Genética [1]..

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Mecanismos de regulação da Transcrição
Cada gene de um organismo possui padrões de expressão específicos, ou seja, são expressos apenas em determinados locais (no caso de organismos multicelulares) e em determinados momentos. A atividade ou expressão gênica é definida como: produção de uma proteína ativa a partir de um gene específico. Esta atividade envolve duas etapas complexas: a transcrição do DNA em RNAm e a tradução deste em proteína. Estas duas etapas são rigorosamente reguladas e quanto mais complexo for o organismo, ou seja, quanto mais genes ele tiver, mais complexa é essa regulação. Por exemplo, a expressão do gene que codifica a produção de colágeno no ser humano acontece em células chamadas fibroblastos, mas algumas células epiteliais também possuem esse mesmo gene em seu conjunto genético; nestas, o gene é inibido por um outro gene, de forma a permitir que o colágeno seja sintetizado apenas nos locais onde é útil.
A regulação da transcrição do DNA em RNAm pode ocorrer através do processamento do RNA ou da transcrição de RNAi (interferência), ambos detalhados adiante. Já a regulação da tradução do RNAm em proteína está relacionada à estabilidade da proteína gerada. A regulação de ambas as etapas ocorre na forma de respostas rápidas da célula, de forma a eliminar produtos indesejáveis o mais depressa possível, causando o mínimo de danos ao organismo. Apesar de ocorrer regulação em ambas as etapas, é muito mais comum a regulação na transcrição, pois permite uma economia metabólica maior do que a regulação na tradução.
O DNA, como sabemos, é composto por duas fitas dispostas em uma dupla hélice. Uma das fitas é chamada fita não codificante e a outra é chamada fita codificante. Durante a transcrição, as duas fitas se separam e o RNAm é transcrito a partir da fita não codificante, gerando um RNAm com seqüência de bases igual à da fita codificante.
 Regulação em Procariotos
A transcrição nos procariotos pode ser tão complexa quanto nos eucariotos. A proteína responsável pela transcrição é chamada RNApolimerase e possui cinco subunidades: duas subunidades α, uma subunidade β, uma subunidade β’ e uma subunidade σ (sigma). Através da subunidade σ, a RNApolimerase se liga ao DNA, enquanto as outras subunidades atuam como enzimas nas reações de transcrição. A região de DNA onde se liga a subunidade σ é chamada promotor. 
O promotor é uma seqüência de DNA localizada imediatamente antes da seqüência a ser transcrita. Portanto, o promotor não faz parte do gene a ser transcrito. A seqüência do promotor é relativamente pequena e pode conter trechos de seqüência altamente conservados, chamados BOX. Os BOXes estão relacionados à afinidade da subunidade σ pelo promotor. Abaixo temos como exemplo um esquema da região promotora do lócus lac da bactéria E. coli, cujo funcionamento é explicado adiante.
Pergunta: O promotor é um gene? Um gene é uma seqüência de DNA capaz de codificar uma proteína específica. Uma mutação no promotor vai impedir a ligação da RNApolimerase à fita de DNA e, como conseqüência, não ocorrerá transcrição. Dessa forma, o gene não pode ser expresso. Isso significa que o promotor faz parte do lócus gênico, ou seja, o promotor é um gene.
 Adaptação/ Indução da enzima β-galactosidase em E. coli
 A expressão gênica em bactérias varia muito em função da composição da fonte de alimento. Algumas bactérias são capazes de metabolizar glicose e lactose para este fim. Em meados de 1950, para descobrir como funciona o metabolismo destas duas substâncias, o cientista Jacob e sua equipe estudaram a indução coordenada da ativação enzimática de três enzimas em E. coli: β-galactosidase, lactose permease (responsável pela entrada de lactose na célula) e tiogalactosidase, todas relacionadas ao metabolismo de lactose. Para isso, cultivaram meios contendo apenas glicose, apenas lactose ou ambos. Observe os gráficos:
Note que, em meio contendo tanto glicose como galactose, a glicose é a primeira a ser consumida e só então se inicia o metabolismo de lactose. Sugeriu-se com isso que, na falta de outra fonte de carbono, a célula utiliza a lactose para a induzir a expressão dos genes que realizam seu metabolismo, garantindo a geração de energia.
Além disso, Jacob também cultivou essas bactérias em três meios de cultura. Todos eles continham uma substância chamada X-galactose (X-GAL), que pode ser clivada pela β-galactosidase, produzindo um composto azul; além de X-GAL, um deles também continha uma substância chamada IPTG, que é um indutor semelhante à lactose, com exatamente os mesmos efeitos. Cada meio foi abastecido com uma fonte diferente de carbono, exceto glicose, pois enquanto houver glicose os três genes do metabolismo da lactose não podem ser ativados, como vimos na explicação dos gráficos. Observe os resultados:
O meio 1 serve como controle. As fontes de carbono foram metabolizadas normalmente. No meio 2, as bactérias mutantes não se desenvolveram e as normais metabolizaram o X-GAL e cresceram azuis. No meio 3, observa-se a formação de colônias azuis e colônias brancas. Qual a explicação?
Segundo Jacob, a célula da bactéria possui várias permeases para a lactose do meio, mas quase todas estão fechadas; por isso, a quantidade de lactose que entra nas células é pequena; assim sendo, se o meio contiver apenas lactose como fonte de carbono para as células, as bactérias morrerão devido à escassez de fontes de carbono em seu interior (meio 2).
No meio três, as células possuíam glicerol como fonte de carbono. O IPTG entra na célula de forma idêntica à lactose e por isso encontra-se em quantidade muito pequena no interior das células (ler o parágrafo anterior). Juntamente com os genes responsáveis pelo metabolismo da lactose – LacZ (β-galactosidase), LacY (lactose permease) e LacA (tiogalactosidase) – há ainda um gene regulador chamado LacI+. Quando há uma ou mais fontes de carbono no interior da célula, de forma que a relação carbono/lactose permanece alta, o gene regulador codifica uma proteína repressora que atravessa o promotor dos três genes e se liga a uma região subseqüente, chamada operador, impedindo dessa forma o progresso da RNApolimerase e a transcrição desses genes. Quando a concentração das fontes primárias de carbono caem e, conseqüentemente, a relação carbono/lactose também, ocorre a inativação do repressor e os três genes passam a ser transcritos normalmente. O gene lactose permease abre as permeases para a lactose (ou IPTG, no caso) permitindo que mais lactose esteja disponível para o metabolismo celular. Porém, algumas células são mutantes para a β-galactosidase e por isso não clivam o X-GAL, gerando colônias brancas (se os mutantes sobreviverem). O que gerou um outro problema para os cientistas é que também havia mutantes para o gene LacI, de forma que a transcrição dos três genes em questão nunca era reprimida, já que não havia nada que impedisse a ligação da RNApolimerase ao operador. Mas quando este tipo de mutação foi descoberta, não se sabia se o gene regulador era repressor ou ativador (explicado adiante) e mais testes foram necessários.
Nota: o conjunto que inclui um ou mais genes e sua seqüência de regulação (promotor + operador) é chamado operon. 
No caso acima, o gene regulador era um repressor da transcrição do DNA, mas há também genes reguladores chamados ativadores, que produzem uma proteína que se liga ao operador de determinado gene e facilitam a ligação da RNApolimerase.
Mas como os cientistas puderam saber se o gene LacI+ era repressor ou ativador no caso descrito acima? A mutação no repressor não interfere na utilização de lactose, pois o operador estará sempre livre, permitindo a transcrição dos três genes, como já mencionamos. Os genes ativadores funcionam de maneira diferente; se fosse o caso do exemplo da lactose, o gene LacI+ funcionaria da seguinte forma: quando a relação carbono/lactose está muito alta, o gene permanece inativo e a transcrição dos três genes não ocorre, pois sem o ativador a RNApolimerase teria muita dificuldade para seligar ao operador; quando a relação cai muito, o gene ativador é ativado e permite uma transcrição efetiva dos três genes. Para que se obtenha um resultado semelhante ao da mutação em um gene repressor, é preciso que a mutação no ativador mantenha-o sempre ativo, para que os três genes sejam sempre transcritos normalmente. Mas ainda não respondemos como os cientistas diferenciaram estes dois casos.
Eles utilizaram um plasmídio I+ Z+ Y+ e criaram um diplóide I+ Z+ Y+ / I- Z+ Y+ , comparando em seguida o crescimento das colônias diplóides com colônias do tipo selvagem e do tipo mutante para o gene I, com e sem indutor de transcrição no operador dos genes Z e Y. Os resultados obtidos foram os seguintes:
 
	
	Sem indutor
	Com indutor (AMPc)
	I+ Z+ Y+
	Não ocorre crescimento
	Ocorre crescimento
	I- Z+ Y+
	Ocorre crescimento
	Ocorre crescimento
	I+ Z+ Y+ / I- Z+ Y+
	Não ocorre crescimento 
	Ocorre crescimento
 
Na figura acima, tem-se uma representação do que aconteceria com o gene I (representado aqui com letra minúscula) no caso deste se tratar de um repressor ou ativador, na presença e na ausência de indutor de transcrição. Na primeira figura, o indutor desativaria o repressor, mas ativaria o ativador, fazendo com que ocorra mais transcrição; na segunda figura, a falta de indutor faz com que o repressor permaneça ativo e o ativador permaneça desativo, diminuindo a taxa de transcrição; na terceira figura, analisa-se o efeito de mutações no gene: repressor inoperante, ativador sempre ativo e ativador inoperante. 
Foi o fato de se recuperar o tipo selvagem que indicou que o gene I codifica um repressor. Se fosse um ativador, haveria atividade da β-galactosidase sem indutor no diplóide, pois o ativador codificado no plasmídio mutante iria se ligar à RNApolimerase.
Quanto à utilização da glicose, principal fonte de carbono para a célula, experimentos mostraram que a regulação das enzimas envolvidas em seu metabolismo se dá por um gene regulador ativador. 
Regulação em Eucariotos
Com o surgimento da carioteca, ocorreu um aumento na diversidade de formas complexas de vida, pois possibilitou o isolamento entre a transcrição e a tradução, além de manter o gene no núcleo, um local mais compactado, que permite um controle rígido de sua transcrição. O arranjo dos nucleotídeos no gene não é aleatório, como pode parecer à primeira vista, pois as seqüências codificantes dos genes estão sob enorme pressão seletiva, de forma que seu arranjo no DNA é todo sistematizado e está sob rígido controle. Cada seqüência codificante do gene é chamada open reading frames (ORFs). Ao contrário do que ocorre em procariotos, os genes de eucariotos não possuem BOXes para a ligação da RNApolimerase. Por isso é muito difícil separar genes em laboratório, já que não há as seqüências conservadas dos operadores para identificá-los. Isso é possível apenas com o uso de indutores de transcrição, como no experimento descrito no tópico anterior, que são proteínas produzidas pelos chamados genes repórteres.
Em eucariotos, chamamos a região codificante do gene de região down-stream, enquanto a região não codificante, que é anterior à codificante, é chamada up-stream. Quando deletemos certos trechos de DNA desta última, a resposta ao metabolismo de certas substâncias era alterada. Portanto, a região up-stream constitui o promotor do gene e possui sub-regiões de ativação e repressão da transcrição deste gene. Abaixo temos como exemplo a resposta de um organismo quanto ao metabolismo de glicose, lactose e galactose:
Em (a), percebe-se que o fragmento deletado do promotor atua na ativação do gene através de indução pela galactose. Em (b), o fragmento deletado atua na repressão do gene para o metabolismo de glicose. Em (c), o fragmento TATAAA, chamado tata-box é identificado como a seqüência de ligação da RNApolimerase. O fragmento (a) foi chamado UAS (sítio up-stream de ativação) e o fragmento (b) foi chamado URS (sítio up-stream de repressão).
Após a identificação das seqüências UAS e URS, tentou-se descobrir como elas atuam na transcrição. A evidência da ligação de proteínas foi dada por eletroforese em gel de extrato de células de levedura em condições diferentes (presença de glicose ou de galactose); esta técnica é chamada gel de desaceleração e seus resultados são expressos abaixo:
O resultado em 3 mostra que alguma proteína se liga à URS. Essa proteína foi chamada TFI (fator de transcrição da classe 1) e é, juntamente com uma série de proteínas chamadas proteínas essenciais à transcrição, necessária para que ocorra a transcrição in vitro. 
O isolamento dessas proteínas por cromatografia de afinidade revelou um conjunto de proteínas chamadas TFII, que provavelmente interagiam com o tata-box. Os fatores foram identificados com as letras de A até H. A confirmação da ligação destes fatores ao tata-box veio através do corrimento em gel de desaceleração. Descobriu-se que o TFIID possui afinidade pelo tata-box. Da mesma forma, o TFIIA e o TFIIB possuem afinidade pelo conjunto TFIID + tata-box e a RNApolimerase possui afinidade pelo conjunto tata-box + TFIID + TFIIA + TFIIB.
A correlação entre a atividade da levedura com e sem o TFIID forneceu a idéia completa sobre a complexidade da regulação em eucariotos. O TFIID, por si só, não é capaz de aumentar a atividade da levedura, ou seja, devem existir outros fatores relacionados à regulação que não foram ainda muito bem compreendidos e são chamados TAFs.
A importância do TFIID na ligação ao tata-box fez com que os cientistas mudassem seu nome para TBP (tata-box binding protein ou proteína de ligação ao tata-box).
Nota: como sabemos que a seqüência do tata-box é TATAAA e não simplesmente TATA? Se assim fosse, a fita dupla geraria uma seqüência palíndromo, o que poderia levar à indesejável transcrição de ambas as fitas e não apenas da fita molde.
E os outros fatores de transcrição? Todos se ligam à cauda carbóxiterminal da RNApolimerase e regulam sua atividade. Sua cauda possui várias seqüências peptídicas repetitivas, que são responsáveis por se ligar aos outros fatores. Quanto maior a complexidade do organismo, maior o número de repetições (de 7, em leveduras, até 70, nos seres humanos). Entre estes outros fatores está a helicase, enzima que abre a dupla hélice do DNA para que ocorra a transcrição.
Como já vimos, o promotor dos genes eucarióticos é composto pelo tata-box, pelo UAS e pelo URS. O UAS é quem permite a transcrição do gene (região down-stream) e é único para cada de gene. Em leveduras, por exemplo, o UAS responsável pela resposta à presença de galactose no meio foi chamado UASI e seu papel na transcrição veio através de sua ligação a um gene repórter e posterior transfecção em um promotor com o UAS mutado (quando o UAS está mutado, a atividade de transcrição é muito baixa), resultando em uma atividade de transcrição muito maior do que o normal.
No exemplo acima, testou-se a resposta à galactose. Descobriu-se que as seqüências UAS são conservadas e constituem locais onde se ligam proteínas que ativam a transcrição quase que independentemente de outros fatores. Estas proteínas são chamadas MBT (maquinaria basal de transcrição) e são formadas por dois domínios: BD (binding domain) e AD (activation domain). O BD é responsável por se prender ao UAS e o AD promove sua ativação. Quando estes dois domínios são utilizados separadamente em laboratório, não ocorre ativação do UAS; porém, se os domínios são separados e proteínas específicas são ligadas a eles, o UAS é ativado normalmente.
Por que isso ocorre? A resposta é que existem proteínas específicas que se ligam ao BD a ao AD e essas proteínas interagem entre si, promovendo a união dos domínios. No caso acima, a proteína que se liga ao BD é chamada MAP e a proteína que se liga ao AD é chamada MAPK. O sistema duplo-híbrido nos permite saber quais proteínas interagem entre si para a ativar o ativador do UAS: fundimos a ORF de uma proteína isca com a ORF de um dos domínios doativador e, em seguida, fundimos a ORF da proteína que interage com a isca com a ORF do outro domínio do ativador; se o gene onde está este UAS for transcrito, as proteínas foram encontradas.
Em genes eucariotos, porém, as ORFs não são contínuas. São separadas por íntrons, seqüências de DNA não codificantes. A transcrição ocorre tanto para éxons (DNA codificante) quanto para íntrons e o RNAm gerado é chamado transcrito primário. A ele é adicionado, ainda, um CAP (metionina metilada) na extremidade 5’ e uma cauda poli-A na extremidade 3’, que o impedem de ser degradado no ciplasma. O transcrito primário é capaz de se autoprocessar através de dobras da cadeia nos íntrons. Este processamento é chamado splicing e é realizado por grandes complexos chamados splicessomos. Há ainda o chamado splicing alternativo, que ocorre quando há o “corte” de certos éxons, resultando na formação de proteínas diferentes a partir de um mesmo gene. Quanto mais complexo o organismo, maior é a quantidade de meios de controle da transcrição.
Trancrição de RNAi e micro RNA’s
O RNAi pode ser definido como um processo de silenciamento de um gene através de uma dupla fita de RNA. Sua descoberta rendeu o Nobel de 2006 a dois pesquisadores norte-americanos. O processo todo envolve a ligação do RNAds (double-stranded RNA – dupla-fita) a uma proteína chamada dicer, que nada mais é do que uma RNAase do tipo III, que cliva o RNAds em pequenos fragmentos. Um destes fragmentos liga-se a um complexo chamado RISC, possibilitando sua ligação a um RNAm, chamado RNA alvo, por pareamento de bases e posterior clivagem deste RNAm. Isso impede a atuação deste RNAm na tradução. O RISC (RNA induced silence complex) é um complexo protéico que possui em sua constituição uma proteína argonauta (uma RNAase), que é a responsável pela clivagem do RNA alvo. O fragmento de RNAds que se liga ao RISC possui em torno de 21 pares de bases, mas apenas uma de suas fitas faz essa ligação. A ligação dessa fita é determinada por seqüências de RNAsenso, presentes no RNA alvo. A fita do RNAds que se liga é chamada RNAanti-senso, que geralmente é mais estável.
Mas de onde vem o RNAi? O RNAds é uma forma encontrada principalmente em plantas e invertebrados, com função de promover a defesa contra vírus, uma vez que a replicação do RNA viral necessariamente passa por uma fase de RNAds. Portanto, o RNAi surgiu primariamente como uma forma de degradar RNA viral. Os chamados micro RNA’s atuam in vivo nesta via de regulação, pois também culminam com a degradação do RNAm. A única diferença é que o micro RNA é transcrito como um transcrito primário, que pode adquirir conformação secundária e ser reconhecido pela dicer. Tanto o RNA viral, como o micro RNA são duas vias naturais de origem do dsRNA, mas existe ainda uma terceira via.
Os transposons são elementos móveis de DNA e podem ser de dois tipos: um tipo comum, no qual fragmentos de DNA originais são translocados no genoma continuamente, e os retrotranposons, que sintetizam uma transcriptase reversa, que por sua vez sintetiza um fragmento de DNA móvel. Os transposons são elementos perigosos para o genoma devido à sua capacidade mutagênica. Geralmente estão concentrados no centrômero, exatamente para evitar esse risco. As seqüências dos transposons são repetitivas e, quando transcritas, formam RNAi, que pode ser reconhecido pela dicer no núcleo, ligando-se em seguida à RISC e pode então reconhecer seqüências de DNA. O reconhecimento do DNA pode levar à agregação de proteínas, conduzindo a uma condensação do DNA, silenciando muitos genes. Mais detalhes sobre esta via de regulação são ainda desconhecidos.
Histórico da descoberta do RNAi 
Em 1995, pesquisadores queriam evidenciar o papel do gene PAR-1 no desenvolvimento do nematóide C. elegans. Com a impossibilidade de transfectar o alelo selvagem em um mutante, eles tentaram obter o fenótipo mutante a partir do silenciamento de PAR-1 no indivíduo selvagem. Eles então observaram que o RNAanti-senso era eficiente para bloquear/inibir a expressão gênica, por complementaridade com o RNAm de PAR-1. O controle infectado com RNAsenso, porém, também funcionava de maneira satisfatória. Em 1998, os mesmos pesquisadores descobriram que os resultados com RNAsenso se deviam a contaminações com RNAanti-senso. Isso mostrou que o RNAds era o responsável pelo fenótipo mutante, uma vez que RNAsenso e RNAanti-senso, sozinhos, não resultaram em fenótipo mutante e, portanto, o efeito do RNAds é catalítico e não estequiométrico.
A descoberta do RNAi possibilitou uma série de screens genéticos independentes do DNA. Uma série de informações obtidas a partir de dados genéticos e bioquímicos possibilitou a descoberta de RNAi em eucariotos como A. thaliana e D. melanogaster.