AULA 12 - Processamento de RNA

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LORRANE BRAGA RANGEL LXIX - UFG 
• Muitas moléculas de RNA em bactérias e 
virtualmente todas as moléculas de RNA em 
eucariotos são processadas em algum grau 
após a síntese 
• Trechos não codificantes que interrompem a 
região codificadora do transcrito são chamados 
íntrons e segmentos codificadores são 
chamados de éxons 
• Os complexos que atuam nesse processo são 
organizados em associação uns com os outros 
e com o CTD fosforilado da Pol II 
• O processamento em eucariotos acontece no 
núcleo 
• Acontece durante a transcrição 
Quais os tipos de RNA presentes na célula? 
✓ Mensageiro 
✓ Ribossomal 
✓ Transportador 
✓ Micro-RNAs 
✓ SN RNAs 
✓ SnoRNAs 
Processamento do RNA mensageiro 
1- Adição de um quepe na extremidade 5’ do RNA 
2- Remoção dos íntrons 
3- Adição de uma cauda de poli A na extremidade 
3’ → estabilizam 
 
• É a inserção de um nucleotídeo (7-
metilguanosina) na extremidade 5’ no sentido 
contrário (5’→3’) que normalmente ocorre a 
ligação fosfodiéster 
• Formando-se uma ligação trifosfato 5,5’ – 
trifosfato 
• Cria-se uma estrutura resistente à ação de 
exonucleases → proteção da extremidade 5’ 
do RNA 
• Ele se liga a um complexo de proteínas 
ligadoras de quepe específico e participa da 
ligação do mRNA ao ribossomo para iniciar a 
tradução 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Como ocorre a formação do quepe? → Condensação 
de uma molécula de GTP com o trifosfato da 
extremidade 5’ do transcrito 
1- A extremidade 5’ tem um fosfato que vai ser 
clivado por uma fosfohidrolase 
2- Uma guanilil transferase transfere o 
nucleotídeo 
3- Ocorre a clivagem de dois fosfatos de um GTP 
liberando pirofosfato e a estrutura do CAP 
4- A guanina é metilada no N-7 e grupos metil 
adicionais são frequentemente adicionados às 
hidroxilas 2’ do primeiro e segundo 
nucleotídeos adjacentes ao quepe 
5- Quando o quepe termina de ser sintetizado, o 
complexo de síntese sai da região C terminal e 
dá lugar a um complexo de ligação do CAP 
(CBC) 
O CAP permanece grudado no domínio C terminal 
durante a transcrição 
• Para que o splicing ocorre é preciso que o RNA 
mensageiro seja mantido próximo à RNA 
polimerase e o CAP faz isso 
O RNA catalisa o splicing de íntrons 
Existem 4 tipos de íntrons 
• Grupo I (genes nucleares, mitocondriais e de 
cloroplastos) e grupo II (transcritos primários 
de mRNAs mitocondriais ou de cloroplastos) → 
diferem em detalhes dos seus mecanismos de 
splicing, mas compartilham o autosplicing, no 
qual nenhuma enzima proteica está envolvida 
 
 
Adição do quepe 
Splicing 
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Grupo I 
• Precisa de um nucleosídeo guanina ou de um 
cofator nucleotídeo → não é usado como 
energia 
• O grupo 3’-hudroxila da guanosina é usado 
como nucleófilo na primeira etapa 
• O grupo 3’-hidroxila forma uma ligação 3’,5 – 
fosfodiéster normal com a extremidade 5’ do 
íntron 
• Para retirar a segunda parte a própria 
extremidade 3’ livre do éxon 1 ataca a ligação 
que está sobrando entre o íntron e o éxon 2 
• O íntron vai ser liberado e uma nova ligação 
será formada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Grupo II 
• Ao invés de uma hidroxila de um nucleotídeo 
livre atacar a junção entre o éxon e o íntron o 
que ocorre é que uma hidroxila de uma adenina 
que faz parte do próprio íntron vai atacar a 
ligação 
• O íntron forma um laço → uma ligação 2’,4 
fosfodiéster 
• A extremidade 3’ OH livre do éxon 1 quebra a 
outra ligação e remove ele 
• O íntron é liberado na forma de um laço 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Spliceossomo 
Existem padrões presentes nos sítios de splicing que 
permite o seu reconhecimento 
• O RNA que compões o spliceossomo é o 
SnRNA: U1, U2, U4, U5 e U6 → snRNP 
• Esses RNAs são essenciais para o 
reconhecimento do sítio de splicing 
Obs: a adenina do final é essencial para o splicing 
• Existe uma complementariedade entre essas 
regiões e o RNA Sn → a exclusão da adenina 
é essencial para o ataque nucleofílico 
• Cada RNA desse interage com um grupo de 
proteínas que forma o spliceossomo 
Como que acontece o splicing mediado por 
spliceossomo? 
Frequentemente no começo do íntron tem uma GU 
(sítio de splicing 5’) e no final um AG (sítio de splicing 
3’) 
• snRNA U1 → reconhece a sequência 5’ → o 
snRNP U1 se liga à essa região 
• O U2 é pareado em uma posição que envolve 
o resíduo A que se torna o nucleófilo durante a 
reação de splicing 
• Os outros snRNPs U4/U6 + U5 entram para 
formar a estrutura com todos os snRNPs (o 
spliceossomo) → forma inativa 
• Para ficar na forma ativa o U1 precisa se 
desligar e o U4 se desligar do U6 
• O U6 também vai ficar grudado no sítio GU 
agora 
• Ocorre o ataque nucleofílico pela adenina na 
ligação fosfodiéster e a formação de um laço 
• Ocorre a clivagem da outra extremidade pela 
extremidade 3’ OH livre 
 
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• O splicing ocorre durante a transcrição do 
mRNA 
• A velocidade com que a RNA polimerase 
transcreve influencia o splicing favorecendo ou 
desfavorecendo o processo 
A adição da cauda poliA+ tem a função de proteger a 
extremidade 3’ da ação de exonucleases e ela também 
estabiliza a molécula do mRNA 
• Ela serve como sítio de ligação para uma ou 
mais proteínas específicas 
• Envolvida no tempo que o mRNA existe 
Como que essa cauda é adicionada? 
1- O transcrito se estende além do local em que a 
cauda de poli (A) deve ser adicionada 
2- Ele é clivado no local de adição da poli (A) por 
endonucleases 
3- O local do mRNA em que a clivagem ocorre é 
marcado por dois elementos de sequência: 5’ 
AAUAAA 3’ a montante do sítio de clivagem e 
uma rica em G e U abaixo do local de clivagem 
4- A clivagem gera um grupo 3’-hidroxila livre que 
define a extremidade do mRNA, à qual os 
resíduos A são imediatamente adicionados 
A quantidade de adeninas adicionadas no final da 
cauda é variável, mas fica em cerca de 250 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Os mamíferos tem maiores números de 
éxons/gente 
Em animais mais evoluídos contém bem mais genes 
com íntros 
Alguns transcritos de mRNA podem ser processados 
de mais de uma maneira para produzir diferentes 
mRNAs e, portanto, diferentes polipeptídeos 
• Esses transcritos podem ter ou mais de um sítio 
de clivagem e poliadenilação ou padrões de 
splicing alternativos, ou ambos 
• Aumenta o número de proteínas codificadas 
por um gene 
Adição da cauda poliA 
Processos alternativos 
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1- Utiliza dois sítios alternativos de poli(A) 
• O RNA poderá ser clivado em dois pontos 
• O uso daquele mais próximo da extremidade 5’ 
irá remover mais sequência do transcrito 
primário 
• Imunoglobulina 
2- Utiliza sítios de splicing 
• Utilização de sítios com combinações 
diferentes 
• Miosina 
 
Existem genes que podem dar origem a diferentes 
proteínas dependendo da célula 
• Ex: um único transcrito de RNA pode ser 
processado para dar origem ao hormônio 
regulador de cálcio calcitonina na tireoide de 
ratos e o peptídeo relacionado ao gene da 
calcitonina (CGRP) no cérebro do rato 
 
A tropomiosina também pode sofrer splicing 
alternativo 
 
 
 
 
 
 
Esse processo permite que um só gene forme várias 
proteínas diferentes → diversidade 
 
 
 
 
 
Uso de promotores alternativos → distrofina 
(proteína associada com a síndrome muscular de 
Duchene) 
• A distrofina é essencial para a conexão das 
fibras de actina com a sarcolema 
• Ela é uma proteína extremamente longa 
presente no cromossomo X 
Gene da distrofina 
• Seu processamento está relacionado com a 
diversidade de promotores 
• Algumas sequências de DNA codificam mais 
de um polipeptídeo 
Muitos RNA mensageiros dão origem a bem mais 
proteínas do que uma só 
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• Tem como função alterar a estrutura do RNA 
para que eleatinja sua estrutura final madura e 
funcional 
• Esses RNAs podem contar com diversos 
nucleosídeos modificados 
rRNA – RNAs ribossomais 
• Constituído de 4 moléculas diferentes 
• Ribossomos = rRNA + proteínas 
1- Gene do RNA ribossomal 18 S; 5.8S e 28S é 
transcrito pela RNA polimerase I em um pré-
rRNA (45S) 
2- Clivagem e modificação de nucleotídeos → 
adição de grupos metil e de pseudouridinas 
permitida por snoRNAs 
O ribossomo vai sendo sintetizado durante a síntese e 
processamento do RNA, assim, ao final do 
processamento do rRNA o ribossomo estará no final da 
sua síntese 
Cada complexo de montagem inclui: 
• Ribonucleases que clivam o precursor de rRNA 
• Enzimas que clivam bases específicas 
• RNA nucleolares pequenos (snoRNA) → guiam 
a modificação de nucleosídeos e algumas 
reações de clivagem 
• Proteínas ribossomais 
• Ele termina sua maturação no citoplasma → 
menor parte 
Obs: o rRNA 5S da maioria dos eucariontes é produzido 
como um transcrito inteiramente separado por uma pol 
III 
• As modificações mais comuns em eucariotos é 
a conversão de uridina em pseudouridina e 
metilação de nucleotídeos dependente de 
adoMet → depende de um complexo snoRNP 
que consistem em um snoRNA e quatro ou 
cinco proteínas, que inclui a enzima 
modificadora 
tRNA – RNAs transportadores 
• Estrutura secundária com grampos e alças 
formando um trevo 
• Esses RNAs transportadores são derivados de 
precursores de RNA mais longos pela remoção 
enzimática de nucleotídeos das extremidades 
5’ e 3’. 
• Alto número de bases modificadas depois da 
sua transcrição 
Processamento 
1- Transcrito contendo uma região 5’ a mais e 
uma parte a mais na 3’ tbm e um íntron que 
precisa ser removida 
2- Modificação de bases e clivagem da região 5’ e 
3’ 
3- Splicing e origem do braço do anticódon 
• O número de classes conhecidas de RNAs de 
função especial está se expandindo 
rapidamente, assim como a variedade de 
funções que se sabe estarem associadas a 
eles 
• Muitos desses RNAs são processados 
• snRNAs e snoRNAs 
Processamento de rRNA e tRNA 
Outros RNAs 
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MicroRNAs 
• São uma classe especial de RNAs envolvidos 
na regulação da expressão gênica 
• Elas não são codificantes, mas são 
complementares em sequências a regiões 
particulares de mRNAs 
• Regulam o funcionamento do mRNA pela sua 
clivagem ou impedindo a sua tradução 
• Eles afetam a expressão dos genes 
Síntese e processamento de miRNAS 
1- Transcrito pela RNA pol II → pri-miRNA 
2- Interação com um complexo de proteínas 
(drosha e DGCR*) → processamento e 
clivagem 
3- Origina o miRNA (reduzido por um complexo 
proteico que inclui a Drosha e a DGCR8) 
4- O precursor (miRNA) vai ser transportado para 
o citoplasma por ação de uma proteína 
(Exportina-5) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5- No citoplasma interage com uma nuclease 
(dicer) que vai clivar a porção de loop fazendo 
com que ele se torne duas fitas ligadas por 
complementariedade 
6- A proteína RISC interage com esse RNA 
desnaturado → ela interage com uma das fitas 
do RNA gerando o miRNA quase maduro 
pareado com um pequeno complemento de 
RNA 
7- O complemento vai ser removido por uma 
RNA-helicase e o miRNA maduro é 
incorporado em complexos de proteínas 
 
 
 
 
 
A partir desse ponto o miRNA irá interagir com mRNA-
alvo, o que pode ser feito de duas formas: 
8- Ele pode gerar a desnaturação do RNA 
mensageiro → quando a sequência do MiRNA 
é muito parecida com o mRNA ele vai se ligar 
e direcionar o mRNA para a degradação 
9- Ou o retardamento da tradução pelo ribossomo 
→ quando ele tem menor complementariedade 
e ele permanece ligado com o mRNA 
impedindo a transcrição 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sistemas bacterianos que evoluíram para fornecer 
defesa contra a infecção por bacteriófagos → “sistema 
imunológicos” 
• Existem regiões de genes cas, que codificam 
nucleases, associados a sequências restantes 
de infecções por bacteriófagos, usadas como 
forma de reconhece-los 
• Assim, ela produz RNAs que têm sequência 
desses bacteriófagos e que servem como guias 
para o reconhecimento de novas infecções e as 
proteínas cas vão clivar e degradar o DNA 
invasor 
CRISPR/Cas9 
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A partir disso surgiu a metodologia utilizada para o 
direcionamento de mutações ou deleções de genes de 
forma direcionada 
1- Coloca a sequência de interesse em um 
plasmídeo e introduz ele na célula 
2- Ele vai entrar no núcleo e vai ser utilizado como 
molde para a síntese do complexo 
CRISPR/Cas9 
3- Esse complexo vai levar a uma quebra nas 
fitas, em uma só ou em duas 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Romper as duas fitas é muito passível a 
mutações 
• Se a intenção é inativar o gene ou substituir o 
gene é preciso inserir um fragmento de DNA 
que você quer inserir deve romper apenas 
uma das fitas e depois combinar o gene 
desejado.