células, tecidos e órgãos, que à vista desarmada não seria possível de se observar 
mais detalhes. 
Os microscópios dividem-se basicamente em duas categorias: 
• Microscópio ótico: funciona com um conjunto de lentes (ocular e objetiva), que 
ampliam a imagem transpassada por um feixe de luz que pode ser: 
a) Microscópio de campo claro 
b) Microscópio de fundo escuro 
c) Microscópio de contraste de fase 
d) Microscópio de interferência 
• Microscópio eletrônico: amplia a imagem por meio de feixes de elétrons. O mesmo 
pode ser Microscópio de Varredura e de Transmissão. 
 
O microscópio de luz é assim chamado devido sua fonte luminosa que é uma luz branca 
oriunda de um filamento de tungstênio. O conjunto de lentes é formado pelas objetivas 
e oculares. A objetiva, a primeira lente e a que está mais próxima do objeto, capta a luz 
filtrada pelo condensador e projeta uma imagem real, invertida e aumentada da 
estrutura. A lente ocular presta-se a aumentar a imagem projetada pela objetiva, para 
ser captada pelo olho do observador. 
O microscópio apresenta uma base mecânica (base, braço, revólver, platina, charriot, 
parafusos macro e micrométrico e parafuso de regulagem do condensador) e um sistema 
de iluminação (fonte luminosa, diafragmas, condensador e filtros). O pé ou Base – 
suporta o microscópio, assegurando a sua estabilidade; braço ou Coluna – peça fixa à 
base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio; Tubo 
ou Canhão – cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade 
superior a ocular e na inferior o revólver com objetivas; Platina – peça circular, quadrada 
ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a observar, possuindo no 
centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos 
concentrados pelo condensador; Parafuso Macrométrico – engrenagem que suporta o 
tubo e permite a sua deslocação a da platina, indispensável para fazer a focagem; 
Parafuso Micrométrico – imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito 
reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do 
microscópio; Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a 
quatro objetivas de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e 
comodamente de objetiva. 
No microscópio ótico, a luz atravessa primeiramente o objeto em estudo. Por isto, o 
material a ser observado não pode ser opaco. Para isto são feitos cortes muitos finos, de 
preferência com uma máquina, chamada micrótomo. O material a ser cortado recebe um 
tratamento de desidratação e inclusão em parafina que facilita o manuseio e permite que 
sejam cortadas fatias muito finas. Na microscopia de luz existem vários tipos de 
aparelhos, os quais apresentam sistemas de lentes e filtros que selecionam um ou outro 
tipo de luz, diversificando as imagens formadas. Estes aparelhos são chamados 
microscópios especiais e são chamados: microscópio de campo claro, campo escuro, 
fluorescência, invertido, confocal (microscopia de varredura confocal) e de polarização. 
Microscopia de campo claro: É o mais comum microscópio de luz. Nesse microscópio, o 
campo de visão aparece iluminado e os objetos que estão sendo observados 
apresentam-se mais escuros. Vantagens: menor toxicidade por necessitar de menores 
concentrações de corantes; baixo contraste, devido ao uso de baixas concentrações de 
cromóforos naturais ou especialmente corantes vitais, pode ser grandemente 
aumentados; observações feitas no comprimento de onda de máxima absorção 
aumentam o contraste. Limitações: objetos de fase exibem mínimo contraste em foco e 
mostra contraste oposto por cima e abaixo do foco. 
Microscopia de campo escuro: Microscópio utilizado para visualizar materiais muito 
pequenos como plâncton, bactérias e cristais. As imagens obtidas no campo escuro 
apresentam grande contraste e este pode ser ampliado pelo uso de sinal de vídeo. 
Baseia-se no princípio de que a luz é dispersa pela superfície dos materiais que possuem 
diferentes índices de refração. A luz dispersada entra na objetiva e o objeto aparece 
iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. Tal consegue-se pela utilização de um tipo 
especial de condensador que ilumina o objeto obliquamente. A luz atinge o espécime a 
ser analisado e somente os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema, 
isto é, objetivas e oculares, formando a imagem. É um tipo de microscopia utilizada na 
observação de microrganismos não corados, suspensos em líquidos, preparações a 
fresco e em gota pendente, plânctons, bactérias, grãos de pólen. 
Microscopia de contraste de fase: Esse tipo de microscopia é baseado nos princípios de 
difração da luz, isto é, o caminho do feixe luminoso, na formação da imagem por esse 
tipo de microscópio, sofre um retardo óptico, permitindo assim que se possa observar 
materiais biológicos sem a coloração. O microscópio de contraste de fase dispõe de 
certos recursos específicos para estudar células vivas e não coradas, particularmente útil 
para o estudo da mitose em células cultivadas in vitro, e exames rápidos de culturas de 
células, sangue, bactérias, algas, protozoários de ambientes aquáticos, conteúdo 
estomacal de animais, análise de materiais cerâmicos, têxteis e minerais. O microscópio 
de contraste de fase tem um sistema óptico especial que torna possível a distinção de 
materiais biológicos que diferem ligeiramente no que se refere aos seus índices de 
refração. A luz que passa através de materiais com densidades ligeiramente diferentes é 
refratada ou desviada do seu trajeto original. Variações mínimas de fase, devidas às 
diferenças de índice de refração dentro do objeto, são ampliadas e transformadas em 
mudanças de amplitude (intensidade) as quais são visualizadas como diferenças de 
contraste na imagem. O microscópio de contraste de fase apresenta sistemas de anéis 
metálicos postos no caminho da luz. Um na lente condensadora e outro nas objetivas. 
Esses anéis, após centralizados, promovem o retardo óptico, permitindo a visualização 
do espécime sem coloração. 
Microscopia de contraste interferencial: A geração do contraste a uma alta abertura de 
trabalho é limitada em uma profundidade de campo raso, resultando na habilidade de 
tornar a seção com alto contraste de 200 a 300 nm de espessura. Esse tipo de contraste 
interferencial trabalha com a defasagem dos comprimentos de ondas. A defasagem gera 
uma deformação na imagem, permitindo o contraste interferencial, aumentando a 
superfície do material analisado. A aplicação dessa microscopia permite a observação de 
materiais biológicos sem coloração, sendo útil no monitoramento de culturas celulares, 
estudo de morfologia, taxonomia de pequenas larvas e ácaros e outros ectoparasitos. 
Esse tipo de microscopia utiliza-se de prismas ópticos posicionados na passagem da luz. 
Esses prismas modificam as fases luminosas que contrastarão com o meio em que se 
encontra o materiala ser observado. Esse microscópio necessita de um revólver com 
ranhuras para alojar os prismas de interferência, então as cores de interferência 
promoverão a visualização da imagem. 
Microscopia de fluorescência: É a mais versátil e poderosa técnica para localizar proteínas 
dentro da célula pela microscopia de luz. Fluorescência é a propriedade de algumas 
substâncias para, após serem excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, 
emitirem radiação de maior comprimento de onda. Algumas substâncias absorvem a 
energia da radiação ultravioleta emitindo depois radiação dentro do espectro de luz 
visível. Microrganismos corados por um corante fluorescente aparecem como objetos 
luminosos quando observados com luz ultravioleta. É com os recursos desta técnica que 
se evidenciam, por exemplo, os antígenos quando associados a anticorpos acoplados a 
moléculas fluorescentes, e quantificam-se pelo processo de fluorometria os objetos de 
estudo da citoquímica normal e patológica. O mais fluorescente corante é chamado de 
fluorocromo, capaz de emitir luz visível. Dois exemplos de fluorocromo é o corante 
alaranjado de acridina que se liga aos ácidos nucléicos conferindo uma fluorescência 
amarelo esverdeada ao DNA e avermelhada ao RNA, e a eosina, que apesar de não ser 
um fluorocromo se comporta como tal, aumenta a fluorescência natural da elastina. Os 
fluorocromos, quando conjugados com anticorpos, torna possível a identificação de 
células individuais que reagem com o anticorpo (imunofluorescência). Os fluorocromos 
podem se combinar com estruturas celulares, tornando-as fluorescentes, tornando-as 
passíveis de identificação e localização, como proteínas ou estruturas celulares. O 
microscópio de fluorescência utiliza um sistema óptico que interage pouco com a luz. 
Utiliza-se uma luz de mercúrio de alta pressão, cujos picos variam entre 312 e 579 nm. 
Nessa microscopia também há filtros especiais chamados de filtros de excitação e filtros 
de barragem. Os filtros de excitação localizam-se logo após a saída de luz antes do 
condensador, selecionando o comprimento de onda desejado. Já, os filtros de barragem 
localizam-se entre a objetiva e a ocular, após o objeto, deixando passar somente a luz 
fluorescente, então o material fluoresce contra um fundo escuro. Na microscopia de 
fluorescência pode-se detectar compostos naturalmente fluorescentes, como a clorofila, 
lignina de paredes celulares, elastina e colágeno. 
Microscopia de varredura confocal: É uma técnica capaz de visualizar em profundidade 
células e tecidos vivos e fixados. O espécime é escaneado com uma série de muitos 
estreitos campos de visão, as imagens destes campos são recuperadas individualmente, 
e depois de estocadas, a imagem completa é construída como um mosaico de partes 
combinadas. O microscópio de varredura confocal é indicado para estudos de materiais 
espessos, sem coloração prévia, vivos ou pré-fixados. Essa microscopia permite o 
detalhamento de estruturas subcelulares que não apresentam limite de resolução 
compatível ao da microscopia de luz fluorescente convencional, como microtúbulos, 
elementos fibrilares do citoesqueleto e elementos finos da matriz celular. Nesse 
microscópio, a imagem pode ser obtida de planos focais específicos ou cortes ópticos. 
Os cortes ópticos são transferidos para um computador e são reconstruídos 
tridimensionalmente de forma a obter uma imagem no total. O microscópio confocal a 
laser trabalha com imagens digitais. O microscópio de varredura confocal utiliza como 
fonte de luz o laser, sendo seu funcionamento complexo. Seu sistema óptico é o mesmo 
da de fluorescência tradicional, com exceção de que a iluminação se dá somente em 
pequenos pontos iluminados pelo laser. Acima da objetiva existe um orifício chamado 
pinhole ou íris que elimina a luz proveniente de objetos que estejam fora do plano focal. 
Graças à sensibilidade dos detectores fotoelétricos e o controle eletrôn ico da intensidade 
dos sinais, imagens pouco evidentes na microscopia de fluorescência são observadas 
com mais nitidez na microscopia confocal. 
Microscopia de polarização: Esse microscópio apresenta dois filtros chamados de 
polarizador e analisador. Esses filtros se posicionam entre a fonte de luz e o condensador 
(filtro polarizador) e entre a objetiva e a ocular (filtro analisador). Os filtros polarizadores 
promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração de ondas luminosas, 
conhecido por plano da luz polarizada (PPL). Sob o efeito do PPL, os componentes 
macromoleculares birrefringentes (anisotrópicos) apresentam brilho colorido ou não, 
promovendo um realce destes materiais em detrimento a outros não birrefringentes 
(isotrópicos), que se distinguem em fundo escuro. Os materiais biológicos mais 
estudados na microscopia de polarização citam-se células musculares estriadas, 
espermatozoides, paredes celulares, amido, colágenos e DNA. 
Microscopia eletrônica 
As lentes do microscópio eletrônico são de natureza eletromagnética, sendo 
constituídas por uma bobina, formada por milhares de voltas de fio, através da qual 
passa uma corrente elétrica. No microscópio eletrônico a focagem é feita por variação 
da corrente que passa na bobina, a qual afeta a distância focal da objetiva. A variação 
da ampliação é feita por variação da distância focal das lentes intermédias. Existem 
vários tipos de microscópios eletrônicos, que variam de acordo com suas 
especificidades: o de transmissão (MET), o de varredura (MEV), o de alta voltagem e de 
tunelamento quântico e de força atômica. 
Microscopia eletrônica de transmissão: No microscópio eletrônico de transmissão, 
forma-se uma imagem bidimensional do interior desta sobre uma tela, pela passagem 
de um o feixe de elétrons através de cortes extremamente finos da amostra. A imagem 
é formada diretamente a partir da impressão do feixe de elétrons na tela de 
observação, após a passagem pela amostra. Os elétrons quando são emitidos são 
absorvidos pelos átomos de ar, então, um tubo inteiro, entre a fonte de elétrons e o 
detector, é mantido sob um grande vácuo. O pequeno comprimento de onda de 
elétrons significa que o limite de resolução do microscópio de transmissão é de 0,0002 
µm, sendo maior do que o de varredura. A parte essencial do microscópio eletrônico 
de transmissão é uma coluna vertical a qual é percorrida por um feixe de elétrons. Na 
parte superior da coluna existe uma fonte de elétrons, o canhão eletrônico. No canhão 
eletrônico existe um gerador de elétrons que é frequentemente um filamento de 
tungstênio. A voltagem aplicada entre o filamento e o ânodo situa-se entre 40 000 e 
100 000 V e provoca a aceleração dos elétrons. A coluna é constituída por uma ou mais 
lentes condensadoras, uma lente objetiva, uma ou mais lentes intermediárias, uma 
lente projetora, um porta-objetos em platina móvel que é controlado do exterior, um 
écran (por vezes dois) e uma câmara fotográfica. As imagens ampliadas pelas lentes 
projetoras são lançadas para um anteparo fluorescente, uma chapa fotográfica ou um 
monitor de TV. A imagem final obtida pode ser interpretada como eletrodensa, ou 
escura, quando os elétrons encontram elementos como o ferro, ósmio, chumbo ou 
ouro e eletrolúcida ou clara, quando os elétrons encontram-se com hidrogênio, 
carbono, nitrogênio ou oxigênio. Os materiais vegetais na maioria das vezes se 
comportam como materiais eletrolúcidos implicando na necessidade de contraste com 
metais pesados para se conseguir uma boa imagem. 
Microscopia eletrônica de varredura: Revela imagens topográficas da superfície com 
grande riqueza de detalhes. Este aparelho forma uma imagem tridimensional da 
superfície de amostras não seccionadas e a imagem é visualizada em um monitor 
acoplado ao microscópio, nesse caso, os elétrons “varrem” apenas a superfície externa 
do material biológico. Então, esse microscópio permite somente uma observação da 
superfícieda amostra. A imagem é formada a partir de elétrons secundários que 
partem da amostra quando a mesma é atingida pelo feixe de elétrons. Os elétrons 
secundários são captados e, após passagem por um amplificador, são transformados 
em imagem visível em um monitor. As fotografias são obtidas indiretamente, a partir 
da imagem gerada no monitor. O limite de resolução nesse microscópio é de 0,02 µm. 
A microscopia eletrônica de varredura pode fornecer imagens tridimensionais de 
objetos relativamente grandes, como vermes e insetos, quanto de células livres, como 
tecidos animais e vegetais, embriões, fragmentos geológicos em análises de 
granulometria e textura de solos. O pré-tratamento das amostras é essencial para se 
conseguir uma boa observação da superfície podendo causar algumas alterações 
físicas. 
Microscopia eletrônica de alta voltagem: É a microscopia eletrônica que acelera seus 
elétrons entre 500 e 1000 KV, então, seus microscópios são conhecidos como de alta 
voltagem ou de alta aceleração. Seu funcionamento e estrutura são semelhantes ao do 
microscópio eletrônico convencional, porém, são aparelhos extremamente grandes, 
chegando a ocupar edifícios de 3 andares. A utilização desse microscópio revolucionou 
a biologia estrutural permitindo que pudesse, por exemplo, observar a organização 
tridimensional dos componentes do citoesqueleto. 
Microscopia eletrônica de tunelamento quântico: Tem a capacidade de ampliar a 
potência visual do olho humano cerca de 1 milhão de vezes. Essa técnica aumenta em 
100 vezes a capacidade dos microscópios eletrônicos. Seu princípio pressupõe que 
todos os corpos apresentam características ondulatórias emitem energia. O aparelho 
possui uma agulha que dista da amostra em 1 Å (10-6 mm). Pelo caminhamento da 
agulha na superfície da amostra se forma uma corrente energética chamada de 
tunelamento. Os elétrons do material são atraídos para a agulha formando um túnel. 
Então, quando a agulha passa sobre um átomo, a corrente aumenta e quando ela 
percorre sobre os espaços entre os átomos ela diminui. Os sinais de aumento e 
diminuição são transmitidos para a tela de um computador formando imagens 
semelhantes a vales e montanhas. 
Microscopia eletrônica de força atômica: A invenção do microscópio de força atômica 
contribuiu significativamente para a nanotecnologia. O microscópio de força atômica 
apresenta um microespelho e um feixe de laser sobre a agulha. O princípio de 
funcionamento de um microscópio de força atômica é baseado na reflexão da luz de 
um feixe de laser por um espelho. Após a reflexão, a luz do laser passa por uma lente e 
incide sobre um fotodetector. A incidência do feixe de laser no fotodetector provoca o 
aparecimento de uma diferença de potencial (ddp) em suas extremidades. Esta ddp 
depende da área iluminada pelo feixe de laser que depende da altura da ponta de 
prova. A posição da ponta de prova varia conforme o relevo da superfície em estudo e, 
com isso, a ddp gerada pelo fotodetector traduz os deslocamentos da ponta durante a 
varredura. Estes deslocamentos são medidos com a amplificação da ddp gerada no 
fotodetector. O fotodetector funciona como uma bateria variável (dependendo da 
incidência de luz) e seu sinal serve de entrada para o amplificador operacional cujo 
ganho, A, é definido pelas resistências R1 e R2. A saída do amplificador operacional é 
conectada a um computador ou a um registrador gráfico (plotter) para a coleta de 
dados. Isto permite uma menor agressividade sobre a amostra e a detecção de 
superfícies, por exemplo, de uma bactéria viva, em que as informações são transmitidas 
para a tela do computador, incluindo movimentos e forma. Nesse aparelho também é 
possível avaliar a estrutura atômica de biomoléculas. Nessa microscopia, as amostras 
podem ser observadas sem qualquer tratamento superficial, sendo capaz de obter 
informações complementares em situações reais sem interferência ou artefatos. As 
técnicas de microscopia eletrônica de varredura e a de força atômica foram ferramentas 
complementares na observação de diferenças morfológicas em bactérias com e sem 
biofilme. 
Fotomicrografia: A qualidade da fotomicrografia seja digital ou gravada em filme, 
depende da qualidade do microscópio. O filme é um modo de avaliar quão bom o 
microscópio tem sido priorizado para capturar a imagem. É essencial que se tenha um 
microscópio bem configurado usando Köhler iluminação e que o campo e o diafragma 
condensador estejam ajustados corretamente e que a altura do condensador esteja 
otimizada. Então, o microscópio mostrará imagens do campo todo de visão com boa 
iluminação e fornecerá o melhor contraste e resolução. 
Fotomicrografia por meio do uso de filmes: Filmes fotográficos utilizados em 
fotomicrografia são revestidos com uma emulsão sensível a luz de sais de prata e ou 
corantes. Quando a luz é incidida para expor a emulsão, centros ativos combinam para 
formar uma imagem latente que deve ser desenvolvida pelo uso de químicos 
fotográficos, em ambiente escuro. O filme é dividido em categorias dependendo se é 
branco e preto ou colorido. Os filmes fotográficos são divididos em transparências de 
campo positivo (as cores são aquelas da imagem que esta sendo observada) e cores 
negativas (cores complementares à da imagem que esta sendo observada). Filmes 
positivos apresentam sufixo chrome e negativos color. Os filmes, geralmente, vêm 
acompanhados de informações como ISO, e se o filme é para dia com luz (Daylight) ou 
um para interiores com menor iluminação. A temperatura de lâmpadas de tungstênio 
encontrada nos microscópios está entre 2900 e 3200 K dependendo da voltagem 
aplicada no filamento da lâmpada. Os fabricantes de filmes oferecem filmes 
balanceados para esta iluminação e indicam se o filme é indicado para interiores ou 
uso científico. Filmes balanceados para dias com luz (Daylight) é o mais comum filme 
disponível e pode ser usado no microscópio desde que seja adicionado um filtro 
conversor de luz apropriado para a rota da luz. Filmes polaroides são usados na 
fotomicrografia, e são encontrados em três tamanhos 35 mm Polachrome (colorido ou 
transparente), pacotes Polapan (preto e branco) em 3 1/4 x 4 ¼ e filmes 4 x 5 
individuais. 
Fotomicrografia digital: A seleção da câmera digital deve ser realizada com muito 
cuidado, incluindo exame de espécimes fixados ou vivos, necessidade de imagens em 
escala de cinza ou cor verdadeira, sensibilidade a baixo nível de luz como fluorescência, 
resolução, velocidade de aquisição de imagem, uso em investigações qualitativas e 
quantitativas, taxa de alimentação de vídeo para o computador ou VCR. Em geral, dois 
tipos de câmeras estão disponíveis para uso na microscopia são as câmeras tubo 
(famíliaVidicon ) ou CCD (dispositivo duplo de mudança). Um critério para seleção de 
uma câmera eletrônica para microscopia inclui sensibil idade da câmera, eficiência 
quântica, resposta espectral, capacidade de alcance dinâmico, velocidade de aquisição 
de imagem e leitura externa, resposta, velocidade de resposta em relação a mudanças 
na intensidade da luz, acerácea geométrica e adaptabilidade de leitura ao microscópio. 
Um importante critério para a mais nova câmera digital CCD é a resolução, sendo a 
preferida para pesquisa. O alcance dos chips disponíveis está entre 64 x 64 pixels até 
2048 x 2048 e acima quando se trata de condições bem especificas. Sua grande 
capacidade de resolução de imagem a torna a câmera digital uma poderosa rival para 
as câmeras de filme.