Manual para confecção de laminas histológicas permanentes

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PREPARO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS
Ana Lúcia Tosta Ribeiro, Anderson Carrijo da Costa,
Cíntia Ruiz Denadai, Érika Maria Antonino Fonseca,
Fabiana Peghim, Janayne Aparecida Pentino,
Luiz Alves Rodrigues, Priscila Maria Antonini,
Teresinha de Jesus Borin de Carvalho,
Vanessa Cristina Mazzi
Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos 
INTRODUÇÃO 
O método mais comum usado em histologia vegetal permite a obtenção de preparados histológicos permanentes (lâminas) para estudo ao microscópio óptico. Nesse instrumento os objetos são examinados por transparência e como órgãos muito delgados são raros, a maioria precisa ser reduzida a cortes finos, suficientemente transparentes para serem examinados ao microscópio. Estes cortes são feitos com um micrótomo, mas antes de serem cortados os tecidos devem passar por uma série de tratamentos.
Obviamente, o que se deseja é levar ao microscópio um preparo no qual os tecidos estejam perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivos. Mas apesar dos cuidados tomados, esse ideal não é alcançado plenamente, observando-se em todos os cortes histológicos certos artefatos decorrentes do processamento que sofreram. 
A fim de evitar a destruição das células por suas próprias enzimas, ou por bactérias, os tecidos removidos devem ser adequadamente tratados imediatamente após a sua retirada. Esse tratamento é denominado fixação. A principal função dos fixadores é insolubilizar as proteínas dos tecidos.
Para obtenção dos cortes, os tecidos devem ser embebidos e envolvidos por substância de consistência firme. As substâncias mais usadas para essa finalidade (meios de inclusão) são a parafina e as resinas plásticas.
Os tecidos devem sofrer uma série de tratamentos antes da impregnação. Na primeira etapa do processo, denominada desidratação, a água é extraída dos tecidos pela passagem dos mesmos em banhos de concentrações crescentes de etanol, geralmente de 70%, até etanol puro (100%).
Em seguida, o etanol é substituído por um líquido miscível e geralmente usa-se xilol ou benzol. Os tecidos embebidos nessas substâncias tornam-se translúcidos, razão por que essa etapa é denominada clareamento. Mergulham-se, então, os tecidos em parafina fundida numa estufa a 60ºC. Devido ao calor, o xilol ou benzol evaporam, e os espaços anteriormente ocupados pela parafina ficam livres. Coloca-se o tecido num recipiente contendo um pouco de parafina fundida e deixa-se solidificar, formando-se um bloco de parafina com o tecido no seu interior (inclusão). 
Os blocos de parafina, contendo os tecidos incluídos, são seccionados pela navalha de aço do micrótomo, obtendo-se geralmente cortes de 6 a 8 (m de espessura.
A maioria dos tecidos é incolor, o que torna difícil sua observação ao microscópio óptico. Devido a isso, foram introduzidos métodos para a coloração dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visíveis e destacados uns dos outros.
A maioria dos corantes usados em histologia comporta-se como ácidos ou bases e tendem a formar ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos.
A hematoxilina comporta-se como um corante básico, ligando-se às estruturas basófilas dos tecidos. A hematoxilina cora em azul os núcleos celulares e outras estruturas de natureza ácida, como regiões do citoplasma ricas em RNA e espessamentos celulares de celulose.
Ao estudar um corte histológico no microscópio, é preciso ter em mente que a estrutura das células e tecidos está alterada pela técnica histológica. As etapas da técnica histológica, subseqüentes à fixação (desidratação, clareamento, impregnação e coloração), também introduzem algumas modificações nos tecidos, que não devem dificultar a caracterização das estruturas estudadas.
Além disso, a delgada espessura dos cortes cria um obstáculo ao estudo tridimensional dos tecidos e órgãos. Para se chegar a compreender a arquitetura tridimensional de um órgão ou tecido, torna-se necessário o estudo de cortes realizados em diferentes direções.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização dos cortes histológicos, foram cortados e retirados segmentos no 1/3 proximal da região laminar, retirando cerca de 1 cm2 cada peça nas folhas de Hibiscus rosacinencis L. com auxílio de uma régua e tesoura. Estes pedaços de folhas foram submetidos às seguintes metodologias:
Metodologia I: 
Utilizou-se a mesma técnica para os cortes histológicos de tecido animal, procedendo à desidratação, clareamento, impregnação, inclusão e a coloração com o auxilio de cassete( (Lupe), pinças, béqueres, cronômetro, proveta, estufa, geladeira, micrótomo, lâminas, lamínulas, resina Permount( (Fisher Scientific) e o microscópio para visualização dos cortes preparados. Consistindo-se na passagem dos cassete( (Lupe) (onde contém a peça da planta) nas seguintes substâncias e nos tempos indicados:
DESIDRATAÇÃO:
	Álcool 70%
	
	30 minutos
	
	Álcool 75%
	
	30 minutos
	
	Álcool 80%
	
	30 minutos
	
	Álcool 85%
	
	30 minutos
	
	Álcool 90%
	
	30 minutos
	
	Álcool absoluto I
	
	30 minutos
	
	Álcool absoluto II
	
	30 minutos
	
	Álcool absoluto / xilol
	
	30 minutos
	
CLAREAMENTO:
	Xilol I
	20 minutos
	Xilol II
	20 minutos
	Xilol III
	20 minutos
IMPREGNAÇÃO:
	Parafina I
	30 minutos
	Parafina II
	30 minutos
	Parafina III
	30 minutos
Após estes procedimentos, realizou-se a inclusão da peça no molde de parafina, onde ela é inclusa no centro do molde até completa solidificação, resfriada e levada a geladeira por no mínimo 40 minutos. A peça é moldada de acordo com o tamanho do micrótomo, sendo realizado os cortes de 7 (m que são levados ao banho-maria na temperatura entorno de 50ºC. Os cortes são colocados na lâmina e corados com a hematoxilina (HE), seguindo os tempos necessários:
	Xilol I
	7 minutos
	Xilol II
	7 minutos
	Álcool absoluto I
	passagem
	Álcool absoluto II
	passagem
	Álcool 90%
	passagem
	Álcool 70%
	passagem
	Água
	2 minutos
	Hematoxilina
	2 minutos
	Água
	2 minutos
	Álcool 70%
	passagem
	Álcool absoluto I
	passagem
	Álcool absoluto II
	passagem
	Xilol I
	passagem
	Xilol II
	passagem
	Xilol III
	passagem
Feita a coloração, as lamínulas foram fixadas nas lâminas com permount, estando pronta para a visualização no microscópio.
METODOLOGIA II:
Aplicou-se a técnica anterior mudando somente o tempo de permanência do xilol no clareamento, de 20 minutos para 10 e 5 minutos. Na coloração, de 7 minutos para 3 e posteriormente para 1minuto, seguindo normalmente as outras etapas até visualização.
METODOLOGIA III:
Quando as peças das plantas foram removidas, elas ficaram por cerca de 12 horas no formol para que fosse realizada a fixação e prosseguiu-se normalmente com a desidratação, clareamento, impregnação e coloração da metodologia anterior.
METODOLOGIA IV:
As peças foram colocadas por 10 minutos na água destilada, 20 minutos no xilol, incluidas no molde de parafina e então foram feitos os cortes no micrótomo.
METODOLOGIA V:
As peças contidas no cassete( (Lupe) passaram pelos seguintes procedimentos:
	Água destilada
	10 minutos
	Xilol
	20 minutos
Descansou até que o xilol tenha escorrido.
	Xilol
	20 minutos
Depois foram colocadas em parafina e levadas para a estufa a 56ºC. Fez-se a inclusão nos moldes, esperou-se secarem e foram levadas para a geladeira. As peças foram moldadas no micrótomo e feitos os cortes, tiradas do banho-maria e passadas para as lâminas, fazendo-se a coloração nas seguintes substâncias:
	Hipoclorito
	7 minutos
	Hematoxilina
	1 minuto
	Água de torneira
	lavagem
	Lugol
	1 minuto
As lamínulas foram fixadas nas lâminas com Permount( (Fisher Scientific) e visualizadas ao microscópio.
METODOLOGIA VI:
Utilizou-se o procedimento da desidratação, clareamento, impregnação e a inclusão dametodologia I, e cortes no tamanho de 20, 25 e 40 (m.
Para a coloração foram usadas as seguintes substâncias e tempos: 
	Xilol I
	1 minuto
	Xilol II
	1 minuto
	Álcool absoluto I
	passagem
	Álcool absoluto II
	passagem
	Álcool 90%
	passagem
	Álcool 70%
	passagem
	Água de torneira
	lavagem
	Hipoclorito
	5 minutos
	Água de torneira
	lavagem
	Lugol
	1 minuto
	Hematoxilina
	38 segundos
	Água de torneira
	lavagem
	Álcool 70%
	passagem
	Álcool 90%
	passagem
	Álcool absoluto I
	passagem
	Xilol I
	passagem
	Xilol II
	passagem
	Xilol III
	passagem
Após a coloração as lamínulas foram colocadas nas lâminas com Permount( (Fisher Scientific) e visualizadas ao microscópio.
METODOLOGIA VII:
Fez-se o mesmo procedimento da metodologia V, mudando as substâncias e tempos na coloração:
	Xilol I
	3 minutos
	Xilol II
	3 minutos
	Álcool absoluto I
	passagem
	Álcool absoluto II
	passagem
	Álcool 90%
	passagem
	Álcool 70%
	passagem
	Água de torneira
	lavagem
	Lugol
	5 minutos
	Hematoxilina
	38 segundos
	Água de torneira
	lavagem
	Álcool 70%
	passagem
	Álcool 90%
	passagem
	Álcool absoluto I
	passagem
	Álcool absoluto I
	passagem
	Xilol I
	passagem
	Xilol II
	passagem
	Xilol III
	passagem
Foram colocadas as lamínulas e visualizadas ao microscópio.
RESULTADOS
Todas as Metodologias I a VI descritas e testadas, não produziram cortes bons, montados em lâminas para visualização ao microscópio óptico adequadas, tornando-se difícil a distinção dos tecidos a serem estudados.
As figuras abaixo mostram os cortes obtidos com a Metodologia VII que mostrou-se a mais indicada para o estudo de cortes da região laminar de folhas de vegetais.
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Dependendo da finalidade a que se destina pode-se montar os cortes em lâminas para observação imediata ou em lâminas ditas permanentes. Neste estudo obtivemos os melhores cortes semi-permanentes com a Metodologia VII.
Outra dificuldade encontrada no estudo da histologia decorreu do fato de que, quando se cora um preparado histológico, dependendo da técnica empregada, apenas alguns aspectos das estruturas teciduais são evidenciados. É difícil o preparo de uma lâmina que mostre todos componentes celulares e todos os detalhes dos tecidos. 
Leia mais sobre a produção de lâminas vegetais em:
a) Junqueira, L. C.; Carneiro, J.; Histologia Básica, 8ª edição, Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1995. 
b) Esau, K., Anatomia das Plantas com Sementes; Editora Edgard Blucher, S.P.,1974.
Figuras e legendas
Figura 1: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L., 
corado com lugol no tamanho de 20 (m.
Figura 2: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,
corado com hematoxilina no tamanho de 20 (m.
Figura 3: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,
corado com hematoxilina no tamanho de 20 (m.
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