21-Toxicologia-Laboratorial_f5a924bc90134fcabc03ad7d5e3079b6

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MÓDULO I 
 
1 – Introdução 
1.1 – Fatores que influem na toxicidade; 
1.2 – Características físicas dos agentes tóxicos; 
1.3 – Tipos e efeitos de ação tóxica (ou órgão alvo, onde atuam); 
1.4 – Tipos de Testes Toxicológicos; 
1.4.1 – Informações Preliminares ; 
1.4.2 – Estudos de Toxicidade Aguda; 
1.4.3 - Estudos de Toxicidade Subcrônica; 
1.4.4 - Estudos de Toxicidade Crônica; 
1.4.5 - Estudos de Mutagênese e Carcinogênese; 
1.4.6 – Testes de Teratogenicidade; 
1.4.7 – Estudos de Toxicocinética; 
1.4.8 – Efeitos locais sobre a pele e os olhos; 
1.4.9 – Estudos de Ecotoxicidade; 
1.5 – Classificação dos métodos analíticos; 
1.5.1 – Tipos de Métodos; 
1.6 – Ferramentas para análises; 
1.7 – Métodos Analíticos; 
1.8 – Calibração de Métodos Analíticos; 
1.9 - Questões para estudo; 
 
 
 
 
 
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1.10 – Glossário. 
 
Índice de figuras e quadros 
 
Figura 1 – Indicador de dose interna 
Figura 2 – Dose/resposta em teste de toxicidade 
Figura 3 – Log dose/resposta em teste de toxicidade 
Figura 4 – Perfil analítico: cromatografia em camada delgada (CCD) 
Figura 5 – Esquema do Teste de Ames 
Figura 6 – Curva de Calibração 
Quadro 1 – Classes de toxicidade 
Quadro 2 – Propriedades físicas e químicas em Métodos Instrumentais 
Quadro 3 – Componentes Instrumentais 
 
MÓDULO II 
 
2. Circuitos; 
2.1 – Amplificadores Operacionais; 
2.2 – Sinais Analógicos e digitais dos instrumentos; 
2.3 – Sinais e Ruídos; 
2.4 – Métodos espectrométricos; 
2.5 – Medidas espectroquímicas e os aspectos quantitativos; 
2.6 – Características dos Instrumentos Ópticos; 
2.7 – Espectrometria de Absorção Atômica e Fluorescência Atômica; 
2.7.1 – Aplicações da espectroscopia de absorção atômica com fontes de plasma; 
2.8 – Espectrometria de Massa Atômica; 
2.8.1 – Métodos de ionização; 
 
 
 
 
 
5 
 
 
2.8.2 – Sistemas de detecção e analisadores de massas; 
2.9 – Questões para estudo; 
2.10 – Glossário; 
 
Índice de Figuras e Quadros 
 
Figura 7 – Exemplos de símbolos e elementos utilizados em circuitos elétricos; 
Figura 8 – Entrada e saída de um amplificador operacional; 
Figura 9 – Amplificador Operacional seguidor de voltagem; 
Figura 10 – Representação de um sistema numérico decimal; 
Figura 11 – Áreas da desoxiguanosina (dG) das amostras de fígado de camundongo 
tratados com tetraidrofurano (THF); 
Figura 12 – Espectro de emissão de uma amostra de dC (desoxicitidina) tratada com THF 
com Ph; 
Figura 13 – Adutos de desoxiadenosina (dA-THF) e desoxicitidina (dC-THF) THF e suas 
tratados com massas; 
Figura 14 – Esquema representando o funcionamento de um espectrômetro de massas; 
Figura 15 – Exemplo de ionização química do ácido de Bronsted CH5
+
Figura 16 – Analisador de massa quadripolar; 
Quadro 4 – Caracteres alfanuméricos e seus equivalentes em binário; 
Quadro 5 – Métodos espectroscópicos que utilizam radiação Eletromagnética; 
Quadro 6 – Categorias principais de métodos espectroquímicos; 
Quadro 7 – Métodos de Ionização; 
 
MÓDULO III 
 
3 - Espectrometria de Luminescência Molecular; 
3.1 – Aspectos da Fluorescência e Fosforescência; 
3.2 – Componentes para a medida de fluorescência e fosforescência; 
3.3 – Aplicações da quimiluminescência, fosforescência e fluorescência; 
 
 
 
 
 
6 
 
 
3.4 - Espectrometria no Infravermelho; 
3.4.1 – Equipamentos para medidas de absorção infravermelha; 
3.4.2 – A espectrometria no infravermelho e suas aplicações; 
3.5 - Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN); 
3.5.1 - Ressonância Magnética Nuclear de onda contínua; 
3.5.2 - Ressonância Magnética Nuclear por Transformada de Fourier; 
3.5.3 – Aplicações de Ressonância Magnética Nuclear; 
3.6 - Espectroscopia de Massa Molecular; 
3.6.1 – Métodos de ionização em espectrometria de massa molecular; 
3.7 - Caracterização por Espectroscopia e Microscopia de superfícies; 
3.8 - Questões para estudo; 
3.9 – Glossário; 
 
Índice de Figuras e Quadros 
 
Figura 17 – Exemplo de Spins; 
Figura 18 – Átomo de oxigênio; 
Figura 19 – Diagrama de Pauling; 
Figura 20 – Componentes para medida de fluorescência e fosforescência; 
Figura 21 – Descrição de componentes de um espectrômetro de massa; 
Quadro 8 – Regiões espectrais do Infravermelho; 
Quadro 9 – Propriedades magnéticas de quatro núcleos com Spin ½; 
Quadro 10 – Deslocamentos químicos aproximados de alguns prótons; 
Quadro 11 – Exemplos de métodos espectroscópicos para análises de superfície; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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MÓDULO IV 
 
4 - Métodos de separação cromatográficos; 
4.1 - Cromatografia Gasosa; 
4.1.1 – Gás de Arraste; 
4.1.2 – Detector por ionização de chama; 
4.1.3 - Detector fotométrico de chama; 
4.1.4 – Outros detectores; 
4.1.5 – Colunas para cromatografia gasosa; 
4.1.6 – Aplicações da cromatografia gasosa; 
4.2 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE); 
4.2.1 – Equipamentos importantes na cromatografia líquida de alta eficiência; 
4.2.2 – Outros tipos de cromatografia líquida de alta eficiência; 
4.3 - Eletroforese Capilar e Eletrocromatografia Capilar; 
4.4 - Miscelânea de Métodos; 
4.4.1 - Método para extração de DNA de fígado de camundongos da linhagem C57Bl/6J; 
4.4.2 - Protocolo de dosagem de proteína pelo método e Bradford; 
4.4.3 - Protocolo de extração de microssomos; 
4.4.4 – Métodos térmicos; 
4.5 - Métodos de Análise Automatizados; 
4.6 – Questões para estudo; 
4.8 - Anexo A – Soluções e Tampões; 
 
Índice de Figuras e Quadros 
 
Figura 22 – Tipos de cromatografia; 
Figura 23 – Esquema de um cromatógrafo a gás; 
Figura 24 – Componentes de um equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência; 
Quadro 12 – Classificação de métodos cromatográficos; 
 
 
 
 
 
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Quadro 13 – Variáveis que afetam a eficiência de uma coluna cromatográfica; 
Quadro 14 – Símbolos das relações e grandezas utilizadas na cromatografia; 
Quadro 15 – Exemplos de fases estacionárias em cromatografia gás-líquido; 
Quadro 16 – Exemplos de fase móvel em cromatografia; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MÓDULO I 
 
 
 
 
 
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Testes Toxicológicos 
 
1 – Introdução 
 
A toxicologia é a ciência que estuda os efeitos nocivos produzidos pelas 
substâncias químicas sobre os organismos vivos. Portanto, ao homem, os animais e as 
plantas que podem estar expostos a uma grande variedade de substâncias químicas. 
Estas podem, por exemplo, serem metais e substâncias inorgânicas, moléculas orgânicas 
muito complexas. Ou seja, a toxicologia se ocupa da natureza e dos mecanismos das 
lesões tóxicas e da avaliação quantitativa do espectro das alterações biológicas 
produzidos pela exposição aos agentes químicos. Estuda o efeito adverso de substâncias 
químicas sobre os organismos vivos, com a finalidade principal de prevenir o 
aparecimento deste efeito, ou seja, estabelecer o uso seguro destas substâncias 
químicas. 
Substâncias muito tóxicas acarretarão efeito tóxico em pequenas doses, enquanto 
que substâncias de baixa toxicidade precisam ser utilizadas em altas doses para acarretar 
um efeito tóxico. É importante saber que a relação entre a concentração e o tempo de 
exposição, bem como a intensidade do efeito, depende de variáveis como idade, 
condições de saúde do indivíduo ou organismo exposto. 
A dose ou concentração do agente químico envolvido na exposição e o tempo de 
interação da substância com o organismo serão determinantes para exercer ou não ação 
tóxica no plano tecidual e celular. 
Um efeito adverso pode ser definido como uma alteração indesejável ou nociva 
após exposição a substâncias tóxicas ou potencialmente tóxicas, que podem ser 
exemplificadas como: variação no peso corpóreo, alteração anatomopatológicas, entre 
outros. Também pode o organismo responder a variação externa mantendo a função 
normal (homeostasia), permitindo que o organismo se adapte por meio de modificações 
 
 
 
 
 
10de variáveis medidas por 
transdutores utilizados em instrumentos químicos, os amplificadores operacionais 
são fundamentais para o bom funcionamento de diversos equipamentos usados nas 
análises químicas. 
São úteis em inúmeras aplicações em instrumentação, sistemas de controle, 
sistemas de regulação de tensão e corrente, processamento de sinais, entre outros. 
Os amplificadores operacionais apresentam, geralmente, circuitos de entrada em 
configuração diferencial. Na figura 8, temos um esquema mostrando as entradas 
 
 
 
 
 
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inversoras (-), não inversoras (+), as tensões de entrada eA, eB e a tensão de saída 
eS. 
 
Figura 8 – Entradas e Saídas de um Amplificador Operacional. 
 
 
A tensão de saída, é, então, independente das tensões eA e eB, dependendo 
de sua diferença, (eB – eA), por causa do circuito diferencial. Geralmente, um 
amplificador operacional é um dispositivo analógico composto em média por vinte 
transistores e resistores fabricados como circuito integrado em um único chip. As 
propriedades principais dos amplificadores operacionais são: ganhos altos de 
circuito aberto; altas impedâncias de entrada; baixas impedâncias de saída; e saída 
zero para entrada zero. Os amplificadores operacionais são usados em interligações 
em circuitos com várias combinações de capacitores e resistores e outros 
componentes elétricos. 
Em circuitos de realimentação, quando um sinal de saída está conectado a 
uma de suas entradas, o amplificador operacional é chamado de resistor de 
realimentação. Entretanto, em um circuito seguidor de voltagem (Figura 9), onde o 
sinal de entrada é apresentado a uma entrada não-inversora, e um circuito de 
realimentação de saída para entrada inversora é usado, neste circuito pode haver 
um ganho alto em potência, pois os amplificadores operacionais têm impedâncias 
altas de entrada e baixas de saída. 
- 
AVO 
+
eSeB
eA
 
 
 
 
 
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Figura 9 - Amplificador operacional seguidor de voltagem. 
 
 
Em um circuito seguidor de voltagem as impedâncias de entrada são 
divididas pelas impedâncias de saída do amplificador operacional, significando que 
não será necessário corrente do sinal de entrada. 
Porém o circuito interno do amplificador operacional e a fonte de 
alimentação poderão fornecer correntes altas na saída, o que é importante em 
medidas de fontes com alta impedância, onde os dispositivos de medidas de baixa 
impedância são empregados. 
Para entendermos a importância destes conceitos, é preciso entender para 
que fim utiliza-se um amplificador operacional dentro da instrumentação química. 
Em métodos analíticos como: coulometria, fotometria, detectores de 
ionização em cromatografia gasosa, onde as amplificações e medida de sinais 
elétricos advindos de transdutores são em geral dependentes da concentração, e a 
corrente, tensão e carga são fundamentais. 
Um transdutor é um dispositivo que transforma um tipo de energia em outro 
tipo de energia, utilizando um elemento sensor que recebe os dados e os 
transforma. Por exemplo, o sensor pode traduzir informação não elétrica (velocidade, 
posição, temperatura, pH) em informação elétrica (corrente, tensão, resistência). 
Para medidas de potencial, como na determinação da temperatura, utiliza-se um 
transdutor termopar; em medidas da concentração de íons é usado um eletrodo 
sensível a íons. 
 
- 
 
 
+ 
eA
 
 
 
eB
eS
http://pt.wikipedia.org/wiki/Energia
http://pt.wikipedia.org/wiki/Elemento_sensor
http://pt.wikipedia.org/wiki/Velocidade
http://pt.wikipedia.org/wiki/Posi%C3%A7%C3%A3o
http://pt.wikipedia.org/wiki/Temperatura
http://pt.wikipedia.org/wiki/PH
http://pt.wikipedia.org/wiki/Corrente
http://pt.wikipedia.org/wiki/Tens%C3%A3o_el%C3%A9trica
http://pt.wikipedia.org/wiki/Resist%C3%AAncia
 
 
 
 
 
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Os dispositivos de medida de alta resistência são necessários na 
determinação de valores de pH com eletrodo de vidro, por exemplo, que tem uma 
resistência interna da ordem de dezenas de megaohms, o que auxilia na medida de 
impedâncias necessárias para as medidas de potencial. Essas medidas fazem parte 
de estudos que precisam, por exemplo, medir as propriedades dos reagentes que 
estarão inseridos na análise toxicológica escolhida. 
 
2.2 - Sinais analógicos e digitais dos instrumentos 
 
Devido à demanda e a necessidade de resultados em menor tempo e com 
confiabilidade, a conexão de instrumentos analíticos ao microcomputador é nos dias 
de hoje, comum em muitos laboratórios de análises ou de pesquisa. Para tanto, 
estes equipamentos são usados para controle, aquisição, processamento dos dados 
analíticos e armazenamento dos dados. 
Os sinais digitais variam no tempo de forma discreta, isto é, caracterizam-se 
por pulsos que assumem um número finito de níveis e valores definidos. Portanto, 
trazem a possibilidade de separação do ruído, pois, enquanto os sinais analógicos 
carregam informação em forma de sua variação contínua de nível, sendo impossível 
corrigir perturbações interferentes, os sinais digitais carregam informação no 
conteúdo binário dos pulsos, preservando a capacidade de distinção entre os níveis 
discretos que estes pulsos podem assumir. 
A conversão digital baseia-se na transformação do sinal analógico em pulsos 
onde o conteúdo binário carrega a informação. 
Para entendermos de que modo uma sequência de códigos binários pode 
carregar uma informação contida num sinal analógico torna-se necessário 
conhecermos a teoria da amostragem que demonstra a tradução deste sinal por 
amostras representativas possibilitando então sua digitalização. 
 
 
 
 
 
Nas análises químicas, os pulsos podem ser convertidos para um domínio 
elétrico, inicialmente como pulsos analógicos e depois como pulsos digitais que 
podem ser contados utilizando-se um transdutor de entrada. 
Os circuitos digitais fazem a contagem dos pulsos elétricos recebidos pelo 
transdutor, pois, “processa” somente números para executar as suas operações e 
cálculos, e como o sistema é binário, os números têm valor 0 e 1. Os dígitos em um 
sistema numérico decimal representam o coeficiente de uma potência de 10. Por 
exemplo, o número 2035 pode ser escrito como demonstrado na figura 10: 
 2 0 3 5 
5 x 105 = 0005 
 
 
 3 x 101 = 0030 
 
 
0 x 103 = 0000 
 
 
 2 x 102 = 2000 
 Soma = 2035 
 
Figura 10 – Representação de um sistema numérico decimal. 
 
 
Porém no sistema binário (bits) é utilizado um coeficiente de potência de 
base 2. Esses dois valores são o “0” e o “1”. Portanto, podemos concluir que para 0 
temos desligado, sem sinal, e para 1 temos ligado ou com sinal. No quadro 4 os 
números decimais estão representados em grupos de oito bits. Porém, como ocorre 
no sistema decimal, todo zero que estiver à esquerda de dígitos binários não vale 
nada. Por exemplo: o decimal 14 é 1110 em binário, o mesmo que 00001110 ou 
000000001110. 
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Quadro 4 - Caracteres alfanuméricos e seus equivalentes em binário 
 
Números Decimais Código Binário 
0 00000000 
1 00000001 
2 00000010 
3 00000011 
4 00000100 
5 00000101 
6 00000110 
7 00000111 
8 00001000 
9 00001001 
10 00001010 
11 00001011 
12 00001100 
13 00001101 
14 00001110 
 
 
 
 
 
 
 
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Os contadores eletrônicos utilizam uma série de circuitos binários para 
contar pulsos elétricos, que são chaves eletrônicas com dois estados lógicos: 1(HI) 
ou 0 (LO). Podendo deste modo, cada circuito ser usado para representar um bit de 
um número binário. De acordo com o número de estágios de circuitos, o número de 
bits significativos em uma contagem tende a ser tão grande quanto o desejado. 
Porém, é preciso saber que estas contagens correspondem a um número 
binário que tem seu correspondente no sistema decimal. Os sinais digitais em geral 
são convertidos para sinais analógicos para o controle de instrumentos, para serem 
mostrados em dispositivosde saídas como, por exemplo, em registradores 
analógicos. 
Já a saída de grande parte dos transdutores utilizados em instrumentos 
analíticos é realizada por sinais analógicos, que são convertidos em sinais digitais, 
para ser usado no processamento de dados de um computador, entre outros. 
Resumindo, para processar sinais analógicos usando circuitos digitais, uma 
conversão é realizada para a digital. Tal conversão é efetuada por um Conversor 
Analógico-Digital ("A/D converter" ou ADC), onde, o sinal recebido, depois de 
digitalizado, é processado e, na maioria das vezes, será utilizado para atuar sobre o 
circuito analógico gerador do sinal original ou até mesmo sobre outro circuito. 
Já um sistema que aceita uma palavra digital como entrada e traduz ou 
converte o valor recebido para uma voltagem ou corrente analógica proporcional à 
entrada é chamado de Conversor digital-analógico ("D/A converter" ou DAC). Para 
tanto, quanto mais bits tiver o sinal de entrada (digital), melhor será o sinal 
convertido (analógico), pela maior precisão. 
Os equipamentos analíticos atualmente são utilizados de três formas: 
- na primeira o analista transfere para o computador os dados coletados e 
então são processados e se obtêm os resultados; 
- na segunda maneira, é feita uma comunicação direta do equipamento 
analítico com o computador a partir de um instrumento eletrônico, onde seu sinal é 
formatado, digitalizado e armazenado; e 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Conversor_Anal%C3%B3gico-Digital
http://pt.wikipedia.org/wiki/Conversor_Anal%C3%B3gico-Digital
http://pt.wikipedia.org/wiki/Conversor_digital-anal%C3%B3gico
http://pt.wikipedia.org/wiki/Conversor_digital-anal%C3%B3gico
http://pt.wikipedia.org/wiki/Conversor_digital-anal%C3%B3gico
 
 
 
 
 
- na terceira maneira, que é a mais utilizada, um microprocessador ou 
computador está imbutido no equipamento analítico, e o analista dirige suas 
operações via computador utilizando-se de um conjunto de softwares que em geral é 
adquirido com o equipamento analítico, desse modo os dados gerados pelo 
equipamento analítico, são transferidos em tempo real para o computador. 
Para exemplificar temos um espectro (figura 11) da área de amostras de 
fígado de camundongo tratado com tetraidrofurano (THF), onde os dados coletados 
foram analisados em um HPLC/PDA constituído por duas bombas LC-10 AD ou LC-
10AD/VP, um injetor Rheodyne (Cotati, CA), um detector de arranjo de diodos, 
modelo SPD35 M10AV, controlados por um módulo de comunicação e pelo software 
Class LC-10AWS (Class-VP). As separações no HPLC foram feitas utilizando uma 
coluna analítica (Luna C18(2) (250 mm x 10 mm i.d., 10 μm) da Phenomenex 
(Torrance, CA). A eluição ocorria por meio do sistema 1 utilizando água e 
acetonitrila. Sistema 1: 0-5 min, 5% de acetonitrila; de 5 a 30 min, 5 a 20% de 
acetonitrila; de 30 a 50 min, 20 a 40% de acetonitrila; e de 50 a 55 min, 40 a 100% 
de acetonitrila. 
 
Área dG das amostras de Fígado tratado com THF
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
1 2 3 4 5 6
 
Figura 11 – Áreas da desoxiguanosina (dG) das amostras de fígado de camundongo tratado com 
THF. 
56 
 
 
 
 
 
57 
Muitos softwares são desenvolvidos para o uso em química, biologia 
molecular, toxicologia e etc. Existem vários exemplos como: Chem Windows® que 
serve para desenhar estruturas moleculares, o SigmaPlot® usado para gráficos com 
dados científicos, o Origin Pro 7.5® para análise de dados. Utilizando-se destes 
softwares é possível traduzir as informações coletadas dos equipamentos analíticos, 
e colocar estas informações em forma de gráfico, tabela, textos, figuras, entre 
outros. Estes softwares são fundamentais para encontrar espectros individuais de 
componentes de uma amostra analisada por cromatografia, por exemplo. 
 
2.3 - Sinais e ruídos 
 
As medidas analíticas são constituídas por dois componentes: o sinal, que 
carrega a informação sobre o analito de interesse e o ruído (informação indesejada), 
que diminui a exatidão e precisão de uma análise e também estabelece o limite da 
quantidade do analito que pode ser detectada. 
A intensidade média do ruído N (noise) é constante e independente da 
magnitude do sinal S (signal). Por isto, a relação sinal-ruído (S/N) é importante e 
muito mais útil que o ruído sozinho para descrever a qualidade de um método 
analítico ou o desempenho de um instrumento, isto é, a sensibilidade do sistema 
analítico escolhido. Existem algumas fontes de ruído em análises instrumentais, 
como: 
• Ruído químico – é originado de inúmeras variáveis químicas ou físico-
químicas: temperatura, pressão, umidade, contaminantes, luz, vibração, entre 
outros. 
• Ruído instrumental - está associado a cada componente de um 
instrumento: à fonte, ao transdutor de entrada, a todos os elementos que processam 
sinais e ao transdutor de saída. Algumas espécies de ruído instrumental são 
reconhecíveis, tais como: ruído térmico ou Johnson: é causado pela agitação térmica 
de elétrons ou outros transportadores de cargas em resistores, capacitores, 
 
 
 
 
 
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transdutores de radiação, células eletroquímicas e outros elementos resistivos em 
um instrumento; ruído shot: ocorre quanto elétrons ou outras partículas carregadas 
atravessam uma junção; ruído flicker é caracterizado por ter uma magnitude 
inversamente proporcional à frequência do sinal que está sendo observado; como 
consequência, algumas vezes é chamado de ruído 1/f e o ruído ambiental 
(interferência): é a radiação eletromagnética captada e convertida em sinal elétrico. 
Existem vários métodos para serem utilizados nos hardwares e com os 
softwares que são úteis para melhorar a relação sinal-ruído de um método 
instrumental. Para reduzir o ruído por meio de um hardware é possível incorporar 
componentes no projeto do instrumento, como: filtros, blindagem, moduladores e 
detectores síncronos. Esses dispositivos auxiliam na remoção ou atenuam o ruído 
sem afetar o sinal analítico de modo significativo. 
Os métodos de softwares são baseados em algoritmos computacionais que 
permitem extrair os sinais mesmo contendo ruídos. Dentre estes programas, 
destacam-se diversas técnicas de averaging (tomada de média), transformada de 
Fourier (permite ter uma visão da imagem a ser analisada no domínio da frequência, 
facilitando esta análise e o seu processamento, aplicando-se técnicas de filtragem 
digital), smoothing (alisamento) e técnicas de correlação. 
Estas técnicas são aplicáveis em formas de onda não periódicas ou 
irregulares, como em um espectro de absorção a sinais que não tenha uma onda 
síncrona ou de referência, e também pode ser utilizada em sinais periódicos. As 
aplicações referentes à transformada de Fourier são inúmeras: filtragem, 
segmentação, reconhecimento de padrões, descrição de imagens, compressão e 
reconstrução são algumas delas. 
A transformada de Fourier representa a soma de uma série de formas de 
onda senoidais com diferentes amplitudes, fase e frequência. Por isso, a 
transformada de Fourier pode ser utilizada também na reconstrução bi-dimensional 
de imagens devido sua facilidade e rapidez de cálculo, comparado com a resolução 
das equações de projeção algebricamente. 
 
 
 
 
 
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Portanto, a transformada de Fourier é uma das ferramentas mais 
empregadas em processamento de sinais, processamento de sons e em 
processamento de imagens. A melhora na relação sinal ruído pode ser obtida 
utilizando-se então, de equipamentos e programas específicos para cada tipo de 
ferramenta analítica. 
 
 
2.4 - Métodos Espectrométricos 
 
Os métodos analíticos baseados na espectroscopia atômica e molecular 
estão inseridos nos métodos espectrométricos. 
Os métodos de espectroscopias de infravermelho (IV), ressonância 
magnética nuclear de hidrogênio e carbono-13 (RMN de 1H e 13C) e a espectrometria 
de massas (EM) são ferramentas utilizadaspara esclarecer a estrutura de 
substâncias orgânicas e inorgânicas. 
Para se obter informações quanto aos grupos funcionais que podem estar 
presentes na estrutura das substâncias o infravermelho é o método espectroscópico 
de eleição. Já a ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono-13, indica a 
disposição do esqueleto hidrocarbônico, isto é, as diferentes situações de ambientes 
químicos dos átomos de hidrogênio e carbono na estrutura. E a espectroscopia de 
massas, fornece os dados que permitem determinar a fórmula, e pode esclarecer a 
forma estrutural por meio dos padrões de fragmentação de acordo com as diferentes 
funções orgânicas. 
De acordo com Mendham (2002), o princípio básico da espectroscopia de 
absorção atômica se baseia no fato de um grande número de átomos do metal na 
fase gasosa não sofrer excitação, ou seja, permanece no estado fundamental. 
Portanto, estes átomos são capazes de absorver energia radiante em um 
determinado comprimento de onda de ressonância que é, geralmente, o 
 
 
 
 
 
60 
comprimento de onda da radiação que os átomos emitiriam se fossem excitados a 
partir do estado fundamental. 
Em outros trabalhos, é descrito também que a absorção de luz por meio de 
átomos fornece uma ferramenta analítica importante para as análises quantitativas e 
qualitativas e confirmam que a espectrometria de absorção atômica (AAS) é 
baseada no princípio onde se estabelece que os átomos livres em estado estável 
possam absorver luz a certo comprimento de onda. Esta absorção é específica de 
cada elemento, nenhum outro elemento absorve este comprimento de onda. 
Portanto, a espectroscopia de absorção atômica é uma das principais ferramentas 
da química analítica. 
Os métodos espectrométricos mais usados utilizam a radiação 
eletromagnética (energia com diversas formas), a luz visível e o calor radiante são 
mais identificáveis, porém também há os raios X, radiações ultravioleta, entre outros 
(Quadro 5). 
No quadro cinco são listados os comprimentos de onda e os intervalos de 
frequência para regiões do espectro que são importantes para as análises, além de 
fornecer os nomes dos métodos espectroscópicos como também, lista os tipos de 
transições (nuclear, atômica, molecular), que são a base para diversas técnicas 
espectroscópicas. 
A radiação eletromagnética é produzida por meio de uma partícula excitada 
(átomos, íons ou moléculas) que diminui para níveis de energia menores, cedendo o 
excesso de energia como fótons. Isto pode ocorrer de várias maneiras como: 
irradiação com um feixe de radiação eletromagnética, com produção de radiação 
fluorescente; uma reação química exotérmica que produz quimiluminescência, por 
exemplo. 
A radiação de uma fonte excitada é caracterizada por meio de um espectro 
de emissão, que é apresentado na forma de gráfico de potência relativa da radiação 
emitida em função do comprimento de onda (figura 12). 
Dois tipos de espectros são evidentes na figura: linhas e contínuo. O 
espectro de linhas é composto pelos picos gerados pela excitação de átomos 
 
 
 
 
 
61 
individuais e a porção contínua do espectro é responsável pela regularidade da 
radiação de fundo que ocorre a 254 nm. 
A partir do momento que a radiação atravessa a camada de um sólido, 
líquido ou gás, algumas frequências são removidas pela absorção, um processo 
onde a energia eletromagnética é transferida para átomos, íons ou moléculas que 
fazem parte da amostra. 
 
Quadro 5 – Métodos espectroscópicos que utilizam radiação eletromagnética 
 
Tipo de Espectroscopia Intervalo de 
Comprimento 
de 
Onda* 
Intervalo de 
Número 
de Onda 
(cm-1) 
Tipo de Transição 
Quântica 
Absorção, emissão, 
fluorescência e difração de 
raios X 
0,1-100 Å - Elétrons internos 
Absorção, emissão e 
fluorescência ultravioleta-
visível 
180-780 nm 5x104 a 
1,3x104
Elétrons de ligação 
Absorção de microondas 0,75-3,75 mm 13-27 Rotação de 
moléculas 
Ressonância magnética 
nuclear 
0,6-10 m 1,7x10-2 a 
1x103
Spin dos núcleos em 
um campo 
magnético 
• 1 Å = 10-10 m = 10-8 cm / 1 nm = 10-9 m = 10-7 cm 
 
 
 
 
 
Com a absorção, partículas são promovidas de seu estado normal à 
temperatura ambiente, ou estado fundamental, para um ou mais estados excitados 
com maior energia. Pois, para que a absorção da radiação ocorra, a energia de um 
fóton de excitação dever ser igual à diferença de energia entre o estado fundamental 
e um estado excitado da amostra que absorve. 
E por haver diferenças de energia para cada espécie, é feito um estudo das 
frequências da radiação absorvida para se obter meios de caracterizar os 
componentes de uma amostra de matéria. E o gráfico de absorbância é determinado 
experimentalmente em função do comprimento de onda, ou da frequência. 
 
2.5 - Medidas Espectroquímicas e os aspectos quantitativos 
 
As medidas espectroquímicas geralmente utilizam à medida da potência 
radiante P (energia de um feixe de radiação que recai numa determinada área por 
segundo). 
62 
Minutes
0 20 40 60
m
A
U
0
1000
2000
m
A
U
0
1000
254 nm
dC THF pH 11
240804-03
2000
Area
Comprimento de onda nm 
A
bs
or
bâ
nc
ia
 
Linhas 
contínuo
 
Figura – 12 Espectro de emissão de uma amostra de dC (desoxicitidina) tratada com tetraidrofurano 
(THF) com pH 11. 
 
 
 
 
 
63 
Esta energia radiante é determinada por um detector de radiação que faz a 
conversão da energia radiante em sinal elétrico S (voltagem ou corrente proporcional 
à potência radiante). São quatro as categorias principais dos métodos 
espectroquímicos, como exemplificado no quadro 6. 
Nos métodos de emissão, luminescência e espalhamento a concentração (c) 
do analito (Pe = kc) é relativo à potência da radiação emitida do analito. Onde k é 
uma constante. 
Nos métodos de absorção, é necessária a determinação da potência 
radiante em duas situações: 
• antes do analito (P0) 
• depois do analito (P) 
 
E a relação entre P0 e P pode ser expressa em termos de: 
• Transmitância 
• Absorbância 
 
Quadro 6 – Categorias principais de métodos espectroquímicos 
 
Classe Potência 
Radiante Medida
Relação com 
concentração 
Tipos de Métodos
Emissão Emitida, Pe Pe = kc Emissão atômica 
Luminescência Luminescente, Pl Pl = kc Fluorescência, 
fosforescência e 
quimiluminescência
atômica e 
 
 
 
 
 
64 
molecular 
Espalhamento Espalhada, Pesp Pesp = kc Espalhamento 
Raman e 
turbidimetria 
Absorção Incidente, Po e 
transmitida, P 
-logP/P0 = kc Absorção 
molecular e 
atômica 
 
 
A transmitância é a simples razão entre as duas potências: 
 
 T = P/P0 (2-01) 
 
E quando expressa em porcentagem: 
 
%T = P/P0 x 100% (2-02) 
 
A absorbância é a simples conversão matemática da transmitância: 
 
A = -log10 T = log P0/P (2-03) 
 
A Lei de Beer se relaciona com as radiações monocromáticas onde a 
absortividade tem unidades como: a = absortividade [L g-1 cm-1]; o caminho ótico por: 
 
 
 
 
 
65 
b = caminho ótico [cm] e a concentração por: c = concentração [g L-1]. A equação é 
tida como: 
A = abc (2-04) 
 
 
Enquanto que a absortividade molar é dada por um símbolo especial ε, 
nesse caso as unidades correspondentes são: a = absortividade molar [L mol-1 cm-1]; 
b = caminho ótico [cm] e c = concentração [mol L-1]. A equação então tem a letra (a) 
substituída pelo símbolo especial ε: 
A = εbc (2-05) 
 
2.6 - Características dos Instrumentos Ópticos 
 
De acordo com os tipos de componentes ópticos, os espectrofotômetros 
podem ser classificados como: dispersivos, enquadrando nesta categoria os 
instrumentos com elementos ópticos do tipo de difração (prismas ou grades) e os 
interferométricos. Os elementos dispersivos são os que difratam a luz, como os 
prismas e grades de difração, por exemplo. Os elementos interferométricos são os 
que produzemprocessos de interferência da radiação eletromagnética, como o 
interferômetro de Michelson, que é utilizado nos espectrofotômetros que operam na 
região do infravermelho utilizando a transformada de Fourier. 
A forma com que a radiação eletromagnética sofre difração por meio de uma 
grade tem como finalidade difratar a luz para que diferentes comprimentos de onda 
se reflitam sobre a amostra permitindo determinar sua absorbância em cada um 
destes comprimentos. Este conjunto de dados é o que conhecemos como espectro 
de absorção. Uma grade de difração é um componente óptico que contém uma série 
de ranhuras, que são justamente os elementos responsáveis pela difração. Então, 
de acordo com o número de ranhuras por milímetro, haverá uma maior ou menor 
 
 
 
 
 
66 
resolução dos espectros. Os instrumentos com melhor resolução espectral terão 
grades de difração com maior número de ranhuras por milímetro, e, este é um dos 
parâmetros a ser avaliado na seleção de um instrumento. 
São seis os fenômenos em que se baseiam os métodos espectroscópicos 
ópticos: absorção, fluorescência, fosforescência, espalhamento, emissão e 
quimiluminescência. Os componentes que fazem parte dos instrumentos 
espectroscópicos comuns são: fonte estável de energia radiante; recipiente 
transparente para a amostra; dispositivo isolante para uma região restrita do 
espectro para a medida; detector de radiação que seja capaz de converter a energia 
radiante para um sinal elétrico e um processador e dispositivo de saída que mostra o 
sinal transduzido numa escala de medida, em um monitor que tenha uma tela com 
osciloscópio, ou em um medidor digital ou ainda, em um registrador gráfico. 
 
2.7 - Espectrometria de Absorção Atômica e Fluorescência Atômica 
 
A absorção da luz por meio de átomos oferece uma ferramenta analítica 
poderosa para as análises quantitativas e qualitativas. E a espectroscopia de 
absorção atômica (AAS) baseia-se no princípio onde os átomos livres em estado 
estável podem absorver a luz a um determinado comprimento de onda. Esta 
absorção é específica a cada elemento, nenhum outro elemento absorve o 
comprimento de onda. 
A espectroscopia de absorção atômica é um método de elemento único 
usado em análise de traços de metal de amostras biológicas, farmacêuticas, entre 
outras. A determinação espectroscópica de espécies pode ser realizada somente em 
uma amostra gaseificada onde os átomos individuais tais como Ag, Al, Au, Fe, e Mg, 
estão bem separados um dos outros. 
Muitos elementos metálicos sob excitação conveniente emitem radiações de 
comprimento de onda característico e devido este fato é utilizado nos testes 
qualitativos de chama para os metais alcalino e alcalinos terrosos. As análises 
 
 
 
 
 
67 
quantitativas com o espectroscópio baseiam-se na relação entre a potência da 
radiação emitida de um determinado comprimento de onda e a quantidade do 
elemento correspondente na amostra. 
Por vezes, a potência radiante é influenciada de um modo complexo devido 
às diversas variáveis, incluindo a temperatura do arco excitante e tamanho, forma e 
material dos eletrodos. Por essa razão, os procedimentos devem seguir um padrão e 
os espectros desconhecidos devem ser comparados àqueles de amostra-padrão 
preparadas com o mesmo aparelho sob condições idênticas. 
Em geral, estes equipamentos não somente convertem os componentes das 
amostras em átomos ou íons elementares, mas também, excitam uma fração dessas 
espécies a altos estados eletrônicos. Com isso, ocorre a rápida relaxação dessas 
espécies excitadas que é acompanhada pela produção de linhas espectrais 
ultravioletas e visíveis que são úteis na análise qualitativa e quantitativa. 
 A base da espectroscopia de emissão atômica se deu na atomização e 
excitação por chama, arco elétrico e centelha elétrica, e esses métodos ainda têm 
aplicações importantes na análise de elementos metálicos. Porém nos dias de hoje, 
fontes de plasma têm se tornado o método mais importante e utilizado para a 
espectroscopia de emissão atômica. 
Dentre os instrumentos que compõem a espectroscopia de absorção 
atômica, a fonte mais utilizada para as medições de absorção atômica é uma 
lâmpada de cátodo oco. Composta por um ânodo de tungstênio e um cátodo 
cilíndrico apoiado em um tubo de vidro que contém gás inerte, como por exemplo, o 
argônio. O cátodo é feito com o elemento a ser analisado. É necessário calor para 
gaseificar a amostra e este calor é gerado a partir de uma chama ou forno de grafita. 
A espectroscopia de emissão atômica por chama pode analisar apenas 
soluções, ao passo que a espectroscopia de emissão atômica com forno pode 
analisar soluções e amostras sólidas. Um atomizador de chama consiste em um 
nebulizador que transforma a amostra em um aerosol que alimenta o queimador. Já 
um atomizador eletrotérmico oferece alta sensibilidade porque atomiza a amostra 
rapidamente. 
 
 
 
 
 
68 
Esta atomização ocorre em um forno cilíndrico de grafita aberto em ambos 
os lados e com uma fenda central onde as amostras são introduzidas. São utilizadas 
duas correntes de gás inerte. Com isso, o sistema externo evita que o ar entre no 
forno e a corrente interna assegura que os vapores gerados desde a matriz de 
amostra sejam retirados rapidamente do forno. 
Um plasma é definido como uma mistura gasosa condutora de eletricidade, 
que contém uma concentração significativa de cátions e elétrons e estas 
concentrações são tais que a carga total aproxima-se de zero. Em um plasma de 
argônio, muito empregado para análises por emissão, os íons argônio e elétrons são 
as principais espécies condutoras, embora os cátions da amostra, embora menores, 
também estejam presentes. 
Os íons argônio, uma vez formados em um plasma, podem absorver energia 
suficiente para manter a temperatura em um nível onde as ionizações adicionais 
sustentam o plasma, indefinidamente. São três os tipos de plasma de alta 
temperatura encontrados o indutivamente acoplado (inductively coupled plasma – 
ICP), o de corrente contínua (direct current plasma – DCP), e o induzido por 
microondas (microware induced plasma – MIP). Os instrumentos para 
espectroscopia de emissão atômica são de três tipos: sequencial, multicanal 
simultâneo e de transformada de Fourier. 
Na espectrometria de fluorescência, os átomos ou moléculas que são 
excitados a altos níveis de energia podem cair a níveis mais baixos, emitindo 
radiação (emissão ou luminescência). Então, para os átomos excitados por uma 
fonte de energia a alta temperatura esta emissão de luz é chamada de emissão 
atômica e óptica (espectroscopia de emissão atômica), e para os átomos excitados 
com luz, é chamada fluorescência (espectroscopia atômica de fluorescência). 
A fluorescência atômica é a emissão óptica de átomos na fase de gás que 
foram excitados a níveis mais altos de energia por absorção de radiação 
eletromagnética. É uma técnica de elementos múltiplos utilizada para a análise de 
traços de metais em água de mar, substâncias biológicas e amostras agrícolas. Para 
a análise de soluções ou sólidos é preciso que os átomos da substância a ser 
 
 
 
 
 
69 
analisada sejam dissolvidos, vaporizados e atomizados a uma temperatura 
relativamente baixa em um tubo quente, chama ou forno de grafita. Após esse 
processo, uma lâmpada de cátodo oco ou laser fornece a excitação ressonante para 
levar os átomos a níveis de energia mais altos. A fluorescência atômica é dispersa e 
detectada por tubos monocromadores e fotomultiplicadores, num processo similar ao 
instrumental da espectroscopia de emissão atômica. 
São dois os tipos de instrumentos de fluorescência: dispersivos e não 
dispersivos. 
Quando o instrumento é dispersivo, este é composto por: 
- uma fonte de luz; 
- um atomizador; 
- um analisador; 
- um detector; 
- um processador de sinal; e 
- um dispositivo de leitura. 
A fonte ideal para a fluorescênciaatômica é o laser, porém a fonte mais 
comum é a lâmpada de descarga sem eletrodo. 
Um instrumento não dispersivo é composto por: 
- uma fonte de luz; 
- um atomizador; e 
- um detector, não necessitando de um analisador. 
Quando uma lâmpada de descarga sem eletrodo serve como fonte de 
excitação, a radiação emitida é a de um elemento simples. 
Já um atomizador por chama é composto por um nebulizador que converte a 
chama em um aerosol que alimenta o queimador, tendo como melhor sistema para a 
espectroscopia de fluorescência atômica, a combinação de acetileno/óxido nitroso e 
hidrogênio/oxigênio e argônio usando uma chama retangular, onde é utilizado um 
 
 
 
 
 
70 
monocromador ou um sistema de filtro de interferência, para isolar o feixe estreito do 
comprimento de onda e um fotomultiplicador que converte a energia de radiação em 
sinais elétricos. 
 
2.7.1 – Aplicações da espectroscopia de absorção atômica com fontes 
de plasma 
 
Por serem ricas em linhas de emissão características, as fontes de plasma 
são úteis tanto para a análise elementar qualitativa como quantitativa. Por esse 
motivo, as fontes de plasma acoplado e as de plasma de corrente contínua 
favorecem a produção de dados de análise quantitativamente melhores do que as 
outras fontes de emissão. A confiabilidade dos resultados ocorre em conjunto com a 
alta estabilidade, baixo ruído, baixa radiação de fundo, e por serem livres de 
interferências se operadas em condições adequadas. 
A espectroscopia de emissão por plasma acoplado é usada, para a análise 
qualitativa e quantitativa de amostras dissolvidas ou suspensas em líquidos aquosos 
ou orgânicos. Entretanto, para a emissão do plasma, existem métodos que se 
aplicam à análise direta de sólidos. Incluindo nestes procedimentos a vaporização 
eletrotérmica, ablação por laser e centelha, e ainda a descarga luminosa. 
Para se obter curvas de calibração nos espectrômetros de emissão por 
plasma muitas vezes consistem de uma voltagem ou corrente de saída de um 
transdutor, em função da concentração de um analito. Um padrão interno é 
frequentemente usado em espectrometria de emissão e por isso, o eixo vertical da 
curva de calibração é a razão, ou o logaritmo da razão, entre o sinal do detector para 
o analito e o sinal do detector para o padrão interno. 
As interferências químicas e os efeitos da matriz são reduzidos de forma 
mais consistente nas fontes de plasma do que em outros atomizadores. Porém, em 
baixas concentrações de analito, a emissão de fundo, devido à recombinação dos 
íons argônio com os elétrons, é grande o suficiente para requerer correções 
 
 
 
 
 
71 
cuidadosas. Enquanto que, para os instrumentos de canal único, essa correção é 
convenientemente obtida por meio de medidas de cada lado do pico. 
Vários instrumentos multicanal estão equipados com elementos ópticos que 
permitem estas correções. Portanto, os limites de detecção com fonte de plasma 
acoplado parecem ser compatíveis ou melhores que os de outros procedimentos 
espectroscópicos atômicos. 
 
2.8 - Espectrometria de Massa Atômica 
 
O espectrômetro de massas é um instrumento que separa íons, positivos ou 
negativos, produzidos a partir de átomos ou moléculas, quer sejam das mais simples 
às mais complexas, de acordo com a razão massa/carga (m/z). Os íons são 
separados de acordo com suas razões massa/carga (m/z onde: z (-1,6 x 10-19 C) = 
1). 
Existem dois diferentes tipos de massa: média e monoisotópica. Média: 
soma das massas atômicas médias de todos os elementos do íon. 
A = A1p1 + A2p2 +.... + Anpn 
Carbono: 12C (A = 12,000000; p = 98,9%) 
13C (A = 13,003355; p = 1,10%) 
A = 12,000000 x 0,989 + 13,003355 x 0,011= 12,0110369 
Monoisotópica: a massa do isótopo mais abundante é usada para calcular a 
massa da molécula/íon. 
Por ser muito sensível este método é usado na análise de substâncias em 
baixa concentração, como no caso do doping, controle de alimentos e 
medicamentos, contaminação ambiental, entre muitas outras aplicações. 
 
 
 
 
 
 
 
72 
A espectrometria de massas pode ser usada para: 
• Detectar e identificar o uso de esteroides em atletas. 
• Monitorar a respiração de pacientes por anestesistas durante a cirurgia. 
• Determinar a composição de espécies moleculares encontradas no 
espaço. 
• Localizar depósitos de petróleo. 
• Monitorar os processos de fermentação de indústrias biotecnológicas. 
• Determinar dioxinas em peixes contaminados. 
• Determinar danos em genes provenientes de causas ambientais, entre 
outros. 
• Identificar a estrutura de biomoléculas. 
• Determinar como as drogas são usadas pelo corpo. 
• Análises judiciais (abuso de drogas). 
• Análises de poluentes ambientais. 
• Determinar a idade e origens de espécimes na geoquímica e 
arqueologia. 
• Identificar e quantificar compostos em misturas orgânicas complexas. 
• Análises de compostos inorgânicos. 
 
Espectrômetros de massa também são usados para elucidação estrutural e 
se classificam conforme o método de separação dos íons: deflexão em campo 
magnético e espectrômetro de massas de quadrupolo. 
Quando o método é o de deflexão a separação dos íons ocorre em campo 
magnético simples (baixa resolução; unidades de massa sem casa decimal) e 
focalização dupla (campo eletrostático e magnético; alta resolução; unidades de 
massa com quatro casas decimais). Se for utilizado o método de massas de 
 
 
 
 
 
73 
quadrupolo têm-se um filtro de massas quadrupolo; com captura de íons com 
quadrupolo (armadilha de íons; análises de CG/MS). 
Um espectro de massa é um gráfico da intensidade do íon em função da 
razão massa-carga como exemplificado na figura 13. 
As amostras são introduzidas no espectrômetro de massas por sistemas de 
injeção: que introduzem uma pequena quantidade de amostra volatilizada na fonte 
de íons, exemplos: 
• Injetores contínuos (a frio, quente): gases e líquidos voláteis (amostras 
puras). 
• Injetores diretos: líquidos não voláteis e sólidos (amostras puras). 
• Injetores cromatográficos (gasosos e líquidos): misturas complexas. 
 
Os espectrômetros de massas são constituídos de seis partes básicas: um 
sistema de manipulação para introduzir a amostra no equipamento; uma fonte de 
íon, onde é produzido um feixe de partículas proveniente da amostra; um analisador 
que separa partículas de acordo com a massa; um detector, onde os íons separados 
são recolhidos e caracterizados, um sistema de vácuo elaborado para manter a 
pressão baixa em todos os componentes excetuando-se o último dispositivo que é 
um processador de dados, como exemplificado na figura 14. 
Em um espectrômetro de massas, é preciso que haja um percurso de 
colisão livre para os íons e por isso, funciona a vácuo ou em condições quase a 
vácuo. A fonte de íon origina fragmentos de íon gasosos da amostra que são 
introduzidas no sistema de injeção em microquantidade. Sendo, então, dois os tipos 
de fontes de íon: fontes de fase de gás e de dessorção. 
 
 
 
 
 
 
 
 
dA-THF
dC-THF
O
OH
O
OH
NN
NN
NH
[M+H]+ = 322
[M+H-dR]+ = 206
O
OH
O
OH
N
N
NH
O
[M+H]+ = 298
[M+H-dR]+ = 182
m/z
0
100
In
te
ns
id
ad
e 
R
el
at
iv
a 
(%
)
322
206
251
135
m/z
0
100
In
te
ns
id
ad
e 
R
el
at
iv
a 
(%
)
298
182
111
 
Figura 13 – Adutos de desoxiadenosina (dA-THF) e desoxicitidina (dC-THF) tratados com 
THF e suas massas. 
 
 
74 
 
Figura 14 – Esquema representando o funcionamento de um espectrômetro de massas. 
Processador 
 de Dados 
Sistema para 
introdução de 
amostras 
Fonte de íon Analisador 
de massas 
Detector SISTEMA 
DE VÁCUO 
 
 
 
 
 
2.8.1 - Métodos de ionização 
 
Existem vários métodos ou processos de ionização (quadro 7), porém vamos 
detalhar apenas os mais utilizados: impacto eletrônico; ionização química; dessorção 
de plasma e Ionização por spray eletrostático. 
Resumidamente os métodos de ionização mais apropriadospara cada tipo 
de análise estão listados a seguir: 
 
• EI e CI: compostos pequenos (5000 Da), não voláteis, termicamente 
instáveis e polares (ESI e MALDI). 
• TI: alimentos, datação arqueológica, estudos nucleares. 
Impacto Eletrônico (EI): neste método os íons são produzidos por meio do 
bombardeamento, por moléculas ou átomos na fase gasosa com um feixe de 
elétrons de alta energia (70 eV), gerado por um filamento aquecido. 
Este feixe é gerado por uma lâmpada de tungstênio para ionizar os átomos 
de fase de gás ou moléculas. Os íons são formados durante a colisão do feixe com 
as moléculas da amostra. 
 
M + e- M+ + 2e- (2-06) 
 
 
 
 
 
75 
 
 
 
 
 
76 
Quadro 7 - Métodos de Ionização 
Tipo 
 
Nome e Sigla Agente Ionizante 
Fase Gasosa Impacto Eletrônico (EI) Elétrons energéticos 
 Ionização Química (CI) Íons gasosos 
 Ionização de Campo (FI) Eletrodo de alta voltagem 
Dessorção Dessorção de Campo (FD) Eletrodo alta voltagem 
 Ionização por electrospray 
(ESI) 
Campo elétrico alto 
 Ionização/dessorção a laser 
por meio de matriz (MALDI) 
Feixe de laser 
 Bombardeamento de 
átomos rápidos (FAB) 
Feixe de átomos 
acelerados 
 Ionização termospray (TI) Alta temperatura 
 
Onde M representa a molécula do analito e M+ é seu íon molecular. Então, 
os íons positivos são acelerados por um campo elétrico e transportados ao campo 
magnético e ao mudar a voltagem de aceleração, a velocidade da partícula ou ainda, 
a força do campo magnético, os íons de diversas proporções massa-carga podem 
ser recolhidos e medidos. 
Pelo método de Ionização Química (IC): os íons são produzidos por meio da 
reação da molécula de interesse (M) com um gás reacional (Figura 15 - ácido 
Bronsted, CH5
+), produzido por meio do bombardeamento de elétrons. Pois, em alta 
pressão ocorrem colisões e reações íon-molécula com o próprio gás reagente, 
 
 
 
 
 
levando a formação de íons secundários, que colidem com moléculas da amostra, 
resultando na ionização química. 
Na dessorção de plasma (Plasma Desorption - PD), o alvo é feito a partir de 
uma folha de alumínio, geralmente revestida com uma fina camada de nitrocelulose, 
sobre a qual a amostra é aplicada. Duas partículas atômicas são produzidas na 
reação de fissão: uma promove a dessorção da amostra e a outra o sinal de partida 
para a aquisição de dados. Este método tem boa sensibilidade para proteínas 
pequenas e peptídeos. 
 
CH4 + e CH4
+ + 2e-
CH4
+ + CH4 CH5
+ + CH3
CH5
+ + M CH4 + MH+
 
 
 
Figura 15 – Exemplo de ionização química do ácido de Bronsted CH5
+
 
Quando o método escolhido é o de Ionização por spray eletrostático 
(Electrospray Ionization - ESI), a amostra é dissolvida em uma mistura de água + 
solvente orgânico (exemplos: acetonitrila, metanol) e é bombeada por meio de um 
capilar de aço inox fino, cuja extremidade encontra-se no primeiro compartimento do 
espectrômetro de massa onde fica flutuando a um alto potencial que cria um spray 
eletrostático de gotas carregadas contendo a amostra, onde ocorre a secagem e 
nebulização por um fluxo de gás nitrogênio. 
 
2.8.2 – Sistemas de Detecção e Analisadores de Massas 
 
Os transdutores são muito utilizados em espectrometria de massas, e dentre 
eles o multiplicador de elétrons é o tipo mais utilizado em experimentos de rotina, 
pois é robusto e simples, muito confiável e pode fornecer grandes ganhos de 
corrente e tempos de resposta de nanosegundos. 
77 
 
 
 
 
 
78 
Após sua formação, os íons são acelerados para o analisador de massa por 
meio de um campo elétrico. O analisador de massa separa os íons de acordo com 
suas razões m/z. Estes analisadores de massa podem ser contínuos ou pulsados: 
• Contínuos: transmitem um simples íon de razão m/z ao detector 
(quadrupolos e campo magnético). 
• Pulsados: coletam um espectro de massa inteiro a partir de um pulso 
simples de íons (TOF, capturador de íons). 
A escolha do analisador depende da resolução, do intervalo de massa, da 
velocidade de varredura e dos limites de detecção requeridos na análise. Quando for 
utilizar campos magnéticos: focalização simples, focalização dupla e geometria 
inversa, o analisador quadrupolo será o utilizado (Figura 16). Se for por capturas de 
íons, poderá ser utilizado: quadrupolo tridimensional, transformada de Fourier, e 
também o analisador de tempo de vôo (TOF). 
Um analisador quadripolar é composto por quatro hastes cilíndricas em 
paralelo que fazem o papel de eletrodos, tendo as hastes opostas conectadas 
eletricamente, sendo que um par fica ligado ao lado positivo de uma fonte de 
corrente contínua e o outro par fica ligado ao terminal negativo. Em cada par de 
hastes são aplicados potenciais de corrente alternada de radiofrequência variável 
(180 graus fora de fase). 
Os íons são acelerados no espaço entre as hastes por um potencial que vai 
de 5 a 10 V, e para se obter um espectro de massa por meio deste dispositivo, é 
determinado o valor da m/z de interesse e quando os íons que tiverem este valor 
atingirem o transdutor, o valor será armazenado para gerar o espectro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Transdutor 
de Íons 
Fonte de Íons 
Íon com trajetória instável 
Íon com trajetória estável 
+
+ 
- 
-
 
Figura 16 – Analisador de massa quadripolar. 
 
 
Em um quadrupolo, ao variar os sinais elétricos, pode-se variar a faixa da 
relação massa-carga transmitida. Possibilitando a varredura espectral, que poderá 
ser analisada. A razão entre o potencial de corrente alternada e o potencial de 
corrente contínua determina a resolução de um quadrupolo e se torna máxima 
quando esta razão é um pouco menor que seis. Por este motivo os espectrômetros 
de quadrupolo são operados com uma razão de potencial constante para este valor. 
O analisador de setor magnético faz parte de espectrômetros de massa de 
dupla focalização, onde se emprega um campo magnético que faz com que os íons 
viajem em um percurso circular de 180, 90 ou 60 graus. No começo os íons são 
acelerados ao passarem por meio de uma fenda na direção do campo elétrico radial, 
usado para focalizar um feixe de íons. Os íons de diferentes massas podem ser 
varridos por meio da fenda de saída variando a força do campo magnético ou o 
79 
 
 
 
 
 
80 
potencial de aceleração entre as fendas. Os íons que passam por meio da fenda de 
saída caem em um eletrodo coletor ou placa fotográfica, resultando na corrente que 
depois será amplificada e registrada. 
Em um espectrômetro de massa por tempo de vôo a produção de íons 
positivos ocorre por bombardeio da amostra com pulsos rápidos de elétrons, fótons 
gerados por lasers ou por íons secundários, usando as diferenças de tempo que 
levam os íons gerados e acelerados para chegar a um eletrodo coletor. Os íons da 
fonte são acelerados por um pulso de campo elétrico. As partículas aceleradas 
passam por meio de um tubo de vôo de um metro de comprimento, com tempo de 
vôo em microssegundos, sendo necessário então que os dispositivos eletrônicos 
sejam rápidos na aquisição dos dados. 
Essencialmente a espectrometria de massa por tempo de vôo baseia-se em 
que todos os íons são acelerados com a mesma energia. Portanto, suas velocidades 
são inversamente proporcionais às raízes quadradas de suas massas. E com isso, 
os íons mais leves e de alta velocidade chegam ao detector antes do que os íons 
mais pesados de baixa velocidade. 
Apesar de não terem a mesma resolução e reprodutibilidade de 
analisadores, por exemplo, de quadrupolo, por ser simples e robusto, e oferecer 
acessibilidade à fonte de íons com intervalode massas “ilimitado”, bem como com a 
alta velocidade de aquisição de dados, este analisador tem sido largamente 
utilizado. 
As três principais características de um analisador são: o limite de massa, 
transmissão iônica e o poder de resolução. O limite de massa significa o valor mais 
alto de massa que pode ser medido; em geral é expresso em daltons (Da) para um 
íon de carga unitária, z = 1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
81 
2.9 – Questões para estudo 
 
1 – De quantas maneiras os componentes de um circuito podem se ligar? 
Descreva-as. 
2 – Por que os amplificadores operacionais são importantes? 
3 – O que é um transdutor? 
4 – De que forma os equipamentos analíticos são utilizados nos dias de 
hoje? 
5 – Quais são os tipos de ruídos em análises instrumentais? Descreva-os. 
6 – Descreva o princípio básico da espectroscopia de absorção atômica. 
7 – Quais as principais classes e tipos de métodos espectroquímicos? 
8 – Quais métodos são usados na análise de elementos metálicos? 
9 – Que instrumento é utilizado na análise toxicológica para identificação de 
uso abusivo de drogas? Por quê? 
10 – Em que método ocorre em alta pressão, colisões e reações de íon-
molécula com o próprio gás reagente, formando íons secundários? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
82 
2.10 - Glossário 
 
Ablação: retirar, diminuir. 
Ânodo: pólo positivo da corrente elétrica, para onde convergem os ânions, 
que são as partículas eletricamente negativas de uma solução. 
Atomizador: aparelho usado para reduzir um líquido a um borrifo muito fino. 
Capacitores: conjunto de condutores elétricos separados entre si por 
isoladores. 
Cátodo: pólo ou eletródio negativo de um circuito elétrico. 
Coulometria: método baseado na medida da quantidade de eletricidade 
requerida para oxidar ou reduzir, em uma célula eletrolítica, a substância a 
determinar. 
Difração: desvio de propagação da luz do seu trajeto retilíneo em virtude do 
encontro das ondas com obstáculos cujas dimensões estejam na ordem de 
grandeza do próprio comprimento da onda de luz. 
Diodo: dispositivo eletrônico onde a corrente passa em uma só direção. 
Doping: uso de substância para melhorar o desempenho esportivo em uma 
competição, seja a substância proibida ou em quantidade acima do permitido. 
Eletrodos: pontos por onde entra uma corrente elétrica. 
Espectros: é o resultado obtido quando as radiações eletromagnéticas são 
emitidas nos seus comprimentos de onda ou frequências correspondentes. 
Fissão: ou cisão nuclear, onde um átomo de um elemento é dividido 
produzindo dois átomos de menores dimensões de elementos diferentes. 
Fotometria: é o ramo da óptica que se preocupa em medir a luz, em termos 
de como seu brilho é percebido pelo olho humano. 
Fóton: porção de energia eletromagnética considerada como unidade de luz 
dentro do conceito de propagação corpuscular da luz. 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Comprimento_de_onda
http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81tomo
http://pt.wikipedia.org/wiki/Elemento_qu%C3%ADmico
http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%93ptica
http://pt.wikipedia.org/wiki/Luz
http://pt.wikipedia.org/wiki/Olho_humano
 
 
 
 
 
83 
Hardware: é a parte física do computador: conjunto de componentes 
eletrônicos, circuitos integrados e placas, que se comunicam por meio de 
barramentos. 
Indutores: o que leva para dentro, é um dispositivo elétrico passivo que 
armazena energia na forma de campo magnético. 
Infravermelho: radiação eletromagnética imperceptível ao olho humano, de 
comprimento de onda entre 780 ∞ 10-9m e 10-3m, superior, ao da radiação visível e 
inferior ao das microondas. 
Interferômetro: aparelho utilizado para efetuar medidas de ângulos e 
distâncias aproveitando a interferência de ondas eletromagnéticas que ocorre 
quando estas interagem entre si. 
Isótopos: Formas de um elemento que diferem entre si na massa de seus 
átomos e nas propriedades dependentes dessa massa. Tendo o mesmo número 
atômico e o mesmo número de valência de elétrons, os isótopos ocupam a mesma 
posição na tabela periódica e têm propriedades idênticas. São distinguíveis apenas 
por pequenas diferenças em seus pesos atômicos ou por transformações 
radioativas. 
Junção: ato de juntar, reunir. 
Luminescência: irradiação de luz por determinada substância devido a 
causas diferentes do aquecimento. 
Mol: Número constante, especificado de moléculas de uma substância, 
definido por convenção. Um mol contém 6,02 x 1023 moléculas de substância. 
Monocromáticas: de uma só cor. 
Nebulizador: aparelho que pulveriza líquido em gotículas muito finas. 
Osciloscópio: instrumento de medida eletrônico que cria um gráfico bi-
dimensional visível para uma ou mais diferenças de potencial. 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Computador
http://pt.wikipedia.org/wiki/Componente_eletr%C3%B4nico
http://pt.wikipedia.org/wiki/Componente_eletr%C3%B4nico
http://pt.wikipedia.org/wiki/Circuito_integrado
http://pt.wikipedia.org/wiki/Placa
http://pt.wikipedia.org/wiki/Barramento
http://pt.wikipedia.org/wiki/Energia
http://pt.wikipedia.org/wiki/Campo_magn%C3%A9tico
http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%82ngulo
http://pt.wikipedia.org/wiki/Interfer%C3%AAncia
http://pt.wikipedia.org/wiki/Ondas_electromagn%C3%A9ticas
http://pt.wikipedia.org/wiki/Instrumento_de_medida
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletr%C3%B4nica
http://pt.wikipedia.org/wiki/Diferen%C3%A7a_de_potencial
 
 
 
 
 
84 
Resistores: dispositivo elétrico muito utilizado em eletrônica, com a 
finalidade de transformar energia elétrica em energia térmica, a partir do material 
empregado, que pode ser, por exemplo, carbono. 
Semicondutores: são sólidos cristalinos de condutividade elétrica 
intermediária entre condutores e isolantes. Os elementos semicondutores podem ser 
tratados quimicamente para transmitir e controlar uma corrente elétrica. 
Softwares: é a parte lógica, ou seja, o conjunto de instruções e dados 
processado pelos circuitos eletrônicos do hardware. 
Transdutores: dispositivo que transforma um tipo de energia noutro tipo de 
energia, utilizando para isso um elemento sensor que recebe os dados e os 
transforma. 
Transistores: componente eletrônico tendo como funções principais a 
amplificação e chaveamento de sinais elétricos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
------------------FIM DO MÓDULO II----------------- 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletr%C3%B4nica
http://pt.wikipedia.org/wiki/Energia_el%C3%A9trica
http://pt.wikipedia.org/wiki/Calor
http://pt.wikipedia.org/wiki/Carbono
http://pt.wikipedia.org/wiki/S%C3%B3lido
http://pt.wikipedia.org/wiki/Condutividade
http://pt.wikipedia.org/wiki/Condutor
http://pt.wikipedia.org/wiki/Isolante
http://pt.wikipedia.org/wiki/Corrente_el%C3%A9trica
http://pt.wikipedia.org/wiki/Energia
http://pt.wikipedia.org/wiki/Elemento_sensor
http://pt.wikipedia.org/wiki/Amplifica%C3%A7%C3%A3o
 
 
 
 
 
86 
 
MÓDULO III 
 
 
3 - ESPECTROMETRIA DE LUMINESCÊNCIA MOLECULAR 
 
Do mesmo modo que a espectroscopia de emissão atômica, a 
quimiluminescência, também utiliza medições quantitativas da emissão óptica da 
espécie química excitada para que seja possível determinar a concentração da 
substância analisável (analito). No entanto, a quimiluminescência, em geral, é a 
emissão de moléculas energizadas e não somente de átomos simplesmente 
excitados. A quimiluminescência pode ocorrer tanto na fase de solução como na 
fase de gás, e é utilizada para a determinação quantitativa de diversas espécies 
orgânicas e inorgânicas em traços. 
A partir de uma reação química que gera uma espécie excitada 
eletronicamente, e que emite luz ao voltar a um estado de menor energia se produz 
a quimiluminescência. A molécula excitada pode ser o produto da reação entre o 
analito e um reativo apropriado (ozônio ou peróxido de hidrogênio). 
Pode ocorrer de uma substância que será analisada não estar diretamente 
envolvida na reação quimiluminescente; porém, o que serve como parâmetro 
analítico, é o efeito inibidorou de catálise da substância analisável. 
Os instrumentos utilizados para as medições de quimiluminescência são 
simples e consistem em uma câmara de reação e um tubo fotomultiplicador. Porém, 
os métodos luminescentes quantitativos, por ser muito sensível, podem sofrer 
interferências nas matrizes das amostras e por isso, estes métodos são geralmente, 
combinados com técnicas de separação cromatográficas e de eletroforese. 
 
 
 
 
 
87 
Como a quimiluminescência, a fluorescência molecular e a fosforescência 
também são métodos ópticos e devido seus estados eletrônicos excitados ocorrerem 
por absorção de fótons, são conhecidos como fotoluminescência. 
A fotoluminescência é a emissão de radiação eletromagnética (fótons) de um 
material, após este ter sido submetido a uma excitação luminosa. A frequência do 
fóton emitido pela amostra se relaciona com o material que a compõe, pois é 
resultante de uma transição eletrônica. 
A fluorescência é conhecida pelo processo de emissão envolvendo estados 
eletrônicos de mesma multiplicidade de spins e a fosforescência pelo que envolve 
estados de multiplicidades de spins diferentes. As transições envolvendo estados 
com mesma multiplicidade de spin são permitidas, enquanto que as que envolvem 
multiplicidades de spins diferentes são proibidas, de acordo com regras de seleção 
espectroscópicas. Porém, o fato das transições serem permitidas por multiplicidade 
de spin não garante que estas sejam permitidas, pois existem outros critérios que 
podem ser determinados. 
Uma transição deve também ser permitida por simetria. Tais transições na 
mecânica quântica são "permitidas" e as taxas de emissão são aproximadamente de 
108 s-1. Estas altas taxas de emissão dão como resultado um tempo de meia-vida de 
fluorescência por volta de 10-8s ou 10ns. Diversas transições podem ocorrer na 
molécula como: cruzamento intersistemas, que representa transições não radiativas, 
isoenergéticas, envolvendo estados de multiplicidades de spin diferentes; conversão 
interna, associada às transições isoenergéticas que ocorrem em 10−12 s envolvendo 
estados de mesma multiplicidade de spin. 
 Estas regras de seleção valem tanto para a espectroscopia de absorção 
quanto de emissão. Para compreendermos como ocorre a fosforescência e a 
fluorescência é preciso lembrar como funciona um spin eletrônico e os estados de 
excitação dos singletes/tripletes. 
A denominação de estado eletrônico singlete está relacionada com a 
multiplicidade de spins eletrônicos, segundo a equação 2S + 1, sendo S a soma dos 
spins dos elétrons. Quando em estado singlete, o valor da multiplicidade é igual a 1, 
 
 
 
 
 
88 
sendo esta a situação mais encontrada para moléculas orgânicas no estado 
eletrônico fundamental, onde todos os elétrons estão ocupando os estados de 
menor energia e os elétrons possuem spins desemparelhados. A denominação dos 
estados com letras e números significa: as letras ordenam os estados em ordem 
crescente de energia e os números a sua simetria. 
O número superior à esquerda fornece a multiplicidade do estado (1A, 3B) 
onde 1 correspondente ao estado singlete, 3 corresponde ao estado triplete, o 
número inferior à direita ordena a sequência de estados com a mesma simetria (B1, 
BB2). Estas denominações dependem das propriedades da simetria das moléculas e 
das funções correspondentes de onda dos estados eletrônicos de acordo com a 
chamada teoria de grupos. 
Existe um princípio de exclusão de Linus Pauling onde ele diz que quaisquer 
dois elétrons em um átomo não podem ter os mesmos valores dos quatro números 
quânticos, isto é, até dois elétrons podem ocupar um orbital e devem estar em 
estados spin opostos (Figura 17). E neste caso os spins estão emparelhados, e 
desse modo à maioria das moléculas são denominadas diamagnética por não 
apresentarem campo magnético próprio. Já os radicais livres, contêm elétrons 
desemparelhados, são atraídos por um campo magnético e são tidos como 
paramagnéticos (Figura 18). 
 
 
Figura 17 – Exemplo de spins em um mesmo orbital em estados opostos. 
 
 
 
 
Figura 18: Átomo de oxigênio (O2 é um radical livre) tem 8 elétrons: 1s2 2s2 2p4. 
 
 
 
 
 
O estado singlete de uma molécula é aquele onde todos os spins estão 
emparelhados. Já no estado triplete, os spins de dois elétrons ficam 
desemparelhados, sendo então, paralelos. 
A distribuição eletrônica, conforme Pauling, não era apenas uma ocupação 
pelos elétrons dos espaços vazios nas camadas da eletrosfera. Os elétrons se 
distribuem segundo o nível de energia de cada subnível, numa sequência crescente 
em que ocupam primeiro os subníveis de menor energia e, por último, os de maior. 
Na figura 19, as setas indicam a ordem crescente dos níveis de energia: 1s2 
2s2 2p6 3s2 3p6 4s2 3d10 4p6 5s2 4d10 5p6 6s2 4f14 5d10 6p6 7s2 5f14 6d10. Note que 
como a energia de 4s2 é menor, pois esta posição vem antes de 3p6 e 3d10. 
Qualitativamente, a existência de uma forte sobreposição entre os espectros 
de absorção e de fluorescência requer que não haja uma alteração da geometria 
molecular entre os dois estados envolvidos (singlete e triplete). Portanto, nos casos 
em que esta alteração é pequena, obtêm-se dois espectros que se sobrepõem e 
estes espectros são imagens especulares. Diversos hidrocarbonetos aromáticos 
condensados atingem esta condição, pois, são moléculas com alguma rigidez e, 
portanto, não sofrem grandes alterações de geometria com a excitação. 
 
 
Figura 19 – Diagrama de Pauling que permite colocar todos os subníveis de energia conhecidos em 
ordem crescente de energia e onde a ordem crescente de energia dos subníveis é a ordem na 
sequência das diagonais. 
89 
 
 
 
 
 
90 
 
Todavia, se presume que os processos indevidos por multiplicidades de 
spins são mais lentos e, com isso, as moléculas nestes estados eletrônicos 
excitados podem ser desativadas por meio de processos não radiativos, como, em 
colisões com impurezas como o oxigênio molecular. 
Este fato explica o fato de que uma emissão do tipo fosforescente em 
moléculas orgânicas aromáticas costuma ser observada apenas na ausência de 
oxigênio molecular, ou em temperaturas baixas que diminuem a possibilidade de 
desativação por colisão por meio da formação de complexos de contato com outros 
supressores. 
Excímero é uma denominação utilizada para designar complexos 
moleculares envolvendo duas moléculas do mesmo tipo, que se formam apenas no 
estado eletrônico excitado. Quando existe uma alta eficiência de desativação por 
oxigênio molecular das moléculas orgânicas excitadas eletronicamente no estado 
triplete é necessário se ater ao fato de que o estado eletrônico fundamental do 
oxigênio molecular é um estado triplete, e, então, a transferência de energia ocorre 
por haver multiplicidade de spins3. 
A fosforescência também está envolvida na desativação de estados 
eletrônicos excitados, pois, conversões externas e internas, competem com a 
fosforescência, quando em baixas temperaturas e em meios viscosos, por exemplo. 
 
3.1 – Aspectos da Fluorescência e Fosforescência 
 
Diversos aspectos podem determinar a intensidade de emissão ou não de 
luminescência de uma molécula como sua estrutura molecular e o ambiente químico, 
por exemplo. A probabilidade de a radiação ultravioleta provocar uma alteração 
mensurável é pequena, porque a energia pode ser dissipada como fluorescência ou 
calor. Esta probabilidade é chamada rendimento quântico4 φ, que é o número de 
 
3 http://aprender.unb.br/mod/book/index.php?id=1095 
4 φ: é da ordem de 10-2 ou menos para macromoléculas biológicas. 
http://www.chemkeys.com/bra/md/ede_5/edl_14/opde_24/opde_24.htm
http://www.chemkeys.com/bra/md/ede_5/edl_14/opde_24/opde_24.htm
 
 
 
 
 
partículas danificadas pelo número QUANTA absorvido. Na fluorescência ou 
fosforescência esse rendimento quântico é entãoa razão do número de moléculas 
luminescentes pelo número total de moléculas excitadas. Então, é importante saber 
que a fluorescência em geral, não resulta da absorção de radiação ultravioleta de 
comprimento de onda menor que 250 nm, porque esta radiação tem energia 
suficiente para desativar os estados excitados por pré-dissociação (a radiação leva 
inicialmente o elétron a um nível eletrônico de mais alta energia. 
Depois, por meio de cruzamento inter-sistema, o elétron passa a um nível 
eletrônico baixo, porém em um nível vibracional mais energético. A pré-dissociação 
ocorre quando este nível vibracional tem energia suficiente para causar a ruptura da 
ligação) ou dissociação (a radiação absorvida leva o elétron diretamente para um 
nível vibracional suficientemente energético para causar a ruptura da ligação). Desse 
modo, a fluorescência se origina de uma transição do nível vibracional mais baixo do 
primeiro estado eletrônico excitado para um dos níveis vibracionais do estado 
eletrônico fundamental. 
No cruzamento inter-sistemas onde o do elétron excitado é invertido e, com 
isso, permite a migração deste para um estado tripleto. Este processo é mais comum 
em moléculas contendo átomos pesados. As interações entre spin e órbita ficam 
mais fortes na presença destes átomos e, assim, a mudança do spin é favorecida. A 
presença, na solução, de espécies paramagnéticas, tais como o oxigênio molecular, 
também promove o cruzamento inter-sistemas, diminuindo a fluorescência. 
Por meio destes mecanismos a fotoluminescência é limitada a um número 
relativamente pequeno de sistemas. Sendo que a rota mais favorável para o 
decaimento é aquela que minimiza o tempo de vida dos estados excitados. Desta 
forma, o decaimento por fluorescência poderá ser observado se o sistema 
apresentar características estruturais e ambientais que façam este decaimento 
rápido o suficiente em relação aos processos não radiativos. 
Algumas espécies que absorvem radiação eletromagnética contendo 
elétrons π, σ e n incluem moléculas e íons orgânicos e alguns ânions inorgânicos. A 
fluorescência mais intensa e mais útil é encontrada em compostos contendo grupos 
91 
 
 
 
 
 
92 
funcionais aromáticos com níveis de transição π π* de baixa energia. 
Entretanto, a substituição de um grupo carboxílico ou carbonílico em um anel 
aromático, em geral, inibe a fluorescência. 
A rigidez estrutural também influencia no aumento da fluorescência em 
determinados agentes quelantes orgânicos, no caso destes estarem complexados 
com um íon metálico. No entanto, a falta de rigidez pode causar um aumento na 
constante de conversão interna e com isso, um aumento na facilidade de 
desativação não-radiativa. 
Um decréscimo na viscosidade do solvente pode facilitar a conversão 
externa que acarretará em desativação da fluorescência, bem como com o aumento 
de temperatura, que pode aumentar as colisões, levando também para a 
desativação da fluorescência. É importante controlar o pH, pois a fluorescência de 
certos compostos em função do pH é utilizada para a detecção de pontos finais em 
titulações ácido/base. 
A presença do oxigênio dissolvido, quase sempre reduz a intensidade de 
fluorescência de uma solução, sendo este, portanto, o resultado de uma oxidação da 
espécie fluorescente, induzida fotoquimicamente. Porém, a supressão ocorre em 
consequência das propriedades paramagnéticas do oxigênio molecular, que 
favorece o cruzamento inter-sistema e a conversão das moléculas excitadas ao 
estado triplete. 
 
3.2 – Componentes para a medida de fluorescência e fosforescência 
 
A maioria dos equipamentos de fluorescência utiliza óptica de feixe duplo, 
para compensar flutuações na potência da fonte. Dentre seus componentes temos: 
filtro ou monocromador de excitação e de emissão, transdutor, atenuador de feixe 
que reduz a potência para uma aproximada da radiação de fluorescência, 
fotomultiplicadoras, amplificador diferencial e dispositivo de leitura, como 
esquematizado na figura 20. 
 
 
 
 
 
 
 
 
93 
 Fotomultiplicadora da 
amostra 
Filtro ou 
monocromador de 
emissão 
Atenuador 
de feixe 
Fotomultiplicadora 
de referência 
amostra 
Radiação espalhada 
Filtro ou monocromador 
de excita ção
Fonte 
Amplificador diferencial 
Dispositivo de leitura 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 20 – Componentes para medida de fluorescência e fosforescência. 
 
 
3.3 – Aplicações da quimiluminescência, fosforescência e 
fluorescência. 
 
Os métodos de quimiluminescência podem determinar contaminantes 
atmosféricos como o ozônio, óxidos de nitrogênio e compostos de enxofre. 
Entretanto, a aplicação mais comum de todos estes métodos é a determinação de 
óxido nítrico. O ozônio de um eletro gerador e a amostra atmosférica é extraído 
 
 
 
 
 
94 
sucessivamente dentro do recipiente de reação e em seguida a radiação é 
monitorada por um tubo fotomultiplicador. 
Para determinar o conteúdo do dióxido de nitrogênio dos gases emitidos 
pelos automóveis, se utiliza a reação do óxido nítrico com o ozônio. Outros métodos 
de quimiluminescência importantes são usados para monitorar o ozônio atmosférico 
e a determinação de contaminantes com conteúdo de enxofre tais como dióxido de 
enxofre e sulfeto de hidrogênio. 
Os métodos fluorescentes são muito utilizados para análise de traços de 
metais em água de mar, substâncias biológicas e amostras agrícolas e os 
fosforescentes que geralmente é complementar ao fluorescente e vice-versa, são 
utilizados na determinação de espécies orgânicas e bioquímicas, como os 
aminoácidos, enzimas, hidrocarbonetos do petróleo e pesticidas, entre outros. A 
sensibilidade, os limites de detecção menores que os usualmente encontrados em 
espectroscopia de absorção, são aspectos que tornam interessantes os métodos 
luminescentes. 
 
3.4 - Espectrometria no Infravermelho 
 
Na espectroscopia infravermelha é medida o comprimento de onda e a 
intensidade da absorção de luz infravermelha de uma amostra. Quando a luz 
infravermelha média possui energia suficiente para excitar vibrações moleculares a 
níveis de energia mais altos. O comprimento de onda dos feixes de absorção da luz 
infravermelha tem como maior utilidade à identificação de moléculas orgânicas e 
organometálicas. Por ter uma alta seletividade este método possibilita a estimativa 
de um analito em uma matriz complexa, por meio da análise dos movimentos de 
rotação e de vibração dos átomos em uma molécula. O espectro de infravermelho é 
dividido em radiação no infravermelho próximo, médio e distante, com técnicas e 
aplicações de métodos baseados nesta divisão. 
 
 
 
 
 
Em um espectrômetro infravermelho a luz infravermelha passa por meio de 
uma molécula orgânica e produz um espectro com o traçado da quantidade de luz 
transmitida no eixo vertical comparado com o comprimento de onda da radiação 
infravermelha no eixo horizontal. E nesse espectro infravermelho, os picos de 
absorção se dirigem para baixo porque o eixo vertical é a transmitância percentual 
da radiação por meio da amostra. 
 Com isso, a absorção de radiação diminui o valor de transmitância 
percentual. Portanto, devido aos enlaces em uma molécula orgânica interagirem 
com a radiação infravermelha, o espectro de radiação infravermelha oferece uma 
considerável quantidade de dados estruturais. No quadro 8 é descrito uma 
reprodução da saída final de um espectrômetro infravermelho, onde a ordenada é 
linear em transmitância que é o tipo mais utilizado. Normalmente, em espectroscopia 
na região do infravermelho é utilizada uma escala linear de número de onda, por 
causa da proporcionalidade direta entre essa grandeza, a energia e a frequência. 
 
Quadro 8 – Regiões espectrais do Infravermelho 
 
Região Região de Número de 
Onda 
 (v), cm-1
Região de Frequência 
(v), Hz 
Próximo 
Médio 
Distante 
Mais utilizado 
12.800 a 4.000 
4.000 a 200200 a 10 
4.000 a 670 
3,8 x 1014 a 1,2 x 1014
1,2 x 1014 a 6,0 x 1012
6,0 x 1012 a 3,0 1011 
1,2 x 1014 a 2,0 x 1013
 
 
95 
 
 
 
 
 
96 
São quatro os tipos de instrumentos para medições de absorção 
infravermelha: espectrofotômetros dispersivos para medições qualitativas, 
instrumentos de transformadas de Fourier para medições qualitativas e quantitativas, 
fotômetros não dispersivos para determinação quantitativa de espécies orgânicas na 
atmosfera e fotômetros de refletância para análise de sólidos. 
As fontes de luz infravermelha nestes instrumentos requerem uma fonte de 
radiação infravermelha contínua e um transdutor infravermelho sensível ou um 
detector. As fontes infravermelhas são compostas por um sólido inerte que é 
eletricamente aquecido a temperaturas entre 1.500 e 2.200 K. Desse modo, o 
material aquecido emitirá, assim, radiação infravermelha. A intensidade máxima de 
radiação nestas temperaturas ocorre entre 5.000 e 5.900 cm-1. 
Existem três tipos de transdutores/detectores para o infravermelho: 
transdutores térmicos; piroelétricos e fotocondutor. Os térmicos têm sua resposta 
vinculada ao efeito do aquecimento da radiação, são utilizados para detecção de 
todos os comprimentos de ondas no infravermelho, exceto os menores. Suas 
principais desvantagens são: tempo de resposta curto e a baixa sensibilidade se 
comparada com outros tipos de detectores. 
O ruído térmico do ambiente é um complicador em se medir a radiação 
infravermelha por este transdutor, por isso, é encapsulada sob vácuo e isolada da 
radiação térmica emitida por outros objetos próximos. O feixe da fonte é sempre 
modulado para minimizar os efeitos de fontes estranhas de calor. Assim, o sinal 
analítico após a transdução, tem a frequência do modulador podendo ser separado 
eletronicamente dos sinais estranhos do ruído. 
Um detector termopar é composto por um conjunto de dois condutores 
metálicos e unido pelos seus extremos, sua diferença de potencial (voltagem) entre 
os extremos se altera de acordo com a diferença de temperatura entre os extremos. 
No caso de um bolômetro que funciona como uma resistência variável quando é 
aquecido e é composto de finas lâminas de platina ou níquel ou de um 
semicondutor. 
 
 
 
 
 
97 
Os transdutores piroelétricos são compostos por folhas de monocristais de 
materiais piroelétricos (sulfato de triglicina), que são isolantes, conhecidos como 
materiais dielétricos, com propriedades térmicas e elétricas. A polarização elétrica 
ocorre quando um campo elétrico é aplicado em um material dielétrico, e essa 
polarização induzida cai rapidamente a zero quando o campo externo é retirado. 
A substância piroelétrica, ao contrário retém uma forte polarização 
dependente da temperatura após a retirada do campo. Desse modo, o cristal 
piroelétrico intercalado entre dois eletrodos, onde um é transparente ao 
infravermelho, cria um capacitor dependente da temperatura. Estes transdutores têm 
tempo de resposta rápido o suficiente para seguir as variações no domínio do tempo 
do sinal de um interferômetro, sendo assim, muitos espectrômetros infravermelhos 
com transformada de Fourier, utilizam este tipo de transdutor. 
Em transdutores para infravermelho os fotocondutores são constituídos por 
um filme fino de material semicondutor, como sulfeto de chumbo, telureto de 
cádmio/mercúrio ou antimoneto de índio, depositado sobre uma superfície não 
condutora de vidro e depois, é selada em um recipiente sem vácuo para proteger o 
semicondutor da atmosfera. 
Os detectores fotocondutivos são mais sensíveis. Baseiam-se nas 
interações entre os fótons e o semicondutor. Os elétrons não condutores são 
promovidos pela absorção por meio desses materiais, a um estado condutor, de 
energia mais alta, decrescendo a resistência elétrica do semicondutor. Em geral, um 
fotocondutor é colocado em série com uma fonte de tensão e um resistor de carga, e 
a carga de tensão no resistor de carga serve como medida da potência do feixe de 
radiação. 
 O transdutor de telureto de cádmio/mercúrio, também é muito utilizado em 
espectrômetros com transformada de Fourier, principalmente se forem interfaceados 
com equipamentos de cromatografia a gás. O detector de sulfureto de chumbo é 
usado para a região infravermelha próxima. Para as regiões médias e mais 
afastadas, utiliza-se o detector de mercúrio ou telúrio de cádmio. E para minimizar as 
alterações deve ser resfriado com nitrogênio líquido. 
 
 
 
 
 
98 
É muito restrita a absorção de radiação infravermelha, que ocorre em 
espécies moleculares que têm pequenas diferenças de energia nos vários estados 
vibracionais e rotacionais. Pois, para que absorva radiação infravermelha, uma 
molécula precisa sofrer uma variação no momento de dipolo como consequência do 
movimento vibracional ou rotacional. 
Somente nessas circunstâncias o campo elétrico alternado da radiação 
interage com a molécula e causa variações na amplitude de um de seus 
movimentos. A magnitude da diferença de carga e a distância entre os dois centros 
de carga determinam o momento dipolar. Quando a frequência de radiação for 
simultânea com a frequência vibracional natural da molécula, uma transferência de 
energia efetiva ocorre e resulta numa variação da amplitude da variação molecular, e 
a absorção de radiação é a consequência. 
 
3.4.1. – Equipamentos para medidas de absorção infravermelha 
 
Existem três tipos de equipamentos para medidas de absorção 
infravermelha: espectrofotômetros dispersivos de rede (usados em geral para 
trabalho qualitativo); equipamentos multiplexados (transformada de Fourier) para 
medidas qualitativas e quantitativas e; fotômetros não-dispersivos usados na 
determinação quantitativa de diversas espécies orgânicas na atmosfera por meio da 
espectroscopia de absorção, emissão e reflectância. 
Os equipamentos com transformada de Fourier são tidos, como melhores 
nas relações sinal-ruído, em mais de uma ordem de magnitude que os dos 
equipamentos dispersivos. Teoricamente os equipamentos com transformada de 
Fourier fornecem um transporte de energia muito maior com sua óptica que os 
equipamentos dispersivos, por terem suas saídas limitadas e por precisarem de 
larguras de fendas estreitas. 
No caso dos equipamentos de interferômetros, as áreas da química têm um 
bom desempenho, como em trabalhos com resoluções altas quando misturas 
 
 
 
 
 
99 
gasosas, por exemplo, apresentam espectros complexos; também nos estudos de 
amostras com grandes absorbâncias; em investigações que requerem uma 
varredura rápida, como estudos cinéticos ou de detecção de efluentes 
cromatográficos, entre outros. 
 
3.4.2 – A espectrometria no infravermelho e suas aplicações 
 
As aplicações da espectrometria no infravermelho estão relacionadas à 
determinação quantitativa e qualitativa de espécies moleculares e também na 
determinação de estruturas de espécies orgânicas e bioquímicas. 
Na identificação de compostos orgânicos, utiliza-se geralmente a região no 
infravermelho médio. Excetuando-se as moléculas homonucleares, outras espécies 
orgânicas e inorgânicas absorvem na região do infravermelho, e desse modo, a 
aplicação desta espectrometria possibilita a determinação de muitas substâncias. 
A espectrometria no infravermelho próximo é utilizada para análises 
quantitativas de compostos contendo grupos funcionais constituídos de hidrogênio 
ligado a carbono, nitrogênio e oxigênio. Dentre suas aplicações, tem se a 
determinação de água em diversas amostras, como filmes orgânico e ácido nítrico 
fumegante; a determinação quantitativa de fenois, alcoóis, ácidos orgânicos e 
hidroperóxidos de acordo com o primeiro harmônico da vibração de estiramento O – 
H que absorve em aproximadamente 7.100 cm-1 (1,4 µm) e também a determinação 
de ésteres, cetonas e ácidos carboxílicos. 
Quando se usa a espectrometria de reflectância no infravermelhobioquímicas, mecanismos fisiológicos e outros em caso de exposição sem manifestações 
toxicológicas. Porém, saber distinguir entre efeito adverso (efeito patológico) e adaptação 
(alteração fisiológica) é muito difícil, então, sempre é realizada a análise de cada caso em 
particular. A verificação da dose administrada ou da concentração em que um organismo 
vivo é submetido é uma das formas de avaliação de exposição toxicológica. 
A curva Gaussiana teórica representa a relação dose/resposta ou 
concentração/resposta, estatisticamente é calculada a partir da observação de 
mortalidade após a exposição à doses/concentrações da substância em teste. No cálculo 
da dose letal 50% (DL50) ou concentração letal 50% (CL50), essa curva é em geral 
empregada. 
A Comunidade Comum Europeia classificou as substâncias químicas em apenas 
3 categorias, como: 
• Muito Tóxica: substâncias com DL50 para ratos menores do que 25 mg/kg; 
• Tóxicas: substâncias com DL50 para ratos entre 25 e 200 mg/kg; 
• Nociva: substâncias com DL50 para ratos entre 200 e 2000 mg/kg; 
 
Podem-se classificar as substâncias químicas, segundo Sterner e Hodge (1949), 
em seis classes de toxicidade, de acordo com a provável dose letal para humanos 
conforme descrito no quadro 1: 
 
 
 
 
 
Quadro 1 – Classes de Toxicidade 
 
 
 
 
 
 
11 
 
 
Classe Categoria de Toxicidade Provável DL oral/ humanos 
1 Praticamente não-tóxica > 16 g/kg 
2 Ligeiramente tóxica 5-15 g/kg 
3 Moderadamente tóxica 0,5-5 g/kg 
4 Muito tóxica 50-500 mg/kg 
5 Extremamente tóxica 5-50 mg/kg 
6 Super tóxicapróximo, 
sua aplicação de maior ênfase é em análises quantitativas de constituintes de 
sólidos finamente pulverizados e para a determinação de proteínas, umidade, 
celulose em produtos agrícolas como grãos e sementes oleosas, entre outros. 
Existem também aplicações conjuntas como no caso do uso da microscopia 
na região do infravermelho e são utilizadas para identificar contaminantes em 
 
 
 
 
 
100 
 
polímeros, em pequenas amostras de fibras, tintas e explosivos em criminalística, 
entre outros. 
 
3.5 - Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 
 
A espectroscopia de RMN é uma técnica analítica pela qual um núcleo 
absorve a radiação eletromagnética de uma frequência específica, na presença de 
um forte campo magnético. Tem sido aplicada na detecção de átomos leves (como o 
hidrogênio nos hidrocarbonetos) e como uma forma não-destrutiva de estudar o 
corpo humano5. A análise do espectro de RMN de 13C, associada com a análise de 
espectros de RMN 1H, permite que se determine a fórmula molecular da substância, 
a fórmula estrutural e até mesmo a espacial. Em se tratando de moléculas de 
estrutura complexa, os espectros de RMN 1H e 13C podem ser obtidos 
simultaneamente de modo correlacionado, dando origem à categoria de RMN em 
duas dimensões (2D 1H-1H e 1H-13C). 
A ressonância magnética nuclear (RMN) ou Nuclear Magnetic Resonance 
(NMR) se baseia na medição de absorção radiação de radiofrequência por um 
núcleo em um campo magnético forte. Assim como os elétrons possuem o número 
quântico spin (S), os núcleos de 1H e de alguns isótopos também possuem spin. O 
núcleo do hidrogênio comum é como o elétron: seu spin é ½ e pode assumir dois 
estados: +½ e -½. Isto significa que o núcleo do hidrogênio possui dois momentos 
magnéticos. Outros núcleos e com número quântico spin igual a ½ são os dos 
isótopos 13C, 19F e 31P. No quadro 9 temos a descrição das propriedades magnéticas 
de quatro núcleos com spin ½. 
A absorção da radiação faz com que o spin nuclear se alinhe ou gire em 
direção à maior energia. Após absorver energia, os núcleos remeterão radiação de 
radiofrequência (RF) e voltarão ao estado de energia mais baixo. Deste modo, para 
 
5 Leitura adicional em: http://www.cerebromente.org.br/n13/tecnologia/ressonancia.htm e 
http://biblioteca.universia.net/ficha.do?id=22556130
 
 
http://www.cerebromente.org.br/n13/tecnologia/ressonancia.htm
http://biblioteca.universia.net/ficha.do?id=22556130
 
 
 
 
 
101 
que os núcleos desenvolvam estados de energia necessários para que ocorra a 
absorção, o analito precisa ser colocado em um campo magnético intenso. 
 
Quadro 9 – Propriedades magnéticas de quatro núcleos com spin ½. 
 
Núcleo Razão 
giromagnética 
(radiano T-1 s-1) 
Sensibilidade 
Relativa * 
Frequência de 
Absorção, MHz ** 
1H 2,6752 x 108 1,00 200,00 
13C 6,7283 x 107 0,016 50,30 
19F 2,5181 x 108 0,83 188,25 
31P 1,0841 x 108 0,066 81,05 
* quando em campo constante para número igual de núcleos. ** quando a intensidade de campo for 
igual a 4,69 T. Fonte: Adaptado de Skoog et.al., 2002 
 
 
Portanto, o princípio de RMN tem como base que os núcleos com número 
ímpar de prótons, nêutrons ou ambos terão um spin nuclear próprio. Então, quando 
um núcleo com um spin nuclear diferente de zero é colocado no campo magnético, o 
spin nuclear pode alinhar-se na mesma direção ou em direção oposta ao campo. E 
estes dois alinhamentos de spin nuclear têm diferentes energias, e a aplicação de 
um campo magnético produz a degeneração dos spins nucleares. Um núcleo que 
possui seu spin alinhado com o campo terá uma energia mais baixa que quando seu 
spin estiver alinhado em direção oposta ao campo. 
A energia de uma transição RMN depende da força do campo magnético, 
um fator de proporcionalidade para cada núcleo, por isso, o ambiente local ao redor 
 
 
 
 
 
102 
do núcleo em uma molécula perturbará levemente o campo magnético local exercido 
sobre o núcleo e afetará sua energia exata de transição. Todavia, esta dependência 
da energia de transição na posição de um átomo, em particular em uma molécula, 
faz com que a espectroscopia RMN seja muito utilizada para determinar a estrutura 
de moléculas e também para a determinação quantitativa da espécie absorvente. A 
espectroscopia RMN é uma das ferramentas mais poderosas para elucidar a 
estrutura de espécies orgânicas e inorgânicas. 
São dois os tipos de espectrômetros de RMN: de onda contínua (CW) e de 
pulso ou de Transformada de Fourier (TF-RMN). Os espectrômetros de onda 
contínua foram substituídos por instrumentos de pulso TF-RMN, porém, devido à 
baixa manutenção e seus baixos custos operacionais, os instrumentos de onda 
contínua ainda são usados para espectroscopia RMN de rotina. Nos instrumentos de 
CW de baixa resolução os eletros-ímã são resfriados com água e os magnetos nos 
espectrômetros TF-RMN são resfriados com hélio líquido. 
 
3.5.1 - Ressonância Magnética Nuclear de onda contínua 
 
O instrumento de onda contínua RMN é composto por: um magneto para 
separar os estados de energia do spin nuclear; por pelo menos dois canais de 
radiofrequência, um para a estabilização do campo/frequência e um para 
proporcionar a irradiação de energia RF; uma sonda de amostra que contenham 
espirais para acoplar a amostra com o campo RF; um detector para processar os 
sinais de RMN; um gerador para a varredura do campo magnético ou RF por meio 
de frequências de ressonância da amostra; e um gravador para mostrar o espectro. 
A radiação produzida por meio de uma bobina de um oscilador RF, que 
como uma fonte está inserida nos equipamentos de RMN. Esta radiação é 
polarizada e orientada perpendicularmente ao campo magnético fixo, onde é 
introduzida uma radiação polarizada no volume da amostra analisada em um plano 
adequado para que ocorra a absorção pelos núcleos da amostra. E com isso, 
apenas o componente magnético da radiação de excitação que gira na direção de 
 
 
 
 
 
103 
precessão (trajetória circular em torno do vetor que representa o campo magnético) 
é absorvido. 
O espectro é varrido pelo método de varrido de campo ou método de varrido 
de frequência. No método de varrido de frequência, o campo magnético mantém-se 
constante, o que mantém os níveis de energia do spin nuclear a níveis constantes; 
depois o sinal RF é varrido para determinar as frequências onde a energia é 
absorvida. No método de varrido de campo, o sinal RF se mantém constante, e o 
campo magnético é varrido, provocando criação nos níveis de energia para 
determinar as forças do campo magnético que produzem ressonância a uma 
frequência de ressonância fixa. 
Se um núcleo é exposto à radiação de frequência adequada, uma absorção 
ocorre por um pequeno excesso de núcleos no estado de energia inferior que estão 
presentes no campo magnético forte e, quando isto ocorre, é dito que o sistema de 
spin esta saturado. Então, para que esta saturação seja evitada, a velocidade de 
relaxação dos núcleos excitados a um nível de energia menor precisa ser tão grande 
quanto ou maior do que a velocidade em que absorvem a energia RF. 
Portanto, para que seja possível reduzir a saturação e se produzir um sinal 
de absorção detectável, a relaxação deveria ocorrer o mais rápido possível. Para 
tanto, há dois tipos de processos de relaxação em espectroscopia de RMN que são: 
relaxação spin-rede, ou longitudinal, e relaxação spin-spin, ou transversal. 
A relaxação spin-rede é uma diminuição exponencial de primeira ordem com 
um tempo de relaxação T1, que é uma medida do tempo de vida médio dos núcleos 
no estado de maior energia. O tempo de relaxação depende da razão giromagnética 
do núcleo absorvedor, T1 é afetado pela mobilidade da rede. Quando em sólidos 
cristalinos e líquidos viscosos, onde as mobilidades são pequenas, T1 é grande. 
Enquanto a mobilidade cresce, as frequênciasvibracional e rotacional 
aumentam, e assim a probabilidade de uma variação magnética apropriada para 
uma transição de relaxação aumenta, e T1 fica menor como consequência. Se ao 
contrário, a mobilidade é grande, as frequências de variação são maiores e 
 
 
 
 
 
104 
espalhadas por uma faixa tão larga que a possibilidade de uma frequência adequada 
para uma transição spin-rede diminui. 
Outros efeitos que podem diminuir os tempos de relaxação estão em geral 
agrupados e descritos por um tempo de relaxação spin-spin, T2. Geralmente os 
valores de T2 são pequenos para sólidos cristalinos ou líquidos viscosos (até 10-4s), 
e para obter espectros de alta resolução, seria necessária a utilização de técnicas 
especiais. 
 
3.5.2 - Ressonância Magnética nuclear por Transformada de Fourier 
 
Os espectrômetros de transformada de Fourier usam radiação de pulso de 
radiofrequências para fazer com que os núcleos em um campo magnético girem em 
direção ao alinhamento de energia mais alto. O comprimento do pulso é de 1-10 µs 
e é suficientemente largo para excitar os núcleos simultaneamente. O intervalo entre 
pulsos é normalmente de um até vários segundos. 
Durante este tempo, é emitido um sinal de domínio de tempo RF chamado 
sinal de decaimento livre (Free Induction Decay - FID) à medida que os núcleos 
voltam a seu estado original. O FID pode ser detectado com uma espiral receptora 
de rádio perpendicular ao campo magnético estático, isto é, com uma bobina de 
receptor de rádio perpendicular ao campo magnético estático. Somente uma bobina 
é usada para emitir e detectar o sinal de decaimento. 
Este sinal é então, digitalizado e armazenado em um computador para o 
processamento de dados. Os sinais de decaimento de domínio de tempo de 
numerosos pulsos sucessivos podem ser somados e agregados para melhorar a 
relação sinal-ruído. O resultado se converte em sinal de domínio de frequência por 
uma transformada de Fourier. O domínio de frequência resultante é similar ao 
espectro produzido ao varrer o experimento de onda contínua. 
O FID é muito complexo para compostos que têm várias linhas de absorção, 
mas em cada caso, o sinal de decaimento no domínio do tempo contém a 
 
 
 
 
 
105 
informação necessária para produzir espectros de absorção no domínio de 
frequência utilizando-se a transformação de Fourier. 
São vários os tipos de espectro de RMN, o que depende do tipo de 
equipamento usado e o tipo do núcleo envolvido, do estado físico da amostra, 
ambiente do núcleo do analito e finalmente, do propósito da análise. 
Os espectros são classificados como de linhas largas ou de alta resolução. 
- Os de linhas largas são os que apresentam uma largura de banda da fonte 
das linhas com largura suficiente para encobrir a estrutura fina de acordo com o 
ambiente químico. Este tipo de espectro é muito utilizado na determinação 
quantitativa de isótopos, por exemplo. 
- Os espectros de alta resolução são os mais utilizados, sendo coletados por 
equipamentos que diferenciam frequências muito próximas (± 0,01 ppm). 
O ambiente químico (elétrons e núcleos próximos) afeta a frequência de 
radiação que é absorvida por um determinado núcleo e por isso, até moléculas 
simples produzem grande quantidade de informação espectral que pode auxiliar na 
elucidação de suas estruturas químicas. Porém, o deslocamento químico e o 
desdobramento spin-spin são igualmente importantes numa análise estrutural. 
O deslocamento químico que é causado por pequenos campos magnéticos 
que são gerados por elétrons e circula ao redor dos núcleos, ocasionando a esses 
campos magnéticos uma oposição ao campo aplicado, e com isso, os núcleos ficam 
expostos a um campo efetivo que é menor que o campo externo. 
Entretanto, o desdobramento de picos com deslocamento químico ocorre 
quando existe a interação do momento magnético de um núcleo com os núcleos 
vizinhos. Pois, o momento magnético criado por um núcleo giratório afeta a 
distribuição dos elétrons em suas ligações a outros núcleos, o que vai produzir um 
desdobramento de níveis de energia (transições múltiplas), e este acoplamento 
magnético de núcleos transmitido por elétrons da ligação é chamado de interação da 
polarização. 
 
 
 
 
 
106 
Deste modo, os deslocamentos químicos originam-se dos campos 
magnéticos secundários que são produzidos pela circulação de elétrons em uma 
molécula, que são chamadas de correntes diamagnéticas, onde a intensidade da 
magnetização induzida em uma substância diamagnética é menor que a produzida 
no vácuo com o mesmo campo. 
Entretanto, o paramagnetismo e as correntes paramagnéticas resultantes 
operam no sentido oposto. O deslocamento químico tem sido usado na identificação 
de grupos funcionais e também ajudam na determinação dos arranjos estruturais 
dos grupos (Quadro 10). 
 
Quadro 10 – Deslocamentos químicos aproximados de alguns prótons 
 
δ,ppm* 
Estrutura M = CH3 M = CH2 M = CH 
Substituintes α-alifáticos 
M-Cl 3,0 3,5 4,0 
M-Br 2,7 3,4 4,1 
M-C≡C 1,7 2,2 2,8 
Substituintes β-alifáticos 
M-C-Cl 1,5 1,8 2,0 
M-C-Br 1,8 1,8 1,9 
M-C-NO2 1,6 2,1 2,5 
* É preciso saber que os valores de δ podem depender da natureza do solvente e da concentração do 
soluto. 
 
 
 
 
 
107 
O efeito que os spins de um tipo de núcleo têm sobre o comportamento de 
ressonância de outros, estão ligados à interação entre dois grupos adjacentes de 
prótons, que de acordo com os resultados de cálculos teóricos detalhados mostram 
consistência com o conceito de acoplamento devido às interações entre os núcleos 
e os elétrons ligantes. 
A interpretação dos padrões de desdobramento spin-spin é simples para 
espectros de primeira ordem, que são aqueles onde o deslocamento químico entre 
grupos de núcleos que interagem é grande em relação à constante de acoplamento 
(J). Para interpretação de espectros de RMN de primeira ordem é preciso observar 
algumas regras como: núcleos equivalentes não interagem entre si para dar picos 
múltiplos de absorção; as constantes de acoplamento decrescem com a separação 
entre os grupos; a constante de acoplamento é independente do campo aplicado, 
então os multipletes são facilmente distinguidos dos picos com deslocamentos 
químicos próximos, registrando-se espectros em duas intensidades de campo 
diferentes. 
Em espectros de segunda ordem as constantes de acoplamento são 
menores que 20 Hz e os deslocamentos químicos podem chegar a milhares de Hz. 
Por isso, a interpretação de espectros de RMN de segunda ordem é mais complexa. 
Utilizando-se técnicas de ressonância dupla, onde a amostra é irradiada 
simultaneamente com dois ou mais sinais diferentes de radiofrequência, como os 
utilizados pelos métodos de desacoplamento de spin; a perturbação de spin e a 
ressonância dupla internuclear, entre outros, auxiliam na interpretação dos espectros 
de RMN complexos. 
 
3.5.3 – Aplicações de RMN 
 
Além de determinar a fórmula molecular da substância, a fórmula estrutural e 
até mesmo a espacial, a espectrometria de ressonância magnética pode ser utilizada 
para estudar outros isótopos como o 31P, 15N, 19F, 2D, 23Na, 207Pb, entre outros, pois 
 
 
 
 
 
108 
existem mais de 200 isótopos que têm momentos magnéticos podendo então serem 
estudados por RMN. 
Ultimamente, a tecnologia de RMN tem sido aplicada em diversos campos 
como biologia, engenharia, controle de qualidade industrial e medicina. Na medicina 
a mais destacada das aplicações é a de ressonância magnética por imagem (RMI), 
onde os dados da excitação pulsada de radiofrequência de objetos sólidos ou 
semissólidos são submetidos à transformada de Fourier e então convertidos em 
imagens tridimensionais do interior dos objetos. 
Com a aplicação competente de várias sequências de pulsos de 
radiofrequência e gradientes de campo magnético, transformações de Fourier 
apropriadas e análises de dados e rotinas de reconstrução produzemimagens 
tridimensionais. Além do uso na medicina, a RMI tem sido utilizada também para 
formação de imagens principalmente na indústria de alimentos como, por exemplo, 
na exploração da distribuição de gordura e músculos em carnes, determinação de 
água e lipídios em óleo de girassol, entre outros. 
 
3.6 - Espectroscopia de Massa Molecular 
 
A espectrometria de massas (MS) utiliza o movimento de íons em campos 
elétricos e magnéticos para classificá-los de acordo com sua relação massa-carga 
(m/z). Assim, a espectrometria de massas é uma técnica analítica onde as 
substâncias químicas são identificadas, por meio da separação dos íons gasosos em 
campos elétricos e magnéticos. Portanto, as colisões entre elétrons energéticos e 
moléculas do analito em geral, fornecem energia às moléculas para que fiquem em 
estado excitado. 
Os íons positivos produzidos por meio de impactos dos elétrons são atraídos 
por uma fenda do espectrômetro de massas, onde são selecionados pelas razões 
massa-carga e apresentados sob a forma de um espectro de massa. O dispositivo 
que realiza esta operação e utiliza meios elétricos para detectar os íons classificados 
 
 
 
 
 
109 
é conhecido como espectrômetro de massas. A espectrometria de massas fornece 
informação qualitativa e quantitativa sobre a composição atômica e molecular de 
materiais inorgânicos e orgânicos. 
Para iniciar uma análise por espectrometria de massas é necessário que 
haja a formação de íons gasosos no analito e para tanto, esse método tem como 
finalidade e utilidade ditadas pelo processo de ionização. 
Os espectrômetros de massas são constituídos por quatro partes básicas: 
um sistema de manipulação para introduzir a amostra no equipamento; uma fonte de 
íon, onde é produzido um feixe de partículas proveniente da amostra; um analisador 
que separa partículas de acordo com a massa; um detector, no qual os íons 
separados são recolhidos e caracterizados. 
O espectrômetro requer um percurso de colisão livre para os íons e, 
funciona a vácuo ou em condições quase a vácuo. O sistema de entrada da amostra 
está desenhado para uma mínima perda de vácuo. A fonte de íon cria fragmentos de 
íon gasosos da amostra. São dois os tipos de fontes de íon: Fontes de fase de gás e 
fontes de dessorção que estão descritos no quadro 7 do módulo II. 
Nas fontes de fase de gás, a amostra é volatilizada antes de ionizar os 
componentes gasosos e estão restritas a compostos termicamente estáveis, com 
pontos de ebulição abaixo de 500ºC. Este fato limita as fontes gasosas aos 
compostos com massas moleculares menores que 103 daltons aproximadamente, 
enquanto que fontes de dessorção, onde não é requerida a volatilização das 
moléculas do analito, as massas moleculares aplicáveis são de 105 daltons. A 
amostra se vaporiza fora da fonte de energia. 
Os métodos como a ionização química, ionização por impacto de elétrons e 
ionização por campo, são exemplos de utilização dessas fontes de gás. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
110 
3.6.1 – Métodos de ionização em espectrometria de massa molecular 
 
O método de ionização mais usado é o de impacto eletrônico. Nesse método 
a amostra é conduzida a uma temperatura elevada o suficiente para produzir um 
vapor molecular, que então é ionizado pelo bombardeio de moléculas resultantes 
com um feixe de elétrons energéticos. Um feixe é gerado pela lâmpada de 
tungstênio, por exemplo, para ionizar os átomos de fase de gás ou moléculas. Os 
íons são formados durante a colisão do feixe com as moléculas da amostra. 
Para que seja formado um número significativo de íons gasosos com 
velocidade reprodutível, os elétrons que vêm do filamento precisam ser acelerados 
por um potencial maior do que 50 V. Os espectros de massa complexos resultantes 
da ionização por impacto de elétrons são úteis para a identificação de compostos. O 
pico do íon molecular aparece na massa correspondente à massa molecular do 
analito, que é fundamental nas determinações estruturais, pois sua massa fornece a 
massa molecular da substância desconhecida. 
Este método tem boa sensibilidade, pois as fontes de íons por impacto de 
elétrons produzem correntes iônicas grandes. A fragmentação e o elevado número 
de picos é uma vantagem por possibilitar a identificação não-ambígua dos analitos, e 
também pode ser uma desvantagem por resultar no desaparecimento do pico do íon 
molecular, e nesse caso, a massa molecular do analito não pode ser determinada. 
A necessidade de se volatilizar a amostra, pode resultar na degradação 
térmica de alguns analitos antes de ocorrer à ionização, o que também é uma 
desvantagem deste método. Porém, os efeitos da decomposição térmica podem ser 
minimizados ao se fazer a volatilização em uma sonda aquecida próxima da fenda 
do espectrômetro e por isso, este método é aplicável a analitos que tenham massas 
moleculares menores que 103 daltons. 
Na ionização química, uma pequena quantidade de átomos gasosos é 
ionizada por colisão com átomos produzidos pelo bombardeamento do gás reativo. 
Alguns dos gases reativos mais utilizados neste método são: metano, oxigênio, 
 
 
 
 
 
111 
amônia e o hidrogênio. E cada um desses reagentes produz um espectro diferente 
para determinado analito. 
Muitos equipamentos de espectrometria de massas atuais utilizam o impacto 
de elétrons e a ionização química de forma intercambiável. Em geral, são usados 
íons positivos, porém no caso da ionização química também é usado íons negativos 
com analitos que contenham átomos eletronegativos. 
No caso das ionizações por campo, as moléculas podem perder um elétron 
quando colocados num campo elétrico muito alto. Os íons são formados sob a 
influência de um campo elétrico elevado (108 V/cm). Os campos altos podem ser 
criados em uma fonte de íon aplicando alta voltagem entre o cátodo e o ânodo, o 
que se chama emissor de campo. 
Um emissor de campo consiste em um cabo coberto por partículas de 
carbono microscópicas, as quais, geralmente, amplificam o campo efetivo dos 
pontos de carbono. A sensibilidade é menor em relação às fontes de íons por 
impacto de elétrons, pois as correntes máximas estão na ordem de 10-11 A. 
Nas fontes de dessorção os íons se formam na fase condensada. Uma 
grande vantagem da ionização por dessorção é que permite a análise de moléculas 
não voláteis e termicamente instáveis. Dispensa a volatilização seguida de ionização 
das moléculas gasosas dos analitos e com isso, os espectros são simples e 
apresentam apenas o íon molecular ou o íon molecular protonado. Dois exemplos de 
fontes de dessorção são: dessorção por campo e por bombardeamento de átomos 
acelerados. 
A dessorção por campo é uma técnica valiosa para o estudo de fenômenos 
como espécies de dessorção e os resultados de reações químicas em superfícies. É 
um método utilizado também para as moléculas polares lipofílicas. O eletrodo é 
montado sobre uma sonda que pode ser removida do compartimento da amostra e 
recoberta com uma solução da amostra. A ionização é realizada aplicando alta 
potência ao eletrodo e, pode ser necessário aquecer o emissor com corrente 
elétrica. 
 
 
 
 
 
112 
Durante o bombardeamento de átomos acelerados (Fast Atom 
Bombardment – FAB), um feixe de energia alta de átomos neutros, em geral xenônio 
ou argônio, em uma amostra sólida provoca dessorção e ionização, causando um 
rápido aquecimento da amostra, reduzindo a fragmentação da mesma. Esta técnica 
é usada para moléculas biológicas grandes que são difíceis de penetrar na fase de 
gás. O feixe atômico é produzido acelerando os íons a partir de uma fonte e os íons 
levantam um elétron em colisão com átomos neutros para formar um raio de átomos 
de alta energia. Por terem baixa energia, os íons formados nessa troca são 
removidos por um defletor eletrostático. 
Na dessorção/ionização por laser auxiliado por matriz (Matrix-Assisted laser 
desorption/ionization – MALDI)que pode analisar massas moleculares de 
biopolímeros polares de alguns milhares a centenas de milhares de daltons, além de 
atual, têm demonstrado um excelente potencial de uso. Ainda não é uma técnica 
totalmente compreendida, porém a partir de experimentos sabe-se que o composto 
da matriz deve ser capaz de absorver a radiação do laser e ser solúvel no solvente 
da amostra, para que seja encontrado em grande quantidade na mistura sólida 
depositada na sonda metálica usada para a introdução da amostra no espectrômetro 
de massa. 
A ionização por eletronebulização (Electrospray ionization/ mass 
spectrometry – ESI/MS) é uma das técnicas mais utilizadas atualmente na análise de 
biomoléculas, como proteínas e oligonucleotídeos, por exemplo, e também na 
caracterização de espécies inorgânicas e polímeros sintéticos. 
A ionização por eletronebulização ocorre em pressão e temperatura 
atmosféricas, onde uma solução da amostra é bombeada por uma agulha capilar de 
aço inoxidável com vazão de microlitros por minuto. Durante o bombeamento da 
amostra, gotículas passam por um capilar de dessolvatação, onde há a evaporação 
do solvente e a ligação da carga às moléculas do analito. Com a evaporação do 
solvente, as densidades de carga se tornam maiores e ocorre a dessorção dos íons 
no gás ambiente. 
 
 
 
 
 
Nesse método ocorre pouca fragmentação de biomoléculas grandes e 
termicamente frágeis, e esse fator é útil no processo de eletronebulização. Os íons 
formados têm carga múltipla, então os valores de massa e carga são pequenos para 
serem detectáveis por equipamentos quadripolares com intervalo de massa de 1.500 
ou menos. A ionização por eletronebulização também pode ser usada para a 
introdução direta de amostras de coluna de cromatografia líquida de alto 
desempenho (HPLC) e eletroforese capilar. 
O objetivo do analisador de massas é separar os íons que são produzidos 
na fonte de acordo com as diferentes relações de massa-carga, e uma característica 
deste tipo de espectrômetro de massa é a necessidade de um sistema de vácuo, 
para criar baixas pressões (10-4 a 10-8 torr), como esquematizado na figura 21. O 
vácuo é necessário porque partículas carregadas interagem com os componentes da 
atmosfera e, são destruídas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sistema de 
Introdução 
Sistema 
de Vácuo 
Fontes de 
íons 
Analisador 
de massas 
Detector 
Processador 
de sinal 
Dispositivo 
de Saída 
Amostra 
 
Figura 21 – Descrição de componentes de um espectrômetro de massa. 
 
113 
 
 
 
 
 
114 
 
Quando a amostra é injetada, a entrada se dá por batelada, onde a amostra 
é volatilizada externamente e escorre para dentro da região de ionização evacuada. 
Se a amostra é gasosa, um pequeno volume de um gás conhecido é capturado 
entre duas válvulas na região da medida e então é expandido no reservatório. Se for 
líquida, uma pequena quantidade da amostra entra em um reservatório, por meio de 
uma seringa de microlitros. 
Nos dois casos, o sistema de vácuo é usado para alcançar uma pressão de 
amostra de 10-4 a 10-5 torr. A possibilidade de obtenção de espectros de compostos 
termicamente instáveis antes que se decomponha, ocorre devido às baixas pressões 
na região de ionização e pela proximidade da amostra da fonte de ionização. 
Os modelos de analisador mais comuns incluem os analisadores de 
quadrupolo, de setor magnético e analisadores de massa por tempo de voo. Um 
campo quadrupolo é formado por quatro rolos paralelos onde é aplicada uma 
corrente contínua que afeta o percurso dos íons viajando pelo trajeto centralizado 
entre os 4 rolos. Costumam ser mais compactos e oferece a vantagem de tempo de 
varredura curto (um campo 
magnético intenso, de forma circular em um plano perpendicular à direção do campo 
é chamada de ressonância ciclotrônica de íons. 
Atualmente os microcomputadores e microprocessadores fazem parte dos 
equipamentos que compõem um espectrômetro de massas, o que facilita a 
digitalização do sinal amplificado da corrente de íons e outros sinais que são usados 
para o controle das variáveis instrumentais, como temperatura, velocidade de 
varredura, entre outros. 
Em geral, o computador armazena os espectros e as informações 
relacionadas em disco, e estas informações podem ser enviadas para impressoras e 
para outros dispositivos que se façam necessários. São diversas as aplicações da 
espectrometria de massas molecular, como exemplo, temos: elucidação de estrutura 
de moléculas orgânicas e biológicas; determinação de massa molecular de 
peptídeos, proteínas e oligonucleotídeos; detecção e identificação de espécies 
separadas por cromatografia e eletroforese capilar; testes de presença de drogas em 
 
 
 
 
 
117 
 
sangue de cavalos de corrida e atletas olímpicos; determinação de resíduos de 
pesticidas em alimentos, entre outros. 
Dentre as várias técnicas que podem ser utilizadas em conjunto com a 
espectrometria de massas, a que envolve o uso de dois espectrômetros de massa é 
chamada de espectrometria de massa sequencial (MS/MS), onde um espectrômetro 
é utilizado para isolar os íons moleculares dos vários componentes de uma amostra 
que são introduzidos um a um em um segundo espectrômetro, e estes íons são 
fragmentados levando a uma série de espectros de massa, um para cada íon 
molecular produzido no primeiro espectrômetro. 
Nesse caso, o primeiro espectrômetro tem a mesma função de uma coluna 
cromatográfica LC/MS6, observando-se que fornece espécies iônicas puras uma por 
uma para identificação no segundo espectrômetro. Estes espectrômetros são 
compostos por várias combinações de setores magnéticos, eletrostáticos e filtros de 
separação quadripolares. 
A maior vantagem na utilização desta técnica é a rapidez com que as 
amostras são analisadas. Também oferece uma excelente sensibilidade já que o 
ruído químico associado ao seu uso costuma ser menor. É muito utilizado para 
determinação quantitativa e qualitativa de diversos componentes complexos 
encontrados na natureza e indústria, como: metabólitos de drogas, traços de 
contaminantes no ar, produtos petroquímicos, entre outros. 
 
3.7 - Caracterização por Espectroscopia e Microscopia de superfícies 
 
Existem vários métodos para caracterizar superfícies e entre eles os 
clássicos continuam sendo importantes por fornecerem informações sobre a 
natureza física das superfícies, porém com oferecem pouca informação sobre a 
natureza química. Com o método de espectrometria de superfície fornecem 
 
6 LC/MS = cromatografia líquida por espectrometria de massas. 
 
 
 
 
 
118 
informação química quantitativa e qualitativa, acerca da composição da camada 
superficial de um sólido. 
Dentre os métodos de superfície os mais realizados são os que a partir do 
feixe primário, o feixe secundário ou ambos são compostos por elétrons, íons ou 
moléculas e não fótons, para que as medidas sejam asseguradas por essa limitação, 
ficando restritas à superfície de uma amostra e não ao seu volume total (Quadro 11). 
Pois em métodos que envolvem a aplicação de feixes de fótons, como fluorescência 
de raios X, por exemplo, é preciso tomar providencias para limitar as medidas a uma 
camada superficial, já que um feixe de fótons pode atingir aproximadamente 104Å, e 
o feixe de elétrons ou íons atinge aproximadamente 25 Å. 
Alguns métodos de amostragem são utilizados antes da espectroscopia de 
superfície, sendo que o primeiro se relaciona com a focalização do feixe primário em 
uma área pequena da amostra e com a observação do feixe secundário, em geral o 
local é examinado com um microscópio óptico. Também é feito o mapeamento da 
superfície, varrendo-a e movendo o feixe primário com um padrão de rastreamento, 
utilizando-se de medições e observações do feixe secundário. Este mapeamento 
pode ser linear ou bidimensional. 
É realizada então, a determinação de um perfil de profundidade, onde um 
feixe de íons proveniente de um canhão de íons é usado para se cavar um buraco 
na superfície por remoção. E por este processo, um feixe primário fino é usado para 
produzir um feixe secundário no centro do buraco, fornecendo dados analíticos 
sobre a composição superficial em função da profundidade. 
Esta análise pode ser contaminada pela atmosfera, bem como pelo próprio 
feixe primário que pode alterar a superfície enquanto esta sendo processada. E para 
minimizar estes efeitos é preciso limpar a superfície da amostra, o que em geral 
ocorre dentro da câmara usada para irradiá-la. 
Na análise de superfícies, três tipos de espectroscopia eletrônica são 
encontrados como: 
• Espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS – X-ray photoelectron 
spectroscopy), onde a superfície é irradiada com raios X monocromáticos, este 
 
 
 
 
 
119 
método também é conhecido como espectroscopia eletrônica para análise química 
(ESCA – electron spectroscopy for chemical analysis) por fornecer informações 
sobre a composição da amostra e também sobre a estrutura e o estado de oxidação 
dos compostos examinados. 
• Espectroscopia eletrônica Auger (AES – Auger electron spectroscopy), 
os espectros Auger são excitados por feixes de elétrons. 
• Espectroscopia fotoeletrônica ultravioleta (UPS – ultraviolet 
photoelectron spectroscopy), neste método um feixe monocromático de radiação 
ultravioleta causa a expulsão de elétrons do analito. 
 
Quadro 11 – Exemplos de métodos espectroscópicos para análise de 
superfícies 
 
Método Feixe primário Feixe secundário 
Espectroscopia Eletrônica Auger 
(AES) 
Elétrons ou fótons de 
raios X 
Elétrons 
Espectroscopia de Massa de Íons 
Secundários (SIMS) 
Íons Íons 
Espectroscopia Fotoeletrônica de 
Raios X (XPS) 
Fótons de raios X Elétrons 
Espectroscopia Fotoeletrônica 
Ultravioleta (UPS) 
Fótons de UV Elétrons 
 
 
A espectroscopia eletrônica pode ser aplicada ao estudo de gases, líquidos 
e sólidos, e devido a pouca penetração dos elétrons as informações obtidas por 
 
 
 
 
 
120 
meio destes métodos está restrita a uma camada superficial com poucas camadas 
atômicas de espessura entre 20 a 50 Å. Tendo sido aplicada nas análises 
qualitativas de superfícies de sólidos, como metais, semicondutores e catalisadores 
heterogêneos. 
A composição dos espectrômetros eletrônicos é similar às encontradas nos 
instrumentos de espectroscopia óptica, que são: fonte; suporte de amostra; 
analisador com mesma função de um monocromador; detector; processador de sinal 
e apresentação de resultados e; sistema de vácuo. Fontes de raios X para 
espectrômetros eletrônicos de XPS são tubos de raios X equipados com alvos de 
alumínio ou magnésio e filtros. 
Os suportes de amostra para amostra sólida são montados em posição fixa 
e próxima da fonte de íons ou elétrons e da fenda de entrada do espectrômetro, com 
uma pressão de evacuação da amostra em aproximadamente 10-5 torr. Amostras 
gasosas escoam por meio de uma fenda de largura adequada resultando em uma 
pressão de aproximadamente 10-2 torr. Se a pressão for alta o feixe de elétrons 
sofrerá atenuação excessiva devido às colisões inelásticas e se a pressão for muita 
baixa, se obterá sinais fracos da amostra. 
Os analisadores são em geral, do tipo hemisférico onde o feixe de elétrons é 
defletido por um campo eletromagnético onde seja possível que os elétrons 
desenvolvam trajetórias curvas. Na grande maioria de espectrômetros eletrônicos 
são oferecidos transdutores de elétrons multicanais bidimensionais, com resolução 
de todos os elementos monitorados e tendo seus dados armazenados em um 
computador, paraposterior análise. 
As espectroscopias Auger e de fotoelétrons fornecem resultados similares 
sobre a composição da matéria, são métodos complementares. A vantagem da 
espectroscopia Auger está na sensibilidade para átomos de número atômico baixo, 
alta resolução espacial permitindo um exame detalhado de superfície de sólidos e a 
desvantagem é a difícil análise quantitativa. 
Os dispositivos do equipamento da espectroscopia de Auger são 
semelhantes aos de XPS, com exceção da fonte que em geral, é um canhão de 
 
 
 
 
 
121 
elétrons, que é composto por um filamento de tungstênio aquecido com 
aproximadamente 0,1 mm de diâmetro e é dobrado na forma de grampo, formando 
uma ponta em V. O efeito do campo elétrico no canhão faz com que os elétrons 
dirijam-se para um pequeno ponto chamado de cruzamento. 
Desse modo, enquanto os elétrons provenientes de canhões penetram a 
uma maior profundidade da superfície, apenas os elétrons Auger das primeiras 
quatro ou cinco camadas atômicas escapam para chegar ao analisador, e nesse 
caso, um espectro Auger refletirá a verdadeira composição da superfície de sólidos. 
A espectrometria de massa de íons (SIMS) é o método mais desenvolvido 
na análise de superfícies e é utilizado tanto para a determinação de composições 
atômicas como moleculares de superfícies sólidas. São encontrados em dois tipos: 
analisadores de massa de íons secundários e analisadores de microssonda. 
Os analisadores de massa de íons secundários fazem em geral análises de 
superfícies e também fazem perfis de profundidade. Enquanto que os 
espectrômetros de dupla focalização, focalização simples, tempo de voo e 
quadripolares são usados para a determinação de massa. Fornecem informações 
qualitativas e quantitativas sobre todos os isótopos presentes em uma superfície. Os 
analisadores de microssondas de íons são equipamentos mais sofisticados, e se 
baseiam em um feixe focalizado de íons primários, onde um microscópio é usado 
para ajustar visualmente a posição do feixe. A amostra é analisada em um 
espectrômetro de dupla focalização, permitindo estudos mais detalhados de 
superfícies sólidas. 
A microscopia eletrônica é utilizada em muitos campos de estudos como a 
química, ciências dos materiais, geologia e biologia, onde é preciso em muitos casos 
um conhecimento detalhado da natureza física das superfícies de sólidos. Existem 
atualmente três técnicas de microscopia eletrônica (SEM - scanning electron 
microscopy), a microscopia de tunelamento (STM – scanning tunneling microscopy) 
e a microscopia de força atômica (AFM – atomic force microscopy). 
A obtenção de imagem por qualquer uma dessas técnicas, a superfície da 
amostra é varrida por um padrão de rastreamento com um feixe de elétrons 
 
 
 
 
 
122 
focalizado com uma sonda adequada, o sinal de varredura é recebido acima da 
superfície e armazenado em um computador, onde é convertido em imagem. Dentre 
os vários sinais possíveis na varredura de superfícies dois são mais utilizados como: 
elétrons espalhados e secundários usados na microscopia eletrônica de tunelamento 
e, emissão de raios X, utilizado com microssonda eletrônica. 
Microscópios de sonda (SPM) podem resolver detalhes de superfície até o 
nível atômico, e atualmente são dois os tipos mais usados comercialmente: o 
microscópio de tunelamento (STM) e o microscópio de força atômica (AFM). São 
baseados na varredura da superfície da amostra com movimentos para cima e para 
baixo conforme muda a topografia da superfície, tendo este movimento medido e 
traduzido por um computador em uma imagem de topografia da superfície. Os 
microscópios de tunelamento usam varredores com faixas de varredura lateral de 
frações de ångstrons até 100 μm, e a extensão da varredura é determinada pelo 
comprimento, pelo diâmetro e pela espessura da parede do cilindro. O controle é 
efetuado por computador que em sua maioria utiliza softwares e conversores 
digital/analógicos para gerar varreduras de rastreamento x/y. 
O microscópio de força atômica (AFM) permite resolução de átomos 
individuais em superfícies condutoras e isolantes. Uma alavanca flexível e sensível à 
força é deslocada com um padrão de rastreamento sobre a superfície da amostra. 
Um feixe de laser é refletido de um ponto da alavanca para um fotodiodo 
segmentado que detecta o movimento da sonda. Os microscópios de sonda podem 
ser usados em diversos campos como na biotecnologia, caracterização de 
superfícies de silício, entre outros. 
 
 
 
 
 
123 
 
3.8 - Questões para estudo 
 
1 – Como a quimiluminescência é produzida? 
2 – Defina fotoluminescência e fluorescência. 
3 – O que é um excímero? 
4 – Quantos e quais são os tipos de instrumentos utilizados para medir 
absorção infravermelha? 
5 – Que técnica é utilizada para estudar o corpo humano de forma não-
destrutiva? E em que são baseadas suas medidas de absorção? 
6 – Quais os tipos de RMN e quais são suas aplicações? 
7 – Por quantas partes é constituído um espectrômetro de massas? 
8 – Na análise de superfícies, que tipos de espectroscopia eletrônica são 
encontrados? 
9 – Definam de espectrometria de massa de íons (SIMS). 
10 – Para que a microscopia eletrônica é utilizada? 
 
 
 
 
 
 
 
124 
3.9 - Glossário 
 
Catalisador – fator ou substância que promove catálise, isto é, aceleração 
de reações químicas que, sem a sua presença, exigiriam elevada energia de 
ativação ou demandariam um tempo exageradamente grande para se processar. 
Cíclotron – aparelho radioscilador (acelerador de partículas) usado 
especialmente para bombardear com nêutrons os núcleos de outros átomos e 
produzir transmutações, com obtenção de radioisótopos; acelerador de partículas 
que as projeta no vácuo contra determinadas substâncias que lhes servem de alvo. 
Hz - O hertz (símbolo Hz) é a unidade derivada do sistema internacional de 
unidades (SI) para frequência, a qual é expressa em termos de oscilações 
(vibrações) por segundo (s-1 ou 1/s). 
Íon – átomo ou grupamento de átomos com excesso de elétrons ou com 
alguma perda deles, disso resultando mostrar-se com carga elétrica negativa ou 
positiva, respectivamente. 
Irradiação – exposição de um corpo a alguma forma de radiação ou 
bombardeio de partículas, usando-se para tal fim elementos radioativos, como rádio 
e o cobalto, que emitem radioatividade, ou empregando aparelhos que emanam 
radiações como os Raios X, os raios gama, etc. Estes últimos são usados na 
esterilização de produtos alimentícios e instrumentos cirúrgicos. Os aceleradores de 
partículas e os reatores nucleares também promovem irradiação. 
Macromoléculas – qualificação que se dá às moléculas orgânicas de 
proteínas, lipídios, polissacarídeos e ácidos nucleicos, que comparadas às 
moléculas dos compostos inorgânicos, assumem proporções enormes, com grandes 
massas moleculares e acentuados índices de sedimentação em unidades Svedberg. 
Quando submetidas á hidrólise total, decompõem-se em numerosas unidades ou 
monômeros e por isso, têm a natureza de polímeros. Encerram considerável 
quantidade de energia, principalmente nas ligações entre os átomos de carbono, nas 
longas cadeias desse elemento de que é formada, razão pela qual assumem 
 
 
 
 
 
125 
relevante papel na nutrição e no metabolismo dos seres vivos. Para serem 
assimiladas no processo anabólico do metabolismo celular, precisa ser 
fragmentadas em suas unidades, o que exige uma atividade digestiva, com intensa 
atuação de enzimas específicas. 
Oxidação – qualificação das reações químicas em que um dos reagentes é 
o oxigênio ou então, nas quais se observa a perda de elétrons de uma substância. 
Na intimidade da célula, numerosas reações de oxidação transcorrem durante o 
fenômeno da respiração celular, sempre com desprendimento de calorias. 
Paramagnetismo - consiste na tendência que os dipolos magnéticos 
atômicos têm de se alinharem paralelamente com um campomagnético externo. 
Este efeito ocorre devido ao spin mecânico quântico, assim como o momento 
angular orbital dos elétrons. Este alinhamento dos dipolos magnéticos atômicos 
tende a se fortalecer e é descrito por uma permeabilidade magnética relativa maior 
do que a sua unidade (ou, equivalentemente, uma susceptibilidade magnética 
positiva e pequena). O paramagnetismo requer que os átomos possuam, 
individualmente, dipolos magnéticos permanentes, mesmo sem um campo aplicado, 
o que geralmente implica em um átomo desemparelhado com os orbitais atômicos 
ou moleculares. No paramagnetismo puro, estes dipolos atômicos não interagem 
uns com os outros e são orientados aleatoriamente na ausência de um campo 
externo, tendo como resultado um momento líquido zero. Em átomos sem dipolo 
magnético, um momento magnético pode ser induzido em uma direção antiparalela a 
um campo aplicado, este efeito é chamado de diamagnetismo. Os materiais 
paramagnéticos podem também exibir o diamagnetismo, mas tipicamente com 
valores fracos. 
Spin - o termo spin é encarado como quarto número quântico, necessário 
para definir uma partícula num sistema, como os níveis de energia no átomo. Na 
terminologia química, dois elétrons com spins em direções opostas são ditos spins 
antiparalelos. As substâncias que possuem um ou mais elétrons desemparelhados 
são atraídas [porém, fracamente] em um campo magnético. Estas substâncias são 
chamadas paramagnéticas. Aquelas que não possuem elétrons desemparelhados, 
 
 
 
 
 
126 
não sendo, portanto, atraídas em campo magnético, são chamadas diamagnéticas. 
A intensidade da atração depende, logicamente, do número de elétrons 
desemparelhados na substância. 
torr – uma unidade de pressão (torr = torricelli) que recebeu o nome de seu 
descobridor, Evangelista Torricelli, que também descobriu o princípio do barômetro 
que perpetuou a sua fama ("tubo de Torricelli", "vácuo de Torricelli") em 1643. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-------------FIM DO MÓDULO III------------- 
 
 
 
 
 
128 
 
MÓDULO IV 
 
 
4 - MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICOS 
 
A cromatografia é um método físico-químico de separação que esta inserida 
em diversos métodos que auxiliam na separação de componentes semelhantes de 
misturas complexas. A migração diferencial dos componentes de uma mistura, que 
ocorre por diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel que pode 
ser um gás, um líquido ou um fluido supercrítico e a fase estacionária, colocada na 
coluna ou em uma superfície sólida. 
Há diversas combinações entre as fases móveis e estacionárias, o que torna 
a cromatografia uma técnica de muita aplicação e flexível. Os componentes da 
amostra que são mais retidos na fase estacionária movem-se vagarosamente no 
fluxo da fase móvel, e os componentes que se liga de forma mais fraca na fase 
estacionária, movem-se mais rapidamente pela fase móvel. E estas diferenças de 
mobilidade, auxiliam na análise qualitativa ou quantitativa dos componentes da 
amostra que são separados em bandas ou zonas discretas. 
Dentre suas aplicações a cromatografia pode ser utilizada na identificação 
de compostos, por meio de comparações com padrões existentes, para a purificação 
de compostos, separando as substâncias indesejadas e também na separação dos 
componentes de uma mistura (Quadro 12). Os métodos cromatográficos podem ser 
classificados considerando-se alguns critérios como: 
• Classificação por forma física da cromatografia, que pode ser dividida 
em cromatografia em coluna e planar. São vários os tipos de cromatografia em 
coluna, dentre eles os mais utilizados estão: cromatografia líquida de alta eficiência 
(CLAE), gasosa (CG), enquanto que na planar estão inclusos os métodos de 
cromatografia em camada delgada (CCD), em papel (CP) e eletrocromatografia. 
 
 
 
 
 
129 
• Classificação por fase móvel e estacionária pode ser apresentada por 
três categorias: cromatografia líquida, gasosa e com fluido supercrítico. 
Na cromatografia líquida a fase móvel é líquida e os métodos utilizados 
podem ser: líquido-líquido ou de partição onde o líquido é adsorvido em um sólido 
com a partição entre os líquidos de forma imiscível; fase líquida - ligado onde as 
espécies orgânicas estão ligadas a uma superfície sólida, com partição entre 
líquidos e superfície ligada; líquido-sólido ou adsorção com a fase estacionário 
sólido e equilibrado por adsorção; por troca iônica com a fase estacionária com 
resina de troca-iônica equilibrada pela troca-iônica e por exclusão de tamanho, onde 
a fase estacionária utiliza líquido em interstícios de sólido polimérico, equilibrada por 
partição e ou filtração. 
 
Quadro 12 – Classificação de métodos cromatográficos 
 
Tipo de Cromatografia Fase 
Móvel 
Fase 
Estacionária 
Processo de 
Distribuição 
Cromatografia de papel L L Partilha 
Cromatografia gás-líquido 
(GLC) 
G L Partilha 
Cromatografia Líquida (CL - 
coluna) 
L L Partilha 
Cromatografia de adsorção 
(coluna) 
L S Adsorção 
Cromatografia em camada 
fina (TLC) 
L S Adsorção 
 
 
 
 
 
130 
Cromatografia gás-sólido 
(GSC) 
G S Adsorção 
Cromatografia de permuta 
iônica 
L S Reação química 
reversível 
Cromatografia de permeação 
em gel 
L S Crivagem molecular 
L = líquido G = gás S= sólido 
 
 
Em cromatografia gasosa a fase móvel é gás e os métodos usados podem 
ser: gás-líquido, com fase estacionária com líquido adsorvido em um sólido, 
equilibrada por uma partição gás e líquido; fase gás-ligado com fase estacionária 
com espécies orgânicas ligadas a uma superfície sólida e com partição entre 
líquidos e superfície ligada; e gás-sólido, com fase estacionária sólida e equilibrada 
por adsorção. 
Na cromatografia com fluido supercrítico a fase móvel é um fluido 
supercrítico com fase estacionária com espécies orgânicas ligada a uma superfície 
sólida equilibrada por partição entre fluido supercrítico e superfície ligada. 
Para que ocorra eluição cromatográfica em colunas, o eluente é adicionado 
como fase móvel forçando o solvente que contém parte da amostra, a descer pela 
coluna onde partições entre a fase móvel e porções ainda não usadas na fase 
estacionária. Com adições contínuas do solvente as moléculas do soluto são 
carregadas coluna abaixo entre as fases estacionária e móvel. 
O isolamento das espécies separadas ocorre passando-se uma quantidade 
suficiente de fase móvel pela coluna provocando o aparecimento de zonas 
individuais, que ao saírem pela extremidade podem ser detectadas ou coletadas. A 
diluição da amostra em geral acompanha as separações, e por isso os detectores 
 
 
 
 
 
131 
 
para amostras separadas devem ser sensíveis em função do processo de separação 
sofrido durante a eluição1. 
O gráfico gerado a partir da detecção do soluto, com uma série de picos é 
chamado de cromatograma e é utilizado nas análises quantitativas e qualitativas. As 
posições dos picos no eixo do tempo podem identificar os componentes da amostra 
e as áreas abaixo dos picos dão uma medida quantitativa de cada componente da 
amostra. O tempo que decorre após a injeção da amostra e que o pico do analito 
demora em atingir o detector é tido como: tempo de retenção (tR). 
Normalmente, a amostra ou fase móvel contém uma espécie que não fica 
retida, se não houver uma dessas espécies na amostra poderá ser adicionada para 
auxiliar na identificação do pico. O tempo morto (tM) é o tempo que a espécie não-
retida demora para alcançar o detector. 
A velocidade relativa onde duas espécies eluem demonstram a eficiência da 
coluna cromatográfica. Em medidas quantitativas de eficiência de uma coluna a 
altura equivalente a um prato teórico, H e o número de pratos teóricos, N são termos 
utilizados e está relacionado com a equação 4.1 onde L é o comprimento (cm) da 
coluna empacotada. 
N = L/H(4.1) 
Portanto, a eficiência da coluna cromatográfica aumenta enquanto o número 
de pratos aumenta e a altura diminui. Sendo que, a eficiência em termos de número 
de pratos varia de algumas centenas a milhares e as alturas dos pratos variam entre 
poucos décimos a um milésimo de centímetro. O prato teórico explica a forma 
gaussiana dos picos cromatográficos e suas velocidades de movimento coluna 
abaixo. 
Então, a eficiência da separação cromatográfica vai depender das 
velocidades relativas de eluição e dos respectivos coeficientes de partição, para que 
os picos cromatográficos não se alarguem demonstrando uma diminuição da 
 
1 Entrar no site: http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromoper.html e ver 
exemplos de colunas cromatográficas, e animação sobre a separação cromatográfica. 
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromoper.html
 
 
 
 
 
132 
eficiência de separação devido o tempo de eluição. No quadro 13 temos a descrição 
de algumas variáveis que podem afetar a eficiência de uma coluna cromatográfica. 
 
Quadros 13 – Variáveis que afetam a eficiência de uma coluna 
cromatográfica 
 
Variável Símbolo e 
Unidades 
Coeficiente de difusão (fase móvel) * DM (cm2.s-1) 
Coeficiente de difusão (fase estacionária) * DE (cm2.s-1) 
Diâmetro da partícula (fase estacionária) dP (cm) 
Espessura da camada de líquido que recobre a fase 
estacionária 
dF (cm) 
Fator de retenção k’ (adimensional) 
Velocidade linear (fase móvel) μ (cm.s-1) 
* com o aumento da temperatura e com a diminuição da viscosidade estas variáveis podem 
aumentar. 
 
 
Dentre as variáveis que afetam a eficiência da coluna, algumas são 
controláveis como o diâmetro das partículas da fase estacionária e o diâmetro da 
coluna. Um exemplo é o das fases estacionárias líquidas, onde a espessura da 
camada líquida adsorvida deve ser minimizada, pois a CE na equação 4.2 é 
proporcional ao quadrado da variável df da equação de transferência de massa para 
 
 
 
 
 
133 
e da fase líquida estacionária como descrito na equação 4.3 sendo que esta 
equação tem suas variáveis definidas no quadro 13. 
 
H = A + B/u – Cu 
= A + B/u + (CE + CM)u (4.2) 
Onde H é a altura dos pratos em centímetros, u é a velocidade linear da fase 
móvel em centímetros por segundo e as grandezas A, B e C são coeficientes 
relacionados com os fenômenos de caminhos múltiplos de fluxo, difusão longitudinal 
e transferência de massa entre fases. 
 
CEu = fE (k’)d2
f u (4.3) 
 DE
 
Para aumentar a resolução de uma coluna cromatográfica pode-se 
incorporar na fase estacionária uma espécie que interaja com um ou mais 
componentes da amostra, porém aumentar o número de pratos na coluna com 
certeza melhora a resolução apesar de ter um custo alto e demandar tempo. São 
diversos os números de grandezas, termos e relações que são utilizadas na 
cromatografia e no quadro 14 estão relacionadas algumas dessas grandezas. 
 
Quadro 14 – Símbolos das relações e grandezas utilizados na cromatografia 
 
Símbolo da grandeza Denominação 
CM, CE Concentração do analito nas fases móvel e estacionária
F Vazão 
 
 
 
 
 
134 
L Comprimento de coluna empacotada 
(tR)A, (tR)B Tempos de retenção, espécies A e B 
(t’R)A Tempo de retenção ajustado, espécie A 
tM Tempo de migração, espécies não retidas 
VE Volume da fase estacionária 
WA, WB Larguras de pico (A e B) 
 
 
A cromatografia é usada para obtenção de dados qualitativos e quantitativos, 
é uma ferramenta importante no reconhecimento da presença ou ausência de 
componentes de misturas com número limitado de espécies possíveis e com 
identidades conhecidas. 
Para confirmação de identidade é requerida a análise espectroscópica ou 
química dos compostos isolados, porém é necessário que haja a separação 
preliminar cromatográfica, sendo assim, a cromatografia é fundamental nas análises 
qualitativas. A análise quantitativa em coluna se baseia na comparação da altura ou 
da área do pico do analito com de um ou mais padrões. 
 Na cromatografia planar a área coberta pela espécie separada é usado 
como parâmetro analítico. O método mais usado em análises cromatográficas 
quantitativas utiliza uma série de soluções-padrão de composições próximas da 
solução desconhecida, o que pode acarretar o erro na análise por incertezas no 
volume da amostra, por exemplo. 
Portanto, para obtenção de uma maior precisão em cromatografia 
quantitativa a utilização de padrões internos, é uma maneira de evitar as incertezas 
introduzidas na injeção da amostra. Na utilização do padrão interno, uma pequena 
quantidade da amostra padrão é introduzida na amostra a ser analisada e em cada 
 
 
 
 
 
135 
padrão, e a razão entre as áreas do pico analito e do pico do padrão interno é tido 
como parâmetro analítico. A largura do pico representa uma boa medida da 
eficiência da coluna o que permite uma comparação entre colunas. Na figura 22 são 
descritos os vários tipos de cromatografia, com seus critérios de classificação mais 
usuais. 
 
4.1 - Cromatografia Gasosa 
 
Na cromatografia gasosa (CG) que foi inicialmente chamada de 
cromatografia gás-líquido (CGL), a amostra é transportada por uma corrente de gás 
por meio de uma coluna empacotada com um sólido inerte recoberta com uma 
película de um líquido. 
Por ser relativamente simples, ser sensível e efetivo para separar os 
componentes de misturas, a cromatografia gasosa é uma das ferramentas mais 
importantes em química. É amplamente usada em análises quantitativas e 
qualitativas de espécies químicas e para determinar constantes termoquímicas tais 
como calores de solução e vaporização, pressão de vapor e coeficientes de 
atividade. 
A cromatografia gasosa também é utilizada para monitorar diversos 
processos industriais de forma automática: analisando as correntes de gás em 
períodos predeterminados e realizando reações de forma manual ou automática 
para compensar variações não desejadas. 
Há dois tipos de cromatografia gasosa: cromatografia Gás - Sólido (CGS) e 
cromatografia Gás - Líquida (CGL). A cromatografia CGS se baseia na base sólida 
estacionária, onde a retenção das substâncias analisáveis é a consequência da 
absorção física. A cromatografia CGL é útil para separar íons ou moléculas 
dissolvidas em um solvente. 
 
 
 
 
 
 
 
136 
 
CROMATOGRAFIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 22 – Tipos mais usuais de cromatografia. 
 
 
Onde: CCD = Cromatografia de cada delgada (HPTLC= Cromatografia de 
alta performance de camada fina/ TLC= Cromatografia de capa fina); CP= 
cromatografia em papel; CGFL= cromatografia gasosa de fase ligada; CGS= 
cromatografia gás-sólido; CGL= cromatografia gás-líquido; CSFL= cromatografia 
líquida de fluido supercrítico; CSS= cromatografia sólida de fluido supercrítico; CLL= 
cromatografia líquido-líquido; CLS= cromatografia líquido-sólido; CE= cromatografia 
eletroforese capilar; CLFL= cromatografia líquida com fase ligada; CTI= 
cromatografia de troca iônica e CB= cromatografia de bioafinidade. 
 HPLC - Fase normal 
Analítica: 2-5mm 
Preparativa: 5- 30mm 
Microdiâmetro:137 
Quando a solução da amostra estiver em contato com um segundo sólido ou 
fase líquida, os diferentes solutos interagem com a outra fase em diferentes graus, 
de acordo com as diferenças de adsorção, intercâmbio de íons, partição, ou 
tamanho. Estas diferenças permitem que os componentes da mistura se separem 
usando estas diferenças para determinar o tempo de retenção dos solutos por meio 
da coluna. 
Diversas análises de rotina são realizadas em um curto espaço de tempo 
utilizando a cromatografia gasosa, como: na análise de contaminantes do ar, álcool 
no sangue, óleos essenciais e produtos alimentícios e em exames sanguíneos, é 
possível detectar com uma pequena amostra porcentagens de oxigênio, monóxido 
de carbono entre outros. 
Este método consiste primeiramente na introdução da amostra em uma 
corrente de gás inerte, normalmente hidrogênio, hélio, nitrogênio ou argônio, que 
atuarão como gás de arraste. As amostras líquidas vaporizam-se antes da injeção 
no gás de arraste. O fluxo de gás passa pela coluna empacotada por onde os 
componentes da amostra se deslocam a velocidades influenciadas pelo grau de 
interação de cada componente com a fase estacionária não volátil. 
As substâncias que têm a maior interação com a fase estacionária são 
retidas por mais tempo e, portanto, separadas daquelas de menor interação. À 
medida que as substâncias eluem da coluna podem ser quantificadas por um 
detector, por exemplo, ou então podem ser re-analisadas. 
 
4.1.1 – Gás de Arraste 
 
A escolha do gás de arraste depende do tipo de detector que é utilizado e 
dos componentes que serão determinados. Os gases de arraste devem ser de alta 
pureza e quimicamente inertes, por exemplo, hélio (He), argônio (Ar), nitrogênio (N2) 
e hidrogênio (H2). O sistema do gás de arraste pode conter um filtro molecular para a 
remoção de água e outras impurezas. 
 
 
 
 
 
138 
Os sistemas de injeção mais comuns para a introdução de amostras de gás 
são válvulas para amostragem e seringa. As amostras gasosas e líquidas podem ser 
injetadas com uma seringa. Na forma mais usual a amostra é injetada primeiro em 
uma câmara aquecida, onde se evapora antes de ser transferida para a coluna. 
Quando são utilizadas colunas empacotadas, a primeira parte da coluna, em 
geral, serve como câmara de injeção, aquecida separadamente a uma temperatura 
adequada. No caso de se usar colunas capilares utiliza-se uma câmara de injeção 
separada onde somente uma pequena parte da amostra vaporizada/gasosa é 
transferida à coluna, este método é conhecido como split-injection. E é necessário 
para que a coluna não seja sobrecarregada com o volume de amostra. 
As vazões em geral, são controladas por um regulador de pressão de dois 
estágios no cilindro de gás e por algum tipo de regulador de pressão ou de fluxo 
montado no cromatógrafo. Um rotâmetro no topo da coluna pode estabilizar as 
vazões, porém este dispositivo não é tão preciso quanto um medidor de bolhas de 
sabão simples localizado no final da coluna. Em um medidor de bolhas de sabão, um 
filme de sabão é formado no caminho do gás quando um bulbo de borracha onde 
tem uma solução aquosa de sabão é espremido. 
O tempo para que este filme se mova é medido e convertido em vazão 
volumétrica e nos equipamentos atuais, pode ser medido por equipamentos 
eletrônicos de vazão controlados por computador (Figura 23). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
139 
 
 
 
 
Figura 23 – Esquema de um cromatógrafo a gás. 
 
 
Ao encontrar traços da amostra, a injeção chamada on-column-injection 
pode ser usada para CG capilar, nesse método a amostra líquida é injetada 
diretamente na coluna com uma seringa. O solvente é evaporado para produzir a 
concentração dos componentes da amostra. Quando a amostra é gasosa, a 
concentração é efetuada por meio do método criogênico. 
Nesse método os componentes da amostra se concentram e separam da 
matriz por condensação em uma câmara de esfriamento antes da separação 
cromatográfica. Porém, a injeção com válvulas de amostragem e Loop muitas vezes 
é a forma escolhida para o controle de processos, onde as amostras gasosas ou 
líquidas fluem continuamente por meio de uma espiral. 
A espiral da amostra enche em posição off-line com uma seringa ou uma 
bomba automática. Portanto, o loop é conectado em série com a coluna e a amostra 
é transferida ao gás de arraste. Para usar este método é necessário concentrar a 
amostra, em alguns casos. 
Gás 
Controlador 
de vazão Injetor 
Analisador 
de dados 
Forno da coluna 
coluna 
Medidor de bolhas 
de sabão 
 
 
 
 
 
140 
4.1.2 – Detector por ionização de chama 
 
Um detector de ionização de chama DIC (FID – flame ionization detector) é 
composto por uma chama de hidrogênio (H2) e ar, e um prato coletor. O efluente 
passa da coluna do CG por meio da chama, a qual divide em moléculas orgânicas e 
produz íons. Um eletrodo negativo recolhe os íons e produzem um sinal elétrico. A 
sensibilidade do detector de ionização de chama é alta e com uma faixa dinâmica 
grande. Sua desvantagem principal é que destrói a amostra. Os detectores por 
ionização de chama são usados para detectar hidrocarbonetos (HC) como o etano 
(C2H6), metano (CH4), entre outros. 
Para ser analisada a amostra mistura-se com hidrogênio (H2), hidrogênio 
mais hélio (He) ou hidrogênio mais nitrogênio (N2). Os íons e elétrons que se 
formaram na chama ficam presos em um eletrodo coletor permitindo que uma 
corrente flua no circuito externo. A corrente é proporcional aos íons formados, o que 
depende da concentração de hidrocarbonetos nos gases sendo então, detectada por 
um eletrômetro e apresentado na saída análoga. O DIC oferece uma leitura rápida, 
precisa e contínua da concentração total de hidrocarbonetos para níveis tão baixos 
como ppb (parte por bilhão). 
Este tipo de detector responde ao número de átomos de carbono que entram 
no detector por unidade de tempo e por isso é sensível à massa e não concentração 
da mesma. É utilizado para análises de diversas amostras orgânicas, na detecção 
de poluentes em amostras de águas naturais, tendo uma alta sensibilidade, um largo 
intervalo de resposta linear e um baixo nível de ruído. 
 
4.1.3 - Detector fotométrico de chama 
 
O detector fotométrico de chama (FPD) permite medições sensíveis e 
seletivas de enxofre volátil e de compostos de fósforo. Por meio da formação de 
 
 
 
 
 
141 
 
espécies de enxofre excitado (S2*)2 em uma chama, ocorre o princípio de detecção. 
Um tubo fotomultiplicador é usado para medir a emissão de quimiluminescência 
característica dessas espécies. 
O filtro óptico pode ser trocado para possibilitar ao fotomultiplicador 
visualizar luz de 394 nm para a medição de enxofre ou 526 nm para fósforo. A 
resposta do detector ao fósforo é linear, e a resposta ao enxofre depende da 
concentração. São empregados filtros para isolar as bandas e as intensidades que 
são registradas fotometricamente. 
Tem sido utilizado para análises de produtos da hidrogenação de carvão, 
poluentes do ar e água, e de pesticidas. 
 
4.1.4 – Outros detectores 
 
Os detectores de condutividade térmica DCT (TCD – thermal conductivity 
detector) foram um dos primeiros detectores usados na cromatografia gasosa, se 
baseia na variação de condutividade térmica de uma corrente gasosa que transporta 
as moléculas do analito. 
O elemento aquecido pode ser um fio fino de platina, tungstênio ou um 
termistor semicondutor, a resistência desse fio irá fornecer uma medida de 
condutividade do gás. 
A vantagem deste tipo de detector esta na simplicidade, um grande faixa 
dinâmica linear, uma resposta geral tanto a espécies orgânicas como inorgânicas e 
por não destruir a amostra, o que permite que após a detecção haja coleta dos 
solutos. Porém é menos sensível o que impede seu uso em colunas capilares por 
terem amostrasmuito pequenas acomodadas neste tipo de coluna. 
O detector de captura de elétrons DCE (ECD – electron-capture detector) é 
muito utilizado para análises de amostras ambientais, pois é capaz de detectar 
 
2 *N2 como gás de fase móvel. 
 
 
 
 
 
 
142 
seletivamente halogênios contidos em compostos como pesticidas e bifenilas 
policloradas. É seletivo na resposta, sendo muito sensível a moléculas que 
contenham grupos funcionais eletronegativos como peróxidos, quinonas, entre 
outros. Não é sensível a grupos funcionais como aminas, álcoois e hidrocarbonetos. 
Há também o detector de emissão atômica DEA (AED – atomic emission 
detector), onde o eluente é introduzido em um plasma de hélio energizado por 
microondas que fica acoplado a um espectrômetro de emissão ótica com um 
conjunto de diodos. 
E ainda, os detectores termoiônicos que são seletivos com relação a 
compostos orgânicos que contenham fósforo e nitrogênio. O que faz com que seja 
útil para detecção e determinação de muitos pesticidas fosforados. 
 
4.1.5 – Colunas para cromatografia gasosa 
 
As colunas podem ser do tipo tubulares abertas ou capilares, e 
empacotadas. As tubulares podem ser abertas com parede revestida que são tubos 
capilares recobertos com uma fina camada de fase estacionária, ou aberta com 
suporte recoberto com a superfície interna do capilar coberta por um filme fino de um 
material suporte. No tipo empacotada, os tubos são empacotados com fase 
estacionária de material uniforme, finamente dividida ou, com suporte sólido 
recoberto com uma fina camada de fase líquida estacionária. O suporte sólido de 
uma coluna empacotada tem como papel manter a fase estacionária líquida no lugar 
para que uma área suficientemente grande seja exposta à fase móvel. 
A fase líquida imobilizada em uma coluna de cromatografia gás-líquido 
precisa abranger as propriedades como: baixa volatilidade; estabilidade térmica; 
inércia química e características de solvente dos solutos. Isto é, o líquido imobilizado 
deve gerar constantes de distribuição diferentes para os solutos diferentes, precisam 
mostrar algum grau de solubilidade com a fase estacionária, e polaridades entre 
soluto e líquido imobilizado. Os álcoois, ácidos e aminas são solutos polares, 
 
 
 
 
 
143 
enquanto que, hidrocarbonetos saturados são apolares e, os éteres, cetonas e 
aldeídos são solutos de polaridade média. A polaridade da fase estacionária deve 
combinar com a dos componentes da amostra a ser analisada (Quadro 15). Diversas 
colunas comerciais já vêm com fases estacionárias com espessura variando entre 
0,1 a 5 μm. O caráter e a capacidade de retenção de uma coluna estão ligados a 
espessura do filme da fase estacionária. 
Na cromatografia gasosa existe um grande número de fases estacionárias 
líquidas e sólidas disponíveis comercialmente, e por isso a natureza da fase 
estacionária é a variável mais importante na otimização da seletividade. As fases 
estacionárias líquidas são as mais empregadas em cromatografia gasosa. Contudo, 
as fases sólidas (carvão ativo, sílica, peneiras moleculares e polímeros porosos) são 
aplicadas para separação de gases e compostos de baixo peso da massa molar. 
 
Quadro 15 – Exemplos de fases estacionárias em cromatografia gás-
líquido 
 
Fase estacionária Temperatura 
Máxima °C 
Aplicações 
Polidimetil-siloxano 350 Fase não-polar: aromáticos 
polinucleares, drogas; esteroides; 
hidrocarbonetos; PCBs 
Poli (fenilmetil)-siloxano 
(50% em fenil) 
250 Drogas; esteroides, glicóis e 
pesticidas 
Poli (dicianoalildimetil)-
siloxano 
240 Ácidos graxos insaturados, ácidos 
livres, álcoois e resinas ácidas 
Poli (trifluorproprildimetil)-
siloxano 
200 Aromáticos clorados, benzenos, 
nitroaromáticos 
 
 
 
 
 
144 
Em colunas empacotadas, o desempenho pode ser afetado pelo diâmetro e 
uniformidade de partículas do recheio e pela carga da fase estacionária. Enquanto 
que, nas colunas capilares, o diâmetro interno da coluna e a espessura do filme da 
fase estacionária são importantes. Pois, quanto menor a espessura da coluna, mais 
eficiente ela será. Porém, as colunas muito estreitas suportam pouca fase 
estacionária, o que diminui a sua seletividade. As fases estacionárias são as 
mesmas usadas para colunas empacotadas. 
Geralmente, visando minimizar as perdas de fase por volatilização durante o 
uso, a fase estacionária é fixada às paredes do tubo. É possível polimerizar em parte 
a fase imobilizada após a deposição ou então ligá-la quimicamente às paredes (fase 
ligada). A capacidade de processamento de amostra das colunas capilares é menor 
que em colunas empacotadas. 
 
4.1.6 – Aplicações da cromatografia gasosa 
 
A cromatografia gasosa é uma técnica usada principalmente para análises 
quantitativas. Tendo em vista o princípio básico da quantificação que é a área dos 
picos registrados no cromatograma como proporcional à massa do composto 
injetado. Desse modo, é importante para que a análise seja confiável que a área dos 
picos seja medida da maneira mais exata e reprodutível possível. Existem diversas 
maneiras de se medir a área de um pico cromatográfico como: 
• Técnicas manuais: a partir da coleta do cromatograma por um 
registrador analógico, onde a área dos picos é medida manualmente. Em geral 
emprega-se o procedimento baseando na suposição do pico cromatográfico se 
assemelhar a um triângulo isósceles. 
• Integradores eletrônicos: são dispositivos baseados em 
microprocessadores que ao coletar o sinal cromatográfico, o digitalizam, detectam a 
presença de picos e calculam a sua área. Integradores costumam ser muito mais 
precisos e rápidos que qualquer método manual de medida. 
 
 
 
 
 
145 
• Computadores: pode se substituir o integrador por um computador, 
desde que este tenha um dispositivo para converter o sinal elétrico em números que 
possam ser armazenados em memória, e também é necessário dispor de programas 
para fazer a análise do cromatograma digitalizado. 
Todavia, independente do modo usado para medir a área dos picos, o 
procedimento geral de uma análise quantitativa por cromatografia gasosa envolve a 
obtenção do cromatograma da amostra, a medida da área dos picos de interesse e o 
cálculo da massa correspondente a cada um dos picos. A curva de calibração deve 
ser usada para se efetuar o cálculo da massa do composto. Por ser difícil conseguir 
uma boa reprodutibilidade entre injeções diferentes, este cálculo fica muitas vezes 
sujeito à grande imprecisão e inexatidão. 
A padronização interna é usada para contornar este problema, onde a cada 
injeção de solução, adiciona-se uma quantidade exatamente igual de um composto 
que seja separável dos componentes da amostra, e que não exista nela, como uma 
amostra de padrão interno. Portanto para todas as soluções, tanto das amostras 
como dos padrões existirá a mesma massa do padrão interno, e nesse caso, a área 
do seu pico deverá ser a mesma. Assim, o pico pode ser usado para corrigir a área 
dos picos dos constituintes da amostra e dos padrões, eliminando-se, em parte, 
muitas deficiências da injeção. 
Dentre as aplicações em análises de orgânicos e inorgânicos, duas 
aplicações são as que dão a base para todos os tipos de análises possíveis na 
cromatografia gasosa como a realização de separações, que tem uma excelente 
aplicação em sistemas bioquímicos, complexos organometálicos ou orgânicos, com 
espécies voláteis ou de espécies que possam reagir formando produtos voláteis. 
A segunda aplicação é a função de proporcionar os meios para que seja 
realizada uma análise completa, com os tempos e volumes de retenção sendo 
empregados na identificação qualitativa e, as alturas ou áreas de picos fornecendo 
informações quantitativas. 
Os equipamentos de cromatografia gasosa podem ser usados acoplados a 
espectrômetros de massa do setor magnético e de quadrupolos. Quando usados em 
 
 
 
 
 
146 
conjuntos,para a descoberta dos efeitos danosos ao 
homem. Pois, os testes toxicológicos são realizados para caracterizar que tipo de efeito 
tóxico uma substância química produz em um organismo vivo e assim mostrar como 
precaver ou tratar uma intoxicação. 
 
1.4.1 - Informações preliminares 
 
 
 
 
 
16 
 
 
 
O objetivo das informações preliminares é conhecer a substância que será 
submetida aos estudos de toxicidade. Já que a toxicidade está ligada a sua estrutura 
química é necessário que a substância em estudo seja quimicamente caracterizada. Se 
houver impurezas, as mesmas devem ser conhecidas quantitativamente e 
qualitativamente, pois podem alterar a toxicidade da substância em estudo. 
Principalmente, porque o efeito tóxico em muitos casos é ocasionado devido às 
impurezas e não à substância em teste. 
Para a aplicação dos testes toxicológicos, devem ser definidas as propriedades 
físico-químicas, pois delas vai depender o tratamento a ser dado à substância. O 
conhecimento do odor, cor, pontos de fusão e ebulição, pressão de vapor, densidade, 
viscosidade, solubilidade e volatilidade são fundamentais, pois servirão para orientar que 
solventes serão usados para a dissolução da amostra, a via de administração entre 
outros. 
 
1.4.2 - Estudos de toxicidade aguda 
 
Neste estudo, a toxicidade aguda é caracterizada pela administração ou 
exposição da substância química numa dose única (ou múltipla num espaço de 24 horas), 
onde os efeitos adversos ocorridos nesse intervalo de tempo são analisados. A dose 
única é utilizada para determinar-se a potência da droga em casos de ingestão ou 
envenenamento acidental, e as doses múltiplas são usadas para avaliarem-se os efeitos 
cumulativos. 
A DL50 (e CL50) é a prova mais comum de toxicidade aguda. Os estudos de 
toxicidade aguda têm por objetivo caracterizar a relação dose/resposta que conduz ao 
cálculo da DL50. Este parâmetro que representa a probabilidade estatística de uma dose 
causar efeito letal em 50% dos animais de uma população é útil para identificar a 
toxicidade relativa da substância. A CL50 (concentração letal média) é utilizada para testes 
de letalidade no caso de inalação ou para peixes no meio aquático. Na figura 2 os grupos 
 
 
 
 
 
receberam baixas doses não se observando mortes, se fossem doses intermediárias 
parte do grupo morreria e se em altas doses todos os animais do grupo morreriam. A 
curva sigmoide apresentada na figura 3 se torna linear entre 16% e 84%, e então é 
possível obter o ponto médio que é a DL50. 
Os principais objetivos deste estudo são: 
• Avaliar a toxicidade do agente tóxico (xenobiótico) ou substância química; 
• Avaliar a suscetibilidade das espécies; 
• Identificar órgãos alvo; 
• Fornecer informações para o planejamento de quantidades necessárias das 
doses para estudos mais prolongados como, no estudo de toxicidade crônica. 
 
 
 
 
Figura 2 Figura 3 
Figura 2 – Dose resposta em teste de toxicidade. 
Figura 3 – Log dose/resposta em teste de toxicidade. 
De acordo com os resultados obtidos a partir dos estudos de toxicidade aguda o 
mecanismo de ação da substância, a identificação de possíveis órgãos ou sistemas 
17 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
 
sensíveis e a determinação dos efeitos serem ou não reversíveis, passam a serem 
conhecidos. 
É fundamental nessa avaliação verificar não apenas a quantidade de animais 
mortos, mas também o início, a natureza e a duração da intoxicação associada à morte. 
Além das observações clínicas, os exames anatomopatológicos que auxiliam na 
caracterização de tecidos e órgãos alvos, devem estar inclusos. 
Diferentes espécies e linhagens de animais de ambos os sexos, devem fazer 
parte nos estudos em que as substâncias são testadas, pois as diferenças de resposta 
indicam que o efeito tóxico não é sempre o mesmo e que a extrapolação para o homem 
deve ser feita considerando-se essas diferenças. 
 
1.4.3 - Estudos de toxicidade subcrônica 
 
Neste estudo o tempo de exposição é de 1 a 3 meses. As doses experimentais 
são divididas em três: mínima, intermediária e máxima. Sendo que a dose máxima não 
deve produzir um índice de letalidade acima de 10% (para que as avaliações 
histopatológicas e bioquímicas não sejam inviabilizadas). Os objetivos principais deste 
estudo são: 
 
• Estabelecer os níveis nos quais não se observam os efeitos tóxicos; 
• Estudar os órgãos alvos e determinar aqueles com mais suscetibilidade; 
• Fornecer dados sobre as doses para os estudos de toxicidade crônica. 
 
Estes testes são realizados para se obterem informações sobre a toxicidade das 
substâncias químicas após exposições repetidas. A importância deste teste se dá porque, 
às vezes, é o primeiro e o único teste com doses repetidas a ser realizado para 
determinadas substâncias químicas. Outro fator importante é o exame dos efeitos após o 
período de tratamento e se a determinação deste efeito é devido a um acúmulo da 
 
 
 
 
 
19 
 
 
substância ou não. Outro aspecto importante é o de estabelecer se os efeitos tóxicos são 
reversíveis, determinando-se assim se o período de observação pós-tratamento é 
necessário ou não. 
Em geral a via de administração é a oral, porém as outras eventuais vias de 
exposições humanas devem ser consideradas. Pelo menos duas espécies animais, sendo 
uma não-roedora, devem ser estudadas com a utilização de pelo menos três doses. 
As manifestações de sinais de toxicidade devem ser verificadas, com exames nos 
animais, pelo menos uma vez ao dia durante todo o experimento. Em geral verificam-se 
modificações no consumo de ração, de peso, modificações na cor e textura dos pêlos, 
alterações circulatórias e respiratórias, anormalidades motoras e de comportamento e 
aumentos macroscópicos de massas de tecidos. Sempre deverão incluir um grupo de 
controle negativo, que será tratado da mesma maneira que o grupo teste, sem o agente 
em teste. 
No final do experimento, os animais sobreviventes serão sacrificados e terão seus 
órgãos retirados para avaliação anatomopatológica. As avaliações hematológicas e 
bioquímicas no sangue (balanço eletrolítico, proteína, ureia, creatinina) costumam ser 
realizadas no final, podendo também ser feitas antes do início e no meio do ensaio. Os 
exames de urina são também recomendados no início, meio e término do experimento. 
Os estudos de toxicidade subcrônica além de caracterizar a relação 
dose/resposta após administrações repetidas, também fornecem dados para escolha de 
doses nos estudos de exposição crônica. 
 
1.4.4 - Estudos de toxicidade crônica 
 
O estudo da toxicidade subcrônica com dados histopatológicos e estudos 
toxicocinéticos precisos podem auxiliar no fornecimento de valiosos subsídios sobre os 
efeitos tóxicos de determinadas substâncias químicas, porém existem várias limitações. 
Por exemplo, os testes subcrônicos não são testes seguros para prever efeitos 
mutagênicos, carcinogênicos ou teratogênicos. 
 
 
 
 
 
20 
 
 
O período de exposição em um estudo de toxicidade crônica é de 2 anos ou 
quase toda a vida do animal (ex.: camundongo vive de 2 a 3 anos). Como no teste 
subcrônico, este também não procura letalidade e utiliza 3 níveis de dose pela via de 
administração de acordo com a via de uso prescrita. 
Para este teste, o protocolo experimental compreende as observações e 
alterações especificadas no estudo de toxicidade subcrônica com adição de outros 
parâmetros bioquímicos que possibilitam uma melhor avaliação de todos os órgãos e 
funções, com um maior enfoque na função renal e hepática. Os principais objetivos deste 
estudo são: 
• Verificar as concentrações/doses máximas das substâncias que não produzem 
efeitos perceptíveis de doença, se administradas durante a maior parte da vida do animal; 
• Verificar os efeitos tóxicos que não são relacionados aos estudos de toxicidade 
subcrônica; 
• Determinação do mecanismo de ação tóxica das substâncias químicaso equipamento de CG/MS é útil para identificar centenas de componentes 
que constituem sistemas naturais e biológicos. Por exemplo, podem caracterizar 
componentes que dão sabor aos alimentos, identificar poluentes na água, 
diagnósticos médicos baseados em compostos do ar expirado, entre outros. 
Quando os equipamentos de cromatografia gasosa são acoplados a 
espectrometria no infravermelho com transformada de Fourier, um meio eficiente de 
separar e identificar os componentes de misturas complexas é habilitado. Os dados 
espectroscópicos são digitalizados, armazenados em um computador para posterior 
impressão. Os espectros gasosos têm estrutura rotacional fina, ausentes em 
espectros de sólidos e líquidos, fornecendo aspectos diferentes, entre espectros de 
fase gasosa e de fase líquida. 
Os equipamentos de cromatografia gás-sólido se baseiam na adsorção de 
substâncias gasosas sobre superfícies sólidas, sendo útil para a separação de 
espécies que não ficam retidas por coluna de gás - líquido, como componentes do 
ar, sulfeto de hidrogênio, monóxido de carbono, entre outros. 
 
4.2 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
 
A cromatografia líquida de alta eficiência é nos dias de hoje, a técnica 
analítica de separação mais utilizada, por ser um método muito sensível capaz de 
determinações quantitativas, adequado para separações de espécies não-voláteis, 
espécies termicamente frágeis e por ser aplicável a diversas substâncias de 
interesse para a indústria, medicina, ciência, entre outros. Os materiais que podem 
ser analisados por este método são diversos, e entre estes estão: as proteínas, 
ácidos nucleicos, hidrocarbonetos, drogas, pesticidas, antibióticos, várias 
substâncias inorgânicas. 
A eficiência da coluna em cromatografia líquida de alta eficiência esta 
relacionada com as variáveis descritas no quadro 13, e os efeitos do tamanho de 
uma partícula da fase estacionária e o alargamento de banda extracoluna são itens 
 
 
 
 
 
147 
específicos na cromatografia líquida de alta eficiência que podem acarretar uma 
menor eficiência nas análises realizadas por esse método. 
Desse modo, sabe-se que o tamanho da partícula que faz parte da fase 
estacionária é muito importante, pois a eficiência de uma coluna de CLAE aumenta 
conforme o tamanho da partícula diminui. O alargamento de banda extracoluna 
ocorre enquanto o soluto é carregado por meio de tubos abertos como os do sistema 
de injeção, da região do detector e da tubulação de conexão dos vários 
componentes do sistema. Este alargamento ocorre a partir da diferença de 
velocidade do fluido entre as camadas de líquido junto à parede e as camadas do 
centro do tubo. 
Com isso, a parte central de uma banda do soluto se move com mais 
rapidez do que a parte periférica e devido à difusão em líquidos, ser mais lenta, este 
tipo de alargamento acaba sendo observável. Para que este problema seja 
minimizado, costuma-se diminuir o raio dos componentes extracoluna para 2,5 mm 
ou menos. 
Na cromatografia líquida de alta eficiência se requer pressões de 
bombeamento de vários milhares de libras por polegada quadrada (psi), e por esse 
motivo, o equipamento necessário para CLAE é mais sofisticado e caro do que os 
utilizados em outros tipos de cromatografia. Na figura 24 temos um esquema dos 
componentes importantes em um equipamento de cromatografia líquida de alta 
eficiência. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Solvente 
Injetor 
Coluna 
Fase móvel bomba 
detector 
interface 
seringa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 24 – Componentes de um equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência. 
 
 
4.2.1 – Equipamentos importantes na cromatografia líquida de alta 
eficiência 
 
Os equipamentos atuais de cromatografia líquida de alta eficiência têm como 
um de seus dispositivos reservatórios de vidro ou aço inoxidável, de 200 a 1.000 mL 
de solvente. São equipados com um meio de remoção dos gases dissolvidos 
(oxigênio e nitrogênio) que interferem formando bolhas na coluna e nos sistemas de 
detecção. Os solventes utilizados para cromatografia líquida devem ser de alta 
pureza, pois, influenciam na separação cromatográfica. Podem ser utilizados na 
técnica, solventes aquosos ou orgânicos bastando, que estes tenham os seguintes 
requisitos: 
 
148 
 
 
 
 
 
149 
• Ser compatível com o detector que se deseja operar. 
• Ter capacidade de solubilizar a amostra totalmente. 
• Possuir baixa viscosidade, pois, trabalhará em alta pressão. 
• Não alterar as características de separação da fase estacionária da 
coluna. 
• Ser seguro para manuseá-lo e viável. 
• Não ser muito volátil, possuir um ponto de ebulição adequado para se 
trabalhar. 
• Ter elevado grau de pureza, pois, a detecção de um componente 
poderá ser afetada. 
• Não decompor a fase estacionária. 
• Possuir polaridade adequada para permitir a separação dos 
componentes da amostra. 
A mistura de solventes deve ser feita com líquidos que sejam miscíveis. Um 
teste, com uma pequena quantidade da mistura, deverá ser realizado, para evitar o 
desperdício. A compressibilidade afeta a exatidão absoluta das bombas e os seus 
níveis de pulsação. A preparação da fase móvel é muito importante. O volume de 
cada solvente deve ser medido numa proveta, separadamente. Devem ser 
adicionados no frasco lentamente para evitar que a quantidade de gases dissolvidos 
seja maior e assim, causa problemas no bombeamento. Todo o solvente utilizado na 
cromatografia líquida deve ser filtrado com membranas de 0,2 a 0,45 μm de 
porosidade, para evitar que obstrua o sistema e o danifique. 
No frasco reservatório do solvente deve-se utilizar um filtro poroso de 10 μm. 
Uma medida usada para aumentar a reprodutibilidade e a estabilidade do detector, é 
desgasificar a fase móvel por meio do borbulhamento com o gás hélio ou de um 
sistema a vácuo. Por vezes, os sistemas também contêm um meio de filtrar poeiras 
e material particulado dos solventes, evitando assim que ocorram danos aos 
sistemas de bombeamento e de injeção. Nem sempre é preciso que exista um 
 
 
 
 
 
150 
sistema para resolver esse problema, pois o solvente pode ser tratado antes de ir 
para o reservatório, passando-os por um filtro sob vácuo, por exemplo. 
Aditivos, como antioxidantes, também são usados para a preservação da 
fase móvel, por exemplo, pode ser usada uma pequena quantidade de BHT (di-terc-
butil metil fenol) no tetrahidrofurano, para evitar a formação de peróxidos. Quando é 
empregado um único solvente de composição constante, a separação é chamada de 
eluição isocrática. 
A limitação deste sistema, é que em algumas amostras mais complexas, não 
é possível separar todos os seus componentes devido à polaridade do solvente da 
fase móvel também permanecer constante. A resolução neste caso é pequena, e os 
picos eluem muito rápido. 
Quando se almeja que a eficiência da separação seja aumentada pela 
eluição do gradiente, são utilizados dois ou três sistemas de solventes, que diferem 
entre si em polaridade. O solvente usado para fase reversa tem polaridade maior 
que a fase estacionária e na fase normal, a polaridade da fase estacionária é maior 
que a do solvente. A composição da fase móvel varia ao longo de toda análise. É 
muito útil para a separação de amostras complexas ou quando as polaridades dos 
compostos, a separar são muito diferentes. 
A polaridade modificada, devido à força do solvente, faz com que a coluna 
seja limpa durante a corrida. A vazão do solvente é muito importante na 
cromatografia líquida, pois esta deverá ser muito estável, para não afetar a 
separação dos componentes na coluna. Normalmente esta vazão é de 1 mL/min. 
O sistema de bombeamento deve seguir requisitos como: geração de 
pressões de até 6.000 psi; saída com ausência de pulsos; velocidades de fluxo 
variando de 0,1 a 10 mL/min; controle de fluxo; componentes resistentes à corrosão(aço inoxidável ou teflon). Existem três tipos de bombas atualmente, as recíprocas, 
as do tipo deslocamento ou de seringa e bombas de pressão constantes ou 
pneumáticas. As mais utilizadas são as recíprocas que são compostas por uma 
pequena câmara onde o solvente é bombeado por meio de um movimento para trás 
e para frente de um pistão controlado por um motor. Onde duas válvulas de esfera 
 
 
 
 
 
151 
se abrem e fecham de forma alternada, controlando o fluxo de solvente para dentro 
e fora de um cilindro. 
A desvantagem deste tipo de bomba reside no fato de que produz um fluxo 
pulsado que deve ser amortecido, pois, apresenta-se como um ruído de fundo, na 
linha de base do cromatograma. Porém, por terem um volume interno pequeno e 
gerarem altas pressões de saída (até 10.000 psi), aliado a fácil adaptabilidade à 
eluição com gradiente e vazões constantes, que são independentes da pressão de 
retorno da coluna e da viscosidade do solvente, são as mais utilizadas em CLAE. 
Alguns sistemas de bombeamento possuem dispositivos controlados por 
computador para a medida de vazão com a determinação da queda de pressão por 
meio de um restritor que fica na saída da bomba, sendo possível alterar a velocidade 
do motor da bomba, quando ocorre uma diferença no sinal comparado a um valor 
preestabelecido. 
A maneira como a amostra é injetada no sistema de injeção do equipamento 
é um fator limitante na precisão das medidas em cromatografia líquida de alta 
eficiência, pois nem sempre a reprodutibilidade de uma amostra introduzida na 
coluna é possível. O meio mais simples de introdução da amostra é a injeção com 
seringa por meio de um septo de elastômero auto-selante. As seringas usadas para 
este fim são projetadas para suportar pressões de até 1.500 psi. 
O método mais utilizado para introduzir amostras em cromatografia líquida 
de alta eficiência se baseia em alças (loop) de amostragem, que em geral fazem 
parte dos equipamentos de cromatografia líquida, com alças intercambiáveis 
possibilitando a escolha de tamanhos de 5 a 500 μL. 
A coluna cromatográfica é a responsável pela separação dos componentes 
de uma amostra. É um tubo de aço com um diâmetro interno, que varia de 4 a 10 
mm e de comprimento com 10 a 30 cm, podendo ser menores de 3 a 7,5 cm. As 
colunas possuem filtros nas suas duas extremidades para protegê-la de substâncias 
que possam danificá-las, e uma seta que indica qual deverá ser o sentido do fluxo 
de operação do solvente ao instalá-la. 
 
 
 
 
 
152 
Costumam ter cerca de 100.000 pratos/metro e apresentam a vantagem de 
serem velozes com um consumo mínimo de solvente. Normalmente usam-se 
colunas menores, pré-colunas, para reter partículas grandes que danificariam a 
coluna. A composição química da amostra é que determina que tipo de fase 
estacionária deva ser usado. O volume de amostra injetada na coluna dependerá da 
quantidade do componente que se deseja analisar e da sensibilidade do detector em 
uso. 
Em alguns casos, utiliza-se mais de uma coluna em série. O diâmetro das 
partículas de empacotamento das colunas é muito importante na separação dos 
componentes de uma amostra, o mais usual é o de 5 μm. Quando uma pré-coluna é 
utilizada antes da coluna analítica, obtêm-se uma durabilidade por remoção do 
material particulado e de contaminantes do solvente. Na cromatografia líquido-
líquido, a pré-coluna auxilia na saturação da fase móvel com a fase estacionária 
minimizando as perdas desse solvente. 
As fases estacionárias (material que preenche as colunas) são compostas 
por dois tipos na cromatografia líquida, que são: pelicular ou de partícula porosa. A 
pelicular é composta por leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com 
diâmetros da ordem de 30 a 40 μm. Uma camada fina e porosa de sílica, alumina, 
resina sintética de poliestireno-divinil-benzeno ou resina trocadora de íons é 
depositada sobre a superfície desses leitos. 
Em algumas aplicações, é adicionada uma fase líquida estacionária mantida 
no local por adsorção, ou os leitos podem ser tratados quimicamente para obter uma 
camada superficial orgânica. As fases estacionárias peliculares são mais utilizadas 
em pré-colunas. 
No caso da fase estacionária de partícula porosa típica para cromatografia 
líquida é composta por micropartículas porosas com diâmetros entre 3 a 10 μm, que 
é constituída por sílica, alumina, resina sintética de poliestireno-divinil-benzeno ou de 
resina de troca iônica. As partículas de sílica são preparadas aglomerando partículas 
submicrométricas em condições que levam a partículas maiores com diâmetros 
 
 
 
 
 
153 
uniformes que são recobertas com filmes orgânicos que são química ou fisicamente 
ligados à superfície. 
Os detectores são os responsáveis pela detecção dos componentes de uma 
amostra durante a sua eluição. Eles medem e indicam a variação da composição da 
fase móvel ao sair da coluna cromatográfica, por meio de um sinal elétrico. Os 
detectores de cromatografia líquida são de dois tipos básicos: detectores de 
propriedades universais ou globais e os detectores de propriedade do soluto. A 
escolha do detector é importante e depende das características do material a ser 
analisado como: sensibilidade, repetibilidade, forma do pico, vazão, temperatura 
entre outros. 
Os detectores de Índice de Refração são considerados detectores 
universais, respondem à maioria dos solutos, são confiáveis e não são afetados pela 
vazão. Porém, são muito sensíveis à temperatura, devendo ser mantidos a uma 
temperatura constante. Não se recomenda usá-los com operação de gradientes, 
porque a variação da composição da fase móvel causa a variação do índice de 
refração. 
Vários detectores de absorbância são dispositivos de feixe duplo onde um 
feixe passa por meio da cela do eluente e o outro por meio de um filtro que reduz a 
sua intensidade. Detectores fotoelétricos germinados são usados para comparar a 
intensidade dos dois feixes. Os detectores de absorbância no ultravioleta com filtros 
mais simples são fotômetros com uma lâmpada de mercúrio como fonte, onde a 
linha intensa em 254 nm é isolada por filtros, porém em alguns equipamentos podem 
absorver em 250, 313, 334 e 365 nm. 
Este tipo de detector limita seu uso a solutos que absorvam num 
comprimento de onda, dentro dos que são possíveis. Quando o equipamento está 
equipado com discos contendo vários filtros, estes podem detectar várias espécies, 
enquanto eluem. Muitos equipamentos de CLAE vêm com detectores compostos por 
um espectrofotômetro de varredura com redes ópticas, onde vários modos de 
operação podem ser escolhidos. Os detectores espectrofotométricos ultravioleta de 
 
 
 
 
 
154 
maior alcance são os equipamentos com arranjo de diodos, pois permitem a coleta 
de dados de um espectro em apenas um segundo. 
Os detectores de fluorescência são similares aos fluorímetros e 
espectrofluorímetros, pois os detectores mais simples nesta modalidade empregam 
uma fonte de excitação de mercúrio e um ou mais filtros para isolar a banda de 
emissão de radiação. É um método sensível, e tem seu uso principalmente em 
produtos que fluorescem como os materiais farmacêuticos, amostras clínicas, 
produtos de petróleo, entre outros. 
Os detectores eletroquímicos se baseiam na amperometria, polarografia, 
coulometria e condutometria. São muito sensíveis, de simples operação e com alta 
aplicabilidade, pois podem detectar inúmeros grupos funcionais, como: 
hidrocarbonetos, ésteres, aldeídos, aminas, hidroxilas aromáticas, 
halogênios, entre outros. Nesse tipo de detecção é possível ter uma configuração 
onde o eluente flui num primeiro momento sobre um eletrodo e depois sobre um 
segundo eletrodo, requerendo assim que o analito sofra uma oxidação (ou redução) 
reversível no primeiro eletrodo. E nesse caso, o segundo eletrodo opera como um 
cátodo (ou um ânodo) para determinar o produto de oxidação(ou redução), e por 
isso, a seletividade desse sistema é muito alta. 
Os detectores de espectrometria de massa mais utilizados atualmente usam 
uma interface chamada termospray, que é um termonebulizador que atua como 
interface, onde o efluente total da coluna é introduzido no detector de forma direta. E 
dessa forma, o líquido é vaporizado à medida que passa por um tubo capilar 
aquecido de aço inoxidável, formando um jato de aerossol de moléculas do solvente 
e do analito. Este analito é ionizado por um mecanismo de troca de carga com um 
sal que é incorporado ao eluente. 
Portanto, o termonebulizador é ao mesmo tempo uma interface e uma fonte 
de ionização. Há equipamentos com interface onde é possível a obtenção de 
espectros por ionização química ou por impacto de elétrons e nesse dispositivo, a 
nebulização térmica e a dessolvatação ocorrem ao mesmo tempo produzindo uma 
mistura de moléculas de soluto particulado e de moléculas da fase móvel gasosa. 
 
 
 
 
 
155 
 
Este aerossol é acelerado por um esguicho para a região do vácuo onde as 
moléculas da fase móvel são bombeadas para fora. O computador armazena os 
dados gerados por esse tipo de detector e os cromatogramas podem ser obtidos 
tanto no momento da análise ou após a mesma. 
 
4.2.2 – Outros tipos de cromatografia líquida de alta eficiência 
 
A cromatografia de partição é utilizada para os quatro tipos de técnicas da 
cromatografia líquida e pode ser subdividida em cromatografia líquido-líquido e de 
fase ligada. As colunas para cromatografia de partição de fase ligada têm os 
suportes preparados com sílica rígida ou com composições baseadas em sílica. Os 
empacotamentos para fase ligada são classificados como sendo de fase reversa 
quando a cobertura ligada tem caráter não polar, e como fase normal quando o 
recobrimento contém grupos funcionais polares. 
Em diversas aplicações da cromatografia em fase reversa, que tem sido a 
mais utilizada na cromatografia líquida de alta eficiência, a eluição é feita com fase 
móvel altamente polar, como uma solução aquosa contendo várias concentrações 
de solventes, como acetonitrila e tetrahidrofurano. Nesse caso é preciso evitar 
valores de pH maiores que 7,5 para que não ocorra a hidrólise dos siloxanos, que 
leva à degradação ou destruição da fase estacionária. 
É preciso que haja um equilíbrio entre as forças intermoleculares3 e os três 
participantes no processo de separação que são o soluto, a fase móvel e a fase 
estacionária, para que a cromatografia seja realizada com sucesso. Portanto, as 
polaridades do soluto, da fase móvel e da fase estacionária devem ser combinadas 
para que boas separações cromatográficas sejam obtidas e em tempo razoável. 
Alguns solventes são chamados de “fortes” por interagirem com os solutos. Diversos 
índices foram definidos para descrever quantativamente a polaridade dos solventes, 
 
3 Leitura adicional sobre forças intermoleculares disponível em: 
http:www.qmc.ufsc.br/química/pages/especiais/revista_especiais_forcas_intermoleculares.html 
 
 
 
 
 
156 
onde o índice de polaridade é uma medida numérica da polaridade relativa dos 
solventes. O quadro 16 descreve os índices de polaridade, refração, ponto de 
ebulição de alguns solventes. E pode-se observar que a água tem um índice de 
polaridade superior a de outros solventes. 
 
Quadro 16 – Exemplos de fase móvel em cromatografia 
 
Solvente Força do 
eluente 
Índice de Polaridade Índice de 
Refração* 
Água Grande 10,2 1,333 
Acetonitrila 0,65 5,8 1,341 
Clorofórmio 0,40 4,1 1,443 
Etanol 0,88 4,3 1,359 
Metanol 0,95 5,1 1,326 
Tetrahidrofurano 0,57 4,0 1,405 
*temperatura em 25 °C. 
 
 
A cromatografia de partição é aplicada em diversos campos como: 
bioquímico (aminoácidos, proteínas, lipídios); clínica médica (ácido de bílis, 
metabólitos de drogas, estrógenos); farmacêutico (antibióticos, esteroides); produtos 
alimentícios (antioxidantes, aditivos); produtos químicos (corantes industriais, 
surfactantes); poluentes (pesticidas, herbicidas) e química forense (drogas tóxicas, 
venenos, narcóticos). Ao utilizar esse tipo de cromatografia é por vezes, 
recomendável converter os componentes de uma amostra a um derivado antes da 
 
 
 
 
 
157 
análise ou dependendo do caso, após a separação cromatográfica. Este tratamento 
é recomendado quando se deseja reduzir a polaridade das espécies para que seja 
possível usar a partição em vez da adsorção ou colunas de troca iônica, para 
aumentar a resposta do detector, a sensibilidade e ainda, aumentar a resposta 
seletiva do detector a certos componentes da amostra. 
Se a cromatografia de par iônico for a escolhida para a separação 
cromatográfica, a fase móvel é composta por um tampão aquoso com um solvente 
orgânico (metanol ou acetonitrila) e um composto iônico que contêm um contra íon 
de carga oposta à do analito. O contra íon é um íon que se combina com o íon do 
analito para formar um par iônico, espécie neutra que é retida na coluna de fase 
reversa. A eluição dos pares iônicos é então acompanhada com uma solução 
aquosa de metanol ou de outro solvente orgânico solúvel em água. 
A cromatografia de pares iônicos é o método de escolha para análises de 
surfactantes (tensoativos), principalmente por terem alta afinidade por trocadores de 
íons, o que dificulta sua eluição. 
A cromatografia de adsorção ou líquido-sólido utiliza como fases 
estacionárias a sílica e alumina. Variações enormes na resolução e nos tempos de 
retenção acompanham as variações no sistema de solvente e muito raramente não 
se obtêm uma fase móvel apropriada. Esse tipo de cromatografia é mais adequado 
para amostras solúveis em solventes aquosos como os usados na fase reversa e 
uma vantagem deste método é sua habilidade em diferenciar componentes de 
misturas isoméricas. 
Os métodos que separam e determinam íons com base em resinas 
trocadoras de íons são também denominados de cromatografia de troca iônica. Os 
processos de troca iônica se baseiam no equilíbrio da troca entre íon em solução e 
íon de mesmo sinal na superfície de um sólido insolúvel com alto peso molecular. As 
argilas e zeólitas são trocadores de íons naturais e são muito utilizadas. Também 
foram desenvolvidas resinas trocadoras sintéticas para amolecer água, deionização 
da água e para purificações de soluções. A fase móvel usada na cromatografia de 
troca iônica deve ter as mesmas propriedades requeridas nos outros tipos de 
 
 
 
 
 
158 
cromatografia, podendo conter quantidades menores de metanol ou outro solvente 
miscível em água. 
Também são compostas por espécies iônicas, em geral um tampão. O tipo e 
a concentração desses ingredientes determinarão a força e seletividade do solvente 
escolhido. Sendo que, geralmente os íons da fase móvel competem com os íons do 
analito pelos sítios ativos da fase estacionária de troca iônica. A aplicação deste tipo 
de cromatografia abrange vários sistemas orgânicos e bioquímicos, incluindo drogas, 
conservantes de alimentos, açucares, entre outros. 
A cromatografia de exclusão de íons mesmo sendo neutra, emprega colunas 
de troca iônica para realizar as separações cromatográficas. É amplamente utilizada 
na identificação e determinação de espécies ácidas como café, leite e vinho. Sais de 
ácidos fracos também podem ser analisados, pois, são convertidos ao ácido 
correspondente por íons hidrogênio no trocador. 
Quando o método é o de cromatografia de exclusão por tamanho (ou 
cromatografia por permeação em gel ou ainda, filtração em gel), aplicável a espécies 
de alto peso molecular. Dois tipos de empacotamento da coluna são descritos como: 
leitos de polímeros e partículas à base de sílica, ambos com diâmetros de 5 a 10 
μm. As colunas empacotadas por partículas à base de sílica oferecem vantagens por 
serem mais rígidas, empacotar mais facilmente e com pressões maiores, commais 
estabilidade, permitindo seu uso com diversos solventes, incluindo água, e também 
por possuir uma maior rapidez para atingir o equilíbrio com novos solventes e por ser 
estável em altas temperaturas. 
 Como desvantagem, as partículas de sílica podem reter solutos por 
adsorção e tem potencial para catalisar a degradação de moléculas do soluto. Além 
de separar moléculas de produtos naturais de alta massa molecular e sais, também 
é possível por meio da permeação por gel separar homólogos e oligômeros, e com 
rapidez na determinação da massa molecular ou da distribuição de massa molecular 
de polímeros maiores ou de produtos naturais. 
A cromatografia planar é baseada em técnicas de camada delgada, por ser 
mais rápida, com melhor resolução, e ser mais sensível que a correspondente em 
 
 
 
 
 
159 
papel. Todavia, estão inclusos na cromatografia em camada delgada (CCD), 
cromatografia de papel (CP) e eletrocromatografia. Cada uma utiliza uma camada 
fina e plana de material que é auto-suportado ou que reveste uma superfície vítrea, 
plástica ou metálica. O deslocamento da fase móvel pela fase estacionária ocorre 
por ação da capilaridade, em alguns casos, auxiliado por potencial elétrico ou 
gravitacional. 
É utilizada com propriedade na indústria de produtos químicos para 
determinações importantes de pureza, tem sido usada também em estudos de 
bioquímica e biologia. Serve como guia para o estabelecimento de condições ótimas 
para a realização de separações por cromatografia líquida em coluna. 
 
4.3 - Eletroforese Capilar e Eletrocromatografia Capilar 
 
Este método de separação que pode ser definido como sendo a migração de 
espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas 
ou suspensas em um eletrólito, por meio do qual uma corrente elétrica é aplicada. É 
empregada para separações analíticas complexas como em ânions, aminoácidos, 
drogas, proteínas, e diversas outras espécies. É uma técnica muito eficiente para 
separar macromoléculas o que é de interesse da indústria biotecnológica, e para a 
biologia e bioquímica. 
Para uma separação eletroforética ocorrer uma pequena quantidade de 
amostra é injetada numa solução tampão aquosa contida em um tubo estreito ou em 
um suporte poroso e plano, como papel ou gel semi-sólido. Aplica-se então, um alto 
potencial de corrente contínua ao longo do comprimento do tampão por meio de um 
par de eletrodos localizados nas extremidades. 
A aplicação desse potencial faz com que os íons da amostra migrem em 
direção a um ou a outro eletrodo. As separações são baseadas nas diferenças das 
relações carga/ tamanho dos analitos da amostra. Se um potencial alto for aplicado 
 
 
 
 
 
160 
por meio de um tubo capilar contendo solução tampão, ocorre um fluxo 
eletroosmótico, onde o solvente migra em direção ao catado ou ao ânodo. 
Para introduzir uma amostra normalmente utiliza-se a injeção eletrocinética 
ou a injeção por pressão. Quando for aplicar a amostra com a injeção eletrocinética, 
uma extremidade do capilar e seu eletrodo são removidos do compartimento do 
tampão e colocados onde contém a amostra. Aplica-se um potencial por um tempo 
determinado, para que a amostra penetre no capilar por meio da migração iônica e 
fluxo eletroosmótico. 
Então, o eletrodo e o terminal do capilar são colocados novamente na 
solução tampão pelo tempo de separação. Se for utilizar a injeção por pressão, a 
extremidade do capilar usada na introdução da amostra é colocada em um recipiente 
com a amostra e uma diferença de pressão é usada para dirigir a solução da 
amostra para o capilar. 
 
4.4 - Miscelânea de Métodos 
 
Neste tópico serão descritos alguns protocolos para serem usados em 
métodos para análises utilizando cromatografia líquida de alta eficiência e/ou 
espectrometria de massas. Para que os métodos sejam executados de maneira 
correta alguns cuidados precisam ser observados como: 
• Todo espécime biológico, fresco ou fixado, só deve ser manipulado 
com cuidado e com luvas nas mãos, bem como os produtos químicos, que não 
devem ser inalados e nem descartados em qualquer pia. 
• As superfícies como bancadas, devem ser descontaminadas pelo 
menos uma vez ao dia, a limpeza e higiene do laboratório devem ser mantidas e de 
preferência que seja livre de materiais que não esteja relacionado com os 
experimentos. 
 
 
 
 
 
161 
 
Cuidados como estes e muitos outros que fazem parte das boas práticas 
laboratoriais devem ser observados rigorosamente, se é pretendido executar um 
trabalho com eficiência e reprodutibilidade. 
 
4.4.1 - Método para extração de DNA de fígado de camundongos da 
linhagem C57Bl/6J 
 
Este método é utilizado para a análise de adutos de DNA induzidos por 
tetrahidrofurano em fígado de camundongos da linhagem C57BI/6J. 
No primeiro dia: 
- homogeneizar o órgão em 20 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M/ e 
EDTA 5 mM pH 7,4. 
- para obter aproximadamente 500 mg de tecido, acrescentar: 5 mL de 
Tampão A; homogeneizar novamente e, centrifugar em 1500g por dez minutos. 
- coletar o pellet [descartar o sobrenadante], ressuspender em 5 mL de 
Tampão A4, homogeneizar novamente e centrifugar em 1500g por dez minutos. 
- coletar o pellet [descartar o sobrenadante], ressuspender em 6 mL de 
Tampão B, adicionar 350 μL SDS 10%. 
- agitar bem, adicionar 30 μL RNAse A, 4 μL RNAse T1 e incubar a 37 °C por 
uma hora. 
- adicionar após este tempo 300 μL de Proteinase K [20 mg/mL], incubar a 
37 °C por uma hora. 
- colocar as amostras em tubo corex (de vidro ou plástico resistente) e 
centrifugar a 5000g por quinze minutos. 
 
4 Os tampões e soluções citados neste método estão descritos no Anexo A. 
 
 
 
 
 
162 
- coletar desta vez o sobrenadante, adicionar 4 mL solução NaL, adicionar 
8mL isopropanol 100% e inverter os tubos para precipitar o DNA guardando no 
freezer até o dia seguinte. 
No segundo dia: 
- centrifugar a 5000g por quinze minutos, descartar o sobrenadante. 
- adicionar 10 mL de isopropanol 60%, e centrifugar a 5000g por quinze 
minutos. 
- lavar o DNA com 10 mL de etanol 70%, centrifugar a 5000g por quinze 
minutos. 
- descartar o sobrenadante, adicionar 300 uL de desferroxamina [0,1mM], 
agitar [para dissolver DNA] e deixar na geladeira para dissolver até o dia seguinte. 
No terceiro dia: 
- medir absorbância a 260nm e 280nm e fazer extração da amostra com 
clorofórmio [mesma quantidade da amostra]. 
- centrifugar por cinco minutos a 5000 rpm, coletar o sobrenadante. 
 
Após estas etapas, a amostra deverá ser hidrolisada para ser posteriormente 
analisada em HPLC/detecção eletroquímica, para se obter as curvas de calibração 
para quantificação das amostras. 
Na hidrólise de DNA utilizando DNAse I e PDEI (fosfodiesterase I) 
substituindo a Nuclease P1, é necessário acrescentar em cada 100 µg de DNA: 
0,031U (U=unidade) de PDE1 e 1,25U de DNAse1 (não se deve agitar a DNAse1 
fortemente). 
Para iniciar a hidrólise: 
- colocar em 200µg de DNA (em 100 µL de água), 10 µL de Tris 200 mM, 10 
µL MgCl2 2 M, 10 µL DNAse I (2,5 U) e incubar por 1,5h a 37oC. 
 
 
 
 
 
163 
- depois acrescentar: 10 µL glicina-acetato (0,2 M) pH 10, 40 µL PDE I 
(0,062 U) e incubar por mais 1,5h a 37oC. 
- após este tempo acrescentar: 50 µL tampão Tris-HCl + MgCl2 - 200 mM pH 
7,4; 4 µL de fosfatase alcalina (6U). 
- incubar por mais 1h a 37oC. 
Terminada a hidrólise as amostras estão prontas para serem analisadas por 
HPLC e por espectrometria de massa (Hermida, 2007). 
 
4.4.2 - Protocolo de dosagem de proteína pelo método de Bradford 
 
O método se baseia na observação de que o azul brilhante de coomassie G-
250 se converte da cor vermelha para azul após ligação à proteína. O complexo é 
formado rapidamente (2 minutos), permanece disperso em solução por um tempo 
relativamente longo, uma hora, e tem um alto coeficientede extinção, o que permite 
grande sensibilidade na dosagem das proteínas (Bradford, 1976). 
As soluções usadas neste método são: 
• Solução A: NaCl 0.15 M; 
• Solução de proteína (albumina bovina) 1 mg/mL; 
• Solução de dosagem; 
Os reagentes para solução de dosagem: 
• 100 mg de azul de coomassie G-250, dissolvido em 50 mL de etanol 
100%; 
• 100 mL de ácido fosfórico 85%; 
• Água miliQ qsp 1000 mL; 
 
 
 
 
 
 
164 
Para preparação precisa: dissolver o azul de coomassie em etanol 100%, e 
após dissolver, adicionar o ácido fosfórico 85%, homogeneizar bem (por mais ou 
menos 5 minutos). Depois acertar o volume com água miliQ. 
A curva padrão para dosagem de proteínas é construída utilizando-se 
albumina de soro bovino (10 -100 μg de albumina em 100 μL de solução A). 
Observação importante: todas as diluições das amostras de proteínas 
(albumina) e amostra a ser analisada (exemplo: microssomos) devem ser 
preparadas em solução A, para depois adicionar a solução de dosagem em todas ao 
mesmo tempo. 
Exemplo: Proteína (Albumina bovina) de 20 a 100 μg/ 100mL em solução A, 
divididas em amostras para construção da curva de calibração como: 
20 μL de Albumina (1 μg/ μL) + 80 μL de solução A + 5 mL de solução de 
dosagem; 
40 μL de Albumina (1 μg/ μL) + 60 μL de solução A + 5 mL de solução de 
dosagem; 
60 μL de Albumina (1 μg/ μL) + 40 μL de solução A + 5 mL de solução de 
dosagem; 
80 μL de Albumina (1 μg/ μL) + 20 μL de solução A + 5 mL de solução de 
dosagem; 
100 μL de Albumina (1 μg/ μL) + 5 mL de solução de dosagem. 
 
Para preparar a amostra e o branco para medir a absorbância: 
• Amostra: 5 μL do homogenato de microssomos + 95 μL de solução A + 
5 mL de solução de dosagem; 
• Branco: 100 μL da solução A e 5 mL da solução para dosagem. 
Exemplo de medida de Absorbância em 595 nm: em 20 µg de proteína a 
absorbância medida foi de: 0,011. Para determinar a concentração de proteína em 
cada diluição: 20 μg/5100 μL, é feita uma conta usando a regra de três: 
 
 
 
 
 
Ex: 20 μg .................5100 μL 
x..........................................1 μL → x = 0,00392 μg/ μL 
Seguindo este exemplo, para construir uma curva de calibração temos: 
 
µg/μL de proteína Absorbância Correspondendo a μg de albumina 
0,00392 0,011 20 
0,00784 0,188 40 
0,01176 0,367 60 
0,01568 0,575 80 
0,01960 0,818 100 
Amostra do exemplo para curva de calibração = 0,614 µg/μL 
 
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
59
5 
nm
Curva padrâo para d
proteína
 
 
0,614 = 41,266x - 0,0616 
-41,266x = - 0,0616 - 0,614 
x = -0,6756/ -(41,266) 
x = 0,01637 µg/µL 
165 
 
 
 
 
 
166 
Para saber a quantidade de microssomos na amostra: 
 
 0,01637µg………………....….….1 µL 
 x.................................………5100 µL 
 x = 83,48 µg/µL de microssomos 
 
Sendo que o volume total de diluição da amostra é: 5 μL de microssomos + 
95 μL solução A + 5000 μL solução dosagem (Borges, 2007). 
 
4.4.3 - Protocolo de extração de microssomos 
 
Para fazer extração de microssomos é preciso alguns equipamentos e 
materiais como: Centrífuga; Ultracentrífuga; Tubo de ultracentrífuga; Frasco 200 mL; 
Eppendorfes 2 mL; Homogeneizador manual. Sais e solventes; Fosfato de potássio; 
EDTA; Água miliQ. 
O procedimento para esta extração consta das seguintes etapas: 
• Homogeneizar o fígado (500 mg) em 20 mL de tampão fosfato de 
potássio 0.1 M/ EDTA 5 mM pH 7.4; 
• Centrifugar o homogenato a 16.900g por 15 minutos 4 °C (descartar o 
precipitado); 
• Centrifugar o sobrenadante a 105.000g por 95 minutos, 4 °C. 
(descartar o sobrenadante); 
• Ressuspender o precipitado em 7 mL de tampão fosfato de potássio 
0.1M/ EDTA 5 mM pH 7.4; 
• Centrifugar 105.000g por 95 minutos (Descartar o sobrenadante); 
 
 
 
 
 
167 
• Ressuspender o precipitado em tampão fosfato 0.1M/ EDTA 5 mM pH 
7.4 
• Separar em alíquotas e armazenar em freezer –80 °C. 
Estas amostras poderão ser analisadas posteriormente, juntando-se a DNA 
para análises de adutos, por exemplo, ou em análises que sejam necessárias as 
avaliações de microssomos em HPLC . 
 
4.4.4 – Métodos térmicos 
 
Os métodos térmicos são técnicas de multicomponentes e incluem 
termogravimetria, análise diferencial térmica e calorimetria diferencial de varrido. 
Estes métodos são largamente utilizados em controle da qualidade e em aplicações 
de investigação sobre produtos industriais como polímeros, farmacêuticos, metais e 
ligas. 
Em termogravimetria (TG) a análise da massa da amostra em uma 
atmosfera controlada é medida como uma função de temperatura ou de tempo. E 
pode ser usada para monitorar qualquer reação que envolve uma fase de gás como 
a oxidação ou desidratação e também em processos físicos como vaporização, 
sublimação e dessorção. Os instrumentos de termogravimetria são compostos por 
uma balança analítica sensível, um forno, um sistema de gás de purga e um sistema 
de manejo de dados. 
A análise térmica diferencial (DTA) é um método onde a diferença na 
temperatura entre uma substância e um material usado como referência é medida 
em função da temperatura, e a substância e o material de referência são medidos 
por um gradiente de temperatura controlada. Normalmente, a câmara da amostra e 
da referência dos dispositivos térmicos diferenciais é projetada para que seja 
possível a circulação de um gás inerte, como o nitrogênio, ou então por um gás 
reativo como o oxigênio. 
 
 
 
 
 
168 
Esse método é muito utilizado na determinação do comportamento e na 
composição de produtos manufaturados e também nos naturais. 
O método de calorimetria exploratória diferencial (DSC), se baseia na 
medida das diferenças no fluxo de calor na substância e referências como uma 
função da temperatura da amostra, sendo que essas duas variáveis estão 
submetidas a um programa de temperatura controlada. 
Em geral, os estudos de calorimetria exploratória diferencial são realizados 
em modo de varredura de temperatura. Tem aplicações na indústria farmacêutica, 
em testes de pureza de fármacos, por exemplo. 
 
4.5 - Métodos de Análise Automatizados 
 
Um método automatizado é providencial em laboratórios que tem uma 
demanda muito grande, pois seu custo é alto e não é fácil de ser posto em 
operação. Além da velocidade podendo viabilizar a monitoração da composição de 
produtos enquanto são produzidos. São muito úteis na medicina por oferecer 
resultados analíticos rapidamente, podendo auxiliar na determinação das condições 
apresentadas pela resposta do paciente a uma terapia. 
São divididos em dois sistemas analíticos os analisadores discretos e 
analisadores de fluxo contínuo, podendo ser combinados em alguns casos. Os 
equipamentos do sistema discreto operam com recipientes individuais, eliminando o 
problema de contaminação entre amostras, o que às vezes, pode ser um 
complicador em sistemas contínuos, pois à medida que a velocidade da injeção 
aumenta as interações entre as amostras podem aumentar também. 
A detecção nos procedimentos de injeção em fluxo pode ser feita por 
absorção e emissão atômica, fluorômetros, sistemas eletroquímicos, 
espectrofotômetros e fotômetros. A separação por diálise, por extração líquido/ 
líquido e por difusão gasosa, pode ser realizada automaticamente com este sistema. 
 
 
 
 
 
169 
Na preparação de sólidos, definição e dissolução da amostra, operações 
unitárias como a moagem se fazem necessárias e este procedimento pode ser 
automatizado e realizado por pequenos robôs de laboratório. O sistema robótico é 
controlado por um microprocessador que pode ser programado pelo usuário. Nessa 
programação o robô pode ser instruído a trazerpequenas amostras ao laboratório 
central para serem diluídas, filtradas, tratadas com reagentes, entre outros. 
A instrução também pode ser para que as amostras sejam aquecidas, para 
que sejam injetadas em uma coluna cromatográfica e também para coleta de frações 
de uma coluna. Estes métodos auxiliam e agilizam os procedimentos com grande 
demanda, principalmente nas rotinas onde diversas tarefas repetitivas são 
necessárias. 
 
4.6 – Questões para estudo 
 
1 – Que métodos podem ser utilizados na cromatografia líquida? 
2 – Quais as variáveis que podem afetar a eficiência de uma coluna 
cromatográfica? 
3 – As soluções padrões são usadas com que propósito nas análises 
cromatográficas quantitativas? 
4 – Que detector se baseia na condutividade térmica e que espécies o 
mesmo detecta? 
5 – Quais os tipos de colunas para cromatografia gasosa? Descreva cada 
tipo. 
6 – Ao acoplar um equipamento de cromatografia gasosa a um 
espectrômetro, quais são as vantagens obtidas? 
7 – Em que tipo de cromatografia a mistura de solventes deve ser realizada 
para líquidos miscíveis? 
 
 
 
 
 
170 
8 – Qual a importância do sistema de bombeamento de cromatografia líquida 
de alta eficiência? 
9 – Na cromatografia líquida de alta eficiência as fases estacionárias são 
compostas por que tipo de material? 
10 – Em que se baseiam os detectores eletroquímicos? 
11 – Descreva a importância de um termonebulizador. 
12 – Quais as aplicações da cromatografia de partição? 
13 – Em que método as separações são baseadas nas diferenças das 
relações carga/ tamanho dos analitos da amostra? 
14 – Que métodos são utilizados em controle de qualidade? 
15 – Quais os sistemas que compõem os métodos de análises 
automatizadas? 
16- Dê exemplos de atividades que podem ser realizadas por robôs em um 
laboratório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
171 
4.7 - Anexo A – Soluções e Tampões 
 
Tampão A (tópico 4.4.1), é necessário calcular a quantidade para pesar os 
componentes do tampão. Como da sacarose que tem peso molecular de 342,3g. 
 
Sacarose (conta=regra de três) 
1M 342,3g 1.000 mL 
0,32M x 1.000 mL 
x = 109,54g 1.000 mL 
Mg Cl2 (conta=regra de três) 
1M 203,3g 1.000 mL 
0,005M x 1.000 mL 
x = 1,0165g 1.000 mL 
Tris (conta=regra de três) 
1M 1211g 1.000 mL 
0,010M x 1.000 mL 
x = 1,211g 1.000 mL 
Desferroxamina (conta=regra de três) 
1M 656,8g 1.000 mL 
0,0001M x 1.000 mL 
 
 
 
 
 
172 
x = 0,06568g 1.000 mL 
Triton X100 (conta=regra de três) 
5g em 500 mL 
 
Tampão B 
 
Tris (conta=regra de três) 
1M 1211g 1.000 mL 
0,010M x 1.000 mL 
x = 1,211g 1.000 mL 
EDTA – Na2 (conta=regra de três) 
1M 372,2g 1.000 mL 
0,005M x 1.000 mL 
x = 1,861g 1.000 mL 
Desferroxamina (conta=regra de três) 
1M 656,8g 1.000 mL 
0,00015M x 1.000 mL 
x = 0,09852g 1.000 mL 
 
RNAse (livre de DNAse) – 10 mg/mL = 0,01g 
 
 
 
 
 
173 
RNAse em 1 mL de tampão acetato de sódio 10 mM em pH 5,2. Aquecer a 
100 °C durante 15 minutos. 
 
Tampão acetato 1M (diluição) 
1M . vi = 10.10-3M . 100 mL 
vi= 1mL + 99 mL de H20 
 
Para fazer a solução de NaI: 
Solução de NaI (7,6M) (conta=regra de três) 
1M 149,89g 1.000 mL 
7,6 M x 1.000 mL 
x = 1139,164g 1.000 mL 
40 mM Tris (conta=regra de três) 
1M 121,1g 1.000 mL 
0,04 M x 1.000 mL 
x = 4,844g 1.000 mL 
EDTA – Na2 20 mM (conta=regra de três) 
1M 372,2g 1.000 mL 
0,02M x 1.000 mL 
x = 7,444g 1.000 mL 
 
 
 
 
 
174 
Desferroxamina 0,3 mM (conta=regra de três) 
1M 656,8g 1.000 mL 
0,0003M x 1.000 mL 
x = 0,197g 1.000 mL 
Tampão C, usado para diluição de RNAse T1 com 10 mM de Tris-HCl; 1 mM 
EDTA; 2,5 mM Desferroxamina em pH 7,4. 
Tris 10mM (conta=regra de três) 
1M 1211g 1.000 mL 
0,010M x 1.000 mL 
x = 1,211g 1.000 mL 
EDTA – Na2 1mM (conta=regra de três) 
1M 372,2g 1.000 mL 
0,001M x 1.000 mL 
x = 0,372g 1.000 mL 
Desferroxamina 2,5 mM (conta=regra de três) 
1M 656,8g 1.000 mL 
0,0025M x 1.000 mL 
x = 1,642g 1.000 mL 
Este tampão é para fazer a diluição de 100 μL de RNAse T1. 
-------------FIM DO MÓDULO IV----------- 
 
 
 
 
 
175 
 
4.8 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 
 
BONATO, P.S. Cromatografia Gasosa in: Collins, C.H.; Bonato, P.S; Braga, G.L. 
“Introdução a Métodos Cromatográficos”. 6ª edição, Editora Unicamp, Campinas, 
1995. 
BORGES, D.L.G., CURTIUS, A.J., WELZ, B., HEITMANN, U. Fundamentos da 
espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua 
Revista Analytica, nº18, Agosto/Setembro 2005. 
BORGES, J. M. P. Investigação da citotoxicidade e genotoxicidade dos 
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos indeno [1,2,3-cd] pireno, trifenileno e 
coroneno. Dissertação de Mestrado no Departamento de Toxicologia e Análises 
Toxicológicas Dissertação, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade 
de São Paulo, São Paulo, Brasil, 2007. 
BRADFORD, M. M. “A rapid and sensitive method for the quantitation of 
microgram quantities of protein utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. 
Anal Biochem., 72, 248-254, 1976. 
BRASIL, Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003. Guia para Validação de 
Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Disponível em: 
http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/899_03re.htm.
CASSARETT & DOULL, Toxicology – The basic Science of Poisons, 6a. edição, 
McGraw-Hill, 2001. 
HERMIDA, S. A. S., Possari, E.P.M., Souza, D.B., Campos, I P A, Gomes, O F, Di 
Mascio, P, Medeiros, M H G, Loureiro, A.P.M. 2’-Deoxyguanosine, 2’-deoxycytidine 
and 2’-deoxyadenosine adducts resulting from the reaction of tetrahydrofuran with 
DNA bases. Chemical Research in Toxicology, v.19, 927 - 936, 2006. 
HERMIDA, S. A. S., Possari, E.P.M., Souza, D.B., Campos, I P A, Gomes, O F, Di 
Mascio, P, Medeiros, M H G, Loureiro, A.P.M. 2’-Deoxyguanosine, 2’-deoxycytidine 
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9141/tde-24052008-105537/
http://www.teses.usp.br/area_pesquisa.php?area=9141
http://www.teses.usp.br/area_pesquisa.php?area=9141
http://www.teses.usp.br/documentos.php?doc=3
http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/899_03re.htm
 
 
 
 
 
176 
and 2’-deoxyadenosine adducts resulting from the reaction of tetrahydrofuran with 
DNA bases. Chemical Research in Toxicology, v.19, 927 - 936, 2006. 
HERMIDA, S.A.S. Adutos de 2’-Deoxiadenosina e 2’-Deoxicitidina induzidos por 
Tetraidrofurano: caracterização estrutural e detecção em DNA. Dissertação de 
Mestrado apresentada ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas – 
Farmácia da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil, 2007. 
IMBENOTTE, M.; AZAROUAL, M. N.; CARTIGNY, B.; VERMEERSCH, G.; 
LHERMITTE M. Identification and quantitation of xenobiotics by 1H NMR 
spectroscopy in poisoning cases. Forensic Science International 133: 132–135, 
2003. 
IPCS — Biomarkers and risk assessment: concepts and principles. Geneva: 
International Programme on Chemical Safety. WHO, 1993. (Environmental Health 
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MCNAIR, H.M.; MILLER, J.M. “Basic Gas Chromatography”. John Wiley & Sons, 
New York, 1997. 
MENDHAM, J.; DENNEY, R. C.; THOMAS, M. Análise Química Quantitativa. 6° 
ed. Rio de Janeiro: LTC, 2002. 
National Toxicology Program (NTP). Fiscal Year 1998 Annual Plan. U.S. 
Department of Health and Human Services. USA, 1999. 
OGA, S. (Ed.) - Fundamentos de Toxicologia. Atheneu: São Paulo, 2a. edição, 
2003. 
ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS, PROGRAMA INTERNACIONAL DE 
SEGURANÇA QUÍMICA, Segurança Química, Fundamentos de Toxicologia 
Aplicada e Características dos Riscos Causados por Agentes Químicos, 1994. 
Pimenta, A.M.C. Os desafios do Proteoma, Ciência Hoje, vol. 32, nº 192, 2003. 
RIBEIRO, L.R., SALVADORI, D.M.F., MARQUES, E.K. Mutagênese Ambiental. Ed. 
Ulbra, Canoas, 2003. 
 
 
 
 
 
177 
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 
5ª. edição, Ed. Artmed, Porto Alegre – RS, 2002. 
STERNER, J. H., AND HODGE, H. C. (1949). Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 10, 93–96.TAVARES, M. F. M, "Mecanismos de Separação em Eletroforese Capilar", 
Química Nova, 20: 493-511, 1997. 
TOLSTOY, V.P., CHERNYSHOVA, I. V., SKRYSHEVSKY, V. A. “Handbook of 
infrared spectroscopy of ultrathin films”, by John Wiley & Sons, Inc., 2003. 
WHO, Principles and Methods for Evaluating the Toxicity of Chemicals, 1978. 
 
-----------FIM DO CURSO!----------- 
	Livro
	 
	Podem-se classificar as substâncias químicas, segundo Sterner e Hodge (1949), em seis classes de toxicidade, de acordo com a provável dose letal para humanos conforme descrito no quadro 1: 
	Classe
	Categoria de Toxicidade Provável DL oral/ humanos
	1
	 Praticamente não-tóxica > 16 g/kg
	2
	 Ligeiramente tóxica 5-15 g/kg
	3
	 Moderadamente tóxica 0,5-5 g/kg
	4
	 Muito tóxica 50-500 mg/kg
	5
	 Extremamente tóxica 5-50 mg/kg
	6
	 Super tóxicaenvolvidas no estudo. 
Os estudos de toxicidade crônica são realizados para se determinar o efeito tóxico 
após uma exposição prolongada a doses cumulativas da substância em estudo, portanto, 
permitem também observar o potencial carcinogênico da substância, desde que a dose 
escolhida seja correta. 
Em roedores, o teste de toxicidade crônica pode variar por um período de 6 
meses a 2 anos e em não roedores o tempo de tratamento é normalmente de um ano. A 
determinação do tempo de tratamento depende do uso previsto da substância. Se for por 
períodos curtos, 6 meses de tratamento podem ser suficientes. Porém se a substância for 
empregada por longo tempo, o que levaria a um contato crônico da população, o tempo 
de tratamento adequado, seria o período de vida normal do animal escolhido para o teste. 
Em geral realiza-se este tipo de estudo em duas espécies animais (ratos e 
camundongos), por um período semelhante ao tempo de vida média destes animais (18 
meses a 2 anos para camundongos e 2 a 2,5 anos para ratos). A escolha das doses é o 
ponto crítico dos testes de longa duração, para que não haja morte prematura no decorrer 
 
 
 
 
 
21 
 
 
do tratamento. 
Os exames clínicos devem ser realizados duas vezes ao dia, evitando-se assim 
perdas por autofagia, após a morte dos animais. Dados como peso corpóreo, consumo de 
ração e sinais clínicos precisam ser anotados rigorosamente todas as semanas durante 
as 13 primeiras semanas do ensaio para se obter resultados conforme os verificados no 
início do tratamento e os da progressão dos efeitos tóxicos. 
Os dados hematológicos como hematócrito, hemoglobina, contagem total e 
diferencial de leucócitos devem ser medidos no início do estudo e após 6 meses. Quando 
o teste for finalizado, os mesmos dados devem ser avaliados em pelo menos 10 animais 
por grupo. A análise de urina e dados bioquímicos, também deve ser avaliada, da mesma 
maneira que os dados hematológicos, bem como, os exames histopatológicos, igualmente 
nos testes de toxicidade subcrônica devem ser realizados. 
 
1.4.5 - Estudos de mutagênese e carcinogênese 
 
Os efeitos mutagênicos de substâncias químicas podem ser avaliados por meio 
de ensaios com microorganismos e em organismos superiores, inclusive o homem. 
Agente mutagênico é todo agente físico, químico ou biológico que, em exposição às 
células, pode causar mutação, ou seja, um dano na molécula de DNA que não é reparado 
no momento da replicação celular, e é passado para as gerações seguintes. 
De acordo com a célula afetada, as mutações podem acarretar desde a 
inviabilidade de desenvolvimento da célula ovo, passando por morte do embrião ou feto 
até o desenvolvimento de anormalidades congênitas que podem ser transmitidas 
hereditariamente. 
Os ensaios com microorganismos, realizados in vitro, são indicados na triagem 
rotineira dos agentes tóxicos. Os ensaios com microorganismos avaliam basicamente o 
dano provocado ao DNA pela substância química estudada ou seu produto de 
biotransformação. 
http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula
http://pt.wikipedia.org/wiki/Muta%C3%A7%C3%A3o
http://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula
http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA
 
 
 
 
 
22 
 
 
Vários testes in vitro e in vivo foram desenvolvidos para avaliar-se a capacidade 
mutagênica das substâncias químicas. Existe a necessidade de se quantificar o perigo de 
indução ao material genético e por consequência a transmissão hereditária destas 
mutações. 
O teste desenvolvido por Ames em 1975 é um dos mais utilizados, pois neste 
teste é possível avaliar-se mutações pontuais em cepas mutantes de SalmoneIa 
typhimurium que precisam de uma enzima, a fosforibosil ATP sintetase, necessária para a 
síntese de histidina. Como algumas substâncias químicas são mutagênicas somente após 
a biotransformação. Este teste foi modificado introduzindo-se no meio de reação, 
composto por uma suspensão de microssomo hepático de ratos. 
Já os testes in vivo, realizados em animais, incluem a observação de danos a 
cromossomos de células de medula óssea em metáfase, o aparecimento de micronúcleos 
em linfócitos de sangue periférico e o teste do dominante letal. No teste do dominante 
letal é avaliada a capacidade da substância produzir alterações nos espermatozoides de 
ratos tratados e a manifestação destas alterações nos descendentes, após acasalamento 
com fêmeas não tratadas. 
O potencial mutagênico das substâncias é avaliado nestes testes, porém, os 
resultados obtidos são de difícil uso para a extrapolação ao homem. Em sua maioria, os 
testes de mutagenicidade são utilizados para prever o desenvolvimento de câncer, a partir 
de uma das teorias de carcinogênese química que indica o desenvolvimento de uma 
mutação como evento inicial deste processo. 
Portanto, os testes de mutagênese fazem parte dos testes de triagem para prever 
o potencial carcinogênico das substâncias; mas eles apenas avaliam as substâncias que 
produzem câncer por mecanismos genotóxicos (interagem diretamente com o material 
genético). 
Existe um grande número de substâncias que produzem câncer por mecanismos 
não genotóxicos. Estas substâncias apresentam os testes de mutagênese negativos, não 
interagindo com o DNA. Alguns mecanismos de carcinogênese não genotóxica incluem 
citotoxicidade com regeneração acompanhada de aumento na síntese de DNA, 
imunossupressores e promotores de expressão de oncogênese. 
 
 
 
 
 
23 
 
 
Deste modo, os testes de mutagênese não são suficientes para indicar o potencial 
carcinogênico de uma substância. Pois, as evidências primárias que podem apontar o 
potencial carcinogênico das substâncias químicas são de origem epidemiológica ou 
experimental em roedores. Sendo que, esses efeitos precisam ser observados em pelo 
menos, duas espécies de animais de laboratório, com uma duração máxima de 130 
semanas em ratos, 120 semanas em camundongos e 130 semanas em hamsters. No 
mínimo, 2 doses da substância são utilizadas e a maior dose é a dose máxima tolerada 
(DMT), definida como sendo aquela que não causa uma perda de peso superior a 10% e 
não induz mortalidade ou sinais clínicos de toxicidade no animal. Como parâmetro se 
utiliza a menor dose correspondendo à metade da DMT. 
Testes de carcinogênese devem ser realizados, principalmente nos casos onde 
ocorra exposição humana em longo prazo. Mesmo que na maioria dos casos, estas doses 
sejam muito superiores às relacionadas à exposição humana, elas são indicadas para 
garantir o aparecimento de tumores, se houver. 
Para se obter uma avaliação final do risco de carcinogenicidade para o homem, é 
necessário além das evidências primárias, obterem dados com a realização de testes de 
curta duração. Como os testes que detectam lesão do DNA, incluindo o estudo da 
formação de ligações entre o DNA e os produtos ativos formados na biotransformação do 
agente tóxico; quebra de fitas e reparo do DNA; que evidenciam alterações dos produtos 
gênicos ou das funções celulares e que avaliam alterações cromossômicas. Existe uma 
limitação na evidência de carcinogenicidade nas seguintes situações: 
 
• Problemas para diferenciar as neoplasias (malignas e benignas); 
• Duração menor do que a necessária do experimento; 
• Inadequação de doses e vias de administração; 
• Poucos experimentos; 
• Uso reduzido de animais no experimento; 
• Utilização de uma única espécie animal. 
 
 
 
 
 
24 
 
 
 
1.4.6 - Testes de Teratogenicidade 
 
Efeitos adversos são estudados na toxicologia do desenvolvimento advindos da 
exposição a substâncias químicas antes da concepção (durante o desenvolvimento 
perinatal ou pós-natal até a puberdade). Estes estudos englobam a teratologia e a 
toxicologia de reprodução. Para tanto, testes de avaliação do efeito teratogênico de um 
composto químico, pode ser realizado por meio de métodos experimentais em animais de 
laboratório sendo executada em complexos protocolos envolvendofases distintas. 
Na primeira fase o objetivo é a avaliação do potencial tóxico do composto químico 
que afeta a fertilidade e o desempenho reprodutivo. O tratamento dos animais (machos e 
fêmeas) ocorre durante um período mínimo de 60 dias antes do acasalamento e, depois, 
continua para as fêmeas durante a gestação e lactação. Aproximadamente no meio da 
gravidez é realizado o sacrifício da metade dos animais do estudo para verificar se 
ocorreram anormalidades uterinas. É observado o número, anormalidades externas, sexo, 
peso corpóreo em todos os filhotes, no final desta fase experimental. 
Na fase seguinte, são administradas doses diárias da substância química na 
alimentação, de animais fêmeas grávidas (período da organogênese), para se obter as 
informações que vão dar suporte a uma avaliação minuciosa e detalhada da mãe e da 
prole. 
Na última fase deste teste, são avaliados os efeitos da substância sobre o 
desenvolvimento peri e pós-natal dos animais do grupo experimental. É realizada a 
administração da substância química no período entre o último terço da gestação até o 
desmame, onde o desenvolvimento somático, sensorial, comportamental da prole, é 
avaliado. Conceitualmente pode-se dizer que a teratologia estuda as alterações induzidas 
durante o desenvolvimento, entre a concepção e o nascimento da prole em estudo, 
enquanto que a toxicologia da reprodução tem seu enfoque no estudo dos efeitos 
adversos que ocorrem nos sistemas reprodutores, masculino e feminino, após exposição 
aos agentes químicos. 
 
 
 
 
 
25 
 
 
 
1.4.7 - Estudos de toxicocinética 
 
Nos estudos de toxicocinética são obtidas as informações sobre a absorção, 
distribuição, armazenamento, biotransformação e excreção da substância. Estes estudos 
permitem a avaliação das diferenças de comportamento das substâncias em diferentes 
espécies animais e para antecipar o seu comportamento no homem, quando as 
diferenças de metabolismo são conhecidas entre as espécies em estudo. É sabido que 
muitas substâncias químicas exercem efeitos tóxicos por meio de seus produtos de 
biotransformação, e o estudo de toxicocinética é a ferramenta que vai proporcionar o 
conhecimento sobre estes produtos. 
As concentrações de substâncias detoxificantes nos tecidos como a glutationa 
têm efeitos importantes na toxicidade e são variáveis entre as espécies, as doses e o tipo 
de substância. A dose quando em grande quantidade e com aplicação contínua é muito 
importante, pois nestas condições, os mecanismos de proteção e as reações enzimáticas 
podem estar diminuídas ou inativas, e o metabolismo de catálise pode estar aumentado. 
As diferenças e as semelhanças no metabolismo de uma substância química 
devem ser consideradas na avaliação de risco quando for realizada a extrapolação de 
dados de animais para o homem. 
É importante compreender que os modelos de animais experimentais apresentam 
limitações e que a correta classificação quantitativa de toxicidade no homem, depende de 
algumas condições, como a espécie de animal escolhida para estudo, os tipos de 
experimentos e os métodos de extrapolação dos dados dos animais para o homem. 
A maior problemática na extrapolação dos dados de animais para o homem é a 
conversão de uma espécie a outra, pois na maior parte das substâncias químicas a 
ocorrência da intoxicação, é similar no homem e em outros mamíferos, por isso os sinais 
de intoxicação são semelhantes. Porém, são mais comuns as diferenças quantitativas na 
resposta tóxica do que as qualitativas. 
 
 
 
 
 
 
26 
 
 
1.4.8 - Efeitos locais sobre a pele e os olhos 
 
Os dados avaliados vão se referir à irritação que a substância em estudo pode 
provocar sobre a pele intacta ou não e sobre os olhos. A pele é uma barreira contra a 
penetração de substâncias químicas exógenas. Porém, alguns xenobióticos podem ser 
absorvidos pela pele, de acordo com alguns fatores como a anatomia, propriedades 
fisiológicas da pele e propriedades físico-químicas dos agentes. Diversos fatores podem 
influir na absorção a partir da pele e estes podem ser agrupados em: fatores ligados ao 
organismo; ao agente químico; presença de outras substâncias na pele; condições de 
trabalho (quando for exposição ocupacional). 
Em 1944, Draize propôs o teste que é conhecido por seu nome e é o empregado 
até hoje, para avaliação de irritação causada por substâncias química sobre a pele e os 
olhos. Os dados avaliados para a pele são: eritema, escara, edema e corrosão. E no caso 
dos olhos, observam-se alterações da conjuntiva, córnea, íris e cristalino. São três os 
tipos de testes de irritação: irritação local ou aguda, resultante da resposta de uma 
aplicação única ou exposição a um agente tóxico; irritação cumulativa (exposição repetida 
à substância); e irritação induzida fotoquimicamente (uma irritação primária resultante de 
luz induzindo modificações moleculares na pele exposta). 
Se uma irritação persistir por mais de 14 dias após a exposição é tida como não 
reversível. O fato que uma simples dose de uma substância química poder causar uma 
lesão reversível ou permanente é avaliada no teste de irritação primária que tem como 
objetivo avaliar o potencial de risco de uma dose da substância em estudo. 
 
1.4.9 - Estudos de ecotoxicidade 
 
O termo ecotoxicidade é utilizado para o estudo dos efeitos químicos no 
ecossistema e seus componentes. Enquanto que no meio ambiente, existem várias 
substâncias potencialmente tóxicas, e muitas delas em concentrações que por si só não 
causam danos, uma interação destas substâncias com outros agentes químicos poderá 
 
 
 
 
 
27 
 
 
então ser a causa de um dano. 
Diversos fatores como as condições climáticas e enchentes podem afetar a 
natureza e os efeitos da exposição a substâncias potencialmente tóxicas. Quando ocorre 
o aumento da temperatura, também há um aumento de vaporização dos agentes 
químicos na atmosfera e estes favorecem a absorção por via respiratória por meio da 
inalação. As enchentes auxiliam na disseminação de substâncias potencialmente tóxicas 
de áreas contaminadas para terras e poços de água ao redor da área afetada pela 
enchente, podendo contaminar a água potável, por exemplo. 
Portanto, a monitoração das substâncias químicas quando em contato com o 
meio ambiente é muito importante. A análise química de amostras ambientais executadas 
conforme os métodos estabelecidos em uma avaliação de risco auxiliam na verificação da 
distribuição do agente químico fornecendo informações acerca de qualquer transformação 
que esses agentes em maior ou menor toxicidade podem ter. 
Nestes estudos se inclui a monitoração biológica que avalia os organismos 
expostos para ser possível detectar efeitos adversos que indiquem a exposição em níveis 
tóxicos das substâncias no ambiente por meio da monitoração de indicadores de 
deficiências enzimáticas ou genéticas. 
 
1.5 - Classificação dos métodos analíticos 
 
Os métodos analíticos têm duas classificações: clássicos ou instrumentais. A 
adaptação ou execução de um método conhecido envolve um processo de avaliação que 
possibilite a verificação de sua eficiência na rotina de um laboratório. Bem como o 
desenvolvimento baseado no estudo da composição química dos constituintes do material 
em estudo, da definição do marcador e/ou princípio ativo, bem como sua quantificação 
para a utilização nos métodos. 
Os métodos clássicos consistem em análises por separação dos componentes 
em estudo (analitos) de uma amostra utilizando-se precipitação, extração ou destilação. 
Em análises qualitativas, os analitos separados são tratados com reagentes, que 
 
 
 
 
 
28 
 
 
possibilitam seu reconhecimento por suas cores, suas solubilidades, ponto de fusão ou 
ebulição em vários solventes, entre outros materiais. No caso de análises quantitativas, as 
medidas titulométricas ou gavimétricas são utilizadas para determinar a quantidade do 
analito.Estes métodos foram muito utilizados nos primeiros anos da química e são 
aplicados até os dias de hoje. 
Entretanto, há mais de um século, químicos começaram a estudar outros dados 
tais quais as propriedades físicas dos analitos, como a condutividade, emissão ou 
absorção da luz, razão massa/carga, fluorescência, potencial do eletrodo na análise 
quantitativa. Desde então, técnicas de cromatografia e de eletroforese começaram a 
substituir a destilação, extração e precipitação para separar componentes de misturas 
complexas, que eram utilizadas na determinação quantitativa e qualitativa das análises, e 
essas técnicas são conhecidas como métodos instrumentais. 
 
1.5.1 - Tipos de Métodos 
 
As análises quantitativas e qualitativas são realizadas de acordo com algumas 
características físicas e químicas do xenobiótico (analito) em estudo. No quadro 2 estão 
listadas algumas propriedades e estas são utilizadas para análise instrumental, pois 
dependendo da característica do analito, uma determinada fonte de energia será 
necessária para se obter uma resposta que possa ser medida. 
Os métodos utilizados nas análises instrumentais são vários, porém os mais 
utilizados nos dias de hoje são os cromatográficos, os espectroscópicos (de ressonância 
magnética nuclear, fotoacústica, de emissão de UV, por exemplo), como os citados no 
quadro 2, entre outros. 
O enfoque principal será dado aos métodos instrumentais, pois os clássicos 
apesar de ainda serem usados, estão sendo substituídos pelos instrumentais que a cada 
dia se renovam trazendo novas metodologias e aparelhos com maior poder de detecção, 
mais rapidez no diagnóstico e também uma maior confiabilidade nos resultados obtidos. A 
seguir alguns exemplos de métodos e suas aplicações: 
 
 
 
 
 
29 
 
 
 
• Imunoensaios ou ELISA: 
Teste analítico que utiliza anticorpos. Características: reagem com uma grande 
variedade de compostos natural-artificiais, biomoléculas, células e vírus; tem excelente 
especificidade que permite detectar quantidades mínimas do analito; ligação não 
covalente/covalente forte que resiste aos processos e geração de sinal; alta precisão e 
exatidão; permite automatização; permite a execução de testes rápidos; pode ser aplicado 
nas áreas de alimento, no ramo farmacêutico, forense, militar, medicina e veterinária. A 
geração de sinais pode ocorrer conforme descrito abaixo: 
• Colorimétrico – limitado ao limite de leitura do espectrofotômetro. 
• Fluorimétrico – composto fluorescente - emissão repetida de radiação em curto 
espaço de tempo. Por dois tipos – marcação direta e marcação enzimática e revelação 
fluorescente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Quadro 2 – Propriedades físicas e químicas utilizadas em Métodos 
Instrumentais 
 
 
 
 
 
 
30 
 
 
Propriedades Características Métodos Instrumentais 
Emissão da radiação Espectroscopia de emissão (raios X, UV, 
visível, elétrons, Auger); fluorescência, 
fosforescência e luminescência (raios X, UV 
e visível). 
Absorção da radiação Espectrofotometria e fotometria (raios X, UV, 
visível, IR); espectroscopia fotoacústica; 
espectroscopia de ressonância magnética 
nuclear e de ressonância de spin eletrônico. 
Difração da radiação Métodos de difração de raios X e de 
elétrons. 
Massa Gravimetria (microbalança de cristal de 
quartzo). 
Relação massa/carga Espectrometria de massa. 
Velocidade da reação Métodos cinéticos. 
Características térmicas Gravimetria e titulometria térmica: 
calorimetria diferencial exploratória; análise 
térmica diferencial e métodos de 
condutimetria térmica. 
Radioatividade Métodos de ativação e diluição de isótopos. 
 
• Espectrometria de Massas: 
 
 
 
 
 
 
31 
 
 
A espectrometria de massa é uma técnica analítica muito usada para identificar 
compostos desconhecidos, quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades 
químicas e estruturais de moléculas e biomoléculas. A detecção de compostos por meio 
desta ferramenta é viável para quantidades pequenas como as de 10-15g e também para 
um composto de massa de 1000 Dalton. É um método utilizado para fornecer informação 
tanto por químicos, como físicos, bioquímicos, toxicologistas e biologistas, entre outros. 
Dentre os tipos de espectrometria de massa podemos destacar o de ionização por 
electrospray que favorece novas possibilidades na análise de compostos com elevada 
massa molecular, incluindo proteínas, nucleotídeos e polímeros sintéticos, sendo, 
portanto uma técnica amplamente utilizada em estudos biológicos, bioquímicos, 
farmacêuticos e médicos. 
 
• Cromatografia: 
 
Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia é uma das mais 
utilizadas devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação 
das espécies químicas, por si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais 
de análise, como por exemplo, a espectrofotometria por absorção no visível e ultravioleta 
ou a espectrometria de massas. Existem alguns tipos de cromatografia como: 
cromatografia em papel, em camada delgada, cromatografia em coluna, cromatografia 
gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência. 
A cromatografia em camada delgada (CCD) é a técnica de referência para muitos 
laboratórios brasileiros porque não necessita de equipamentos caros e é confiável. A CCD 
permite separação eficaz dos compostos, o que torna este método muito útil na 
caracterização e a quantificação de compostos químicos pode ser realizado utilizando 
técnica visual sob luz UV ou a densitometria. Este tipo de cromatografia é muito útil para 
avaliar casos de intoxicação aguda, principalmente se o toxicante for desconhecido 
(Figura 4). A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) de fase normal e 
fase reversa em geral, utilizam-se em conjunto com ferramentas de detecção por 
absorção ultravioleta (UV), fluorescência e espectrometria de massas, entre outros. É o 
 
 
 
 
 
tipo de cromatografia mais utilizada atualmente em laboratórios de pesquisas e de 
análises por sua versatilidade, sensibilidade, resultados quantitativos, por analisar 
espécies não-voláteis e termolábeis, e por sua automatização. 
 
dipirona
30%
antidepressivo
6%
barbitúrico
17%
benzodiazepínico
26%
outros
21%
 
Figura 4 – Perfil analítico: cromatografia em camada delgada (CCD). 
 
 
1.6 - Ferramentas para Análise 
 
Para que uma informação possa ser interpretada, manipulada é necessário que a 
conversão da informação contida nas características químicas ou físicas do analito passe 
por um instrumento para sua análise. Portanto, este analito deverá receber um impulso na 
forma de energia elétrica, eletromagnética, mecânica ou nuclear, e estes impulsos 
auxiliam na obtenção de uma resposta do analito em estudo (alguns exemplos no quadro 
32 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
 
3). Existem vários dispositivos que podem converter uma informação de uma forma à 
outra, em geral os dados gerados são analisados em forma gráfica ou numérica. 
Alguns termos apesar de serem utilizados como sinônimos têm diferenças em 
seus significados como no caso de detectores, transdutores e sensores. O detector é um 
dispositivo mecânico, elétrico ou químico que serve para indicar, identificar ou registrar 
uma alteração em uma variável (pressão, temperatura, radiação nuclear, entre outros). 
 
Quadro 3 – Componentes Instrumentais 
 
Instrumento Fonte de 
Energia 
(impulso) 
Informação 
Analítica 
Transdutor 
de Entrada 
Domínio de 
Dados da 
Informação 
vinda do 
Transdutor 
Processador da 
Informação 
Dispositivo 
de Leitura 
de Saída 
Fotômetro Lâmpada de 
tungstênio, 
filtro de 
vidro 
Feixe de Luz 
atenuado 
Fotocélula Corrente 
elétrica 
Escala Medidor de 
corrente 
Espectrômetro Chama Radiação UV 
ou visível 
Válvula 
fotomulti-
plicadora 
Potencial 
elétrico 
Amplificador 
Demodulador 
Monocromador 
modulador 
Registrador 
gráfico 
pHmetro Amostra/ 
Eletrodode 
vidro 
Atividade do 
íon 
hidrogênio 
Eletrodos 
vidro-
calomelano 
Potencial 
Elétrico 
Amplificador 
digitalizador 
Unidade 
digital 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
 
Os dispositivos que fazem a conversão de informações não elétricas para 
elétricas são denominados transdutor (exemplos: fotomultiplicadores, fotodetectores 
eletrônicos, entre outros) e o sensor faz parte dos dispositivos utilizados para monitorar 
substâncias químicas específicas de modo contínuo e reversível (exemplo: eletrodos íon-
seletivo, sensores de fibra ótica, entre outros). 
Os instrumentos analíticos estão em geral conectados com alguns dispositivos 
eletrônicos e a conversores de domínios de dados, como circuitos integrados, 
conversores analógico-digital e digital-analógico, microprocessadores e computadores. 
Portanto, tomando como exemplo conversores analógico-digital, que são usados para 
tratar uma informação por meio da análise de uma série de pulsos de energia que são 
produzidos pelo declínio dos átomos, sendo que esses pulsos podem ser convertidos em 
domínio elétrico, num primeiro momento como pulsos analógicos e depois como pulsos 
digitais. Estes são contados com a utilização de um transdutor de entrada específico, para 
somente após estes passos serem passíveis de análise. Desse modo, fica clara a 
necessidade de conhecer vários dispositivos e ferramentas que integram os instrumentos 
analíticos em um laboratório experimental, devido à complexidade dos equipamentos 
utilizados para as análises. 
 
 
1.7 - Métodos Analíticos 
 
A definição por um método analítico requer que alguns itens sejam pensados e 
realizados antes, como: levantamento bibliográfico (Há algum método descrito na 
literatura? Quais as propriedades físico-químicas do analito? Que conhecimento existe 
sobre as substâncias relacionadas?); tempo necessário para realizar as análises; 
quantidade de amostra disponível e necessária (sensibilidade do método); intervalos de 
concentração do analito (amplitude do método); impurezas que a amostra poderá conter e 
causar interferência nas análises (seletividade do método); propriedades física e química 
da matriz da amostra e quantas amostras serão analisadas. A quantidade de amostras a 
serem analisadas tem peso econômico no desenvolvimento do protocolo de estudo, pois 
 
 
 
 
 
35 
 
 
se a quantidade de amostras for grande o método requererá que cada amostra tenha um 
tempo mínimo de análise. Portanto, tirando os trabalhos preliminares, e se forem poucas 
amostras, a opção por um método mais simples, porém que requer mais tempo de análise 
para cada amostra, e pouco ou nenhum trabalho preliminar, pode ser a melhor escolha. 
Depois de verificar todas as variáveis que fazem parte de uma escolha acertada acerca 
do método analítico, verificando as características e eficiência dos vários instrumentos 
que estarão inseridos nos trabalhos desenvolvidos neste método, alguns pontos 
importantes devem ser analisados tendo em vista uma abordagem adequada à eficiência 
e aos resultados esperados do método analítico escolhido. 
Os equipamentos que serão utilizados no método analítico deverão ser estudados 
verificando sua eficiência no que diz respeito a sua precisão (repetibilidade), tendência 
(Bias), sensibilidade, limite de detecção, faixa de concentração e seletividade. Bem como, 
saber como são os equipamentos em termos de eficiência qualitativa, na caracterização 
da velocidade, facilidade e conveniência, custo e disponibilidade do equipamento, custo 
por amostra, treinamento de pessoal, para então definir qual será o método analítico. E 
ainda será preciso saber que tipo de aplicação terá esse método analítico, qual matriz 
será usada e em que concentração, com que sensibilidade. A robustez de um método 
analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações 
dos parâmetros analíticos, e durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se 
considerar a avaliação da robustez. A seguir os fatores que devem ser considerados na 
determinação da robustez de um método analítico. 
 
 
 
 
 
Preparo das Amostras 
 
Estabilidade das soluções analíticas 
 
 
 
 
 
36 
 
 
Tempo de extração. 
Espectrofotometria 
 
Variação do pH da solução 
Temperatura 
Diferentes fabricantes de solventes 
Cromatografia Líquida 
 
Variação do pH da fase móvel 
Variação na composição da fase móvel 
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas 
Temperatura 
Fluxo da fase móvel 
Cromatografia Gasosa 
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas 
Temperatura 
Velocidade do gás de arraste 
 
Para iniciar o desenvolvimento do método analítico alguns dados precisam ser 
definidos sobre as condições analíticas. Por exemplo, ser for utilizar CLAE (Cromatografia 
Líquida de Alta Eficiência) mais conhecido como HPLC (High Performance Liquid 
Chromatography), será necessário saber que coluna será usada? Que fase móvel? Qual 
fluxo? Em que temperatura? Qual detector? Somente após a definição desses dados será 
possível otimizar o método, ajustando os parâmetros (capacidade, seletividade, eficiência, 
reprodutibilidade). E finalmente, verificar o sistema analítico, que é composto por: 
instrumentos, computador e método. 
A cromatografia líquida de alta eficiência de fase normal e fase reversa são 
usadas com detecção por absorção ultravioleta (UV), fluorescência e espectrometria de 
 
 
 
 
 
37 
 
 
massas para detectar vários tipos de substâncias químicas orgânicas e inorgânicas. Por 
exemplo, ao desenvolver uma metodologia analítica para identificar lesão em DNA 
causada por substâncias mutagênicas, estes equipamentos mostrarão resultados 
precisos acerca do objeto de estudo, de acordo com o protocolo de estudo desenvolvido 
para a identificação, nesse caso, da lesão em DNA. 
No caso da metodologia escolhida for o Teste de Ames, conhecido também como 
teste da Salmonella microssoma, ou teste de mutagenicidade com S. typhimurium, que é 
uma metodologia de triagem para detecção de substâncias carcinogênicas genotóxicas. 
Existem vários protocolos para este ensaio, porém em geral utilizam-se os métodos de 
incorporação em placas, de pré-incubação ou de microssuspensão (Kado et al., 1983), 
conforme esquema na figura 5. 
 
1.8 - Calibração de Métodos Analíticos 
 
Somente os métodos gravimétricos e coulométricos não requerem calibração por 
terem a relação entre quantidade medida e concentração do analito, calculadas por 
constantes físicas conhecidas. Em todos os outros métodos analíticos, a calibração que é 
um processo onde se relaciona o sinal analítico medido com a concentração do analito, é 
necessária. Para tanto, prepara-se a curva de calibração, o método de adição de padrão e 
o método de padrão interno. 
Para se obter a curva de calibração alguns padrões com concentrações do analito 
previamente conhecidas são adicionados em forma de amostras ao equipamento (Por 
exemplo: HPLC/detecção eletroquímica) para se ter a resposta registrada, em geral esta 
resposta, é corrigida para o valor obtido com uma amostra denominada branco no 
equipamento. Essa amostra chamada de branco deverá conter todos os componentes da 
amostra original excetuando-se o analito. Depois que as amostras dos padrões e do 
branco são adicionadas ao equipamento, os dados obtidos são colocados em um gráfico 
linear, de preferência, pois este tipo de gráfico apresenta menos erros do que os não-
lineares. 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
++
Salmonella typhimurium+
Várias doses 
triplicatas 
48h 
37ºC 
revertentes 
espontâneos 
+ 
induzidos 
revertentes 
espontâneos 
 
 
 
Figura 5 – Esquema do teste de Ames – incorporação em 
placas 
 
 
Na figura 6, temos o exemplo de um gráfico linear, de uma curva de calibração de 
uma amostra de DNA, analisando a formação de 8-oxo-dGuo, que auxilia na verificação 
 
 
 
 
 
39de dano oxidativo em DNA. Para se obter esta curva, quatro amostras de DNA foram 
preparadas com concentrações diferentes e quatro amostras de branco (padrão) foram 
injetadas no HPLC/detecção eletroquímica. Cada amostra tem um dado numérico 
correspondente que é calculado por meio de uma análise estatística denominada como 
teste t-student, que compara as amostras (DNA e padrão) para a determinação da 
quantificação e determinação da fração molar de 8-oxodGuo presente em cada amostra, 
gerando a curva de calibração, onde o R2 preferencialmente, deve ficar entre 0,99 e 1,00 
para que a curva esteja dentro dos padrões considerados como excelentes. 
É preciso conhecer as concentrações dos padrões e o quanto estes padrões 
correspondem à matriz das amostras que serão analisadas. Isto porque, uma amostra 
tem vários componentes que podem interferir nos dados apresentados nas curvas de 
calibração, sendo assim, é necessário separar o analito antes de analisar uma amostra, 
para se obter uma resposta sem interferências. 
Portanto, a calibração corresponde à colocação em um gráfico da razão entre o 
sinal do analito e o sinal do padrão, em função da concentração do analito nos padrões. 
Quando um padrão é adequado sua utilização pode compensar vários tipos de erros 
aleatórios e sistemáticos, pois se os sinais do analito e do padrão responderem às 
flutuações aleatórias do método e instrumental, a razão entre esses sinais não depende 
dessas flutuações. A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média 
determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente: 
 
Exatidão = concentração da média experimental = x 100 
concentração teórica 
 
O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções 
contendo concentrações decrescentes da amostra até o menor nível determinável com 
precisão e exatidão aceitáveis. Pode ser expresso pela equação: 
 
LD = DPa x 10 
 
 
 
 
 
 IC 
 
Onde: DPa é o desvio padrão, de no mínimo, 3 curvas de calibração construídas 
contendo concentrações das amostras próximas ao suposto limite de quantificação. Este 
desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de calibração proveniente da 
análise de um apropriado número de amostras do branco; IC é a inclinação da curva de 
calibração. 
 
Curva 8-oxo-dGuo
y = 98425x - 1084,4
R2 = 0,9965
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
pmol
ár
ea
0,25 0,50 1
 
Figura 6 – Curva de Calibração. 
 
 
É também necessário avaliar a precisão do método analítico que pode ser 
expressa como o desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) de 
uma série de medidas. A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) 
ou coeficiente de variação (CV%), segundo a fórmula: 
DPR = DP x 100 
40 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
 
 CMD 
 
Onde: DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada. 
 
1.9 - Questões para estudo: 
 
1 – O que é efeito adverso? Exemplifique. 
2 – Quais fatores relacionados ao organismo influem na toxicidade? 
3 – Que princípios devem ser seguidos na realização de testes toxicológicos em 
animais? 
4 – Em quanto tempo o teste de toxicidade crônica pode variar quando aplicado 
em roedores? 
5 – Qual é a “maior problemática” na extrapolação dos dados de animais para o 
homem? 
6 – Quais são os métodos analíticos mais utilizados nos dias de hoje? 
7 – Que técnica analítica é usada para identificar propriedades químicas e 
estruturais de moléculas e biomoléculas? Por quê? 
8 – Por que a técnica de CCD é tida como referência em muitos laboratórios? 
9 – Que dispositivos fazem à conversão de informações não elétricas para 
elétricas? 
10 – Por que é necessário conhecer as concentrações dos padrões que serão 
usados na curva de calibração? 
 
1.10 - Glossário 
 
 
 
 
 
 
42 
 
 
Absorção - diz-se que um material foi absorvido somente quando tenha 
alcançado entrada no fluxo sanguíneo e consequentemente poder ser carregado para 
todas as partes do corpo. A absorção necessita que a substância passe por meio da pele, 
membrana mucosa, ou por meio dos alvéolos pulmonares (sáculos de ar dos pulmões). 
Amostra – termo geral que abrange: controles, brancos, amostras processadas e 
desconhecidas. 
Amostra (branco) – amostra de uma matriz biológica na qual nenhum analito foi 
adicionado, utilizada para avaliar a especificidade do método bioanalítico. 
Analito – composto químico específico a ser mensurado, podendo ser o fármaco 
não-transformado, biomolécula ou seu derivado, metabólito ou produto de degradação em 
uma matriz biológica. 
Antídoto – agente capaz de antagonizar os efeitos tóxicos de uma substância. 
Autofagia – autodestruição pela célula de alguma ou algumas de suas próprias 
estruturas (já degeneradas ou não mais funcionais) em pequenos vacúolos, onde são 
lançadas as enzimas hidrolisantes dos lisossomos. É uma forma de digestão intracelular 
com finalidade de retardar o processo de envelhecimento da célula. 
Biotransformação – toda alteração que ocorre na estrutura química da 
substância, no organismo. 
Congênito – aquilo que acompanha o indivíduo desde o seu nascimento, ou 
antes dele, anomalia decorrente de malformação embrionária; patologia adquirida durante 
a vida intrauterina por contágio por meio da placenta, como sucede com a sífilis, a 
toxoplasmose e a rubéola. 
CL50 - concentração letal média. 
DL50 - dose letal média. 
Droga – toda substância capaz de modificar ou explorar o sistema fisiológico ou 
estado patológico, utilizada com ou sem intenção de benefício no organismo receptor. 
 
 
 
 
 
43 
 
 
Especificidade – habilidade do método bioanalítico de medir e diferenciar o 
analito de componentes que possam estar presentes na amostra, tais como metabólitos, 
impurezas, compostos de degradação ou componentes da matriz. 
Estabilidade – parâmetro que visa determinar se um analito mantém-se 
quimicamente inalterado numa dada matriz sob condições específicas, em determinados 
intervalos de tempo. 
Exatidão – representa o grau de concordância entre os resultados individuais 
encontrados e um valor aceito como referência. 
Faixa de quantificação – corresponde a uma faixa de concentração, incluindo o 
LSQ e o LIQ, que pode ser confiável e reprodutivelmente quantificada com exatidão e 
precisão, por meio da relação concentração-resposta. 
Fármaco – toda substância de estrutura química definida capaz de modificar ou 
explorar o sistema fisiológico ou estado patológico em benefício do organismo receptor. 
Histopatológico – estudo de tecidos doentes, no que se refere à origem (sinais e 
sintomas). 
IN VITRO – expressão usada em técnica experimental para caracterizar toda 
experiência laboratorial feita em um dispositivo artificial de mesa, como tubo de ensaio, 
proveta, entre outros. Experiência não realizada em organismo vivo. 
IN VIVO – atividade experimental praticada em organismo vivo. Diz-se da 
experiência procedida em cobaia, interpretando como tal qualquer ser vivo. 
Limite de Detecção (LD) – menor concentração de um analito que o 
procedimento bioanalítico consegue diferenciar confiavelmente do ruído de fundo. 
Limite Inferior de Quantificação (LIQ) – menor quantidade de um analito numa 
amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão aceitáveis. 
Limite Superior de Quantificação (LSQ) – maior quantidade de um analito numa 
amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão. 
Linearidade – corresponde à capacidade do método de fornecer resultados 
diretamente proporcionais à concentração da substância em exame (analito). 
 
 
 
 
 
44 
 
 
Matriz biológica – material distinto de origem biológica, que pode ser amostrado 
e processado de modo reprodutível. 
Método – descrição compreensível de todos os procedimentos usados em 
análises de amostras. 
Mutagênico – qualquer fator, físico ou químico, queprovoque mutação. Dentre os 
fatores físicos mutagênicos destacam-se os raios X, ultravioleta, entre outros. Os fatores 
químicos mutagênicos são numerosos e os mais conhecidos são os derivados de pireno, 
o ácido nitroso, o LSD, o gás de mostarda, entre outros. 
Organogênese – fase da embriogênese durante a qual se formam e se 
desenvolvem os órgãos, pela harmônica e ordenada distribuição dos tecidos. 
Padrão de calibração – matriz biológica a qual foi adicionada uma quantidade 
conhecida de analito. Os padrões de calibração são usados para construir a curva de 
calibração, com a qual são determinadas as concentrações do analito e nas amostras 
desconhecidas em estudo. 
Padrão Interno – composto, geralmente com características estruturais similares 
ao analito, adicionado aos padrões de calibração e amostras em concentrações 
conhecidas e constantes, para facilitar a determinação do analito. 
Precisão – representa o grau de repetibilidade entre os resultados de análises 
individuais, quando o procedimento é aplicado diversas vezes numa mesma amostra 
homogênea, em idênticas condições de ensaio. 
Recuperação – eficiência de extração de um método analítico, expressa como a 
porcentagem da quantidade conhecida de um analito, obtida da comparação dos 
resultados analíticos de amostras de branco acrescidas de padrão e submetidas ao 
processo de extração, com os resultados analíticos de soluções padrão não extraídos. 
Reprodutibilidade – precisão entre dois laboratórios. Também representa a 
precisão do método sob as mesmas condições operacionais, num curto período de 
tempo. 
Toxicidade – capacidade inerente e potencial do agente tóxico de provocar 
efeitos nocivos em organismos vivos. 
 
 
 
 
 
45 
 
 
Toxicidade Aguda - este termo será empregado no senso médico para significar 
“de curta duração”. Quando aplicado para materiais que podem ser inalados ou 
absorvidos por meio da pele, será referido como uma simples exposição de duração 
medida em segundos, minutos ou horas. Quando aplicado a materiais que são ingeridos, 
será referida comumente como uma pequena quantidade ou dose. 
Toxicidade Crônica - este termo significa de longa duração. Quando aplicado a 
materiais que podem ser inalados ou absorvidos por meio da pele, será referido como 
períodos prolongados ou repetitivos de exposição de duração medida em dias, meses ou 
anos. Quando aplicado a materiais que são ingeridos, será referido como doses 
repetitivas com períodos de dias, meses ou anos. O termo “crônico” não se refere ao grau 
(mais severo) dos sintomas, mas com a implicação de exposições ou doses que podem 
ser relativamente perigosas, a não ser quando estendidas ou repetidas após longos 
períodos de tempo (dias, meses ou anos). 
Sistêmico - este termo se refere a um ponto de ação diferente do ponto de 
contato e pressupõe que ocorreu absorção. É possível, que agentes tóxicos possam ser 
absorvidos por meio de canal (pele, pulmões ou canal gastrintestinal) e produzirem 
manifestações posteriores em um daqueles canais que não são um resultado do contato 
direto original. Assim, é possível para alguns xenobióticos produzir efeitos perigosos em 
um simples órgão ou tecido como o resultado de ambas as ações “local e sistêmica”. 
Termolábil – não resistente ao calor. Que se decompõe pelo calor. A vitamina C 
é um produto termolábil, por exemplo. 
Xenobiótico – substâncias químicas estranhas ao organismo. 
 
 
 
 
---------------FIM DO MÓDULO I----------- 
 
 
 
 
 
 
MÓDULO II 
 
 
2 – Circuitos Elétricos 
 
A parte conceitual do funcionamento de alguns dispositivos dos 
equipamentos que compõem os instrumentos de análise se faz importante para 
entendermos alguns tópicos. 
Os circuitos elétricos podem ser compostos por resistores, indutores e 
capacitores, alimentados por fontes de corrente ou de tensão. Estas fontes podem 
ser fontes independentes ou fontes controladas. Estes circuitos são partes 
integrantes dos microcomputadores e outros equipamentos utilizados na análise dos 
testes toxicológicos. Alguns destes elementos estão mostrados na Figura 7. 
 
 
 
Figura 7 – Exemplos de símbolos e elementos utilizados nos circuitos elétricos. 
 
47 
 
 
 
 
 
48 
Quando os circuitos elétricos têm sua finalidade relacionada à transmissão 
de potência, estes circuitos denominam-se elétricos; quando se destinam ao 
processamento de sinais elétricos, denominam-se eletrônicos. 
Dentre as variáveis elétricas mais utilizadas na descrição dos circuitos 
elétricos temos: a tensão ou diferença de potencial, índice da energia elétrica que 
um ponto de um circuito possui em relação a outro ponto análogo; e a intensidade 
de corrente, que expressa a velocidade com que se deslocam às cargas elétricas. 
Portanto, cada componente tem uma equação que relaciona a intensidade da 
corrente que circula por meio dele com a diferença de potencial existente entre seus 
pontos extremos. Os componentes de um circuito pode se ligar de duas maneiras: 
em paralelo, quando a diferença de potencial entre todos os pontos terminais de 
seus elementos se mantém constante e em série, quando a intensidade de corrente 
que circula entre seus elementos é a mesma. As leis de Kirchhoff são utilizadas para 
a análise de um circuito, e a primeira lei de Kirchhoff diz que em um nó - ponto em 
que é ligado três ou mais ramificações de uma rede ou circuito complexo - a soma 
das intensidades de corrente de todas as ramificações é zero. A segunda lei de 
Kirchhoff se refere ao princípio onde a soma de todas as diferenças de potencial ao 
longo de qualquer malha (conjunto fechado de ramificações) também é nula. 
Os métodos mais modernos da análise de circuitos baseiam-se no 
denominado cálculo operacional, que é capaz de transformar complexas equações 
integrais e diferenciais em equações algébricas. Utilizando-se de avançados 
conceitos matemáticos, como as transformadas de Fourier e Laplace e também os 
números complexos, definidos como expressões do tipo a + bi, em que a e b são 
números reais e i (2 = -1), por exemplo. 
São diversas as funções exercidas pelos circuitos. Os circuitos retificadores 
ou filtros, que selecionam sinais elétricos de acordo com sua frequência, e os 
circuitos amplificadores, que aumentam a amplitude de um sinal, têm papel 
importante. Entretanto, para o avanço da informática, foi fundamental o 
desenvolvimento dos circuitos designados como de comutação, entre eles os 
chamados flip-flop e os circuitos lógicos. Bem como, o desenvolvimento de materiais 
 
 
 
 
 
49 
semicondutores, substâncias cristalinas de condutividade elétrica muito inferior à dos 
metais, que permitiu a fabricação de novos componentes fundamentais na 
engenharia de circuitos, como exemplo: os diodos e os transistores, além dos 
circuitos integrados, que são pequenos módulos constituídos por grande número de 
componentes eletrônicos em uma superfície de uma lâmina ou pastilha. 
Os circuitos integrados foram responsáveis pela miniaturização dos circuitos, 
resultando na diminuição do preço, do consumo de energia, favorecendo o aumento 
da velocidade e precisão com que os sinais elétricos são transmitidos e 
armazenados. O que é vital em análises instrumentais, onde a velocidade e precisão 
são muito importantes para que o resultado seja confiável e preciso, sem demandar 
um tempo muito grande. 
 
2.1 – Amplificadores Operacionais 
 
Para compreender o funcionamento e operacionalidade dos equipamentos 
utilizados para as análises dos testes toxicológicos, precisamos entender como 
funcionam alguns equipamentos e obtermos alguns conceitos sobre estas 
ferramentas para entendermos o porquê da escolha de um determinado método em 
detrimento de outro. 
Por serem utilizados em computadores analógicos num primeiro momento 
para executar operações matemáticas, e também para medidas precisas de 
voltagem, corrente e resistência, que fazem parte