Aula PCR

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O que é PCR???
PCR-consiste em fazer cópias de seqüências alvo presentes no DNA, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.
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PCR
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.
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Ocorre em Ciclos
1) Desnaturação:
94-96ºC
2)Anelamento
37-65ºC
3)Polimerização
72ºC
Como ocorre ???
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Visualizando o que acontece em cada ciclo...
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OS Alvos do PCR
Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.
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PCR Targets
O número de bases nos alvos pode variar.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
O . . . . Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas em não conhecê-la para poder amplificá-la.
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PCR - Desnaturação
A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C. 
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PCR Primers
Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da seuqência-alvo.
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PCR Primers 
Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções.
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PCR Primers
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
AATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>
e
 <. . . . . . . . . . AAATTTGGCCAA
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
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PCR Primers
OS primers são colocados em excesso na reação de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.
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PCR - Anelamento
O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.
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PCR Taq DNA Polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.
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PCR Taq DNA Polimerase
Essa bactéria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de MG, a altas temperaturas.
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
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PCR Cycles
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PCR Ciclos
Desnaturação: 94°- 95°C
Anelamento: 55°- 65°C
Extensão: 72°
Número de ciclos: 25-40
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
Número de cópias da 
Região alvo de DNA
A = 2n
n = número de ciclos
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PCR Requerimentos
Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
Tampão: pH 8.3-8.8
dNTPs: 20-200µM
Primers: 0.1-0.5µM
DNA Polimerase: 1-2.5 units
DNA Alvo:  1 µg
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Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado de
Não remover a faixa de células brancas.
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Extração de DNA de células sanguíneas
Extrair cuidadosamente 200ul da região de células brancas
E separar em tubos identificados
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Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar
Protease a 
Cada tubo
Adicionar 
Tampão de
Lise em cada
tubo
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Extração de DNA de células sanguíneas
Realizar
Homogeneização
Criteriosa do 
material
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Extração de DNA de células sanguíneas
Incubar os tubos
A 56C por pelo
Menos 10min.
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Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar os tubos
para retirar quaisquer
grumos
Adicionar etanol para lavagem
e centrifugar de novo.
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Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar as amostras em colunas de afinidade e 
centrifugar .
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Extração de DNA de células sanguíneas
Tubo com coluna
A coluna vai ser retirada
e adaptada em outro tubo
no qual será feita a eluição
Coluna.
Esse eluato (flow
through) será
Descartado.
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Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna será colocada em um novo tubo, aonde será
Lavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquer
Moléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.
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Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna com o tubo é então centrifugada
Mais uma vez, para remover excesso de
Tampão de Lavagem.
O próximo passo é adicionar Tampão de Eluição
Incuba-se por 30 minutos a 25C
O eluato da coluna é então guardado, pois agora esse contém o DNA Alvo.
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Extração de DNA de células sanguíneas
Então pode-se preparar o mix de PCR.
Mix de PCR
10x Buffer - 10 µl
MgCl - 6 µl
dNTPs- 0.8 µl
Primer forward - 2 µl
Primer reverse - 2 µl 
Taq polimerase - 0.5 µl
H2O estéril - 73.7 µl 	
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Concentrações Padrão
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Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubos
Específicos e colocar em termociclador.
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Extração de DNA de células sanguíneas
Análise do produto de PCR.
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Aplicações do PCR na Tecnologia de DNA recombinante
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Tecnologia do DNA recombinante
Importância
Enzimas de Restrição
Vetores
 Plasmídeo
Fagos
Vírus
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Construindo o DNA recombinante
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Teste de Paternidade
Uma das principais características encontradas no genoma de organismos eucariotos são as chamadas seqüências de repetição
Em uma população, podemos encontrar alelos diferentes desta mesma seqüência entre os indivíduos onde a diferença entre eles está apenas no número de vezes em que a unidade se repete.
Estas seqüências repetitivas são utilizadas em testes de paternidade por DNA por serem altamente polimórficas, o que diminui muito a possibilidade de que dois indivíduos não relacionados tenham o mesmo genótipo, isto é, os mesmos alelos
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Aplicação em algumas Doenças 
Hemofilia
vetores liberando fatores de coagulação
Diabetes
inibição de moléculas implicadas no desenvolvimento da diabetes tipo 1
Modificação da células do fígado
Arteriosclerose
expressão de fatores de crescimento
Aids 
modificação de glóbulos brancos
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Dor
expressão de preproencefalina
Câncer
Destruição de células tumorais pela expressão de produtos tóxicos
Inibindo a expressão de oncogenes e aumentando a de genes supressores de tumores
Proteção das células normais dos efeitos da quimioterapia.
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