DNA: A Molécula da Vida

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DNA: A Receita da Vida
O DNA é um polímero constituído por inúmeras unidades denominadas nucleotídeos. Os nucleotídeos do DNA são derivados de quatro bases nitrogenadas: adenina e guanina (chamadas purinas, apresentam dois anéis de carbono em sua estrutura), timina e citosina (chamadas pirimidinas, possuem um anel de carbono em sua estrutura). O pareamento das bases nitrogenadas se dá numa relação de 1:1 entre bases púricas e pirimídicas, o que foi evidenciado por Chargaff em meados da década de 1940. A partir desses dados, e dos dados cristalográficos colatados por Rosalind Franklin, em 1953, Francis Crick e Watson descreveram a molécula de DNA.
A molécula de DNA possui duas fitas polinucleotídicas, antiparalelas, que formam uma dupla hélice de 24Å de diâmetro. O arranjo das bases é complementar e determina a formação de dois sulcos a cada volta: o major group, de 12Å, e o minor group, de 6Å. Uma volta completa do DNA possui 34Å de comprimento, o equivalente a 10 pares de base.
Replicação do DNA
Em 1053, Watson e Crick propuseram uma possível capacidade auto-replicativa do DNA, mas foi só em 1958 que Mathew e Meselson demonstraram a replicação semi-conservativa, medindo a atividade de nitrogênio radioativo nas moléculas de DNA de E. coli.
Em 1959, Kornberg recebeu o Nobel pela purificação e descrição da DNApolimerase tipo I de E. coli. Os estudos a respeito da replicação do DNA remetem a ele.
A adição de bases à fita de DNA é feita pelas DNApolimerases com a utilização de nucleotídeos de trifosfato de amina. Porém, somente estas enzimas não são o suficiente para se iniciar a replicação. Este processo se inicia em regiões do DNA ricas em pares A=T; nestas regiões, a fita é aberta em uma forquilha chamada garfo de replicação. A enzima responsável pela abertura da fita é chamada helicase. A adição de bases em uma das fitas ocorre da extremidade 5’ para a extremidade 3’, mas na fita oposta ocorre na direção contrária. Na primeira, a adição de bases é feita diretamente pela DNApolimerase, mas na segunda isso não é possível, pois a DNApolimerase só trabalha no sentido 5’ – 3’. Na fita 3’- 5’ a replicação é descontínua e é realizada por primers de RNA chamados fragmentos de Okazaki.
O genoma de E. coli forma apenas dois garfos de replicação durante o processo, que resultam na formação em uma “bolha” no meio do DNA. O fato de seu cromossomo ser circular torna a replicação mais simples e rápida. Em eucariotos, o cromossomo é linear e possui vários pontos de origem de replicação, já que o cromossomo é bem maior do que o dos procariotos.
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Como já foi dito, a abertura da fita é realizada pela enzima helicase. Os fragmentos de Okazaki são sintetizados por uma outra enzima, a primase. O complexo helicase-primase é chamado primessomo.
A ligação da DNApolimerase ao DNA se dá através da associação com uma proteína chamada grampo β, que é dimérica em procariotos, mas trimérica em eucariotos. Essa associação forma um anel que se encaixa no DNA e desliza sobre ele através de interações eletrostáticas entre a superfície negativa do DNA e a superfície interna positiva da proteína. Na síntese descontínua (3’ – 5’), além da DNApolimerase e do grampo β, há uma proteína de ligação, que possibilita a mobilidade da DNApolimerase, chamada proteína carreadora de grampo. Outra proteína, a topoisomerase, diminui a tensão que o garfo de replicação exerce sobre a fita de DNA. Isso é feito através de um corte e um giro na fita.
O Dna eucarioto é condensado por histonas. Para sua replicação, é necessária a retirada das histonas por uma proteína chamada CAF-1 posterior alocação na fita recém-sintetizada. Outro aspecto diferente da replicação em eucariotos é a replicação dos telômeros (as porções finais da molécula de DNA) através da DNAtelomerase. Esta última é uma nucleoproteína, que possui em sua composição uma seqüência de RNA complementar às seqüências teloméricas. Ocorre adição de fragmentos de Okazaki por esta proteína, formando então os telômeros, que nada mais são do que “pára-choques” do DNA, pois protegem-no contra a erosão resultante da recombinação. 
O lindo vídeo que o professor passou na aula está nestes sites: www.as.wvu.edu/~dray/219files/Replication_588x392.html
www.wehi.edu.au/education/wehi-tv/dna/replication.html
 
 Reparo do DNA
O organismo humano possui de 10 a 50 trilhões de células. Cerca de 18000 ligações fosfodiéster podem ser rompidas por dia através da perda de purinas, além de 500 deaminações (oxidação de aminas), tudo isso em uma única célula. Isto de deve ao próprio metabolismo celular, e a maquinaria de reparo do material genético atua constantemente. Erros no DNA também podem ser gerados pela DNApolimerase, durante a replicação, e, portanto, devem ser corrigidos por mecanismos específicos de reparo. Radiações e produtos químicos também podem provocar danos à molécula de DNA como, por exemplo, dimerização de timinas por luz ultravioleta e metilação de bases. Um meio interessante de reparo é a fotoativação de enzimas em casos específicos, como a dimerização induzida por ultravioleta.
Existem sistemas de reparo apropriados a cada tipo de lesão do DNA, constituindo os pontos de controle do ciclo celular. Uma única lesão leva à ativação de cascatas de transdução de sinais, levando ao arrasto da progressão do ciclo celular. O ciclo pode ser arrastado em G1, S ou G2 por proteínas reguladoras do ciclo. Às vezes é necessário mais de um dano ao DNA para que o sistema de reparo seja ativado. Algumas quinases, como a ATM, por exemplo, levam à ativação do sistema de reparo através da ativação de algumas enzimas, como BRCA-1 e BRCA-2. Defeitos nestas enzimas estão envolvidos em casos de câncer de mama. Outro mecanismo de reparo se dá pela tolerância a danos, e ocorre quando a DNApolimerase coloca bases erradas no DNA; em seguida, outras polimerases, de releitura e reparo da fita, corrigem o erro sem parar o processo de replicação. E, finalmente, outro processo de reparo é o da excisão de nucleotídeo, na qual uma proteína chamada XPC reconhece a lesão, liga-se ao local danificado e recruta proteínas que cortam a fita nas proximidades das extremidades do dano; o fragmento retirado é então sintetizado novamente por outro grupo de proteínas. Uma doença associada a defeitos nesse tipo de mecanismo é a xeroderma pigmentosum, na qual o doente não pode passar muito tempo exposto à luz solar, de acordo com a gravidade da doença.
Um tipo peculiar de reparo do DNA é o chamado mismatch repair, que age sobre mutações envolvendo pareamentos de base errados, como G=T ou A=C, e se dá pela atividade proofreading da DNApolimerase: ao “perceber” seu próprio erro, a DNApolimerase retrocede até o ponto do erro e o corrige. Este mecanismo é pouco versátil, pois a DNApolimerase pode não detectar seu erro. Em tais casos, proteínas chamadas multi-S e multi-L reconhecem o defeito e, juntas, hidrolisam um ATP para ativar um complexo chamado multi-H. Este complexo hidrolisa a fita de DNA em um trecho de DNA metilado, anterior ao dano, o que possibilita a entrada da helicase e de outra DNApolimerase, sintetizando assim uma nova fita. Este processo ocorre apenas em procariotos, onde a metilação ocorre diretamente no DNA. As enzimas multi-S e multi-L acompanham o garfo de replicação, promovendo assim o reparo das duas fitas. Apenas as fitas mais velhas são metiladas; a metilação das fitas mais novas ocorre tão logo se dê a replicação.
 
Há certos danos graves ao DNA que exigem mecanismos de reparo distintos. Um destes danos é a quebra da fita de DNA, que se dá por radiação ionizante, danos oxidativos, ou eventos espontâneos. Neste caso, a célula pode simplesmente religar as duas extremidades no local lesionado, ou então, caso a lesão ocorra durante o ciclo celular, buscar seqüências semelhantes à que sofreu quebra, usando-as como molde para o reparo. Geralmente, estas seqüências semelhantes estão localizadas no cromossomo homólogo ao danificado e o processo total é muito semelhante à recombinação,que ocorre normalmente nas células gaméticas, como fonte de geração de diversidade.
Recombinação do DNA
 Este evento se dá através do pareamento de duas fitas “homoduplex” de DNA e posterior corte por endonucleases. Após o corte, ocorre síntese de parte da molécula de DNA e um corte subseqüente pode ou não gerar recombinantes. Este “crossing-over” pode ocorrer tanto em situações de reparo, como durante a meiose.
Não leva à recombinação
Leva à recombinação
Genética do Desenvolvimento
Tudo começa com o zigoto. Todas as células possuem as mesmas informações genéticas contidas em seu DNA. Como então é possível que uma única célula origine vários outros tipos distintos? A atividade gênica diferencial, através da regulação transcricional, pode ocorrer por diferentes meios e estratégias:
Localização diferencial do RNAm no óvulo, levando à polarização celular. Isto ocorre pela interação entre uma proteína adaptadora presente na membrana e a extremidade 3’ do RNAm.
Interação física célula-célula: através da especificidade ligante-receptor, que, através de cascatas de sinais, leva à fosforilação de fatores de transcrição (proteínas de ligação ao DNA).
Interação à distância (proteínas difundidas): células com quantidades diferentes de receptores e a distâncias diferentes da célula secretora respondem diferentemente a um mesmo “hormônio”.
A Drosophila é o modelo mais utilizado no estudo do desenvolvimento. Apesar de holometábolo, é um eucarioto com genes muito semelhantes aos dos humanos. O óvulo e o embrião apresentam uma polarização no que diz respeito à concentração de RNAm. O ovo de D. melanogaster possui uma extremidade com maior quantidade de RNAm contendo um gene chamado Bicoid, enquanto a outra extremidade possui maior quantidade de RNAm contendo um gene chamado Oskar. Isto estabelece o eixo antero-posterior de expressão gênica no embrião deste inseto.
Mas como se estuda a polarização por RNAm?
No início desse estudo, embriões tinham algumas células de determinadas regiões do corpo retiradas. Isto gerava mutações nulas. Em seguida, injetava-se o produto de um gene retirado na região original e conferia-se o resultado. Se o embrião retornasse ao fenótipo original, o gene responsável, presente no RNAm, estava identificado. Isso muito utilizado para se estudar as regiões anterior e posterior dos embriões desses animais. Foi com esse método que se descobriu as funções dos genes Bicoid e Oskar.
Outro método de se estudar esta polarização é utilizar métodos de biologia molecular, como a hibridização in situ. Isto é feito utilizando-se uma sonda de RNA e avaliando-se as regiões onde ocorreu resposta à sonda, que geralmente adquirem coloração característica.
O padrão de expressão de certos genes é controlado por outros. Os genes reguladores do desenvolvimento são chamados homeóticos e regulam a expressão dos genes ao longo do eixo antero-posterior. Estes genes foram descobertos por Edward Lewis, que recebeu o Nobel em 1995, e são encontrados não só em Drosophila, mas também em alguns vertebrados; apesar de ocorrerem diferenças quantitativas (número de boxes), muitos possuem funções homólogas. 
Uma evidência da existência dos genes homeóticos é a realização de experimentos onde se obteve mutantes com desenvolvimento anormal, como a anopedia (desenvolvimento de patas no lugar das antenas) em Drosophila.
Em 1993, pesquisadores descreveram o gene Pax-6 como o principal regulador da formação dos olhos em Drosophila. Embriões com este gene expresso em outros segmentos do corpo, que não o correto, leva à formação de tecidos de olhos nesses locais, chamados ectópicos. Da mesma forma, a inserção de Pax-6 de mamíferos em Drosophila gerou o mesmo resultado.
Outro animal muito utilizado em estudos do desenvolvimento é o nematóide C. elegans. Isso se tornou possível graças ao fato de que, nestes animais, onúmero de células no adulto é fixo, o que permitiu que se estudasse a ação de células sobre a diferenciação de outras, tanto próximas como também à distância. Em C. elegans, o desenvolvimento da vulva se dá a partir de três linhagens de células que interagem entre si. A retirada de apenas uma dessas células interrompe todo o processo, evidenciando a interação física entre essas células. O desenvolvimento dessas três linhagens de células é controlado por uma célula âncora, que atua à distância, e cuja retirada também compromete o desenvolvimento da vulva. Além disso, C. elegans também possui genes homeóticos.
Há muito tempo, os cientistas queriam saber o quanto totipotente é uma célula diferenciada. Os primeiros resultados deste tipo de estudo vieram através da clonagem de anfíbios, que jamais atingiam a fase adulta devido a mutações causadas pela radiação. Posteriormente, um resultado satisfatório foi conseguido com a primeira clonagem em mamíferos, a clonagem da ovelha Dolly.
Seqüenciamento de Genomas
Um projeto genoma se destina a determinar a seqüência de nucleotídeos do DNA de um determinado organismo. O seqüenciamento gênico permite que se conheça a informação genética contida no DNA. Essa informação é “escrita” com apenas quatro letras: A, T, C e G, e a organização dessas letras no genoma determina quando uma proteína será expressa, quanto dela será produzida e até mesmo o modo como ela será expressa, além é claro da fórmula química e estrutural dessa proteína. O gene, portanto, é organizado em módulos de informação: o promotor controla a expressão do gene; a região codificante, que vai desde o atg até o códon stop, contém a “receita” da proteína; a região terminadora contém as seqüências necessárias para a adição da cauda poli-A.
À quantidade, em quilobases, de DNA que existe dentro de uma célula haplóide chamamos valor c. Mas há um paradoxo quanto a este valor: quanto maior ele for, não significa que o organismo é necessariamente é mais complexo. O lírio, por exemplo, possui valor c maior que o homem, ou seja, possui mais genes que o homem; mas quantos desses genes são funcionais? 
Essa questão torna o paradoxo do valor c ainda mais aparente, fato que mudou o paradigma de seqüenciamentos de genomas. Após o seqüenciamento do genoma humano, buscou-se trabalhar com EST’s (Expressed Seqüence Tags), os quais chamamos transcriptomas, que consistem o conjunto de genes expressos em um organismo. Esta abordagem é muito importante, pois representa o conjunto de proteínas expressas em cada tipo celular. Os EST’s vêm trazendo um conjunto de informações muito grande; por exemplo, sabe-se que 40% das proteínas com seqüência gênica determinada no EST da cana-de-açúcar não possuem função definida, o que ocorre de maneira muito semelhante nos seres humanos. Após o seqüenciamento de um gene, sua funcionalidade é determinada pelo Blast X.
Existem várias metodologias para o seqüenciamento de genomas. O setor público utiliza o chamado shotgun hierárquico, que visa à sobreposição mínima de segmentos de DNA, mas só consegue seqüenciar, no máximo, quinhentos pares de bases. Com a participação do setor privado, uma nova metodologia foi introduzida: o shotgun inteiro, que quebra o DNA em pedaços menores, que são seqüenciados e colocados em cada cromossomo por hibridação in situ. Porém, por utilizarem softwares distintos, os setores público e privado reconheceram número diferente de genes.
A determinação da função de cada gene é chamada genômica funcional. Ela busca saber em quais situações cada gene é expresso e qual o produto desses genes. Atualmente este tipo de estudo é feito através dos chamados chip’s de DNA, que são hibridações de cDNA com plasmídios conhecidos, e permitem analisar a expressão de muitos genes ao mesmo tempo.
A área da genômica que estuda as causas genéticas das diferentes respostas a medicamentos e tratamentos é chamada farmacogenômica. Isto é feito através de polimorfismos simples de nucleotídeos (SNP’s), pequenas variações no DNA associadas a fenótipos distintos. Aproximadamente mil SNP’s afetam a função dos genes. 
 
Genômica Mitocondrial
A genômica mitocondrialestuda o material genético contido nas mitocôndrias. É uma área dinâmica, muito utilizada no estudo comparativo com abordagens evolutivas, como o DNAbarcode ou relações filogenéticas.
Em 1960 foi proposta a teoria do endossimbionte, que afirma que as mitocôndrias são derivadas de organismos procariotos que se associaram, ao longo de sua evolução, a células “pró-eucarióticas”. Esta teoria causou muito impacto na época mas, com o avanço das tecnologias de manipulação do DNA, tornou-se muito bem aceita.
Os genomas mitocondriais de leveduras, plantas e animais diferem surpreendentemente entre si. Em leveduras, o genoma mitocondrial é associado basicamente a funções respiratórias, enquanto nas plantas ele é incrivelmente rico em genes, não só associados à respiração, mas também a outras funções, como a fotossíntese. Isto mostra que podem haver graus distintos de “promiscuidade” entre o genoma nuclear e o mitocondrial, ou seja, há compartilhamento de genes envolvidos em uma determinada função. O genoma mitocondrial de plantas pode variar dentro dos vários grupos vegetais, enquanto o dos animais é bem mais conservado. A mitocôndria humana codifica treze genes envolvidos, juntamente com o núcleo, no controle da cadeia respiratória e da divisão da organela.
Já foram identificadas mais de duzentas mutações, no genoma mitocondrial, envolvidas em doenças. A herança mitocondrial é tipicamente materna. A ocorrência de doenças depende da existência de mitocôndrias mutantes no óvulo. O aparecimento da doença é tardio, pois só ocorre quando o número de mitocôndrias mutantes é suficiente para causar os distúrbios, que estão relacionados principalmente ao envelhecimento. Essas doenças geralmente acometem tecidos mais dependentes de atividade mitocondrial e ATP, como os músculos e o tecido nervoso, e não são conhecidos mecanismos de reparo no genoma mitocondrial.
A diversidade de genomas mitocondriais pode ser expressa pelo tamanho destes, desde o menor documentado até agora (o protozoário P. falciparum, com cerca de 6Kb) até o maior (C. melo, o melão, com 2500Kb). Porém, a ocorrência de genes semelhantes em mitocôndrias de diferentes seres vivos não mostra relações filogenéticas.
O código genético é degenerado, porém não é universal. Alguns códons de eucariotos possuem outras funções na mitocôndria. Por exemplo, o códon UAG em animais é um códon stop, mas na mitocôndria dos animais é o codificante do triptofano. Como isso afeta a transferência horizontal de genes (núcleo – mitocôndria)? A diferença no código genético de mitocôndrias e núcleo pode resultar no acúmulo de genes mitocondriais nos espaços intergênicos do núcleo – a sua funcionalidade depende de alterações ou inserções em locais de seqüência promotora. Isto poderia ser uma das explicações para a origem do DNA lixo humano. 
Síntese descontínua
Síntese contínua