AULA_3_TRANSCRIÇÃO_EUCARIOTOS

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BIOLOGIA MOLECULAR
ACH5564-2022
AULA_3- TRANSCRIÇÃO EUCARIOTOS
Prof. Luiz Paulo Andrioli
•A transcrição em eucariotos é mais complexa do que nas 
bactérias!
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TRANSCRIÇÃO EUCARIOTO
• Existem 3 RNA polimerases nos eucariotos: 
• RNAP I - genes RNAr 
• RNAP II - genes RNAm e outros não codificadores de proteínas 
• RNAP III - genes RNAt, 5S ribossomal, alguns snRNAs
• Além disso, as 3 RNA polimerases dependem de outras proteínas, 
fatores basais da transcrição, para montagem do aparato básico da 
transcrição, na região central (core) do promotor. 
TRANSCRIÇÃO EUCARIOTO
•A complexidade é desproporcionalmente maior envolvendo a 
RNA polimerase II! 
3
•Que transcreve quase a totalidade dos genes celulares;
• Em um ambiente onde o DNA está fortemente complexado 
com proteínas (cromatina), diferente dos procariotos.
TRANSCRIÇÃO EUCARIOTO
• A RNA polimerase II não só é responsável pela transcrição da maior 
parte dos genes constitutivos (housekeeping);
• Como é responsável pela transcrição de todos genes regulados!
• Por isso depende de uma diversidade muito grande de fatores trans- 
reguladores;
• Que atuam próximos da região promotora; 
• E em elementos cis-reguladores distantes da região do promotora. 
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• Assim como para as outras RNA polimerases, o aparato para a transcrição da 
RNA pol II é montado próximo do sítio de início da transcrição; 
• Mas existem elementos cis-reguladores (enhancers ou módulos reguladores) 
distantes entre 100pbs até vários kbs do promotor; 
• Onde se ligam (fatores de transcrição) que atuam para a regulação tecido-
específica da transcrição.
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TRANSCRIÇÃO EUCARIOTO
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RNA POLIMERASES
• Cada uma delas com 
mais subunidades do que 
a RNA polimerase de 
procariotos (ao menos 12 
subunidades);
• Apresentam 2 subunidades 
maiores, catalíticas, que são 
homólogas entre as 3 
polimerases eucariotas e 
homólogas as 2 subunidades 
catalíticas de bactérias (β e β’);
• A RNA polimerase e os fatores basais da transcrição formam o Complexo 
de Pré-iniciação da Transcrição (PIC) ou aparato básico da transcrição;
• Dentre esses componentes, existem aqueles que reconhecem as 
sequências de DNA, já que nenhuma RNA polimerase eucariota 
(nenhuma das suas subunidades), interage diretamente com o DNA;
• E aqueles que recrutam e posicionam corretamente a RNA polimerase;
• Um componente comum e fundamental entre os aparatos das 3 
polimerases é a TATA Binding Protein TBP. 
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RNA POLIMERASES
RNA POLIMERASE I e PROMOTOR
• Transcrição é realizada a partir de um promotor único e termina após o terceiro 
gene;
• Promotor é bipartido: região core e região upstream promoter element (UPE);
• UPE é uma região atípica para promotor, rica em C-G;
• Mas a região core apresenta sequência A/T conservada próxima ao sítio de início 
da transcrição;
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• O aparato de transcrição necessita de duas 
proteínas auxiliares;
• Uma delas é o fator SL1, crucial para reconhecer 
o promotor, recrutar RNA pol I e posicioná-la no 
promotor;
• SL1 é composta por 4 subunidades;
• Uma das subunidades de SL1 corresponde a TBP 
(TATA binding protein);
• No caso da RNA pol I, TBP não se liga ao DNA, 
mas é necessária para recrutar a polimerase;
• O fator UFB se liga no elemento UPE;
• Função para abrir e manter a cromatina aberta 
além de estimular SL1 e a transcrição. 
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RNA POLIMERASE I e PROMOTOR
• RNA pol III transcreve subunidades 5S rRNA, tRNAs e alguns snRNAs (small 
nuclear RNAs);
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• O promotor externo, para snRNAs, é 
composto por três elementos;
• O elemento TATA é ligado pela TBP e 
os outros dois elementos são ligados 
por proteínas que cooperam entre si e 
incrementam a transcrição;
RNA POLIMERASE III e PROMOTOR
• Duas classes de promotores: internos (downstream) e externos (upstream) a 
unidade de transcrição;
• Os promotores internos são elementos 
bipartidos;
• Elementos downstream são reconhecidos 
por fatores (TFIIIA e TFIIIC) que após se 
ligarem no DNA;
• Têm como função recrutar e posicionar 
TFIIIB próxima ao início da transcrição; 
• TFIIIB por sua vez, tem como uma das 
subunidades a TBP que então recruta 
DNA pol III.
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TBPTBP
RNA POLIMERASE III e PROMOTOR
RNA POLIMERASE II
• A RNA polimerase II transcreve todos genes codificadores de proteínas e uma 
quantidade enorme e variável de RNAs, muitos dos quais com funções 
desconhecidas que tem sido descobertos nos últimos anos;
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• A diversidade de genes transcritos pela RNA 
polimerase II implica na maior complexidade 
do aparato de transcrição (mais subunidades 
da RNA pol II e de fatores gerais da 
transcrição);
PROMOTOR CORE
• A diversidade de genes sob controle dessa polimerase implica em maior diversidade de 
sequências passíveis de serem utilizadas na região promotora; 
• A sequência TATA, muito parecida com a de bactérias, também com posição conservada em 
relação ao início de transcrição, mas a 25pb no caso dos eucariotos; 
• Além disso, destacam-se outros elementos, como a sequência iniciadora (Inr), que é um duo 
CA no início de transcrição ladeado por pirimidinas;
• Alguns genes não possuem TATA e apresentam uma sequência DPE (elemento promotor 
downstream). 
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RNA POLIMERASE II
• A formação do PIC é um processo de 
montagem sequencial dos fatores gerais da 
transcrição; 
• Envolvidos com o reconhecimento das 
sequências de DNA da região promotora;
• No recrutamento e correto posicionamento 
da RNA polimerase II (transcrever a fita no 
sentido correto a partir da posição +1);
• Na abertura do DNA e na interação com a 
cromatina entre outras funções. 14
RNA POLIMERASE II
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• Um dos principais fatores basais da transcrição é o TFIID; 
• TFIID é formado por subunidades invariáveis e outros tecido-específicas;
• Além da TBP, em torno de outras 14 subunidades (TAFs: TBP associated factors);
• Algumas delas podem assumir papel importante no reconhecimento de 
sequências alternativas caso o TATA box não seja a região mais importante para 
um gene.
RNA POLIMERASE II
• Além disso, o aparato basal da 
transcrição interage proteína-
proteína, com proteínas 
associadas diretamente ou 
indiretamente com regiões do 
DNA próximas ou distantes do 
promotor.
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RNA POLIMERASE II
• O domínio C-terminal (CTD) da 
maior subunidade é formado por 
uma repetição conservada de sete 
aminoácidos (25-50x), alvo de 
fosforilação em serina e treonina;
• CTD regula as funções da enzima 
RNA polimerase e integra o 
processo de transcrição com outros 
processos celulares. 
17
PROMOTOR UPSTREAM
• Existem outras sequências adicionais de DNA upstream da região do core (em torno 
de 100 pb);
• Reconhecidas por outra classe de fatores de transcrição (ativadores/ repressores/ 
coreguladores/ mediadores), que atuam em diferentes momentos da transcrição;
• Como no reconhecimento de sequências e participação da montagem do aparato de 
transcrição; 
• E também na conexão entre os módulos reguladores e o core.
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MÓDULOS REGULADORES
• Genes codificadores de proteínas e regulados no desenvolvimento dependem de módulos 
reguladores (enhancers/ silencers), que podem estar próximos ou muito distantes do 
promotor (milhares pb);
• Modulam a regulação do promotor basal de forma tecido-específica, ou seja, (quando, onde, 
e quanto do gene será transcrito);
• Nos módulos reguladores ligam-se os fatores de transcrição propriamente ditos, atuando 
como ativadores ou repressores; 
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• O módulo atua positiva ou 
negativamente na transcrição, de 
acordo com o balanço da atividade dos 
fatores nele ligados; 
• Os módulos comunicam-se com o 
promotor provavelmente pela formação 
de alças/ dobras que aproximam as 
duas regiões. 
• Uma série de eventos sucessivos são 
necessários para a montagem do complexo 
de pré-iniciação;
• O primeiro fator basal que atua 
reconhecendo o DNA é o TFIID, seguido do 
fator TFIIB que além de se ligar define a fita a 
ser transcrita;
• TFIID, TFIIB e TFIIA recrutam a polimerase; 
• TFIIF é umahelicase que deve atuar na 
abertura do DNA com TFIIH;
• TFIIH é multifuncional atuando tb na 
fosforilação de CTD (com o complexo quinase 
P-TEFb);
• A fosforilação de CTD possibilita iniciar a 
transcrição abortiva (4 – 5 nucl.);
• Outras fosforilações são necessárias para 
estender o RNA e o escape do promotor (e 
desacoplamento dos fatores basais). 
INICIAÇÃO
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• No alongamento do DNA restam os fatores TFIIF, TFIIS e proteínas associadas aos 
sítios fosforilados de CTD;
• O controle da fosforilação/ desfosforilação de CTD serve para reconhecimento e 
ancoragem ou desligamento de diversas proteínas;
• Proteínas que se ligam ao CTD estão envolvidas com diferentes etapas do 
processamento;
• O que torna essa região crítica para coordenar esses eventos com a transcrição;
ALONGAMENTO
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• A polimerase pode manter-se pausada já 
fora do promotor para essa possibilidade;
• 
• Além disso CTD também faz contato com 
a maquinaria de exportação do núcleo. 
TERMINAÇÃO
• As RNA pol I e III apresentam sítios discretos para terminação, o que não 
acontece para a RNA pol II;
• A RNA pol II pode continuar transcrição até 1 a 1,5 kb após a clivagem; 
• No entanto, a clivagem é importante para a terminação: 
22
• Ou porque o complexo de 
poliadenilação altera a conformação 
da cromatina local e a complexada 
com a RNA pol II desestabilizando-a 
(modelo alostérico);
• Ou porque gera uma extremidade 
sujeita a ação de exonuclease que ao 
alcançar a polimerase a desestabiliza 
(isso explicaria a ausência de 
conservação de sinal para o término). 
PROCESSAMENTO 
• Os RNAs mensageiros possuem regiões que não são traduzidas tanto em 
procariotos quanto em eucariotos (UTRs);
• Estas regiões estão a 5’ (5’UTR/ leader) e a 3’ (3’UTR/ trailer) da sequência 
codificadora;
• Por exemplo, a sequência Kozak, é um motivo de ácido nucleico que funciona 
como o local de iniciação da tradução de proteínas na maioria dos transcritos 
de RNAm eucariotos. 
ESTRUTURA RNAm
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• Nos eucariotos ocorrem modificações na molécula de RNAm ainda no núcleo
• O RNAm é uma molécula longa que será processada no núcleo
• O RNA recém-sintetizado RNAm primário ou pré-RNAm (RNAm nuclear 
heterogêneo), após processamento gera um RNAm (maduro/ final) que é 
exportado para o citoplasma
• Ocorrem três tipos de processamento:
• no 5’
• na região codificadora
• no 3’
ESTRUTURA RNAm
24
PROCESSAMENTO 
ADIÇÃO 5’ CAP
• Processamento 5’ CAP significa a adição de 
uma capa na extremidade 5’ do RNAm;
• Essa capa é um nucleotídeo guanina 
adicionado ao primeiro nucleotídeo da 
cadeia;
• Reação catalisada pela guanilil-transferase 
que atua como fosfatase removendo 
fosfatos;
25
• E fazendo a ligação não usual 5’-5’ entre os dois nucleotídeos;
• A guanina é então metilada na posição 7 pela guanina 7- 
metiltransferase;
• Outras metilações podem ocorrer nos nucleotídeos seguintes; 
• A modificação 5’ CAP tem várias funções: proteção 
(estabilidade), splicing, exportação e tradução.
PROCESSAMENTO 
• Na extremidade 3’ do RNAm é adicionada uma repetição entre 50 a 250 
nucleotídeos adenina;
• Essa sequência é adicionada após clivagem na região 3’UTR; 
ADIÇÃO DA CAUDA POLI A
26
PROCESSAMENTO 
• A clivagem é realizada por um complexo 
enzimático após 11 a 30 nucleotídeos de 
uma sequência AAUAAA e antes de uma 
repetição de uracilas;
• Do complexo fazem proteínas que 
reconhecem, sequências no DNA, uma 
endonuclease e a poliA polimerase 
(PAP) que inicia a síntese da cauda; 
• Na sequência, outra enzima- proteína 
reconhecedora de poli A (PBP)- estende 
a cauda até ≈ 200 adeninas.
• A principal função da cauda é proteger da degradação; 
• Provavelmente com papel tb na exportação;
ADIÇÃO DA CAUDA POLI A
27
PROCESSAMENTO 
• No citoplasma a cauda de poliA é 
direcionada para 5’CAP formando uma 
alça que é importante para o início de 
tradução;
• A região 3’UTR também é mediadora 
de interação com várias proteínas 
envolvidas na regulação dos RNAms;
• Controle importante de estabilidade 
removendo adeninas ou mantendo a 
cauda (meia vida de RNAm).
• O RNAm é sintetizado como uma molécula longa (RNA primário ou pré-RNA), 
em geral processado antes de sair do núcleo (RNA secundário ou maduro);
• O RNA primário contém dois tipos de módulos: éxons e íntrons;
• Os íntrons são módulos removidos da sequência do RNAm e os módulos 
restantes (éxons), são ligados entre si gerando o RNA maduro;
• Processamento chamado de splicing (recomposição) 
SPLICING/ 
RECOMPOSIÇÃO
28
PROCESSAMENTO 
• O splicing é realizado no núcleo, em um dos maiores complexos 
supramoleculares da célula, o spliceossomo; 
• O spliceossomo é formado por 5 tipos de snRNAs (pequenos RNAs nucleares) e 
centenas de proteínas;
• Os snRNAs se associam a proteínas formando pequenas partículas, snRNPs 
(pequenas ribonucleoproteínas nucleares);
SPLICING
29
PROCESSAMENTO 
• Os snRNAs são pequenas moléculas de RNA, 
entre 100 e 200 nucleotídeos (U1, U2, U4, 
U5, U6) que dão nome aos snRNPs;
• Cada snRNA se associa a um conjunto de 
proteínas específicas para cada RNP 
(distintas das demais proteínas do 
spliceossomo). 
• O splicing depende de sequências sinalizadoras conservadas:
• GU no início do íntron (sítio doador) 
• AG no final do íntron (sítio aceptor) 
• A entre 18 a 40 nucleotídeos do final do íntron (ponto de ramificação) (branch 
site)
SPLICING
30
PROCESSAMENTO 
• O splicing ocorre por meio de etapas 
sequenciais, com participação ativa dos RNPs;
• Primeiro: corte no sítio 5’ (GU) liberando 
extremidade do íntron que forma uma ligação 
com adenina do ponto de ramificação A 
(formando um laço);
• Depois, corte no sítio 3’ (AG) e as 
extremidades dos éxons unem-se 
covalentemente;
• O íntron (laço) é liberado e degradado 
rapidamente.
SPLICING
31
PROCESSAMENTO 
• Os snRNA reconhecem e pareiam com as sequências 
sinais do RNAm ou com snRNAs de outros snRNPs;
• O comprometimento inicial é dado pelo U1 snRNP se 
ligando no sítio doador e por proteínas se ligando no 
ponto de ramificação, que aproximam essas regiões 
do RNAm; 
• Segue-se a montagem do spliceossomo com a 
associação e dissociação sequencial das demais 
snRNPs;
• Processo requer energia, e em algumas etapas há 
evidências de atividade catalítica dos RNAs (e não das 
proteínas). 
SPLICING
32
PROCESSAMENTO 
• Além do splicing verificado para a maior parte dos RNAms dos eucariotos;
• Existem duas outras formas de splicing, dos grupos I e II, verificadas em 
bactérias, organelas e eucariotos unicelulares;
• Possuem em comum a característica de auto-splicing (independem de proteínas 
para remoção do íntron); 
• Por outro lado, especialmente o grupo II, guarda homologia mecânica com 
splicing nuclear. 
SPLICING
33
PROCESSAMENTO 
• O processamento é muito frequente nos eucariotos multicelulares; 
• A maior parte dos genes com vários éxons e íntrons de tamanho grande;
• Além disso, éxons podem ser íntrons (e vice-versa), dependo do tipo celular;
• Esse processo chama-se splicing alternativo; 
• O splicing alternativo é a regra e não exceção (90% dos genes de mamíferos). 
SPLICING
34
PROCESSAMENTO 
TROPOMIOSINA de CAMUNDONGOS
• A exportação do núcleo tb está associada ao correto 
splicing;
• RNAs corretamente processados, sendo que o 
monitoramento do 1º íntron é fundamental;
• São exportados;
• Processo mediado pelo complexo éxon juncional (EJC); 
• Parte do complexo é exportado junto com o RNAm;
• Que é removido em situações normais após o 1º round 
de tradução;
• Caso o RNAm seja defeituoso, por exemplo, stop códon 
prematuro, ribossomo não libera proteínas do EJC; 
• Que recruta proteína para remoção da capa 5’ do 
RNAm induzindo sua degradação. 
SPLICING
35
PROCESSAMENTO 
RNAS RIBOSSOMAIS
• Os genes ribossomais geram grande qtde de RNA: 80- 90% do total de RNA 
celular;
• Os genes para RNArs estão presentes em inúmeras cópias no genoma, idênticas 
entre si;
• Entre100 cópias em unicelulares até várias centenas em multicelulares; 
• As cópias dos genes ribossomais estão em tandem (in tandem), ou seja, 
dispostas lado a lado numa mesma região do cromossomo;
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RNAS RIBOSSOMAIS
• Nos eucariotos, as cópias em tandem encontram-se agrupadas em 
diferentes regiões cromossômicas, formando clusters (1 cluster = 1 
agrupamento);
• No núcleo, os clusters são agrupados em unidades funcionais, as 
regiões organizadoras do nucléolo;
• O nucléolo é um compartimento nuclear (não delimitado por 
membrana) dedicado a síntese de rRNA e montagem dos ribossomos; 
37
RNAS RIBOSSOMAIS
• Os clusters ribossomais são formados por vários genes em tandem, a partir de 
uma organização estrutural denominada unidade de repetição; 
• Existe um cluster (unidade de repetição) para o RNAr 5S e uma para os demais 
RNArs 28S/ 18S/ 5,8S
38
RNAS RIBOSSOMAIS
• A unidade de repetição para RNArs 28S/ 18S/ 5,8S contém um promotor único, 
que transcreve os 3 genes simultaneamente;
• As unidades de repetição são separadas por regiões espaçadoras não 
transcritas;
• Os genes são separados por regiões internas transcritas (ITSs) mas processadas, 
assim como regiões externas da unidade de repetição (ETSs). 
39
Raška et al.,2004
RNAS RIBOSSOMAIS
40
• Para o cluster RNAr 5S humano, a unidade de repetição tem 2,2 kbs;
• O transcrito é pequeno, com 200pb, e regiões transcritas são removidas; 
molécula madura tem 120pb. 
• As regiões espaçadoras 
transcritas são removidas 
do RNA precursor;
• Endonucleases e 
exonucleases clivam e 
aparam essas regiões 
liberando cada um dos 3 
tipos de RNArs. 
RNAS TRANSPORTADORES
• Grande diversidade estrutura de genes de RNAts;
• Variação tb do número de genes:
• Genoma de camundongo e humano revelaram a existência entre 350-400 genes 
(além de pseudogenes);
• Mas Danio e Xenopus ≥ 300 genes;
• Amplitude tb verificada entre arqueobactérias;
• Genes podem apresentar íntrons.
41
• Término da transcrição: dependente de uma sequência 
de Ts que desestabiliza RNA pol III e repetição de Us no 
RNA protege contra degradação.
RNAS TRANSPORTADORES
• Os RNAts originam pré-RNAs que são 
processados;
• Regiões das extremidades são removidas e 
podem ocorrer adições na molécula;
• Mecanismos de processamento 
conservados entre bactérias e eucariotos 
(não para a remoção de íntrons); 
42
RNAS TRANSPORTADORES
• A extremidade 5’ é clivada pela 
ribonucleoproteína ribonuclease P, que é um 
complexo formado por proteínas e um 
componente de RNA com atividade catalítica; 
• A extremidade 3’ é clivada por ação de 
endonucleases seguida por exonucleases que 
aparam essa extremidade;
• Uma enzima, a RNAt nucleotidiltransferase 
sintetiza e adiciona a sequência CCA na 
extremidade 3’ quando essa sequência não é 
codificada pelo gene de um RNAt.
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RNAS TRANSPORTADORES
• São comuns alterações pós-transcricionais nos RNAs, principalmente nas bases 
nitrogenadas;
44
• Mas nos RNAts são diversificadas e 
extensas (15- 20% da molécula); 
• Modificações vão desde metilações até a 
substituição de uma base por outra 
(convencional ou não);
• As modificações conferem estabilidade à 
molécula de RNAt e especificidades de 
reconhecimento no sítio A do ribossomo, 
além de garantir especificidade de 
pareamento (por causa das oscilações 
(wobbles)).
45
RNAs
• RIBOZIMA
• RNA do intron com atividade catalítica e capaz de 
auto-remoção. 
• Splicing do RNAr 35S deTetrahymena
Ensaio de splicing do intron de
Tetrahymena inserido em
construção para expressão de
β-galactosidase em E. coli.
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